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Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni

Developmental Biology

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Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die groß angelegte axenic Isolierung und Sammlung von freischwimmenden Miracidia der menschlichen Blut Egel Schistosoma Mansoni und deren Weiterverarbeitung für Einführung in die in-vitro- Kultur.

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Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

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Abstract

Menschliches Blut Egel, Schistosoma spp., haben einen komplexen Lebenszyklus, der sexuelle und asexuelle Entwicklungsphasen innerhalb einer Schnecke zwischen- und Säugetieren Endwirt, bzw. beinhaltet. Die Fähigkeit, zu isolieren und Aufrechterhaltung der verschiedenen Lebenszyklusphasen unter in-vitro- Kulturbedingungen hat Untersuchungen der zellulären, biochemischen und molekularen Mechanismen zur Regulierung Parasit Wachstum, Entwicklung und Host erheblich erleichtert. Interaktionen. Übertragung von Schistosomiasis erfordert Ungeschlechtliche Fortpflanzung und Entwicklung mehrere Larvenstadien innerhalb der Schnecke Host; von der infektiösen Miracidium, durch primäre und sekundäre Sporocysts zu cercarial Endstufe, die für den Menschen ansteckend ist. In diesem Beitrag präsentieren wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur Masse Schraffur und Isolierung von Schistosoma Mansoni Miracidia von Eizellen aus Lebern von infizierten Mäusen und ihre nachträgliche Einführung in in-vitro- Kultur. Es wird erwartet, dass das ausführliche Protokoll wird neue Forscher zu betreiben und erweitern diese wichtige Forschungsfeld schistosome-zu fördern.

Introduction

Das menschliche Blut Egel Schistosoma spp., sind die Erreger der Schistosomiasis, eine vernachlässigte tropische Krankheiten leidet schätzungsweise 230 Millionen Menschen weltweit1. Die am weitesten verbreitete Art, Schistosoma Mansoniist in Südamerika, des karibischen Archipels, Nahost und Afrika südlich der Sahara in Afrika2geografisch verteilt. Der Lebenszyklus von S. Mansoniund andere Schistosomen ist komplex, mit einem Säugetier Definitive Host und Süßwasserschnecken der Gattung Biomphalaria , die als obligate Zwischenwirte dienen.

S. Mansoni männlichen und weiblichen Erwachsenen Wurm Paare Leben in den hinteren mesenterialen Adern der Säugetier-Wirt reproduzieren, was die Auflösung von embryonierten Eiern (Ova), die in die kleinen Venolen der Darmschleimhaut eingereicht werden. Eiern dann durchbricht die Gefäßwände durch Schleimhaut Wandern, und schließlich geben Sie das Darmlumen, wo sie mit dem Kot storniert werden. Bei Ova Süßwasser und freischwimmenden Larven (Miracidia) schlüpfen müssen, sie in kurzer Zeit eine geeignete Biomphalaria Schnecke zu infizieren, um seinen Lebenszyklus weiter vorkommen. Dieser Infektionsprozess beinhaltet Miracidial Bindung an die Schnecke äußeren Körperoberfläche gefolgt von aktiven eindringen und Eindringen von der Larve in den Host. Bald nach Eintritt beginnt das Miracidium, die Außenlamellen ciliated epidermalen Schuppen, wie es ein Syncytium bildet, die die neue äußere Oberfläche (Schale) des nächsten Larvenstadium, die primäre oder Mutter Sporocyst werden. Durch Ungeschlechtliche Fortpflanzung jede primäre Sporocyst produziert und veröffentlicht eine zweite Generation von Sporocysts, als sekundäre oder Tochter Sporocysts, die wiederum erzeugen und lösen zahlreicher intramolluscan Endphase der Cercaria3 . Bei der Flucht aus der Schnecke Host können Nautiliden Cercariae zuweisen und direkt die Haut eines Menschen oder andere geeignete Säugetier-Hosts durchdringt. Bei der Einreise in ihren neuen Wirt Cercariae auf die parasitären Schistosomula Bühne verwandeln und dringen in das Gefäßsystem. Sie migrieren wiederum an der Lunge und dann an die Lebervene wo sie Reifen zu Erwachsenen Würmer, männliche und weibliche Paare bilden und Reisen zu den mesenterialen Adern um ihren Lebenszyklus zu vervollständigen.

Erfolgreiche intramolluscan oder "Schnecke-Phase" Entwicklung der Larven Schistosomen unbedingt Fortsetzung des Zyklus des menschlichen Host-to-Host-Übertragung. Von entscheidender Bedeutung ist die folgende Posten von der freischwimmenden Miracidium in der Schnecke Host und seine frühen Transformation auf die primäre Sporocyst-Bühne. Abhängig von den physiologischen und immunologischen Kompatibilität zwischen Wirt und Parasit ist es in dieser Phase der Larvalentwicklung dieser anfänglichen Erfolg oder Misserfolg zu Infektionen ist bestimmt4,5,6 . Nachfolgende Entwicklung der primären Sporocysts asexuell produzieren sekundäre Sporocysts, die dann Menschen infektiöse Cercariae erzeugen, weitere erfordern eine permissive physiologischen Host-Umgebung, die für alle der Parasit Wachstum bereitstellt und reproduktive braucht.

Bisher ist wenig bekannt über die zugrunde liegenden, physiologische, biochemische und molekulare Prozesse schistosome-Schnecke Interaktionen, vor allem die Moleküle und Wege beteiligt zur Regelung der Larvalentwicklung und Reproduktion oder Modulation Host-Immunantworten. Zugriff auf eine große Anzahl dieser Larvenstadien unter in-vitro- Kulturbedingungen, die experimentelle Manipulation zulassen würde erheblich erleichtern die Entdeckung des entwicklungspolitischen Wege und zugrunde liegenden Mechanismen des Zellwachstums, Differenzierung und Reproduktion. Kritischen Parasit Wege oder Mechanismen, identifiziert durch in-vitro- Experimente, könnte dann Larven Wachstum/Reproduktion in der Schnecke Host zu stören oder Schnecke Host Abwehrmechanismen beteiligt Erkennung und Beseitigung von identifizieren verwendet werden Miracidial oder Sporocyst Stufen.

In diesem Artikel und video-Präsentation bieten wir eine detaillierte Beschreibung einer Methode zur Isolierung von freischwimmenden S. Mansoni zahlreicher Miracidia für Einführung in in-vitro- Kultur, die dann mit weiteren experimentellen ausgesetzt sein könnten Manipulation (siehe Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die Protokoll-Workflow). Obwohl ähnliche Verfahren beschrieben wurden bisher7,8,9, fühlten wir, dass ein detailliertes Protokoll sinnvoll, Forscher, die dieses Modell wäre, um noch offene Fragen im Zusammenhang mit Adresse beschäftigen wollen intramolluscan Larvalentwicklung, Zellproliferation und schistosome-Schnecke immun Interaktionen. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz für die Isolierung von Eiern aus anderen medizinisch wichtigen Trematoden wie Blase-Wohnung S. Haematobium, Leberegel oder Lunge Egel leicht angepasst werden.

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Protocol

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss der University of Wisconsin-Madison unter Protokoll genehmigt keine. V005717. Das folgende Protokoll beinhaltet Arbeiten in einer Einrichtung Biosafety Level 2 (BSL2) für menschliche Krankheitserreger, obwohl keiner der schistosome-Stufen dargestellt, die in diesem Protokoll ansteckend für Menschen oder andere Säugetiere sind. Institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Risiko-Gruppe 2 (RG2) menschliche Krankheitserreger zu folgen.

Hinweis: Wir verwenden weibliche Swiss-Webster Mäuse (6 - Wochen alten) aufgrund ihrer höheren Anfälligkeit zur Infektion10, damit größere Ei Belastungen nachgeben. Tucker Et Al. beschreiben die Maus und Schnecke Infektion Protokolle in diesem Modell System11verwendet. Die Tabelle der Materialien zeigt eine Liste aller spezifischen Ausrüstung, Materialien, Reagenzien und tierischen Quellen, die zur Durchführung dieser experimentellen Protokolls.

1. Verarbeitung von infizierten Leber

  1. Einschläfern Sie Mäuse, 6-7 Wochen nach der Infektion, durch CO2 ersticken (Rate von 10-30 % von dem Kammervolumen pro Minute). Mäuse für die Einstellung der Atmung und Herzschlag zu überwachen.
    Hinweis: In der Regel können bis zu 20 Mäuse zu einem bestimmten Zeitpunkt verarbeitet werden.
  2. Legen Sie nach der Übertragung euthanasierten Mäuse auf eine biologische Kabinett Mäuse auf den Rücken und sprühen Sie ihre ventralen Flächen mit 70 % Ethanol. 1 min. einwirken lassen.
  3. Kneifen und ziehen Sie die Haut des Unterleibs und quer durch die Basis der eingeklemmten Haut am nächsten an den Bauch mit sterilen Chirurgische Scheren. Ziehen Sie die geschnittenen Haut anterior (d. h. in Richtung zum Kopf), die Leber zu offenbaren. Beachten Sie, dass die Leber sollte vergrößert und durch eine Ei-induzierte granulomatöse Reaktion (Abbildung 2A gesprenkelt).
  4. Entfernen Sie die Leber und legen Sie sie in einen Becher mit 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 mit verbleibenden Mäuse.
    Hinweis: Zwanzig Mäuse sind in der Regel in einer einzigen Ernte verarbeitet.
  6. Die Leber in eine sterile Petrischale und entfernen Sie-Leber Fett/Bindegewebe mit der sterilen Pinzette.
  7. Auf eine sterile 250-mL-Zentrifuge-Flasche mit ~ 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep getrimmt/gereinigt Lebern übertragen.
  8. Kräftig schütteln Sie die Flasche mit der Leber, und mit einer sterilen Einweg-Pipette, entfernen Sie die überschüssige Oberfläche Schaum/Treibgut. Langsam die restliche Salzlösung in ein Gefäß abgießen oder Waschbecken mit 1 % Bleichmittel (Desinfektionsmittel).
  9. Die Lebern ~ 200 mL frische Kochsalzlösung hinzu, und wiederholen Sie Schritt 1,8 noch dreimal.

2. Leber Extraktion und Miracidial isolation

  1. Legen Sie die Leber in einer kleinen sterilen Edelstahl-Mixbecher und ~ 2 mL 1,2 % NaCl-Lösung (Abb. 2 b).
  2. Decken Sie die Tasse mit Folie und einer Petrischale zur Verhinderung von Verschmutzungen und Mischung für 1 min durch den Wechsel von niedriger und hoher Geschwindigkeit (20 s niedrige Geschwindigkeit/10 s high-Speed, Wiederholung) (Abbildung 2).
  3. Verteilen Sie gleichmäßig die kombinierte Leber Aussetzung in sterilen 250-mL-Zentrifuge Flaschen (für 20 Lebern 4 Flaschen verwenden).
  4. ~ 200 mL Gesamt Volumen/Flasche sterile Kochsalzlösung mit Antibiotika hinzufügen. Gewicht/Balance Flaschen vor der Zentrifugation.
  5. Zentrifuge gemischt Leber bei 290 X g für 15 min bei 4 oC. sanft aus Überstände in einen Behälter mit Bleichmittel vor der Entsorgung zu gießen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 einmal. Achten Sie darauf, gründlich vor Zentrifugation Leber Sediment aufzuwirbeln.
  7. Nach verwerfen die letzten Kochsalzlösung waschen Sie (Schritt 2,6), gebeizte Lebergewebe, schütteln Sediment aufzuwirbeln und übertragen die Aufhängung in eine sterilisierte 1 L volumetrischen Kolben, der komplett mit Aluminium abgedeckt wurde fügen 200 mL sterilem Teichwasser mit Pen/Strep hinzu Folie, mit Ausnahme der Spitze 3 cm des Halses (Abb. 2D).
    Hinweis: Verwenden Sie zwei Flaschen (= 10 Lebern) pro 1-L-Flasche. Teichwasser simuliert die natürliche Süßwassersee Umgebung musste Miracidial schlüpfen aus den Eiern zu stimulieren.
  8. Mit sterilem Teichwasser, füllen Sie die Flasche um ca. 3 cm oberhalb der Folie abdecken am Hals. Dann, ohne Verzögerung (wie Miracidia in Kürze beginnen zu schlüpfen), restliche Schaum und Lebergewebe schwimmend an der Oberfläche durch schnell Pipettieren bis ~ 12 mL Teichwasser mit Schutt entfernen und verwerfen es in einem separaten Rohr zu verwerfen. Ersetzen Sie durch frische sterile Teichwasser.
  9. Wiederholen Sie die Reinigung Schritt 2.8, drei weitere Zeiten, Überprüfung auf Vorhandensein eines Miracidia in der Röhre verwerfen. Einzustellen Sie Wiederholung der Reinigung Schritt erscheint Miracidia in der Waschlösung.
  10. Fügen Sie nach der letzten Wäsche hinzu, langsam ~ 12 mL warmen sterilem Teichwasser (30 oC vorgewärmt) um ein Temperaturgradient mit sauberem, sterile warmes Wasser an der Spitze zu schaffen.
    Hinweis: Dies geschieht am besten durch langsam entladen Wasser entlang der Seite des Halses Fläschchen mischen zu vermeiden.
  11. Legen Sie eine kleine Petrischale Abdeckung über der Öffnung der Flasche und strahlen ein helles Licht am oberen Rand der Flasche über die Folienabdeckung, die Oberfläche des Wassers zu beleuchten.
    Hinweis: In der Regel innerhalb von 5-10 Minuten, Schwimmen Miracidia, angezogen, das Licht in großer Zahl innerhalb der ersten 2-3 cm Teichwasser (Abbildung 3A) konzentrieren.

3. Miracidial Ernte und Anbau

  1. Wenn Miracidia haben nach 10 min an der Oberfläche gesammelt, mit einer sterilen Transferpipette ~ 8 mL Teichwasser und Transfer in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL entfernen. Legen Sie die Röhrchen mit Miracidia auf Eis.
  2. Zurück 8 mL warmen sterilem Teichwasser entlang der Innenseite der volumetrischen Küvette hinzufügen und weitere 10 Minuten warten.
  3. Mit neuen Röhren jedes Mal, wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 noch dreimal. Halten Sie nach der 4th -Sammlung das letzte Rohr auf Eis für 10 min erlauben die Miracidia zu begleichen. Dieser Satz von Rohren umfasst die erste Ernte.
  4. Zentrifugen-Röhrchen mit Miracidia 290 X g für 1 min bei 4 oC in einer vorgekühlten gekühlten Zentrifuge.
  5. Umgehend entfernen Sie die meisten des Überstands (~ 7 mL) darauf achten, nicht zu stören das Parasiten-Pellet (Abb. 3 b).
  6. Pool der Miracidia aus dieser ersten Ernte zu einem Rohr, dann spülen Sie alle der ursprünglichen Rohre mit ~ 1 mL sterilem Teichwasser und hinzufügen "gepoolte" Rohr.
  7. Können Parasiten für ~ 5 min auf Eis zu begleichen, und erneut Zentrifugieren der Parasiten bei 290 X g für 1 min bei 4 oC.
  8. Sorgfältig entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 6-8 mL sterile Chernin Salzlösung (CBSS +; siehe Tabelle of Materials) enthaltenden Pen/Strep ausgeglichen.
  9. Auszusetzen Sie die Miracidia und aliquoten folgte ihnen in eine Kultur 24-Well-Platte (1 mL pro Well), indem das Rohr in 6-8 mL CBSS + Spülung und 1 mL Spülen in jede Vertiefung sanft. Parasiten bei 26 oC unter inklusieve Bedingungen auszubrüten. Konzentrationen von isolierten Miracidia schwankt, aber werden in der Regel durchschnittlich ~ 7000/mL.
  10. Wenn Parasiten noch auf die Lichtquelle konzentrieren, wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.9 weiterhin Ernte spät-Schlupf Miracidia aber erhöhen Sie das Zeitintervall zwischen Sammlungen auf 15-20 min zu.
    Hinweis: Diese neue Reihe von Röhren steht die zweite Ernte. Jedoch weil die Miracidial Zahlen in der Regel niedrig sind, sind Larven aus allen Rohren in der Regel in einer einzigen Kultur gut mit 2 mL CBSS + gebündelt.
  11. 24 h nach der Ernte und Anbau Aufschwemmen Sie sanft Sporocysts in den Brunnen durch pipettieren.
  12. Warten Sie ein paar Minuten um Parasiten, sich an der Unterseite der Brunnen zu ermöglichen. Sobald sie sich niedergelassen haben, entfernen Sie vorsichtig den überstand (~1.5 mL), enthalten die meisten der Nasenfunktion epidermalen Platten Schuppen von Miracidia während der larvalen Transformation. Diese "Verwandlung" überstand kann entweder verworfen oder in Folgestudien Larven sekretorischen Produkte integriert.
  13. Jeder Brunnen und sanft Pipette zum Sporocysts Aufschwemmen fügen Sie 1,5 mL frische CBSS hinzu +. Wiederholen Sie Schritt 3.12, wenn weitere waschen oder Umstellung auf ein anderes Medium gewünscht wird.

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Representative Results

Die überwiegende Mehrheit der Miracidia wird in der Regel in den ersten beiden "ernten" gesammelt wurden. Inkubation von isolierten Miracidia in CBSS + löst den Miracidium-Sporocyst Transformationsprozess (Abbildung 4A- C). Innerhalb der ersten Stunde Brunnen folgende Übertragung auf Kultur mit CBSS +, die meisten Miracidia nicht mehr schwimmen (Abb. 4A). Um 6 Uhr in der Kultur Miracidia sind dabei aktiv shedding ihre Nasenfunktion epidermalen Platten (Abbildung 4 b). Deckungsgleich mit dabei vergießen, Larven ihre Außenverkleidung syncytial tegumental bilden, wie sie zur primären Sporocysts zu verwandeln. Die meisten der Parasiten werden larval Transformation, immer voll ausgebildet Sporocysts von 24-48 h nach dem Anbau in CBSS + (Abbildung 4) abgeschlossen haben. Nach 4 Tagen der Kultur in CBSS + allein dürfte die Sporocyst überleben bis ~ 80 % zu verringern. Allerdings Sporocysts für 1 Tag in CBSS + kultiviert und dann zu kompletten Bge (cBge) Medium übertragen, für 3 Tage in der Regel bessere Überlebensraten und Larven mit robuster Optik (Abbildung 4) führen. Sporocyst Tragfähigkeit bleibt in der Regel zwischen 4 und 7 Tage in cBge mit anhaltenden Anstieg der Larven Wachstum während dieser Zeit in Kultur im Vergleich zu CBSS + allein stabil.

Figure 1
Abbildung 1 . Überblick über Protokoll Workflow. Schematische Übersicht über die wichtigsten Schritte in der Isolation und Anbau von Miracidia abgeleitet von Mäusen, die mit der menschlichen Blut Egel, S. Mansoniinfiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Verarbeitung von infizierten Leber. (A) Mouse Leber stark infiziert, S. Mansoni Eier. Beachten Sie die erweiterten Umfang, ungewöhnliche Farbe und das Vorhandensein von Granulome in der infizierten Leber (rechts) im Vergleich zu einem normalen nicht infizierten Leber (links). (B) Washed Maus Lebern nach dem Transfer zum sterilen Edelstahl-Mixbecher. Lebern wurden dann für eine Minute mit sterilen Folie und Petrischale bedecken den Cup, wodurch Verschmutzungen (C) gemischt. Nach der Assemblage, war die Leber Homogenat, mit Eiern, mehrmals in Kochsalzlösung gewaschen und Nukleinsäuretablette in sterilem Teichwasser, bevor auf eine volumetrische 1-L-Flasche mit Aluminiumfolie (D) bedeckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Ernte S. Mansoni Miracidia. Aktiv schwimmen Miracidia durch Anziehungskraft auf Licht an der Spitze der volumetrischen Kolben (A) konzentriert. In 10 min Abständen sind Parasiten Pipette geerntet und bei 4 ° C, Larven zu immobilisieren. Miracidia sind dann durch Zentrifugation in CBSS + gewaschen und gesammelt in einem einzigen Rohr (B) kurz vor der Verteilung in Vertiefungen einer Kultur-Platte. CBSS +; Chernin des ausgewogenen Salzlösung (Table of Materials). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Miracidial Transformation zu primären Sporocysts und deren Wartung in-vitro- . Miracidia S. Mansoni und Sporocysts platziert in in-vitro- Kultur zu verschiedenen Zeiten nach dem ernten. Neu geernteten Miracidia innerhalb 1 h nach Kultur in CBSS + (A). Nach 6 h Kultur Miracidia haben begonnen, ihre Nasenfunktion epidermalen Platten (Pfeile) zu vergießen, wie sie zur primären Sporocysts (B) zu verwandeln. Nach 24 h im CBSS + haben die meisten von den Miracidia zum primären Sporocysts (C) komplett umgestaltet. Sporocysts wurden umgewandelt in CBSS + für 24 h, dann übertragen und im cBge Medium für 3 Tage (D) gepflegt. Sporocysts in der Regel erscheinen robuster und haben höhere Überlebensraten auf 4 Tage nach dem Anbau in Anwesenheit von cBge, im Vergleich zu CBSS + allein. CBSS + ausgewogen Chernin der Salzlösung; cBge Medium, komplette B. Glabrata embryonale Zelle Medium (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Miracidia von S. Mansoni, isoliert und manipuliert, wie hier beschrieben nur die Schnecke Zwischenwirt infizieren können und daher repräsentieren keine menschliche Biohazard während dieser Phase der Larvalentwicklung. Jedoch um versehentliche Belichtung/Infektion der Schnecken zu vermeiden, sollte darauf geachtet werden, Miracidial Isolationen an einem anderen Ort aus ausführen wo anfällig Biomphalaria Schneckenarten anwesend oder gepflegt werden können. Ein separater Raum, registriert als BSL2 Raum, wird dringend empfohlen. Darüber hinaus alle Wäsche, die Lösungen in der Verarbeitung von Lebern und Larven Isolation mit Desinfektionsmittel (z.B. 1 % Bleichmittel) vor der Entsorgung behandelt werden sollten.

Es sei darauf hingewiesen, dass die chirurgische Entfernung der Leber von infizierten Mäusen und deren Weiterverarbeitung vor dem Mischen/Homogenisierung werden in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Jedoch sind aus praktischen Gründen (einfache Manipulation Mischproben) alle anderen auf eine desinfizierte Benchtop Verwendung von sterilen Behälter (z.B., Mixer Tassen, Flaschen, Flaschen und Tuben, Transfer Mehrkanalpipette usw.) und sterile Lösungen durchgeführt Antibiotika (Kochsalzlösung, Teichwasser, CBSS) enthalten. Antibiotika werden alle Lösungen als weitere Vorsichtsmaßnahme gegen eingeführte Verkeimung hinzugefügt. Darüber hinaus wird während der Miracidial Isolation und Ernte Schritte (Protokoll Abschnitte 2 und 3), eine kleine Petrischale Abdeckung über den Kolben zur Minimierung von außen Kontamination bei der ersten Entnahme von Schaum/Leber Schutt und anschließende Übertragung der Eröffnung gesetzt geballte Miracidia aus der Flasche zu Röhrchen zentrifugieren.

In der Regel ernten wir Miracidia aus 20 infizierte Maus Lebern in einem einzelnen Batch, aus denen wir Larven Ausbeuten von etwa 5000 Larven pro Leber schätzen. Erträge können jedoch abhängig von der Intensität der Infektion von einzelnen Mäusen was in Charge zu Charge Variation in Miracidial Erholungsphasen erheblich variieren. Isolationen kann mit weniger Start Lebern durchgeführt werden, obwohl die Methode, die wir beschrieben haben in der Regel gilt für 10-20 Lebern. Wenn 20 Leber verarbeitet werden, nach der endgültigen Wiederfreisetzung der Leber Pellets in sterilem Teichwasser (Protokoll Abschnitt 2, Schritt 2.7), sollte die Suspensionen in zwei 1000-mL-Fläschchen (2 Flaschen/Kolben) gleichmäßig verteilt werden. Wenn 10 Leber oder weniger verwendet werden, die ursprünglichen Leber Homogenates (Protokoll Abschnitt 2, Schritt 2.3) können auf 2 Flaschen verteilt werden und gewaschen Suspensionen, die dann in einem einzigen volumetrischen Kolben zur Weiterverarbeitung übertragen. 1 oder 2 Lebern auch verarbeitet werden können, aber Mengen (Volumen) der Extraktion, waschen und Schraffur Lösungen proportional reduziert werden sollte, mit Finale gewaschen Sediment im Teichwasser übertragen in ein 10 mL Folie abgedeckt volumetrischen Kolben zu konzentrieren Miracidia.

Um Miracidial Erträge mit einem Minimum an Leber Schutt Kontamination zu maximieren, ist es auch wichtig, den Teich Wasser wäscht (Protokoll Abschnitt 2, Schritte 2,7-2,9) so schnell und effizient wie möglich durchzuführen. Sobald Eiern Teichwasser ausgesetzt sind, tritt Miracidial schlüpfen bald danach, obwohl beginnt die Zeit, bevor die Larven aussehen auf die Lichtquelle in den Hals der Flasche von 5-20 min nach dem Schlupf variieren kann. Um Verlust von Parasiten bei der Teich Wasserreinigung zu begrenzen waschen Schritte ist es entscheidend für jede Teichwasser eine Sichtkontrolle für früh ankommende Miracidia in die obere Wasserschicht der Hals der Flasche. Darüber hinaus einmal Miracidia werden in 15 mL Röhrchen überführt und sind auf Eis gelegt, sie schwimmen Aktivität einzustellen und auf den Rohrboden zu begleichen. Jedoch nach der Zentrifugierung, pellet-Larven (Abschnitt 3, Schritte 3.4-3.5), beginnt Miracidia wieder zu schwimmen, wenn Wasser erlaubt ist zu warm. Daher ist es wichtig, das Teichwasser schnell, aber ohne zu stören das Pellet oder Pipettieren schwimmen Parasiten zu entfernen.

Wie bereits erwähnt, Renditen von isolierten Miracidia können je nach der Anzahl der Erwachsenen Wurm-Paare, die in den einzelnen Mäusen (Infektion Intensität) und Konsistenz der Erstinfektion Protokolle. Miracidia sind stark phototrop und die Mehrheit (80-90 %) konzentriert sich auf die Lichtquelle über die Zeit der ersten Ernte. Die restliche 10-20 % der Miracidia wird weiterhin schlüpfen und mehr sammeln sich langsam während der zweiten Ernteperiode. Die meisten (> 95 %) Miracidia in Kultur eingeführt und auf 26 oC in CBSS + Medium gehalten wird zum primären Sporocysts innerhalb 24-48 h nach Anbau verwandelt haben. Zu diesem Zeitpunkt in der Regel Larven Lebensfähigkeit ist > 90 %. Nach 4 Tagen in CBSS + allein Rentabilität sinkt erheblich (70-80 %). Das Kulturmedium von CBSS + Bge mittlere 24 h nach der kompletten Umstellung führt jedoch erste CBSS Anbau in höheren Überlebensraten und robusteres Wachstum. Wir pflegen regelmäßig kurzfristige Sporocyst Kulturen inklusieve Bedingungen. Sporocysts sind jedoch sehr empfindlich, Sauerstoffgehalt und vor allem reaktive Sauerstoffspezies, die schädlichen oxidativen Schaden7zufügen können. C.j. Bayne4 und andere haben berichtet, dass die allgemeine Gesundheit und Lebensfähigkeit des Sporocysts in Vitro erheblich verbessert werden, wenn Kulturen unter hypoxischen Bedingungen eingehalten werden. Abgesenkter Sauerstoffgehalt können durch Begasung (mit Stickstoff) einzelne verschließbare Fläschchen oder durch Stickstoff-Anreicherung der Gasphase des Inkubators4bezogen werden.

Als die oben genannten Methoden zur axenic Isolierung und Kultivierung von Schistosome wurden Miracidia und Sporocysts zuvor beschrieben. Es wurde schon früh erkannt, dass Miracidial Phototropismus genutzt werden, um zu gewinnen und Larven schwimmen zu konzentrieren und diese isolierten Miracidia könnte schnell immobilisierten Hyperosmotic Salzlösungen (zwischen 120-160 mOs/Kg)8. Es wurde weiter festgestellt, dass primäre Sporocysts, die erste intramolluscan Larvenstadium9,12Wartung in Salzlösungen in der Transformation des Miracidia geführt. Komplexe Medien wurden auch formuliert, um längerfristige in-vitro- Wachstum und Entwicklung von S. Mansoni Sporocyst Stufen9,13,14,15, Zellen zu unterstützen von der Schnecke Host Biomphalaria Glabrata16abgeleitet. Diese Formulierungen verschiedene kommerzielle Medien aufgenommen und wurden mit Aminosäuren, Salze, Lipide, Reduktionsmittel und Zucker ergänzt. Komplette Medien Formulierungen enthalten auch Hitze-inaktivierten fetalen Rind oder Pferd Serum bei verschiedenen Konzentrationen. Wir haben gefunden, dass richtige Hitzeinaktivierung (HI) war entscheidend für Sporocyst überleben und die langfristige Entwicklung in Vitro. Wir gefunden, dass Inkubation von Serum (aufgetaut, 100-mL-Flaschen) in einem 60 oC Wasserbad für 60 min, mit schonendes Mischen alle 10 min für gleichmäßige Erwärmung war am effektivsten. Darüber hinaus testen wir in der Regel mehrere Lose von Serum von einem potenziellen Lieferanten für Larven Kultur Kompatibilität. Schließlich war die Gründung der ersten (und derzeit einzigen) authentische Weichtier-Zelllinie, die B. Glabrata embryonalen (Bge) Zell-Linie von Hansen16 einen großen Durchbruch, die Fortschritte in der Larven Schistosome deutlich erleichtert Anbau-Bemühungen. Miracidia S. Mansoni , isoliert, wenn in Kokultur mit Bge Zellen entwickelt von der Grundschule zu weiterführenden/Tochter Sporocysts17, und schließlich auf die Endphase cercarial18,19. So ist die kontinuierliche in-vitro- Kultivierung der gesamten Schnecke Phase des Lebenszyklus S. Mansoni erreicht worden. Das Bge Zelle Medium in unserem Kultursystem unterstützt Sporocyst Wachstum/Entwicklung und Wartung von der Bge-Zell-Linie.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir beschrieben und ein detailliertes Protokoll für die Masse axenic Isolierung und Kultivierung der Nautiliden Miracidial Bühne von S. Mansonivisuell dargestellt. Diese Miracidia, bei geeigneten Kulturbedingungen sind in der Lage zu aufeinander folgenden primären und sekundären Sporocyst Generationen, und schließlich Cercariae zu entwickeln. Mit der Entwicklung und die ständige Verfeinerung der derzeit verfügbaren Tools für die Manipulation von Genen und gen Ausdruck in Vitro durch transgene, RNA-Interferenz und Genom bearbeiten (z. B. CRISPR/Cas9) Ansätze, es ist vorgesehen, die effizient Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Miracidia von Trematode Artenvielfalt20 weiterhin erforderlich sein, um Materialien für die weitere Förderung der Forschung auf diesem Gebiet zu verschaffen. Diese Methode gut ergänzt ein zuvor beschriebenen Protokoll zur Isolierung und Kultivierung Nautiliden Cercariae von S. Mansoni zur Erleichterung von in-vitro- Transformation zu den Säugetieren Schistosomula Bühne21, für eventuelle Anbau an Ovigerous Erwachsenen Würmer22.

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Disclosures

Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

NIH Grant RO1AI015503 finanziert teilweise. Schistosome-infizierten Mäusen lieferten die NIAID Schistosomiasis Resource Center unter Biomedical Research Institute (Rockville, MD) durch NIH-NIAID Vertrag HHSN272201000005I für den Vertrieb über BEI Ressourcen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

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References

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