基于状的不均匀 Nanopatterns 对局部控制表面粘附的研究--一种直接软骨分化的方法

Bioengineering

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Summary

本文介绍了一种获得基于状的不均匀 nanopatterns 的方法, 该法允许对局部精氨酸-甘氨酸 (RGD) 的表面密度进行纳米控制, 并将其用于细胞黏附和软骨分化的研究。

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Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

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Abstract

细胞黏附和分化的条件是由纳米尺度配置的细胞外基质 (ECM) 成分, 当地浓度有一个主要的影响。在这里, 我们提出了一种方法, 以获得大规模不均匀 nanopatterns 的精氨酸-甘氨酸-天冬酸 (RGD) 官能化状, 允许纳米控制的局部 RGD 表面密度。Nanopatterns 是由不同初始浓度的溶液中的状表面吸附形成的, 其特征是水接触角 (CA)、X 射线光电子能谱 (XPS) 和扫描探针显微镜技术, 如扫描隧道显微镜 (STM) 和原子力显微镜 (AFM)。用 AFM 图像, 利用最小间距离的概率等高线图测量了 RGD 的局部表面密度, 并与细胞黏附反应和分化相关。这里介绍的 nanopatterning 方法是一个简单的过程, 可以以直接的方式扩展到大面积的表面积。因此, 它完全符合细胞培养协议, 并可适用于其他配体, 发挥浓度依赖性的影响细胞。

Introduction

在这里, 我们描述一个简单和通用的状的 nanopatterning 程序, 以获得细胞培养表面, 允许在纳米尺度的局部粘附控制。已报告了 ECM 组织的纳米尺度细节,1,2,3和细胞黏附表面的 nanopatterning 提供了深刻的洞察力的细胞要求与黏附力4, 5。实验使用胶束光刻基 nanopatterns 揭示了阈值约 70 nm 的 RGD 肽 nanospacing, 细胞粘附明显延迟超过此值6,7,8 ,9。这些研究还突出了局部配体密度对细胞黏附力的影响大于9,10,11

在形态发生过程中, 细胞与周围环境的相互作用触发了第一次分化事件, 直到最终形成复杂的组织结构。在这个框架内, nanopatterned 表面被用来解决最初的细胞表面相互作用对形态发生的影响。在β型 Ti-40Nb 合金中横向间距为 68 nm 的光刻基 RGD nanopatterns 有助于维持未分化的干细胞的表型12, 而 RGD 95 和150纳米之间的 nanospacings 则增强了间充质干细胞 (MSCs) 向脂/成骨13,14,15和软骨命运16。此外, 通过向信号元件修饰的自组装大分子, 可以通过提供信号提示的纳米结构调节来指示细胞的黏附力和分化程度17。在这方面, 状的沉积与细胞相互作用的基在他们的外球面18,19,20到表面已经被用来研究细胞黏附力21,22,形态学23,24和迁移事件25,26。然而, 在这些研究中缺乏表面表征, 使得很难在状表面构型和细胞反应之间建立任何相关性。

在低离子强度的溶液中, 状吸附到低电荷表面时, 可以得到状 nanopatterns 的液样顺序和定距。27在此属性的基础上, 本文给出了一种在低带电表面上获得大尺度不均匀 nanopatterns 的方法, 它允许对局部 RGD 表面密度进行纳米尺度的 RGD 控制。水接触角 (CA), x 射线光电子能谱 (XPS) 和扫描探针显微镜技术 (STM 和 AFM nanopatterns) 表明, 局部配体密度可以调整修改初始状浓度的解决方案。利用最小间距离的概率等高线图, 用 AFM 图像对局部 RGD 表面密度进行量化, 然后与细胞实验相关联。与其他 nanopatterning 技术4相比, 基于状的 nanopatterning 非常简单, 可以很容易地扩展到较大的表面区域, 从而与单元格区域性应用程序完全兼容。Nanopatterns 被用作生物活性基质, 以评估局部 RGD 表面密度对细胞黏附力的影响28和对成人骨髓间充质干细胞的软骨诱导,29。我们的结果表明, RGD 状基 nanopatterns 维持细胞生长, 细胞粘附增强了高局部 RGD 表面密度。在分化实验中, 细胞对基质的中间粘附倾向于 MSC 缩合和早期软骨分化。由于容易与状外周组可以修改, 这里所描述的方法可以进一步扩展到其他 ECM 配体, 发挥浓度依赖性的影响细胞。

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Protocol

1. 承印物的制备

  1. 在云母基底上退火 1.4 x 1.1 cm Au (111)。
    1. 将 Au (111) 衬底放在玻璃陶瓷滚刀上, 用丁烷火焰将其退火3分钟, 使基板在氩气气氛下冷却。对每个 Au (111) 衬底重复此步骤。
      注: 退火后应立即使用 Au (111) 衬底。
  2. 制备聚 (l-乳酸) (PLLA) 涂层玻璃基板。
    1. 切下并冲洗玻璃片。
      1. 切割显微镜幻灯片18幻灯片 1.25 cm x 1.25 cm 与钻石尖端刀具。在每张幻灯片的下部都做一个小的缩进, 这样可以使上、下侧的区别。
      2. 用去离子水彻底冲洗幻灯片, 然后用96% 乙醇。让他们晾干。
    2. 准备 2% PLLA 解决方案。
      1. 在压力管中加入200毫克的 PLLA 至10毫升的 14-二。加入搅拌杆, 把管子紧紧地关上。
      2. 将压力管置于60° c 下的热板上的甘油浴中, 在温和搅拌下24小时, 然后将溶液转移到一个15毫升的玻璃瓶中。
    3. 用 PLLA 溶液涂覆玻片。
      1. 在60° c 的清洁热板上放置玻璃滑块和 PLLA 液瓶。确保将幻灯片朝上放置, 使其保持至少10分钟以达到所需的温度。
      2. 准备旋转涂布机并设置表 1中指定的程序。
      3. 将一张幻灯片放在旋转涂布机上, 使用真空系统。用巴斯德吸管, 应用0.25 毫升的 PLLA 溶液的幻灯片, 确保整个表面覆盖。运行涂层程序。对每张幻灯片重复此步骤。

2. 状 Nanopatterning

  1. 准备 RGD 功能化的状 (RGD-Cys-D1) 28解决方案。
    1. 在6.494 毫升去离子水中溶解5毫克的状。这是解决方案 A。
      注: 在准备6月内使用状库存解决方案。
    2. 几种解决方案 A 为10分钟, 并准备解决方案 B 和 C 下面的表 2
    3. 几种解决方案 C 为10分钟, 并准备解决方案 D、E 和 F 下面的表 2
    4. 存储解决方案 B, c, D, E 和 F 在4° c, 直到使用。溶液 A 可贮存在-20 ° c 以备以后使用。
  2. RGD-Cys-D1 状在基板上的 Nanopatterning
    1. 在组织培养罩中, 通过紫外线照射13分钟, 对基底进行消毒。
      注意: 只有当 nanopatterned 基板被用作细胞培养基时, 这一步才需要。在这种情况下, 保持无菌条件 (组织培养罩, 无菌材料, 解决方案和技术), 为以下步骤。
    2. 将每个基板正面放在一个盘子的井里, 用镊子小心地处理它们。
    3. 几种解决方案 B、C、D、E 和 F 为10分钟。
    4. 通过 RGD-Cys-D1 状解决方案通过一个 0.22-µm 直径过滤器直接在含基板 (2 毫升/井) 的井中使用注射器。建议每状浓度至少三副本。关闭和密封板, 并留在室温 (RT) 为16小时。
    5. 删除并丢弃解决方案。用无菌去离子水冲洗基材, 晾干。在4° c 贮存基板。
      注意: 协议可以在此处暂停。

3. 控制基板的制备

注意: 所有的步骤都是在无菌组织培养罩中进行的, 只使用了无菌材料、溶液和技术。至少使用了六控制基板 (正控制的三副本和负控制的三副本)。

  1. 在组织培养罩中, 通过紫外线照射13分钟, 对基底进行消毒。
  2. 成纤维细胞粘附实验的控制基质。
    1. 采用火焰退火 Au (111) 衬底作为负控制。黄金有一个众所周知的蛋白质变性的作用, 赋予抗细胞粘附性的属性28。几种所有的解决方案和过滤器之前, 基质孵化。
    2. 对于正向控制, 浸入式火焰退火 Au (111) 衬底在 RGD 修饰的 PEG 硫醇, Ac-甘-Arg-甘-asp-asp-NH-乙二醇 mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-peg-SH)30和三甘醇mono-11-mercaptoundecyl 醚 (PEG-SH) 在1:100 摩尔比在96% 乙醇为16小时 RT。
    3. 在乙醇中彻底清洗基体, 并用氩干。在4° c 贮存基板。
  3. 软骨的控制基板。
    1. 使用原始的 PLLA 基底作为负控制。没有任何表面处理, PLLA 显示与活细胞的接口较差。31
    2. 为积极的控制, 准备5毫升的0.1 毫克/毫升纤维连接蛋白在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和孵化每个 PLLA 基板1.6 毫升的纤维连接蛋白溶液1小时 RT。
    3. 去除和丢弃纤维连接蛋白溶液, 并用 PBS 清洗基体。在4° c 贮存基板。

4. 表面表征

  1. AFM 成像
    1. 对粗糙度分析的 PLLA 基底进行 AFM 成像。由于状的直径为 4-5 nm, 因此应获得 1 nm 的粗糙度值, 以便对 nanopatterns 进行适当的可视化。同时, 对 nanopatterns 进行 AFM 成像。在这两种情况下, 执行 AFM 在攻丝模式在空气中。
    2. 选择一个带有弹簧常数 k = 40 N/米和谐振频率ν = 300 赫的硅悬臂, 并将其安装到 AFM 设备上。
    3. 在原子力显微镜的舞台上安装样品。根据设备的设置, 调谐和成像规格可能会有所不同。查阅制造商手册。
    4. 用显微镜的尖端接近样品, 直到接触。
    5. 到图像 PLLA 的粗糙度分析, 选择至少四个代表性的区域20x20 µm 每个基板从三独立的基板。对图像状 nanopatterns, 选择至少三代表性的图像5x5 µm 每个基板从三独立的基板每个条件 (初始状浓度在解决方案)。为避免在成像时损坏状层, 请调整设置点以使力保持最小。
      注: 成像区的选择也取决于压电扫描仪的工作范围。请参阅这方面的文书手册。
    6. 利用 afm 设备制造商的专有软件, 将每条扫描线装配到多项式水准函数中, 对 afm 高度图像进行处理, 并对 PLLA 计算表面粗糙度进行分析。根均方根 (RMS) 分析可以提供一个合适的选择。
  2. 局部 RGD 表面密度测量。
    1. 获取所处理的 AFM 高度图像的图像阈值, 以选择表面上的状。
    2. 使用图像处理软件确定粒子位置, 并使用它们获取最小的间距离 (dmin)。
    3. z中的dmin值绘制到相应的粒子位置, 以获取dmin的概率等值线映射。调整绘图图的颜色比例, 以可视化最高本地 RGD 表面密度的区域 (dmin < 70 nm)。
    4. 使用图像处理软件对具有最高局部 RGD 表面密度的区域进行量化。在计算中包括状聚合的区域。
  3. STM 成像。
    注: STM 成像只能在导电 Au (111) 衬底上进行 nanopatterns。测量是在空气中完成的。
    1. 将 nanopatterned 基板放置在 STM 设备的样品盒中。使用测试仪检查样品和刀柄之间的电气连接。
    2. 蚀刻所选探针材料的尖端 (i. e。Pt 0.8: Ir 0.2), 其直径确保了 STM 设备头部的适当贴合。蚀刻可以通过手工切割或电化学蚀刻进行。32
      注: 电化学蚀刻呈现更对称的尖端。
    3. 将尖端安装在 STM 设备的头部, 并连接样品。
    4. 在反馈通道中设置 "电流" (在这种类型的测量中, 电流将通过反馈调节来保持恒定)。调整的偏置电压和电流设定点和扫描大小, 以获得一个良好的解决图像一旦提示是订婚。
      注: 成像区的选择也取决于压电扫描仪的工作范围。请参阅这方面的文书手册。
    5. 利用 stm 设备制造商的专有软件, 将每条扫描线装配到多项式水准函数中, 处理 stm 地形图像。
  4. CA 测量。
    1. 测量 nanopatterned 基板上的无梗滴法在三不同位置上的三独立基板上的每个条件 (初始状浓度在溶液中) 与光学 ca 系统。
    2. 用去离子水填充微量, 并在 CA 软件中设置参数, 以产生1µL 的水滴。
    3. 将样品放在舞台上, 以便在计算机上清晰地看到样品的表面以进行成像。
    4. 移动注射器与微, 直到它得到接近表面和免除滴到表面上。在液滴稳定后立即记录图像。
      注意: 在 CA 测量中, 控制湿度是非常重要的, 以便获得可重现的结果。
    5. 分析用 ca 设备制造商的专有软件测量的 CAs。拟合方法可根据用户要求进行调整。椭圆拟合方法可以是一个选项。

5. 细胞培养

注意: 所有的步骤都是在组织培养罩中进行的, 只使用了无菌材料、溶液和技术。

  1. 成纤维细胞黏附实验。
    1. 培养 NIH 3T3 小鼠胚胎成纤维细胞从早期通道 (< 10) 在37° c 和 4.6% CO2大气在基介质中, 高葡萄糖补充10% 胎牛血清 (FBS), 1% l-谷氨酰胺, 1% 青霉素-链霉素和1% 钠丙酮酸(生长培养基)。建议在10毫升生长培养基中, 每瓶总播种50万细胞的 T75 烧瓶。
    2. 每2天用10毫升吸管移除旧培养基, 用10毫升新鲜培养基取代。
    3. 培养细胞在生长培养基中, 直到它们到达大约80% 汇合处, 然后去除培养基和增加5毫升的胰蛋白酶每瓶。为了确保适当的细胞脱离底部的烧瓶, 保持与细胞接触的胰蛋白酶溶液5分钟在37° c。
    4. 每瓶增加5毫升培养基, 并在离心管中收集细胞。在 470 x g上离心细胞5分钟, 去除上清液, 在10毫升的生长培养基中重细胞颗粒。使用例确定细胞的浓度。
    5. 将基板转移到不为组织培养 (非附着体) 而处理的好的板块上。
    6. 在生长培养基上以4000细胞/cm2的密度对基板上的细胞进行播种, 并在37° c 和 10% CO2大气中孵育4.5 小时。
  2. 软骨诱导的 MSCs。
    1. 培养人 MSCs 从早期的段落 (< 5) 在37° c 和 4.6% CO2大气在 MSC 成长媒介。建议在10毫升生长培养基中, 每瓶总播种50万细胞的 T75 烧瓶。
    2. 每3天更换培养基 (如5.1.2 中所述)。
    3. 处理细胞在80% 汇合之前被到达, 并且离心和重他们在 MSC 成长媒介 (如描述在 5.1.3)。使用例确定细胞的浓度。
    4. 再次离心的细胞和重他们在10毫升软骨诱导介质。
    5. 将基板从板材转移到未接受组织培养的新井板 (非附着体)。以3000细胞/cm2的密度为基板上的细胞播种。
    6. 每3天更改软骨介质 (如5.1.2 中所述)。

6. 细胞固定和免疫

注意: 以下步骤可在无菌条件下执行。

  1. 取出介质, 用 PBS 轻轻冲洗细胞。通过添加10% 福尔马林溶液为20分钟的 RT 来修复它们。
  2. 取出福尔马林, 用 PBS 清洗细胞。
  3. 通过在 PBS 中添加50毫米氯化铵 (NH4Cl) 溶液, 阻止游离醛基团。在 RT 处保留20分钟的细胞. 去除 NH4Cl 溶液, 用 PBS 冲洗细胞。
    注意: 协议可以在此处暂停。在 PBS 4 ° c 贮存样品。
  4. 在 RT 中加入0.1% 的皂苷溶液 (pbs 中1% 白蛋白), 去除 pbs 和 permeabilize 细胞, 10 分钟. 用 pbs 清洗细胞, 然后将样品转移到新的油井板上。
  5. 在 RT 中, 在阻塞解决方案 (表 3) 中, 用主抗体的溶液孵育细胞, 使其为1小时。然后, 去掉主抗体溶液, 用 PBS 冲洗细胞。
  6. 在 RT 中, 在阻塞解决方案 (表 3) 中孵育具有二次抗体的细胞, 用于1小时。
    注意: 避免光照射。
  7. 去除二次抗体溶液, 用 PBS 和干燥冲洗细胞。
    注意: 协议可以在此处暂停。在4° c 的黑暗中将样品储存在 PBS 中。
  8. 显微镜观察的样品安装: 使用菱形刀尖切割器, 将片切成 1.25 cm x 1.25 厘米. 将50µL 显微镜安装介质放在样品上, 用切割片轻轻地盖住它们。
  9. 将样品转移到一个方便的接收方, 用铝箔盖住, 在4° c 的暗处贮存, 直到观察。

7. 细胞成像和数据分析

注: 对于不透明 Au (111) 和厚 microslide 基材, 必须使用直立显微镜。

  1. 成纤维细胞黏附实验。
    1. 使用装有数码相机和低 (即 10X) 和高 (即 40X) 放大目标的荧光显微镜。在空气中进行测量。
    2. 将样品放在舞台和10X 目标的图像细胞核上, 使用紫外激发、longpass 发射过滤器来可视化赫斯特/DAPI 染色。
    3. 图像细胞骨架和局灶粘连 (FAs) 与40X 目标, 选择显微镜过滤器, 匹配相应的抗体荧光规范。
    4. 对于 FA 量化, 使用图像处理软件将图像转换为8位文件。通过设置阈值, 删除背景并将图像转换为二进制。计算每个样本的至少30图像, 并考虑从1µm2进行 FAs 计算。
  2. 软骨诱导的 MSCs。
    1. 图像细胞凝聚在软骨诱导 (< 5 天) 的初始阶段与一个直立的荧光显微镜配备了数码相机和低 (10X) 放大目标。使用紫外线激发和 longpass 发射过滤器来可视化赫斯特/DAPI 染色。
    2. 要测量凝结水区域, 请使用图像处理软件, 将图像转换为8位文件, 删除背景并选择一个突出显示聚合轮廓的阈值。计算粒子的面积。
    3. 图像 immunostained 样品的 FAs, 细胞骨架肌动蛋白纤维, 和软骨特异性胶原 II 型α 1 (COL2A1) 与垂直共聚焦显微镜在高倍率 (即 40-60X)。以具有代表性的间隔 (1 µm) 收集节。
    4. 要处理堆栈, 请使用图像处理软件。将图像转换为8位文件, 删除背景, 并通过设置阈值使它们成为二进制。每三独立样本的条件下, 至少处理三细胞凝聚。
    5. 将 FA 蛋白染色区从细胞凝聚的基底区量化, 并将其表达为相应的面积百分比除以图像中细胞核的个数。
    6. 为了测量 COL2A1 染色, 使用共焦 z 投影和量化的总和的预测面积 (最大 COL2A1 面积每个样本)。对相应的凝结水区域的面积值进行规范化。

8. 定量逆转录-聚合酶链反应 (qRT PCR) 分析

注意: 为防止核糖核酸污染, 使用一次性的、无菌的塑料制品, 并在处理试剂和 RNA 时佩戴一次性手套。始终使用适当的微生物无菌技术, 并使用适当的净化解决方案, 以消除核糖核酸污染的工作表面和非一次性项目, 如离心机和管。

  1. 分离总 rna 和粉碎它在 rna 干扰。用 dnasei 治疗 RNA 样品, 用 cdna 合成试剂盒将其转化为 cdna。
  2. 使用引物为转录因子SOX9进行 qRT PCR。Beta-2-microglobulin (B2M) 和核糖体蛋白 L13a (RPL13a) 可作为持家基因。
  3. 计算表达式级别, 并对负控制 (PLLA) 进行规范化。

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Representative Results

我们提出了一种 nanopatterning 的方法, 允许在纳米尺度上处理表面附着 (图 1)。RGD-Cys-D1 的化学结构如图 1A所示。状在导电金 (111) 表面进行了图案, 用于高分辨率的 STM 特征。解决方案中的低状浓度 (最高为 10-5% w/w) 呈现的隔离状直径为 4-5 nm (图 1B), 而高度填充的状聚合体在较高浓度 (图 1C) 中形成。AFM 表面表征 (图 1 d-G, 上部行) 表明, RGD-Cys-D1 状的表面分布可以作为初始状浓度在溶液中的函数来调整。在dmin的概率等高线图上, 这将导致表面上不同的局部 RGD 纳米密度 (图 1 d-G, 下一行)。

在细胞培养实验中, 直径约 10 nm 的细胞膜受体整合在状周围识别 RGD 序列。虽然这个序列的八拷贝提供了每状, 只有一个状交互作用每个整合素由于它的大小 (4-5 毫微米由 STM 测量;图 1B)。即, 每个状提供了一个单一的网站, 整合素结合, 从而允许直接相关的状分布 (如在 AFM 图像中所见) 和 RGD 分布可用于细胞黏附。此外, 在可能影响细胞黏附性的不同 nanopattern 构型的 CA 值中, 没有发现明显的变化29。这些特性使状 nanopatterns 在生物相容表面上适合通过调节和研究细胞行为的基底。

细胞黏附力对 nanopatterned Au (111) 在第一 24 h 文化 (图 2A) 和与 MSCs 在 nanopatterned PLLA (图 2B) 被测试了成纤维细胞。在这两种情况下, 为 FA 蛋白蛋白 (大同) 染色的面积百分比随着状浓度的增加而逐渐增大, 局部 RGD 表面密度 (nanopatterned 区域的百分比在 70 nm 阈值以下的dmin有效的细胞黏附;表 4)。对于初始状浓度为 10-2% 的w/w和正控制, 每个单元格中的 "大同" 区域的百分比降低, 与dmin < 70 nm 的 nanopatterned 区域的百分比之间的相关性丢失。

dmin < 70 nm (图 1D-G下一行和表 4) 占用的表面积百分比是一个很好的指示, 表明本地 RGD 表面密度为 nanopatterns 10-5% w/w初始状集中, 但不包括 10-2% w/w, 原因是状聚合。聚合在配体分布方面产生了高度异构的样本, 在 70 nm 阈值 (图 1D下一行和表 4) 下面只有一小部分具有dmin值的曲面。XPS 结果显示, 这些曲面呈现一个全局 RGD 密度, 可与 10-5% w/w-派生 nanopatterns28相媲美。这一观察表明, 在含有状集料的区域内达到最大 RGD 密度, 而dmin < 70 nm 占据的表面积百分比不代表本地 RGD 的表面密度。这个案子

观察到, 正控制 (均匀涂层) 与最大局部 RGD 表面密度没有显示预期增加的细胞粘附可归因于空间位阻效应。这些结果表明, 与细胞培养中常用的均匀表面相比较, RGD nanopatterns 能更有效地维持细胞黏附。因此, 这一发现凸显了局部配体密度的相关性。

在形态发生过程中, 与周围环境的相互作用触发了第一次细胞分化事件, 并将其传播至最终的复合组织结构的建立。为了评价状 nanopatterns 对细胞黏附和分化的影响, 采用软骨诱导的 MSCs 作为模型。在软骨中, 有活性基质重塑, 在软骨形成的不同阶段引导细胞具有指导作用。

MSCs 在 nanopatterns 上接受了软骨 (图 3)。软骨分化开始于细胞凝聚步骤, 这涉及到细胞的招募形成致密凝聚, 建立细胞与细胞的通信, 并伴随变化的细胞形态33图 3A显示, 在所有基板中都发生了细胞凝聚, 并且随着状浓度的增加, 凝析油面积增加了 2.5 x 10-8% w/w凝结水区域再一次降低为状浓度为 10-2% w/w并用于正向控制。细胞凝聚步骤在软骨发生通过活跃细胞移动而不是通过增加细胞增殖34。这种细胞运动的青睐与基板的柔性粘合: 应形成稳定的粘连, 允许牵引力移动细胞体, 同时, 这些粘连应弱到足以让细胞释放从基板期间运动.细胞凝聚的倾向是增加局部 RGD 的表面密度高达 2.5x10-8% w/w-衍生 nanopatterns, 在细胞黏附力和细胞移动之间的良好平衡。对于 10-2和正控制, 局部多元化的表面密度太高, 从而损害了冷凝事件。

软骨分化得益于 prechondrogenic 凝聚: 凝聚体中的细胞变得更加圆润, 开始合成软骨特异标记物, 如 ECM 蛋白 COL2A1 和转录因子 SOX933,34,35. 相应地, 具有中间粘附的基底, 有利于细胞凝聚的形成, 显示出更高的 COL2A1 染色 (图 3B) 和更高的SOX9 mRNA 表达式 (图 3C)。

我们的结果突出了细胞基质相互作用在软骨分化的早期阶段的影响。通过基于状的 nanopatterns, 可以很容易地解决这种交互。

时间 (秒) 转速 (rpm) 加速度 (rpm/秒)
1 5 500 300
2 30 3000 1500

表 1: 微调程序步骤, 用于在准备好的 PLLA 溶液中涂上玻璃幻灯片.第一个均匀化的步使用了在500转每分钟以加速度300转每秒在 5 s. 跟随最后步在3000转每分钟以加速度1500转每秒三十年代。

解决 RGD-Cys-D1 (毫克/毫升) RGD-Cys-D1 (mg) MQ 水 (µL)
一个 0.77 5 6494
RGD-Cys-D1 (% 瓦特/瓦) 解决方案 A (µL)
b 10-2 779 5220
c 10-5 0.78 6000
解决方案 C (µL)
d 25 x 10-8 15。0 5985
e 10-8 6。0 5994
f 4 x 10-9 2。4 5998

表 2:使用的 RGD-Cys-D1 解决方案的准备的详细信息.在0.77 毫克/毫升 (溶液 a) 的最终浓度下制备了 RGD-Cys-D1 状的储存液, 其中溶液 B 和 C 分别为 10-2和 10-5% w/w浓度。解决方案 C 的 10-5% w/w浓度的 RGD-Cys-D1 状被用来准备解决方案 D, E 和 F 在最终浓度的 2.5 x 10-8, 10-8和 4 x 10-9% 瓦特/w, 分别。

名称 卷 (µL) 阻塞缓冲区 (mL)
主要组合 兔单克隆到大同 65 12.870
小鼠单克隆 COL2A1 32。5
二次混合 Alexa 488 山羊抗鼠 13 12.961
Alexa 568 山羊抗兔 13
赫斯特解决方案 13

表 3: 抗体溶液的制备.主要抗体混合物含有单克隆抗体在兔稀释1:200 在阻断溶液中产生的单克隆抗体对 COL2A1 产生的小鼠稀释1:400 在阻断溶液中。二级抗体合剂分别含有细胞细胞核染色赫斯特和山羊对小鼠和家兔产生的二级抗体 (分别用 Alexa 的氟488和568荧光标记)。

Figure 1
图 1: RGD-Cys-D1 状 nanopatterning 对局部 RGD 表面密度的纳米尺度控制。(A) RGD-Cys-D1 状结构, 含有多达八份的细胞粘合剂 RGD 肽。代表性 STM 图像 (偏置 = 200 mV, 设置点 = 0.5 nA) 的 RGD-Cys-D1 nanopatterns 在 Au (111) 从初始水溶液为 10-8% w/w (刻度条 = 3 nm, B) 和在虚线上获得的相应高度距离轮廓在(B)中指示的区域, 并且(C)的 10-2% w/w显示状聚合 (缩放条 = 20 nm)。(D-G)RGD-Cys-D1 nanopatterns 在 PLLA 上的代表性 AFM 图像从相应的状水溶液中获得 10-2%, 2.5 x 10-8%, 10-8% 和 4 x 10-9% w/w, 分别 (比例栏 = 1 µm)。相应的最小间距离 (dmin) 概率等高线图显示在每个 AFM 图像下面, 高密度 RGD 区域显示在深红色 (dmin < 70 nm) 中。状和状聚合物以黑色为清晰的描述。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: RGD-Cys-D1 nanopatterns 上的细胞黏附.在与基体 (左轴) 接触的细胞与初始状浓度时, 每个细胞为 FA 蛋白位点染色的面积百分比的图。将值与本地 RGD 的表面密度 (nanopatterns 中包含dmin值的 70 nm 临界值) (右轴) 的百分比与分配给正数 (+ 控件) 和负值的100和0的百分比进行比较 (-控制) 控制, 分别。(A)继 4.5 h 培养后, 在 Au (111) 上成纤维细胞黏附在状 nanopatterns 上。(B) MSC 粘附在状 nanopatterns 上的 PLLA 评估在1天软骨诱导。以标准差为平均值给出值。请单击此处查看此图的较大版本.

RGD-Cys-D1 (% 瓦特/瓦) 区域 (< dmin = 70 nm) (%) 在 Au (111) 区域 (< dmin = 70 nm) (%) PLLA
10-2 5±1 2±2
10-5 97±2
2,5x10-8 65±11 90±2
10-8 25±16 45±7
4x10-9 18±11

表 4: 占区域的百分比dminAu (111) 和 PLLA 表面上获得的 RGD-Cys-D1 状沉积值低于 70 nm, 作为初始状浓度的函数.

Figure 3
图 3: 软骨 RGD-Cys-D1 nanopatterns 间充质干细胞分化。(A)在软骨诱导5天后, 在 PLLA 上培养的 RGD-Cys-D1 nanopatterns 上的 MSCs 的缩合反应。染色细胞核的代表性荧光图像 (赫斯特;刻度栏 = 300 µm;上部行) 和情节的细胞凝聚区 (下行) 获得的 RGD-Cys-D1 nanopatterns 从不同的初始状浓度。分化得益于细胞凝聚步骤与特定的软骨标记的表达: (B) COL2A1 染色面积的百分比从相应的共焦 z 投影中的单元格凝析区域归一化获得5天后软骨诱导。(C)相对SOX9 mRNA 表达式 (对负控制) 经过3天的软骨诱导。值以(B)(C)中标准偏差的平均值表示。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在所述协议的开发过程中, 应考虑一些关键步骤。第一个是指用扫描探针显微镜技术 nanopattern 表征。为了可视化 nanopatterns, 图案产生的表面必须有一个粗糙值低于状的平均直径, 这是在 4-5 nm 的测量, 由 STM (图 1B)。此外, 应该考虑到高分辨率 STM 成像限制在导电基板, 在这种情况下 Au (111)。在自旋涂层后, 从滑轨的拐角处提升聚合物, 可以使用生物相容胶进行校正。

状 nanopatterning 是在纳米尺度上实现受控局部细胞粘附的过程。基于吸附法对表面状的自组装, 该技术不需要任何复杂的 nanopatterning 设备, 因此与以前描述的基于光刻的方法的对比36,37,38. 状 nanopatterning 可以很容易地扩展到较大的表面积, 并且与细胞培养协议完全兼容。

本文所描述的状 nanopatterning 方法可以在再生医学中找到未来的应用。状 nanopatterning 对细胞粘附的控制使得这种技术适合于植入前的生物材料的调理, 从而促进它们与宿主组织的融合。此外, 状外周基的易变性使状 nanopatterning 适合于在细胞上施加浓度依赖性活动的其他配体。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

作者承认 Oriol 字体巴赫和阿尔伯特 G. 卡洛斯·卡斯塔诺在dmin量化中的帮助。他们也承认先进的数字显微镜单位在生物医学研究所 (IRB 巴塞罗那), 让作者在他们的处所录制的视频。这项工作得到了西班牙网络生物医学研究中心 (CIBER) 的支持。CIBER 是由《国家研究 & 发展 & 计划2008-2011、倡议赫尼奥2010、Consolider 方案、CIBER 行动和干杯第三研究所资助的一项倡议, 并得到欧洲区域开发基金的支持。这项工作得到了大学和创新、大学和加泰罗尼亚自治区加泰罗尼亚的企业的研究委员会 (2014 SGR 1442) 的支持。它还由 OLIGOCODES 项目资助 (No。MAT2012-38573-C02) 和 CTQ2013-41339-P, 由西班牙经济和竞争力部授予, 除了区域 V-西班牙-葡萄牙 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E)。C.R.P. 承认西班牙经济和竞争力部给予的财政支持 (No。IFI15/00151)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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References

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148, (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5, (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27, (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27, (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5, (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85, (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92, (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5, (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10, (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11, (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34, (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9, (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15, (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15, (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20, (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23, (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24, (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115, (1), 96 (2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107, (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73, (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113, (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104, (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7, (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013, (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10, (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76, (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87, (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8, (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102, (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112, (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8, (4), 541-545 (2012).

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