Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic

Bioengineering

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Summary

Un metodo per ottenere nanopatterns irregolare Dendrimero-based che consentono il controllo su scala nanometrica di locale arginina-glicina-aspartico (RGD) superficie densità dell'acido è descritto e applicato per lo studio del differenziamento cellulare adesione e chondrogenic.

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Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

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Abstract

Differenziazione e adesione cellulare è condizionata dalla disposizione su scala nanometrica dei componenti della matrice extracellulare (ECM), con concentrazioni locali avendo un effetto importante. Qui presentiamo un metodo per ottenere nanopatterns su larga scala irregolare di arginina-glicina acido aspartico (RGD)-densità di superficie di dendrimeri funzionalizzati che consentono il controllo su scala nanometrica di RGD locale. Nanopatterns sono costituiti da superficie adsorbimento di dendrimeri da soluzioni a diverse concentrazioni iniziali e sono caratterizzate dall'angolo di contatto di acqua (CA), spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS), e scansione della sonda come tecniche di microscopia scansione microscopio a effetto tunnel (STM) e microscopia a forza atomica (AFM). La densità di superficie locale di RGD viene misurata utilizzando immagini AFM mediante mappe di contorno di probabilità delle distanze minime interparticella e quindi correlato con differenziazione e la risposta di adesione delle cellule. Il metodo nanopatterning presentato qui è una procedura semplice che può essere scalata in modo semplice per grandi superfici. Esso è quindi pienamente compatibile con protocolli della coltura delle cellule e può essere applicato a altri ligandi che esercitano effetti di concentrazione-dipendente sulle cellule.

Introduction

Qui descriviamo una procedura semplice e versatile basato su Dendrimero nanopatterning per ottenere superfici di coltura delle cellule che consentono il controllo del locale adesività su nanoscala. Dettagli su scala nanometrica di organizzazione ECM sono stati segnalati,1,2,3 e il nanopatterning di superfici di adesione delle cellule ha fornito le comprensioni profonde il cellulare delle esigenze legate alla adesione4, 5. Gli esperimenti usando micellare basati su Litografia nanopatterns ha rivelato un valore di soglia di circa 70 nm per RGD peptide nanospacing, adesione delle cellule significativamente in ritardo sopra questo valore6,7,8 ,9. Questi studi hanno evidenziato l'influenza maggiore di locali di densità globale ligando delle cellule adesione9,10,11.

Durante la morfogenesi, interazioni cellula con l'ambiente circostante innescano i primi eventi di differenziazione, che continuano fino a quando sono state formate strutture del tessuto complesso finale. In questo quadro, le superfici nanostrutturati sono state usate per affrontare l'influenza delle interazioni cellula-superficie iniziale sulla morfogenesi. Basato su Litografia RGD nanopatterns con una spaziatura laterale di 68 nm a β-tipo Ti-40Nb leghe aiutano a mantenere il fenotipo indifferenziato di liberi cellule staminali12, mentre RGD nanospacings di fra 95 e 150 nm che permettono di migliorare la differenziazione dei cellule staminali mesenchimali (MSCs) verso adipogenico/osteogeniche13,14,15 e condrogenica destini16. Inoltre, autoassemblanti macromolecole modificate con componenti di segnalazione sono stati indicati per diretta adesione delle cellule e differenziazione fornendo il regolamento architettonica su scala nanometrica delle stecche segnalazione17. A questo proposito, la deposizione di dendrimeri con moiety d'interazione delle cellule nella loro sfera esterna18,19,20 sulle superfici è stata utilizzata per lo studio delle cellule adesione21,22, morfologia23,24e migrazione eventi25,26. Tuttavia, la mancanza di caratterizzazione delle superfici in questi studi rende difficile stabilire alcuna correlazione tra Configurazione superficie Dendrimero e risposta cellulare.

Dendrimero nanopatterns con liquido-come ordine e spaziatura definito possono essere ottenuti quando dendrimeri adsorbono a bassa carica superfici dalle soluzioni con bassa forza ionica. 27 sulla base di questa proprietà, qui vi presentiamo un metodo per ottenere nanopatterns su larga scala irregolare di dendrimeri funzionalizzati RGD su superfici di carica bassa che consentono il controllo su scala nanometrica di densità superficiale RGD locale. Angolo di contatto acqua (CA), spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS) e scansione sonda microscopia tecniche (STM e AFM nanopatterns) Visualizza che densità locale ligando può essere regolato modificando la concentrazione iniziale Dendrimero in soluzione. La densità di superficie RGD locale è quantificata da immagini AFM di contorno mappe di probabilità di distanze minime interparticella e quindi correlata con esperimenti cellulari. Confrontato con altre tecniche di nanopatterning4, basato su Dendrimero nanopatterning è semplice e può essere facilmente scalato per grandi superfici, essendo così completamente compatibile con applicazioni della coltura delle cellule. Nanopatterns vengono utilizzati come substrati bioattivi per valutare l'effetto della densità superficiale di RGD locale su cellula adesione28 e sull'induzione condrogenica di adulto umano MSCs29. I nostri risultati indicano che RGD basati su Dendrimero nanopatterns sostenere la crescita delle cellule e che adesione delle cellule è rinforzata da alta densità di superficie RGD locale. Negli esperimenti di differenziazione, intermedio adesività delle cellule ai substrati favorito MSC condensa e differenziazione condrogenica iniziale. A causa della facilità con cui Dendrimero gruppi periferici possono essere modificati, il metodo qui descritto può essere ulteriormente esteso per altri ligandi di ECM che esercitano effetti di concentrazione-dipendente sulle cellule.

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Protocol

1. preparazione del substrato

  1. Ricottura 1.4 x 1.1 cm au (111) su substrati di Mica.
    1. Posizionare il substrato au (111) su un piano di cottura di vetroceramica e temprare con una fiamma butano per 3 min Consenti il substrato per raffreddare sotto un'atmosfera di argon. Ripetere questo passaggio per ogni substrato au (111).
      Nota: Substrati di au (111) devono essere utilizzati immediatamente dopo la ricottura.
  2. Preparazione di poli (acido L-lattico) (PLLA)-rivestito substrati di vetro.
    1. Tagliare e lavare i vetrini.
      1. Tagliare le diapositive di microscopia in 18 scivoli di 1,25 x 1,25 cm con una fresa a punta di diamante. Fare una piccola rientranza sul lato inferiore di ogni diapositiva, in modo che i lati superiori e inferiori si possono distinguere più tardi.
      2. Lavare i vetrini con acqua deionizzata seguita da etanolo al 96%. Lasciarli asciugare all'aria.
    2. Preparare la soluzione PLLA 2%.
      1. Aggiungere 200 mg di PLLA a 10 mL di 1,4-diossano in un tubo di pressione. Aggiungere una barra per l'agitazione e chiudere saldamente la provetta.
      2. Posizionare il tubo di pressione in un bagno di glicerina su una piastra calda a 60 ° C sotto agitazione delicata per 24 h e quindi trasferire la soluzione in un flaconcino di vetro da 15 mL.
    3. Rivestimento i vetrini con la soluzione PLLA.
      1. Posizionare i vetrini e il flaconcino con la soluzione PLLA su una piastra calda pulita a 60 ° C. Assicurarsi di inserire le diapositive rivolta verso l'alto e consentire loro di rimanere per almeno 10 minuti per raggiungere la temperatura necessaria.
      2. Preparare la spalmatrice di spin e impostare il programma specificato nella tabella 1.
      3. Posizionare una delle diapositive a faccia in sulla SPALMATRICE di spin, utilizzando un sistema di vuoto. Con una pipetta Pasteur, applicare 0,25 mL di soluzione di PLLA alla diapositiva, assicurandosi che l'intera superficie è coperta. Eseguire il programma di rivestimento. Ripetere questo passaggio per ogni diapositiva.

2. Dendrimero Nanopatterning

  1. Preparazione delle soluzioni di 28 Dendrimero RGD-funzionalizzate (RGD-Cys-D1).
    1. Sciogliere 5 mg di Dendrimero in 6,494 mL di acqua deionizzata. Questa è la soluzione A.
      Nota: Utilizzare la soluzione di riserva Dendrimero entro 6 mesi di preparazione.
    2. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione A per 10 min e preparare soluzioni B e C seguente tabella 2.
    3. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione C per 10 min e preparare soluzioni D, E e F seguente tabella 2.
    4. Conservare soluzioni B, C, D, E e F a 4 ° C fino all'utilizzo. Soluzione A possa essere conservata a-20 ° C per un uso successivo.
  2. Nanopatterning di RGD-Cys-D1 dendrimeri sui substrati
    1. In una cappa di coltura del tessuto, sterilizzare i substrati da loro irradiazione con luce UV per 13 min.
      Nota: Questo passaggio è necessario solo quando i substrati nanostrutturati stanno per essere utilizzati come substrati di coltura delle cellule. In questo caso, mantenere le condizioni di sterilità (cappa di coltura di tessuti, materiali sterili, soluzioni e tecniche) per le seguenti operazioni.
    2. Posizionare ogni substrato scoperte nei pozzetti di una piastra, gestirli attentamente con le pinzette.
    3. Sonicare soluzioni B, C, D, E e F per 10 min.
    4. Passare le soluzioni Dendrimero RGD-Cys-D1 attraverso un filtro di diametro 0,22 µm utilizzando una siringa direttamente nei pozzetti contenenti substrati (2 mL/pozzetto). Almeno tre repliche per concentrazione Dendrimero sono raccomandate. Chiudere e sigillare la piastra e lasciarlo a temperatura ambiente (TA) per 16 h.
    5. Rimuovere e scartare le soluzioni. Lavare i substrati con acqua deionizzata sterile e asciugare. Substrati di negozio a 4 ° C.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. preparazione di substrati di controllo

Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti in un cappuccio sterili per coltura e solo materiali sterili, soluzioni e tecniche sono state usate. Almeno, sei di controllo substrati sono state usate (tre repliche del controllo positivo) e tre repliche del controllo negativo.

  1. In una cappa di coltura del tessuto, sterilizzare i substrati da loro irradiazione con luce UV per 13 min.
  2. Substrati di controllo per l'esperimento di aderenza del fibroblasto.
    1. Utilizzare substrati di fiamma-ricotto au (111) come controllo negativo. L'oro ha un effetto ben noto di denaturazione proteica che conferisce proprietà adesive delle anti-cellule28. Sottoporre ad ultrasuoni tutte le soluzioni e filtrare prima dell'incubazione del substrato.
    2. Per i controlli positivi, immergere fiamma-ricotto di substrati di au (111) in una soluzione di PEG RGD-modificato del tiolo, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glicole mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH):30 e trietilene glicole mono-11-mercaptoundecyl etere (PEG-SH) a un rapporto molare 1: 100 in etanolo al 96% per 16 h a TA.
    3. Lavare accuratamente substrati in etanolo e asciugarle con argon. Substrati di negozio a 4 ° C.
  3. Controllo substrati Chondrogenesis.
    1. Utilizzare substrati PLLA incontaminate come controllo negativo. Senza alcun trattamento superficiale, PLLA dimostra scarsa interfacciamento con le cellule viventi. 31
    2. Per i controlli positivi, preparare 5 mL di fibronectin di 0,1 mg/mL in tampone fosfato salino (PBS) e incubare ogni substrato PLLA con 1,6 mL della soluzione di fibronectina per 1 h a TA.
    3. Rimuovere e scartare la soluzione di fibronectina e lavare i substrati con PBS. Substrati di negozio a 4 ° C.

4. superficie caratterizzazione

  1. Formazione immagine AFM
    1. Eseguire formazione immagine AFM di substrati PLLA per un'analisi di rugosità. Poiché dendrimeri hanno un diametro di 4-5 nm, valori di rugosità di 1 nm dovrebbe essere ottenuta per la corretta visualizzazione della nanopatterns. Inoltre, eseguire formazione immagine AFM della nanopatterns. In entrambi i casi, è necessario eseguire AFM in modalità in aria a intermittenza.
    2. Selezionare un cantilever di silicio con una molla di costante k = 40 N/m e una frequenza di risonanza ν = 300 kHz e montarlo sull'apparecchiatura AFM.
    3. Inserire il campione sul palco del microscopio a forza atomica. A seconda della configurazione dell'apparato, tuning e specifiche possono variare. Consultare il manuale del produttore.
    4. Approccio il campione con la punta del microscopio fino al contatto.
    5. Per realizzare l'immagine PLLA per analisi di rugosità, è necessario selezionare almeno quattro aree rappresentative di 20x20 µm al substrato da tre substrati indipendente. Dendrimero nanopatterns di immagine, scegliere almeno tre immagini rappresentative di 5 × 5 µm al substrato da tre substrati indipendenti a condizione (Dendrimero iniziale concentrazione in soluzione). Per evitare di danneggiare il layer Dendrimero durante la formazione immagine, regolare il set point per mantenere la forza al minimo.
      Nota: La scelta dell'area di imaging dipende anche il campo di lavoro dello scanner piezoelettrico. A questo proposito si prega di consultare il manuale dello strumento.
    6. Processo l'altezza AFM immagini inserendo ogni scansione riga per polinomio livellamento funzioni utilizzando il software proprietario del produttore dell'apparato AFM e analizzare quelli da PLLA per calcolare la rugosità superficiale. Root-mean square (RMS) analisi può fornire un'opzione adatta.
  2. Misura di densità superficiale di RGD locale.
    1. Ottenere le soglie di immagine delle immagini elaborate di altezza AFM per selezionare i dendrimeri sulla superficie.
    2. Determinare le posizioni delle particelle utilizzando una software di elaborazione di immagini e li usa per ottenere le distanze minime interparticella (dmin).
    3. Stampa valorimin da z per le posizioni di particella corrispondente per ottenere le mappe di contorno di probabilità per dmin. Regolare la scala di colore della trama per visualizzare le regioni di più alta densità superficiale per locale RGD (dmin < 70 nm).
    4. Quantificare l'area delle regioni con la più alta densità superficiale locale RGD utilizzando una software di elaborazione di immagini. Includono le zone di Dendrimero aggregati nel calcolo.
  3. Imaging di STM.
    Nota: la formazione immagine STM può essere eseguita solo per nanopatterns su substrati conduttivi di au (111). Misurazioni sono fatte in aria.
    1. Posto il substrato nanostrutturati in supporto del campione dell'apparecchiatura STM. Controllare il collegamento elettrico tra campione e titolare con un tester.
    2. Etch un suggerimento del materiale selezionato sonda (vale a dire. PT 0,8: Ir 0,2) con un diametro che assicura il corretto montaggio sulla testa dell'apparecchiatura STM. Acquaforte può essere eseguita mediante taglio manuale o incisione elettrochimica. 32
      Nota: Acquaforte elettrochimica rende più punte simmetriche.
    3. Montare la punta alla testa dell'apparecchiatura STM e collegare il campione.
    4. Impostare "corrente" nel canale di feedback (in questo tipo di misurazione, attuale sarà costante di feedback tuning). Regolare la tensione di polarizzazione e punto impostato corrente e dimensioni di scansione per ottenere un'immagine ben risolta una volta che la punta è impegnata.
      Nota: La scelta dell'area di imaging dipende anche il campo di lavoro dello scanner piezoelettrico. A questo proposito si prega di consultare il manuale dello strumento.
    5. Processo le immagini topografiche STM inserendo ogni linea di scansione a livellare la polinomiale funzioni usando il software proprietario del produttore dell'apparato STM.
  4. Misure di CA.
    1. Misura CA sui substrati nanostrutturati mediante il metodo sessile-goccia tre diverse posizioni su tre substrati indipendenti a condizione (Dendrimero iniziale concentrazione in soluzione) con un sistema ottico di CA.
    2. Riempire la microsiringa con acqua deionizzata e impostare i parametri del software di CA per produrre gocce di 1 µ l.
    3. Posizionare il campione sul palco in modo che la superficie del campione è chiaramente visibile sul computer per l'imaging.
    4. Spostare la siringa con il micromanipolatore, fino a quando si arriva vicino alla superficie e versare la goccia sulla superficie. Registrare l'immagine immediatamente dopo la stabilizzazione della gocciolina.
      Nota: Nelle misurazioni di CA, è molto importante controllare l'umidità al fine di ottenere risultati riproducibili.
    5. Analizzare il CAs misurato con il software proprietario del produttore dell'apparato di CA. Il metodo di montaggio può essere regolato ai requisiti utente. Il metodo di montaggio ellittica può essere un'opzione.

5. coltura cellulare

Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti in una cappa di coltura del tessuto e solo materiali sterili, soluzioni e tecniche sono state usate.

  1. Esperimento di aderenza del fibroblasto.
    1. Cultura di fibroblasti embrionali del mouse di NIH 3T3 dai primi passaggi (< 10) a 37 ° C e atmosfera al 4,6% CO2 in sostanza basale con alto glucosio completato con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, piruvato di sodio di penicillina-streptomicina e l'1% 1% (crescita medio). T75 boccette per una semina totale di 500.000 cellule per fiaschetta in 10 mL di terreno di coltura sono raccomandati.
    2. Rimuovere il vecchio mezzo con una pipetta 10ml ogni 2 giorni e sostituire con 10 mL di terreno di coltura preparati al momento.
    3. Cellule di cultura nel mezzo di crescita fino a raggiungere intorno 80% confluenza, quindi rimuovere il mezzo e aggiungere 5 mL di tripsina per fiaschetta. Per garantire la separazione adeguata delle cellule dal fondo del matraccio, mantenere la soluzione di tripsina in contatto con le cellule per 5 min a 37 ° C.
    4. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura per fiaschetta e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga. Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura. Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro.
    5. Trasferire i substrati per bene le piastre non trattati per coltura tissutale (antiaderente).
    6. Le cellule sui substrati ad una densità di 4.000 cellule/cm2 a crescita medio di semi e li Incubare per 4,5 h a 37 ° C e 10% di CO2 in atmosfera.
  2. Induzione condrogenica delle MSC.
    1. MSCs umano dai primi passaggi della coltura (< 5) a 37 ° C e del 4,6% CO2 in atmosfera nel mezzo di crescita di MSC. T75 boccette per una semina totale di 500.000 cellule per fiaschetta in 10 mL di terreno di coltura sono raccomandati.
    2. Sostituire il terreno ogni 3 giorni (come descritto in 5.1.2).
    3. Tripsinizzano cellule prima 80% confluenza è raggiunto e centrifugare e risospendere li in mezzo di sviluppo di MSC (come descritto in 5.1.3). Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro.
    4. Centrifugare le cellule ancora e li risospendere in 10 mL di terreno che inducono chondrogenesis.
    5. Trasferire i substrati dalle piastre nuove piastre a pozzetti non trattate per coltura tissutale (antiaderente). Seme le cellule sui substrati ad una densità di 3.000 cellule/cm2.
    6. Modificare il mezzo condrogenica ogni 3 giorni (come descritto in 5.1.2).

6. fissaggio e Immunostaining delle cellule

Nota: La seguente procedura può essere eseguita in condizioni non sterili.

  1. Rimuovere il supporto e lavare le cellule delicatamente con PBS. Correggerli aggiungendo una soluzione di formalina al 10% per 20 min a TA.
  2. Rimuovere la formalina e lavare le cellule con PBS.
  3. Bloccare i gruppi di aldeide gratis aggiungendo una soluzione di 50 mM di cloruro di ammonio (NH4Cl) in PBS. Lasciare le cellule per 20 min a RT. rimuovere NH4Cl soluzione e lavare le cellule con PBS.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C.
  4. Rimuovere PBS e permeabilize le cellule aggiungendo una soluzione di 0,1% di saponina nella soluzione bloccante (1% di albumina in PBS) per 10 min al RT. Wash le cellule con PBS e trasferire campioni per una nuova piastra bene.
  5. Incubare le cellule con una soluzione di anticorpi primari nella soluzione bloccante (tabella 3) per 1 h a TA. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, quindi lavare le cellule con PBS.
  6. Incubare le cellule con anticorpi secondari nella soluzione bloccante (tabella 3) per 1 h a TA.
    Nota: Evitare di luce dell'esposizione.
  7. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le cellule con PBS e asciugare.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C al buio.
  8. Montaggio del campione per l'osservazione del microscopio: utilizzando una fresa a punta di diamante, lamelle tagliate a 1,25 cm x 1,25 cm. applicare 50 µ l di microscopia mezzo su campioni di montaggio e coprire delicatamente con il coprioggetto taglio.
  9. Trasferire i campioni a un destinatario conveniente, coprire con foglio di alluminio e negozio al buio a 4 ° C fino a osservazione.

7. cell Imaging e l'analisi di dati

Nota: Per opaco au (111) e substrati spessi basati su 2mpx, deve essere utilizzato un microscopio dritto.

  1. Esperimento di aderenza del fibroblasto.
    1. Uso di un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera digitale, basso (cioè 10 X) e alto (cioè 40 X) ingrandimento obiettivi. Effettuare misurazioni in aria.
    2. Posizionare il campione sui nuclei delle cellule palcoscenico e immagine con l'obiettivo 10x utilizzando un'eccitazione ultravioletta, filtro di emissione longpass per visualizzare la macchia di Hoechst/DAPI.
    3. Immagine cella citoscheletro e adesioni focali (FAs) con l'obiettivo 40x, selezionando il filtro di microscopio che corrisponde alle specifiche di fluorocromo anticorpo corrispondente.
    4. Per la quantificazione di FA, utilizzare una software di elaborazione di immagini per convertire immagini in file a 8 bit. Rimuovere le immagini di sfondo e convertire in binario impostando una soglia. Calcolare almeno 30 immagini al campione e considera FAs da 1 µm2 per il calcolo.
  2. Induzione condrogenica delle MSC.
    1. Condensati di cella di immagine alle fasi iniziali della induzione condrogenica (< 5 giorni) con un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una fotocamera digitale e una bassa (cioè 10 X) obiettivo di ingrandimento. Filtro di emissione ultravioletto di eccitazione e longpass consente di visualizzare la macchia di Hoechst/DAPI.
    2. Per misurare la superficie di condensa, utilizzare un software di elaborazione dell'immagine, convertire immagini in file a 8 bit, rimuovere lo sfondo e selezionare una soglia che mette in evidenza il contorno di aggregato. Calcolare l'area delle particelle.
    3. Immagini di esempio immunostained per FAs, fibre di actina del citoscheletro e cartilagine specifico collagene tipo II alfa 1 (COL2A1) con un microscopio confocale dritto ad alto ingrandimento (cioè 40-60 X). Raccogliere le sezioni a intervalli rappresentativo (cioè 0,5 – 1 µm).
    4. Per elaborare lo stack, utilizzare una software di elaborazione di immagini. Convertire immagini in file a 8 bit, rimuovere lo sfondo e renderli binario impostando una soglia. Trattare un minimo di tre condensati di cella a condizione di tre campioni indipendenti.
    5. Quantificare la proteina FA tinto aree dalla zona basale dei condensati di cella e di esprimere come la corrispondente percentuale di area divisa per il numero dei nuclei delle cellule nell'immagine.
    6. Per misurare la macchiatura COL2A1, utilizzare confocale z-proiezioni e quantificare la somma dell'area proiettata (con una superficie massima di COL2A1 per campione). Normalizzare il valore dell'area ottenuto contro la zona della condensa corrispondente.

8. quantitativa analisi di reazione a catena (qRT-PCR) della trascrizione-polimerasi inversa

Nota: Per evitare la contaminazione di RNasi, utilizzare oggetti in plastica monouso, sterile e indossare guanti monouso durante la manipolazione di reagenti e RNA. Sempre utilizzare tecniche asettiche microbiologici adeguate e una soluzione appropriata decontaminazione per rimuovere la contaminazione RNasi da superfici di lavoro e gli elementi riutilizzabili come centrifughe e pipette.

  1. Isolare il RNA totale e si polverizzare in un disgregatore di RNA. Trattare i campioni di RNA con DNasi e convertirli in cDNA usando un kit di sintesi di cDNA.
  2. Condurre qRT-PCR utilizzando primers per il fattore di trascrizione SOX9. Beta-2-microglobulina (B2M) e proteina ribosomale L13a (RPL13a) può essere utilizzato come geni housekeeping.
  3. Calcolare i livelli di espressione e normalizzarli contro il controllo negativo (PLLA).

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Representative Results

Presentiamo un metodo nanopatterning che permette adesività superficiale essere affrontati su scala nanometrica (Figura 1). La struttura chimica del RGD-Cys-D1 è mostrata in Figura 1A. Dendrimeri sono stati modellati su superfici conduttive elettriche di au (111) per caratterizzazione di STM ad alta risoluzione. Dendrimero basse concentrazioni in soluzione (fino a 10-5% w/w) resi dendrimeri isolato di 4-5 nm di diametro (Figura 1B), mentre gli aggregati altamente imballato Dendrimero formata alle più alte concentrazioni (Figura 1). Caratterizzazione della superficie AFM (Figure 1 D-G, fila superiore) ha rivelato che la distribuzione superficiale dei dendrimeri RGD-Cys-D1 può essere regolata in funzione della concentrazione iniziale Dendrimero in soluzione. Sulle mappe di contorno di probabilità per dmin, in questo modo diverse densità di nanoscala RGD locale sulla superficie (Figure 1 D-G, fila inferiore).

In esperimenti della coltura cellulare, le integrine di recettore di membrana cellulare di circa 10 nm di diametro riconosciuto la sequenza RGD alla periferia di dendrimeri. Anche se otto copie di questa sequenza sono state fornite al dendrimero, sola Dendrimero interagito per integrina grazie alle sue dimensioni (4-5 nm misurati da STM; Figura 1B). Vale a dire ogni Dendrimero fornito un unico sito per l'associazione di integrina, quindi consentendo una correlazione diretta da Dendrimero distribuzione (come si vede nelle immagini AFM) e la distribuzione di RGD disponibile per adesione delle cellule. Inoltre, nessuna variazione significativa è stata trovata nei valori CA ottenuti per le configurazioni di GNSM differenti che possono influenzare la cellula adesione29. Queste caratteristiche rendono Dendrimero nanopatterns su superfici biocompatibili adatti substrati attraverso cui modulano e studiano il comportamento delle cellule.

Adesione delle cellule alla nanostrutturata au (111) è stato testato con i fibroblasti entro le prime 24 ore di cultura (Figura 2A) e con MSCs su nanostrutturati PLLA (Figura 2B). In entrambi i casi, la percentuale di area macchiato per la paxillina di proteina FA (pax) è aumentato progressivamente con concentrazione Dendrimero, come ha fatto la densità superficiale locale RGD (la percentuale di area nanostrutturati con dmin sotto la soglia di 70 nm per adesione cellulare efficiente; Tabella 4). Per una concentrazione di Dendrimero iniziale di 10-2% w/w e controlli positivi, la percentuale di area macchiata per pax per cella è diminuito e la correlazione con la percentuale di superficie nanostrutturata con dmin < 70 nm è stato persa.

La percentuale della superficie occupata da dmin < 70 nm (Figura 1-G fila inferiore e tabella 4) è una buona indicazione della densità superficiale di RGD locale per nanopatterns fino a 10-5% w/w iniziale Dendrimero concentrazione, ma non di quelli fino a 10 %-2 w/w, a causa di Dendrimero aggregazione. Aggregazione prodotto campioni altamente eterogenei in termini di distribuzione di ligando, con solo una piccola percentuale della superficie con valorimin dsotto la soglia di 70 nm (riga inferioreFigura 1 e tabella 4). XPS risultati hanno mostrato che queste superfici presentano una densità RGD globale paragonabile a 10-5% w/w-derivato nanopatterns28. Questa osservazione indica che la densità massima di RGD è stato raggiunto nelle regioni contenenti Dendrimero aggregati e che la percentuale della superficie occupata da dmin < 70 nm non è rappresentativa della densità superficiale di RGD locale in questo caso.

L'osservazione che controlli positivi (rivestimenti omogenei) con densità massima di superficie RGD locale non hanno mostrato l'aumento previsto nell'adesione delle cellule può essere attribuito ad un effetto sterico. Questi risultati indicano che, rispetto alle superfici omogenee corrispondenti comunemente utilizzate nella coltura cellulare, RGD nanopatterns sostenere adesione delle cellule in modo più efficiente. Questa individuazione così evidenzia la rilevanza della densità locale ligando.

Interazioni con l'ambiente circostante nella morfogenesi innescano i primi eventi di differenziazione cellulare e propagano fino alla costituzione di strutture del tessuto complesso finale. Per valutare gli effetti di Dendrimero nanopatterns su adesione delle cellule e differenziazione, abbiamo usato l'induzione condrogenica delle MSC come un modello. Durante Condrogenesi, c'è rimodellamento della matrice attiva, che svolge un ruolo istruttivo nel dirigere le cellule attraverso le varie fasi di formazione della cartilagine.

MSCs ha subito chondrogenesis il nanopatterns (Figura 3). Differenziazione chondrogenic inizia con un passo di condensazione delle cellule, che prevede il reclutamento di cellule per formare condensati dense, l'istituzione di comunicazione cellula-cellula e concomitanti cambiamenti in cellule morfologia33. Figura 3A spettacoli che condensa delle cellule si è verificata in tutti i sottofondi e quello condensati aumentato nell'area con concentrazioni crescenti di Dendrimero fino a 2,5 x 10-8% w/w quindi la zona di condensa è diminuita ancora per un dendrimero concentrazione di 10-2% w/w e per il controllo positivo. Il passo di condensazione delle cellule in chondrogenesis avviene attraverso il movimento di cella attiva piuttosto che attraverso un aumento di proliferazione cellulare34. Questo movimento di cella è favorito dalla adesione flessibile con il substrato: aderenze stabile dovrebbero essere formati per consentire le forze di trazione per spostare il corpo cellulare, e allo stesso tempo, queste adesioni dovrebbero essere abbastanza debole per permettere la fuoriuscita delle cellule dal substrato durante movimento. Condensazione di cella è favorita da un aumento nella densità superficiale RGD locale fino a 2.5x10-8% w/w-derivato nanopatterns, con un buon equilibrio tra adesione e movimento cellulare. Per 10-2 e il controllo positivo, la densità di superficie di RDG locale era troppo alta, alterando quindi l'evento di formazione di condensa.

La differenziazione chondrogenic procede dal prechondrogenic condensati: le cellule nei condensati di diventare più arrotondate e iniziare la sintesi di marcatori specifici della cartilagine come la trascrizione e la proteina della ECM COL2A1 fattore SOX933, 34 , 35. di conseguenza, substrati con un'adesività intermedio, favorendo la formazione di condense delle cellule, ha mostrato maggiore COL2A1 macchiatura (Figura 3B) e livelli più elevati di espressione di mRNA di SOX9 (Figura 3).

I nostri risultati evidenziano l'influenza delle interazioni cellula-cellula matrice durante le prime fasi di differenziazione chondrogenic. Tali interazioni possono essere facilmente affrontate attraverso basati su Dendrimero nanopatterns.

Passo Tempo (s) Velocità (rpm) Accelerazione (giri/min/s)
1 5 500 300
2 30 3.000 1.500

Tabella 1: fasi del programma Spinner utilizzati per rivestire i vetrini con la soluzione preparata di PLLA. Un primo passo di omogeneizzazione è stato utilizzato a 500 giri/min con un'accelerazione di 300 giri/min/s per 5 s. seguita da un ultimo passaggio a 3.000 giri/min con un'accelerazione di 1.500 giri/min/s per 30 s.

Soluzione RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) Acqua MQ (µ l)
A 0,77 5 6.494
RGD-Cys-D1 (% w/w) Soluzione A (µ l)
B 10-2 779 5.220
C 10-5 0.78 6.000
Soluzione C (µ l)
D 2,5 x 10-8 15,0 5.985
E 10-8 6.0 5.994
F 4 x 10-9 2.4 5.998

Tabella 2: Dettagli della preparazione delle soluzioni RGD-Cys-D1 usato. Una soluzione di riserva di dendrimeri RGD-Cys-D1 è stata preparata ad una concentrazione finale di 0,77 mg/mL (soluzione A), da cui sono state preparate soluzioni B e C alle 10-2 e 10-5% w/w concentrazioni. Soluzione C con una concentrazione di 10-5% w/w di Dendrimero RGD-Cys-D1 è stata usata per preparare le soluzioni D, E e F alle concentrazioni finali di 2,5 x 10-8, 10-8 e 4 x 10-9%w/w, rispettivamente.

Nome Volume (µ l) Tampone di bloccaggio (mL)
Miscela primaria MAb di coniglio a pax 65 12.870
Mouse mAb di COL2A1 32.5
Miscela secondaria Anti-topo di capra Alexa Fluor 488 13 12.961
Alexa Fluor 568 capra anti-coniglio 13
Soluzione di Hoechst 13

Tabella 3: preparazione soluzione anticorpo. L'anticorpo monoclonale miscela contenuta di anticorpo primario contro pax prodotta in coniglio diluito 1: 200 nella soluzione di blocco con l'anticorpo monoclonale contro COL2A1 prodotta in mouse diluito 1: 400 in soluzione bloccante. La miscela di anticorpo secondario conteneva la macchia di nuclei di cellule Hoechst e gli anticorpi secondari prodotti in capra contro topo e coniglio rispettivamente (etichettato con Alexa Fluor 488 e 568 fluorofori, rispettivamente).

Figure 1
Figura 1 : Nanopatterning Dendrimero RGD-Cys-D1 per il controllo su scala nanometrica di densità superficiale RGD locale. (A) RGD-Cys-D1 Dendrimero struttura contenente fino a otto copie del peptide RGD adesivo di cella. Immagini rappresentante STM (bias = 200 mV, set-point = 0,5 nA) di RGD-Cys-D1 nanopatterns su au (111) da una soluzione acquosa iniziale di 10-8% w/w (barra della scala = 3 nm, B) e il profilo di altezza-distanza corrispondente ottenuto sulla tratteggiata regione indicata in (B)e (C) di 10-2% w/w risultati Dendrimero aggregazione (barra della scala = 20 nm). (D-G) Immagini AFM di rappresentante di RGD-Cys-D1 nanopatterns il PLLA ottenuti dalle soluzioni acquose Dendrimero corrispondente di 10-2%, 2,5 x 10-8%, 10-8%e 4 x 10-9% w/w, rispettivamente (barra della scala = 1 µm). Il programma di contorno di probabilità minima distanza interparticella (dmin) corrispondente è indicato sotto ogni immagine AFM, con alta densità regioni RGD mostrate in rosso scuro (dmin < 70 nm). Dendrimeri e Dendrimero aggregati sono raffigurati in nero per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Cellula adesione sulla RGD-Cys-D1 nanopatterns. Trama della percentuale dell'area hanno macchiato per il pax di proteina FA a cella per le celle a contatto con il substrato (asse sinistro) con concentrazione iniziale Dendrimero. I valori vengono confrontati con la densità di superficie locale di RGD (percentuale di superficie a nanopatterns contenente valorimin dsotto la soglia di 70 nm) (asse di destra) con 100 e 0 percentuali assegnate al positivo (+ controllo) e negativo (- controlli di controllo), rispettivamente. (A) adesione dei fibroblasti su Dendrimero nanopatterns su au (111) dopo 4,5 ore di cultura. (B) adesione MSC su Dendrimero nanopatterns il PLLA valutato al giorno 1 di induzione condrogenica. I valori sono riportati come media con la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

RGD-Cys-D1 (% w/w) Zona (< dmin = 70 nm) (%) su au (111) Zona (< dmin = 70 nm) (%) il PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

Tabella 4: percentuale dell'area con d min valori inferiore a 70 nm ottenuti per deposizione di Dendrimero RGD-Cys-D1 su au (111) e il PLLA superfici in funzione delle concentrazioni iniziali Dendrimero usato.

Figure 3
Figura 3 : Differenziazione Chondrogenic delle MSCs sul nanopatterns RGD-Cys-D1. (A) condensazione delle MSC coltivate su RGD-Cys-D1 nanopatterns il PLLA dopo 5 giorni di induzione condrogenica. Immagini di epifluorescenza rappresentante dei nuclei delle cellule macchiato (Hoechst; Barra della scala = 300 µm; riga superiore) e terreno della superficie di condensati di cella (riga inferiore) ottenuti su RGD-Cys-D1 nanopatterns da Dendrimero iniziali differenti concentrazioni. Differenziamento procede dal passaggio di condensazione delle cellule con l'espressione di marcatori specifici condrogenica: (B) percentuale dell'area di COL2A1 macchiatura normalizzato con l'area della condensa delle cellule da corrispondente confocale z-proiezioni ottenuta dopo 5 giorni di induzione condrogenica. (C) espressione relativa SOX9 mRNA (contro controllo negativo) dopo 3 giorni di induzione condrogenica. I valori sono riportati come media con la deviazione standard (B) e (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Durante lo sviluppo del protocollo descritto, dovrebbe essere considerato un numero di passaggi critici. Il primo si riferisce alla GNSM caratterizzazione con tecniche di microscopia della sonda di scansione. Per visualizzare il nanopatterns, la superficie dove viene prodotto il patterning deve avere un valore di rugosità di sotto del diametro medio di dendrimeri, che è di circa 4 – 5 nm come misurato da STM (Figura 1B). Inoltre, si dovrebbe tener conto che la formazione immagine ad alta risoluzione STM è limitata ai substrati conduttivi, in questo caso au (111). Qualsiasi sollevamento del polimero dagli angoli della diapositiva dopo il rivestimento per rotazione può essere rettificata con colla biocompatibile.

Dendrimero nanopatterning è un processo attraverso il quale raggiungere controllato adesività delle cellule locali su nanoscala. Basato sull'auto-assemblaggio di dendrimeri sulla superficie di adsorbimento, questa tecnica non richiede attrezzature complesse nanopatterning, contrastando con precedentemente descritti metodi basati su Litografia36,37, 38. nanopatterning Dendrimero possono essere facilmente scalato per grandi superfici ed è pienamente compatibile con protocolli della coltura delle cellule.

Il Dendrimero nanopatterning metodo descritto qui può trovare applicazioni future nella medicina rigenerativa. Il controllo esercitato da Dendrimero nanopatterning su adesività cellulare rende questa tecnica adatta per il condizionamento di biomateriali prima dell'impianto, facilitando in tal modo la loro integrazione nei tessuti dell'ospite. Inoltre, la facilità con cui Dendrimero moiety periferico può essere modificato rende Dendrimero nanopatterning appropriato per altri ligandi che esercitano attività di concentrazione-dipendente sulle cellule.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono Oriol Font-Bach e Albert G. Castaño per il loro aiuto in dmin quantificazione. Riconoscono anche l'unità di microscopia digitale avanzato presso l'Istituto di ricerca in biomedicina (IRB Barcelona) affinché gli autori di registrare il video nei loro locali. Questo lavoro è stato supportato dal Networking Biomedical Research Center (CIBER), Spagna. CIBER è che un'iniziativa finanziata dal VI nazionale R & D & i piano 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programma Consolider, CIBER azioni e l'Instituto de Salud Carlos III, con il sostegno del Fondo europeo di sviluppo regionale. Questo lavoro è stato supportato dalla Commissione per l'Università e la ricerca del dipartimento innovazione, Università e impresa della Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). È stato inoltre finanziato dai progetti OLIGOCODES (No. MAT2012-38573-C02) e CTQ2013-41339-P, assegnato dal Ministero spagnolo dell'economia e competitività, in aggiunta a INTERREG va Spagna-Portogallo 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P riconosce sostegno finanziario dalla concessione Ministero dell'economia e della competitività spagnolo (n. IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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