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Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

Bioengineering

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Summary

Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

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Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

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Abstract

Diferenciação e adesão celular é condicionado pela disposição dos componentes da matriz extracelular (ECM), escala nanométrica com concentrações locais, tendo um efeito importante. Aqui nós apresentamos um método para obter nanopatterns desigual em grande escala de arginina-glicina-aspartato (RGD)-densidade de superfície funcionalizados dendrímeros que permitem o controle de escala nanométrica de RGD local. Nanopatterns são formados por superfície adsorção de dendrímeros de soluções em diferentes concentrações iniciais e caracterizam-se por água ângulo de contacto (CA), espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS), e digitalização sonda técnicas de microscopia, tais como microscopia de tunelamento (STM) e microscopia de força atômica (AFM). A densidade da superfície local da RGD é medida usando imagens AFM através de mapas de contorno de probabilidade de distâncias mínimas interpartícula e então correlacionados com diferenciação e resposta de adesão celular. O método de nanopatterning apresentado aqui é um procedimento simples que pode ser escalado de uma maneira simples para grandes áreas de superfície. Assim, é totalmente compatível com protocolos de cultura de células e pode ser aplicado a outros ligantes que exercem efeitos de concentração-dependente em células.

Introduction

Aqui descrevemos um procedimento simples e versátil baseado em dendrímeros nanopatterning para obter superfícies de cultura de células que permitem o controle de aderência local à escala nanométrica. Nanoescala detalhes de organização de ECM foram relatados,1,2,3 e o nanopatterning de aderência de célula forneceu insights profundos sobre os celulares requisitos relativos à adesão4, 5. Experimentos utilizando micélica baseada em litografia nanopatterns revelaram um valor limite de cerca de 70 nm para RGD peptídeo nanospacing, adesão celular, sendo significativamente atrasada acima deste valor6,7,8 ,9. Estes estudos também destacou a maior influência do local do que a densidade global do ligante na aderência de célula9,10,11.

Durante a morfogênese, interações célula com o meio ambiente desencadear os eventos de primeira diferenciação, que continuam até estruturas de tecido complexo final tem sido formadas. Neste âmbito, as superfícies de nanopatterned têm sido utilizadas para combater a influência das interações da pilha-superfície iniciais na morfogênese. Baseado em litografia RGD nanopatterns com um espaçamento lateral de 68 nm no tipo β-Ti-40Nb ligas de ajuda para manter o fenótipo indiferenciado de células-tronco não confirmada12, enquanto RGD nanospacings de entre 95 e 150 nm realçar a diferenciação de células-tronco mesenquimais (MSCs) no sentido de adipogenic/osteogênica13,14,15 e chondrogenic destinos16. Também, auto-montagem macromoléculas modificadas com sinalização componentes foram mostradas para direcionar a aderência de célula e diferenciação fornecendo nanoescala Regulamento arquitectónico a sinalização de pistas17. A este respeito, a deposição de dendrímeros com metades de célula-interagindo em sua esfera exterior18,19,20 nas superfícies tem sido usada para estudar a célula adesão21,22, morfologia de23,24e migração eventos25,26. No entanto, a falta de caracterização de superfície nestes estudos torna difícil estabelecer qualquer correlação entre superfície configuração dendrímeros e resposta das células.

Nanopatterns de dendrímeros com líquido, como ordem e espaçamento definido podem ser obtidos quando dendrímeros adsorver às superfícies de baixo-carregado de soluções com baixa força iônica. 27 com base nesta propriedade, aqui apresentamos um método para obter nanopatterns desigual em grande escala de dendrímeros RGD-acrescida em superfícies de baixo-carregado que permitem o controle de escala nanométrica de densidade de superfície RGD local. Ângulo de contato de água (CA), espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS) e sonda microscopia técnicas (nanopatterns STM e AFM) mostrar que densidades locais ligante podem ser ajustadas modificando a concentração inicial de dendrímeros em solução de digitalização. A densidade da superfície local RGD é quantificada de imagens AFM pela probabilidade de mapas de contorno de distâncias mínimas interpartícula e então correlacionada com experimentos de célula. Em comparação com outras técnicas de nanopatterning4, nanopatterning baseados em dendrímeros é simples e pode ser facilmente ampliado para grandes áreas de superfície, sendo assim totalmente compatível com aplicações de cultura de células. Nanopatterns são utilizados como substratos bioativos para avaliar o efeito da densidade de superfície do local RGD na aderência de célula28 e na indução de adulto humano MSCs29chondrogenic. Nossos resultados mostram que o RGD baseada em dendrímeros nanopatterns sustentar o crescimento celular e que adesão celular é reforçada pelas altas densidades de superfície RGD locais. Nas experiências de diferenciação, adesividade intermediária de células para os substratos favoreceu MSC condensação e diferenciação de chondrogenic cedo. Devido à facilidade com que dendrímeros grupos periféricos podem ser modificados, o método descrito aqui pode ser estendido para outros ligantes de ECM que exercem efeitos de concentração-dependente em células ainda mais.

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Protocol

1. os preparadores

  1. Recozimento de 1.4 x 1.1 cm Au(111) em substratos de Mica.
    1. Coloque o substrato Au(111) sobre uma placa de vitrocerâmica e recoze-lo com uma chama de butano de 3 min. permitir o substrato arrefecer sob uma atmosfera de argônio. Repita esta etapa para cada substrato Au(111).
      Nota: Au(111) substratos devem ser usados imediatamente após recozimento.
  2. Preparação de poli (ácido L-láctico) (pilão)-revestido de substratos de vidro.
    1. Cortar e lavar as lâminas de vidro.
      1. Corte lâminas de microscopia em 18 slides de 1,25 x 1,25 cm com um cortador de ponta de diamante. Fazer um pequeno recorte na parte inferior de cada slide, de modo que os lados superiores e inferiores podem ser distinguidos mais tarde.
      2. Lave os slides com água desionizada, seguida de etanol a 96%. Permita-lhes secar ao ar livre.
    2. Prepare a solução de pilão de 2%.
      1. Adicione 200 mg de pilão para 10 mL de 1,4-dioxano em um tubo de pressão. Adicionar uma barra de agitação e fechar o tubo firmemente.
      2. Coloque o tubo de pressão em um banho de glicerina, um prato quente a 60 ° C, sob agitação suave durante 24 h e em seguida, transferir a solução para um frasco de vidro de 15 mL.
    3. Revestimento de lâminas de vidro com a solução de pilão.
      1. Coloque as lâminas de vidro e o frasco com a solução de pilão sobre uma chapa quente limpa a 60 ° C. Certifique-se de colocar os slides virado para cima e permitir-lhes permanecer pelo menos 10 minutos atingir a temperatura necessária.
      2. Preparar o aplicador girar e definir o programa especificado na tabela 1.
      3. Coloque um dos slides a face para cima sobre o aplicador de rotação, usando um sistema de vácuo. Com uma pipeta Pasteur, aplica 0,25 mL da solução de pilão para o slide, certificando-se de que toda a superfície está coberta. Execute o programa de revestimento. Repita esta etapa para cada slide.

2. dendrímeros Nanopatterning

  1. Preparação de soluções de 28 RGD-acrescida dendrímeros (RGD-Cys-D1).
    1. Dissolva 5 mg dos dendrímeros em 6,494 mL de água desionizada. Esta é a solução A.
      Nota: Use solução dendrímeros dentro de 6 meses de preparação.
    2. Proceda à sonicação solução-A por 10 min e preparar soluções B e C tabela 2a seguir.
    3. Proceda à sonicação solução C por 10 min e preparar soluções, D, E e F tabela 2a seguir.
    4. Loja soluções B, C, D, E e F a 4 ° C até o uso. Solução pode ser armazenada a-20 ° C para uso posterior.
  2. Nanopatterning de dendrímeros RGD-Cys-D1 sobre os substratos
    1. Em uma capa de cultura de tecidos, esterilize os substratos por irradiação-los com a luz UV para 13 min.
      Nota: Este passo só é necessário quando substratos nanopatterned vão ser utilizados como substratos de cultura de células. Neste caso, manter as condições estéreis (capuz de cultura de tecidos, materiais estéreis, soluções e técnicas) para as etapas seguintes.
    2. Coloque cada substrato de face para cima em poços de uma placa, manuseá-los cuidadosamente com uma pinça.
    3. Proceda à sonicação soluções B, C, D, E e F por 10 min.
    4. Passe as RGD-Cys-D1 dendrímeros soluções através de um filtro de 0,22 µm de diâmetro usando uma seringa diretamente nos poços contendo os substratos (2 mL/poço). Pelo menos três réplicas por dendrímeros concentração são recomendadas. Fechar e selar a placa e deixar à temperatura ambiente (RT) para 16 h.
    5. Retire e descarte as soluções. Lave os substratos com água desionizada estéril e seca. Substratos de loja a 4 ° C.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. preparação de substratos de controle

Nota: Todas as medidas foram realizadas em uma capa de cultura de tecidos estéreis e apenas material esterilizado, soluções e técnicas foram utilizadas. Pelo menos, seis controlam substratos foram usadas (três réplicas do controlo positivo) e três réplicas do controle negativo.

  1. Em uma capa de cultura de tecidos, esterilize os substratos por irradiação-los com a luz UV para 13 min.
  2. Substratos de controle para o experimento de adesão dos fibroblastos.
    1. Use chama-recozido Au(111) substratos como controlo negativo. O ouro tem um efeito bem conhecido de desnaturação de proteínas que confere propriedades adesivas anti-celular28. Proceda à sonicação todas as soluções e filtrar antes da incubação do substrato.
    2. Para os controles positivos, mergulhe a flama-recozido substratos de Au(111) em uma solução de PEG modificado RGD tiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glicol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 e glicol do triethylene mono-11-mercaptoundecyl éter (PEG-SH) na proporção molar de 1: 100 em etanol a 96% para 16 h na RT
    3. Lave substratos em álcool etílico e secá-las com argônio. Substratos de loja a 4 ° C.
  3. Controle de substratos para a condrogênese.
    1. Use substratos de pilão imaculados como controlo negativo. Sem qualquer tratamento de superfície, pilão mostra interface pobre com células vivas. 31
    2. Para os controles positivos, prepare-se 5 mL de fibronectina 0,1 mg/mL de tampão fosfato salino (PBS) e incube cada substrato pilão com 1,6 mL da solução de fibronectina por 1h no RT
    3. Remover e descartar a solução de fibronectina e lavar os substratos com PBS. Substratos de loja a 4 ° C.

4. superfície caracterização

  1. Imagens de AFM
    1. Realize imagens de AFM de substratos de pilão para uma análise de rugosidade. Desde que os dendrímeros têm um diâmetro de 4-5 nm, valores de rugosidade de 1 nm deve ser obtida para a visualização adequada do nanopatterns. Além disso, realize imagens de AFM do nanopatterns. Em ambos os casos, execute o AFM em batendo modo no ar.
    2. Selecione um cantilever de silício com constante da mola k = 40 N/m e uma frequência ressonante ν = 300 kHz e monte-a no equipamento AFM.
    3. Monte a amostra no palco do microscópio de força atômica. Dependendo da configuração do aparelho, ajuste e especificações de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante.
    4. Abordagem da amostra com a ponta do microscópio até o contato.
    5. Para pilão de imagem para análise de rugosidade, selecione pelo menos quatro áreas representativas de 20 x 20 µm por substrato de três substratos independentes. A imagem nanopatterns de dendrímeros, escolher pelo menos três imagens representativas de 5 × 5 µm por substrato de três substratos independentes por condição (concentração inicial dendrímeros em solução). Para evitar danificar a camada de dendrímeros enquanto imagem, ajuste o ponto de ajuste para manter a força no mínimo.
      Nota: A escolha da área de imagem também depende da escala de trabalho do scanner piezoelétrico. Por favor consulte o manual do instrumento nesse sentido.
    6. Processo a altura AFM imagens por encaixe cada varredura linha de polinômio nivelamento funções utilizando o software proprietário do fabricante do aparelho AFM e analisar os do pilão para calcular a rugosidade da superfície. Raiz da média quadrado (RMS) análise pode fornece uma opção adequada.
  2. Medição de densidade de superfície RGD local.
    1. Obter os limiares da imagem das imagens processadas altura AFM para selecionar os dendrímeros na superfície.
    2. Determinar as posições de partículas usando uma software de processamento de imagem e usá-los para obter as distâncias mínimas interpartícula (d.min).
    3. Lote dmin valores em z para as posições de partícula correspondente para obter os mapas de contorno de probabilidade para dmin. Ajuste a escala de cores da trama para visualizar as regiões de maior local RGD densidade de superfície (dmin < 70 nm).
    4. Quantificar a área das regiões com maior local RGD superfície densidade usando uma software de processamento de imagem. Incluem as áreas de dendrímeros agregados no cálculo.
  3. Imagem de STM.
    Nota: Imagens STM podem ser executada somente para nanopatterns em substratos de Au(111) condutoras. As medições são feitas no ar.
    1. Coloque o substrato nanopatterned no suporte de amostra do equipamento STM. Verifique a conexão elétrica entre a amostra e titular com um testador.
    2. Etch uma dica do material selecionado sonda (i. e. Pt 0,8: IV 0,2) com um diâmetro que assegura o adequado encaixe na cabeça do equipamento STM. Gravura pode ser realizada por corte manual ou pelo ataque eletroquímico. 32
      Nota: Gravura eletroquímica processa mais dicas simétricas.
    3. Monte a ponta na cabeça do equipamento STM e conectar-se a amostra.
    4. Definir "atual" no canal de retorno (neste tipo de medição, atual será constante por gabarito tuning). Ajuste a tensão de polarização e atual ponto de ajuste e tamanho de varredura para obter uma imagem bem resolvida, uma vez que a ponta está envolvida.
      Nota: A escolha da área de imagem também depende da escala de trabalho do scanner piezoelétrico. Por favor consulte o manual do instrumento nesse sentido.
    5. Processo, as imagens topográficas STM encaixando cada linha de varredura de nivelamento polinomial funções utilizando o software proprietário do fabricante do aparelho STM.
  4. Medições de CA.
    1. CA medida sobre os substratos de nanopatterned pelo método de gota séssil em três posições diferentes em três substratos independentes por condição (concentração inicial dendrímeros em solução) com um sistema óptico de CA.
    2. Encher o microseringa com água desionizada e definir os parâmetros do software de CA para produzir gotas de 1 µ l.
    3. Coloque a amostra no palco para que a superfície da amostra é claramente visível no computador para a imagem latente.
    4. Mover a seringa com o micromanipulador até chegar perto da superfície e dispense a cair sobre a superfície. Grave a imagem imediatamente após a estabilização da gota.
      Nota: Nas medições de CA, é muito importante controlar a umidade a fim de obter resultados reprodutíveis.
    5. Analise o CAs medido com o software proprietário do fabricante do aparelho de CA. O método de encaixe pode ser ajustado às exigências do usuário. O método de montagem elíptica pode ser uma opção.

5. cultura celular

Nota: Todas as medidas foram realizadas em uma capa de cultura de tecidos e apenas o material esterilizado, soluções e técnicas foram utilizadas.

  1. Experimento de adesão dos fibroblastos.
    1. Cultura de fibroblastos embrionários de NIH 3T3 rato de passagens precoce (< 10) a 37 ° C e atmosfera de 4,6% CO2 em meio basal com glicose alta, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, piruvato de sódio penicilina-estreptomicina e 1% 1% (meio de crescimento). T75 frascos para uma propagação total de 500.000 células por balão em 10 mL do meio de crescimento são recomendados.
    2. Remover antigo médio com uma pipeta de 10 mL a cada 2 dias e substitua com 10 mL de meio de cultura preparados na hora.
    3. Células de cultura no meio de crescimento, até que chegam em torno de 80% de confluência, em seguida, remover o meio e adicionar 5 mL de tripsina por balão. Para garantir o desprendimento de célula apropriada do fundo do frasco, manter a solução de tripsina em contacto com as células por 5 min a 37 ° C.
    4. Adicionar 5 mL de meio de cultura por frasco e coletar as células num tubo de centrífuga. Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL do meio de crescimento. Determine a concentração de células usando um hemocytometer.
    5. Transferi os substratos para bem placas não tratadas para cultura de tecidos (não aderente).
    6. As células sobre os substratos em uma densidade de 4.000 células/cm2 no meio de crescimento de sementes e incube-os por 4,5 horas a 37 ° C e 10% CO2 atmosfera.
  2. Chondrogenic indução do MSCs.
    1. Cultura humanas MSCs de passagens antecipadas (< 5) a 37 ° C e 4,6% CO2 atmosfera meio de crescimento de MSC. T75 frascos para uma propagação total de 500.000 células por balão em 10 mL do meio de crescimento são recomendados.
    2. Alterar médio cada 3 dias (conforme descrito em 5.1.2).
    3. Trypsinize células antes de confluência de 80% é atingido e centrifugue e ressuspendê-los no meio de crescimento de MSC (conforme descrito em 5.1.3). Determine a concentração de células usando um hemocytometer.
    4. Centrifugar as células novamente e Resuspenda-los em 10 mL de meio de indução condrogênese.
    5. Transferi os substratos das placas para novas placas bem não tratadas para cultura de tecidos (não aderente). As sementes das células sobre os substratos em uma densidade de 3.000 células/cm2.
    6. Altere o meio de chondrogenic cada 3 dias (conforme descrito em 5.1.2).

6. fixação e imunocoloração de celular

Nota: As seguintes etapas podem ser executadas em condições não estéreis.

  1. Remova a mídia e lavar as células suavemente com PBS. Corrigi-los, adicionando uma solução de formalina 10% por 20 min no RT
  2. Remover o formol e lavar as células com PBS.
  3. Bloquear os grupos aldeído livre pela adição de uma solução de 50 mM de cloreto de amónio (NH4Cl) em PBS. Deixar as células por 20 min em solução de NH4Cl de RT. Remova e lave as células com PBS.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C.
  4. Remover PBS e permeabilize as células, adicionando uma solução de 0,1% de saponina na solução de bloqueio (1% em PBS de albumina) por 10 min no RT. Wash as células com PBS e transferir amostras para um prato bem novo.
  5. Incubar as células com uma solução de anticorpos primários na solução de bloqueio (tabela 3) por 1h no RT Em seguida, remover a solução de anticorpo primário e lavar as células com PBS.
  6. Incubar as células com anticorpos secundários na solução de bloqueio (tabela 3) por 1h no RT
    Nota: Evite luz exposição.
  7. Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as células com PBS e seco.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as amostras em PBS a 4 ° C, no escuro.
  8. Montagem da amostra para a observação do microscópio: usando um cortador de ponta de diamante, corte as lamelas em 1,25 cm x 1,25 cm. aplicar 50 µ l de montagem média para as amostras de microscopia e cobri-los suavemente com as lamelas de corte.
  9. Transferir as amostras para um destinatário conveniente, cubra com papel alumínio e guarde no escuro a 4 ° C até observação.

7. célula de imagem e análise de dados

Nota: Para Au(111) opaco e espessos substratos microslide-baseado, um microscópio vertical deve ser utilizado.

  1. Experimento de adesão dos fibroblastos.
    1. Uso de um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera digital e ampliação de alta (ou seja, 40 X) e baixa (ou seja, 10 X) objectivos. Fazer medições no ar.
    2. Coloca a amostra sobre o palco e a imagem do núcleo de células com o objectivo de X 10 usando uma excitação ultravioleta, filtro de emissão longpass para visualizar a mancha Hoechst/DAPI.
    3. Imagem célula citoesqueleto e aderências focais (FAs) com o objetivo de X 40, selecionando o filtro de microscópio que corresponda às especificações de fluorocromo anticorpo correspondente.
    4. Para a quantificação de FA, use uma software de processamento de imagem para converter imagens em arquivos de 8 bits. Remova as imagens de fundo e converter para binário, definindo um limite. Calcular pelo menos 30 imagens por exemplo e considerar FAs de 1 µm2 para cálculo.
  2. Chondrogenic indução do MSCs.
    1. Condensados de célula de imagem nas fases iniciais de indução chondrogenic (< 5 dias), com um microscópio de epifluorescência vertical equipado com uma câmera digital e um baixo (ou seja, 10 X) objetivo de ampliação. Use o filtro ultravioleta de excitação e longpass de emissão para visualizar a mancha Hoechst/DAPI.
    2. Para medir a área de condensado, use um software de processamento de imagem, converter imagens em arquivos de 8 bits, remover o fundo e selecione um limiar que destaca o contorno de agregação. Calcule a área das partículas.
    3. Amostras de imagem immunostained para FAs, fibras de actina do citoesqueleto e cartilagem-específicas do colágeno tipo II alfa 1 (COL2A1) com um microscópio confocal vertical em alta ampliação (ou seja, 40-60 X). Recolha as seções em um intervalo representante (ou seja, 0,5-1 µm).
    4. Para processar a pilha, use uma software de processamento de imagem. Converter imagens em arquivos de 8 bits, remover o fundo e torná-los binário, definindo um limite. Trate um mínimo de três condensados de célula por condição de três amostras independentes.
    5. Quantificar a proteína FA manchada de áreas da zona basal de condensados de célula e expressá-las como a porcentagem correspondente da área dividida pelo número de núcleos de célula na imagem.
    6. Para medir COL2A1 coloração, usar z-projeções confocal e quantificar a soma da área projetada (área máxima de COL2A1 por amostra). Normalize o valor de área obtido contra a área do condensado correspondente.

8. quantitativa análise de reação em cadeia (qRT-PCR) transcrição-polimerase reversa

Nota: Para evitar a contaminação de RNase, use utensílios de plástico descartável, estéril e luvas descartáveis quando manusear reagentes e RNA. Sempre usar técnicas assépticas microbiológicas adequadas e usar uma solução de descontaminação adequada para remover a contaminação de RNase de superfícies de trabalho e itens não-descartáveis, tais como pipetas e centrífugas.

  1. Isolar o RNA total e pulverizá-lo em um disruptor de RNA. Tratar as amostras de RNA com DNase e convertê-los em cDNA usando um kit de síntese do cDNA.
  2. Conduta qRT-PCR utilizando primers para o fator de transcrição SOX9. Beta-2-microglobulina (B2M) e proteínas ribossomais L13a (RPL13a) pode ser usado como genes das tarefas domésticas.
  3. Calcular os níveis de expressão e normalizá-los contra o controlo negativo (pilão).

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Representative Results

Apresentamos um método nanopatterning que permite aderência superficial ser endereçado à escala nanométrica (Figura 1). A estrutura química da RGD-Cys-D1 é mostrada na figura 1A. Dendrímeros foram estampados em superfícies condutoras elétricas do Au(111) para caracterização do STM de alta resolução. Dendrímeros baixas concentrações em solução (até 10-5% w/w) processado dendrímeros isolados de 4-5 nm de diâmetro (figura 1B), ao mesmo tempo altamente compactado dendrímeros agregados formados em altas concentrações (Figura 1). Caracterização de superfície AFM (Figuras 1, D-G, linha superior) revelou que a superfície distribuição de dendrímeros RGD-Cys-D1 pode ser ajustada em função da concentração inicial de dendrímeros em solução. Os mapas de contorno de probabilidade para dmin, isso resulta em diferentes densidades de nanoescala RGD locais na superfície (Figuras 1, D-G, linha inferior).

Em experimentos de cultura celular, as membrana celular receptores integrinas de cerca de 10 nm de diâmetro reconheceu a sequência RGD na periferia de dendrímeros. Embora oito cópias desta sequência foram fornecidas por dendrímeros, único dendrímeros interagiram por integrina devido ao seu tamanho (4-5 nm, medido pelo STM; Figura 1B). Isto é, cada dendrímeros desde um único local para ligação integrina, desse modo permitindo uma correlação direta da distribuição de dendrímeros (como visto nas imagens de AFM) e a distribuição de RGD, disponível para adesão celular. Além disso, sem variações significativas foram encontradas nos valores obtidos para as nanopattern diferentes configurações que podem influenciar a aderência de célula29CA. Estas características fazem dendrímeros nanopatterns em superfícies biocompatível substratos adequados através dos quais modulam e estudar o comportamento da célula.

Aderência de célula para nanopatterned Au(111) foi testada com fibroblastos dentro as primeiras 24 horas de cultura (Figura 2A) e com o MSCs em nanopatterned pilão (Figura 2B). Em ambos os casos, a porcentagem de área manchada para o FA da proteína paxillin (pax) aumentada progressivamente com concentração de dendrímeros, como fez o local densidade de superfície RGD (a porcentagem de área de nanopatterned com dmin abaixo do limiar de 70 nm para a aderência de célula eficiente; Tabela 4). Para uma concentração de dendrímeros inicial de 10-2% w/w e controlos positivos, a porcentagem de área manchada por pax por célula diminuída e a correlação com a percentagem de área nanopatterned com dmin < 70 nm foi perdida.

A porcentagem de área de superfície ocupada por dmin < 70 nm (Figura 1-G linha inferior e tabela 4) é uma boa indicação da densidade de superfície RGD local para nanopatterns até 10-5% w/w inicial dendrímeros concentração, mas não daqueles até 10-2% w/w, devido à agregação de dendrímeros. Agregação produzido amostras altamente heterogêneas em termos de distribuição de ligante, com apenas uma pequena percentagem da superfície com valores demin dabaixo do limiar de 70 nm (linha inferiorFigura 1 e tabela 4). XPS resultados mostraram que estas superfícies apresentam uma densidade global de RGD comparável ao 10-5% w/w-derivado nanopatterns28. Esta observação indica que a densidade máxima da RGD foi alcançada nas regiões contendo agregados de dendrímeros e que a porcentagem de área de superfície ocupada por dmin < 70 nm não é representativa do local RGD superfície de densidade em Neste caso.

A observação de que os controlos positivos (revestimentos homogéneos) com a máxima densidade de superfície RGD local não mostrou o aumento esperado na adesão celular pode ser atribuída a um efeito estérico. Estes resultados indicam que, em comparação com as superfícies homogêneas correspondentes comumente utilizadas na cultura de pilha, RGD nanopatterns sustentar a aderência de célula mais eficientemente. Esta constatação, portanto, destaca a relevância da densidade local ligante.

Interações com o meio ambiente na morfogênese acionar os primeiros eventos de diferenciação celular e propagação-los até ao estabelecimento de estruturas de tecido complexo final. Para avaliar os efeitos de dendrímeros nanopatterns na aderência de célula e diferenciação, usamos a indução de chondrogenic do MSCs como um modelo. Durante a condrogênese, há remodelação de matriz ativa, que desempenha um papel instrutivo em dirigir as células através dos diferentes estágios de formação de cartilagem.

MSCs submeteu-se a condrogênese sobre o nanopatterns (Figura 3). Chondrogenic diferenciação começa com um passo de condensação da célula, que envolve o recrutamento de células para formar o densos condensados, o estabelecimento de comunicação célula a célula e alterações concomitantes no celular morfologia33. A figura 3A mostra que a condensação de célula ocorreu em todos os substratos e que condensados aumentou em área com o aumento das concentrações de dendrímeros até 2,5 x 10-8% w/w área de condensado então diminuiu novamente para um dendrímeros concentração de 10-2% w/w e para o controlo positivo. A etapa de condensação de célula em condrogênese ocorre através do movimento da célula ativa, em vez de através de um aumento de proliferação celular34. Este movimento de célula é favorecido por adesão flexível com o substrato: aderências estáveis devem ser formadas para permitir que as forças de tração para mover o corpo celular, e ao mesmo tempo, estas aderências devem ser fracas o suficiente para permitir a liberação celular de substrato durante movimento. Condensação de célula é favorecida por um aumento na densidade de superfície RGD local até 2.5x10-8% w/w-derivado de nanopatterns, com um bom equilíbrio entre o movimento de célula e adesão celular. Para 10-2 e o controle positivo, a densidade da superfície local RDG era demasiado elevada, prejudicando, assim, o evento de condensação.

Chondrogenic diferenciação prossegue de condensados de prechondrogenic: células em condensados tornam-se mais arredondadas e iniciar a síntese de marcadores específicos de cartilagem, tais como a proteína de ECM COL2A1 e a transcrição do fator SOX933, 34 , 35. por conseguinte, substratos com uma adesividade intermediária, favorecendo a formação de condensados de célula, mostraram maior COL2A1 coloração (Figura 3B) e maiores níveis de expressão de RNAm de SOX9 (Figura 3).

Nossos resultados destacam a influência das interações de matriz celular durante as fases iniciais da diferenciação de chondrogenic. Tais interações podem ser facilmente tratadas através de nanopatterns baseado em dendrímeros.

Passo Tempo (s) Velocidade (rpm) Aceleração (rpm/s)
1 5 500 300
2 30 3.000 1.500

Tabela 1: as etapas do programa Spinner usadas para revestir as lâminas de vidro com a solução preparada de pilão. Uma primeira etapa de homogeneização utilizou-se a 500 rpm com uma aceleração de 300 rpm/s para 5 s. seguido por uma última etapa a 3.000 rpm com uma aceleração de 1.500 rpm/s para 30 s.

Solução RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) Água MQ (µ l)
A 0,77 5 6.494
RGD-Cys-D1 (% w/w) Solução A (µ l)
B 10-2 779 5.220
C 10-5 0,78 6.000
Solução C (µ l)
D 2,5 x 10-8 15,0 5.985
E 10-8 6.0 5.994
F 4 x 10-9 2.4 5.998

Tabela 2: Detalhes da preparação das soluções RGD-Cys-D1 usado. Uma solução stock de dendrímeros RGD-Cys-D1 foi preparada em uma concentração final de 0,77 mg/mL (solução A), do qual soluções B e C foram preparadas em 10-2 e 10-5% w/w concentrações. Solução C com concentração de 10-5% w/w de dendrímeros RGD-Cys-D1 foi usada para preparar soluções D, E e F, em concentrações finais de 2,5 x 10-8, 10-8 e 4 x 10-9%w/w, respectivamente.

Nome Volume (µ l) Tampão de bloqueio (mL)
Mistura de primária MAb coelho para pax 65 12.870
MAb mouse para COL2A1 32.5
Mistura de secundária Alexa Fluor 488 anti-rato de cabra 13 12.961
Alexa Fluor 568 de cabra anticoelho 13
Solução de Hoechst 13

Tabela 3: preparação de solução de anticorpos. Anticorpo monoclonal anticorpo primário mistura contida contra pax produzido em coelho diluído 1: 200 na solução de bloqueio com anticorpo monoclonal contra COL2A1 produzido no rato diluído 1: 400 na solução de bloqueio. A mistura de anticorpo secundário contido a mancha de núcleos de células Hoechst e os anticorpos secundários produziram em cabra contra rato e coelho respectivamente (rotuladas com Alexa Fluor 488 e 568 fluorophores, respectivamente).

Figure 1
Figura 1 : Nanopatterning de dendrímeros RGD-Cys-D1 para o controle de escala nanométrica de densidade de superfície RGD local. (A) RGD-Cys-D1 dendrímeros estrutura contendo até oito cópias do peptide RGD adesivo celular. Imagens de representante STM (viés = 200 mV, set point = 0,5 nA) da RGD-Cys-D1 nanopatterns na Au(111) de uma solução aquosa inicial de 10-8% w/w (barra de escala = 3 nm, B) e o correspondente perfil de altura-distância obtidos sobre o tracejado região indicada em (B)e (C) de 10-2% w/w mostrando agregação dendrímeros (barra de escala = 20 nm). (D-G) Imagens de AFM representante da RGD-Cys-D1 nanopatterns no pilão obtidos a partir de soluções aquosas de dendrímeros correspondente de 10%-2, 2,5 x 10-8%, 10%-8e 4 x 10-9% w/w, respectivamente (barra de escala = 1 µm). O mapa de contorno de probabilidade mínima distância interpartícula (d.min) correspondente é mostrado abaixo de cada imagem AFM, com alta densidade regiões RGD mostradas em vermelho escuro (dmin < 70 nm). Dendrímeros e dendrímeros agregados são retratados em preto para maior clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Célula aderência sobre o RGD-Cys-D1 nanopatterns. Sinopse da percentagem de área manchada para o FA proteína pax por célula para as células em contacto com o substrato (eixo esquerdo), com concentração inicial de dendrímeros. Valores são comparados com a densidade de superfície RGD e local (percentagem de área de superfície na nanopatterns que contém valores demin dabaixo do limiar de 70 nm) (eixo direito) com percentagens de 100 e 0 atribuídas ao positivo (+ controle) e negativo (- controla o controle), respectivamente. (A) adesão de fibroblasto em dendrímeros nanopatterns na Au(111) após 4,5 horas de cultura. (B) adesão MSC em dendrímeros nanopatterns no pilão avaliada no dia 1 de indução chondrogenic. Valores são dados como a média com o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

RGD-Cys-D1 (% w/w) Área (< dmin = 70 nm) (%) em Au(111) Área (< dmin = 70 nm) (%) no pilão
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

Tabela 4: porcentagem de área com d min valores abaixo de 70 nm obtidos para superfícies de deposição de dendrímeros RGD-Cys-D1 na Au(111) e no pilão em função das concentrações iniciais dendrímeros usado.

Figure 3
Figura 3 : Chondrogenic de diferenciação do MSCs na nanopatterns RGD-Cys-D1. (A) condensação de MSCs cultivadas na nanopatterns RGD-Cys-D1 no pilão após 5 dias de indução chondrogenic. Imagens de epifluorescência representante do núcleo de células coradas (Hoechst; Barra de escala = 300 µm; linha superior) e parcela da área de condensados de célula (linha inferior) obtidos no RGD-Cys-D1 nanopatterns de dendrímeros inicial diferentes concentrações. Diferenciação produto da etapa de condensação de célula com a expressão de marcadores específicos chondrogenic: percentagem (B) da área de COL2A1 coloração normalizada com a área do condensado célula das correspondentes confocal z-projeções obtidas após 5 dias de indução chondrogenic. (C) relativo SOX9 a expressão de RNAm (contra o controlo negativo) após três dias de indução chondrogenic. Valores são dados como a média com o desvio-padrão em (B) e (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Durante o desenvolvimento do protocolo descrito, deve ser considerado um número de passos críticos. O primeiro refere-se a caracterização de nanopattern com sonda técnicas de microscopia de varredura. Para visualizar o nanopatterns, a superfície onde a padronização é produzida deve ter um valor de rugosidade abaixo o diâmetro médio dos dendrímeros, que é em torno de 4-5 nm, medida pelo STM (figura 1B). Além disso, ele deve ter em conta que imagens de alta resolução STM é restrita aos substratos condutoras, neste caso Au(111). Qualquer levantamento do polímero dos cantos do slide após o revestimento de rotação pode ser retificado usando cola biocompatível.

Dendrímeros nanopatterning é um processo através do qual a alcançar controlado aderência de célula local à escala nanométrica. Baseia a auto-montagem de dendrímeros na superfície por adsorção, esta técnica não requer qualquer equipamento complexo nanopatterning, assim, contrastando com anteriormente descritos métodos baseados em litografia36,37, 38. dendrímeros nanopatterning podem ser facilmente dimensionado para grandes áreas de superfície e é totalmente compatível com protocolos de cultura de células.

O método de nanopatterning de dendrímeros descrito aqui pode encontrar futuras aplicações na medicina regenerativa. O controle exercido por dendrímeros nanopatterning na aderência de célula faz com que esta técnica adequada para o condicionamento de biomateriais antes da implantação, facilitando a sua integração nos tecidos do hospedeiro. Além disso, a facilidade com a qual dendrímeros partes periféricas podem ser modificados faz dendrímeros nanopatterning apropriado para outros ligantes que exercem atividade dependente da concentração nas células.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Os autores reconhecem Oriol Font-Bach e Albert G. Castaño por sua ajuda na quantificação demin d. Eles também reconhecem a unidade de microscopia Digital avançado no Instituto de pesquisa em biomedicina (IRB Barcelona) para deixar os autores a gravar o vídeo em suas instalações. Este trabalho foi apoiado pelo Networking biomédica Research Center (CIBER), Espanha. CIBER é que uma iniciativa financiada pelo VI nacional R & D & i plano 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, consolidar programa, CIBER acções e Instituto de Salud Carlos III, com o apoio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. Este trabalho tem sido apoiado pela Comissão para universidades e investigação do departamento de inovação, universidades e Enterprise da Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Ele também foi financiado pelos projetos OLIGOCODES (n. º MAT2012-38573-C02) e CTQ2013-41339-P, concedido pelo Ministério espanhol de economia e competitividade, além de INTERREG do v Espanha-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. reconhece o apoio financeiro de subvenção Ministério da economia e competitividade espanhol (n. º IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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