Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques

Bioengineering

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Summary

Une méthode pour obtenir nanopatterns inégale dendrimère-basé qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD) surface densité locale est décrite et appliquée pour l’étude de la différenciation cellulaire adhésion et chondrogéniques.

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Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

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Abstract

Différenciation et adhésion cellulaire est conditionnée par la disposition de l’échelle nanométrique des composants de la matrice extracellulaire (MEC), avec des concentrations locales ayant un effet majeur. Nous présentons ici une méthode pour obtenir des nanopatterns inégales à grande échelle d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD)-fonctionnalisés dendrimères qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de RGD local grammage. Nanopatterns sont formés par adsorption en surface de dendrimères de solutions à différentes concentrations initiales et sont caractérisées par l’angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS), et scanning probe techniques de microscopie tels que microscopie à effet tunnel (STM) balayage et microscopie à force atomique (AFM). La densité de surface locale de RGD est mesurée en utilisant des images de l’AFM au moyen de cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec la différenciation et la réponse d’adhérence cellulaire. La méthode de structuration présentée ici est une procédure simple qui peut évoluer vers le haut d’une manière simple de grandes surfaces. Il est donc entièrement compatible avec les protocoles de culture de cellules et peut être appliqué aux autres ligands qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.

Introduction

Ici, nous décrivons une procédure simple et polyvalent basé sur dendrimère durcie pour obtenir des surfaces de culture de cellules qui permettent le contrôle des locaux de l’adhérence à l’échelle nanométrique. Nanoscale détails d’organisation de l’ECM ont été signalés,1,2,3 et la structuration de l’adhérence cellulaire a permis de mieux comprendre profondément les exigences cellulaires associés à adhérence4, 5. Expériences utilisant micellaire nanopatterns axée sur la lithographie a révélé un seuil à environ 70 nm pour nanospacing de peptide RGD, adhésion cellulaire retardée significativement supérieur à cette valeur6,7,8 ,9. Ces études ont aussi souligné le plus d’influence des locaux que la densité globale de ligand sur cell adhesion9,10,11.

Au cours de la morphogenèse, interactions cellulaires avec le milieu environnant déclenchent les premières manifestations de différenciation, qui continuent jusqu'à ce que les structures tissulaires complexe final ont été formés. Dans ce cadre, des surfaces de nanopatterned ont été utilisés pour lutter contre l’influence des interactions cellule-surface initiales sur la morphogenèse. Axée sur la lithographie RGD nanopatterns avec un espacement latéral de 68 nm en β-type Ti-40Nb alliages aident à maintenir le phénotype indifférencié de cellules de tige non engagés12, tandis que nanospacings RGD entre 95 et 150 nm améliorer la différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) vers adipocytaire/ostéogénique13,14,15 et chondrogéniques fates16. Auto-assemblage macromolécules modifiés avec signalisation composants montrent également, pour diriger l’adhésion cellulaire et la différenciation en fournissant nanométriques règlement architectural des indices signalisation17. À cet égard, la déposition de dendrimères avec interaction cellule moitiés dans leur sphère extérieure18,19,20 , sur des surfaces a été utilisée pour étudier les cellules adhérence21,22, morphologie23,24et migration des événements25,26. Néanmoins, l’absence de caractérisation de surface dans ces études rend difficile d’établir une quelconque corrélation entre dendrimère configuration surface et réponse de la cellule.

Dendrimère nanopatterns avec ordre de liquide et l’espacement défini peut être obtenue quand dendrimères s’adsorber sur les surfaces à faible charge de solutions avec faibles forces ioniques. 27 sur la base de cette propriété, nous présentons une méthode pour obtenir à grande échelle nanopatterns inégale des dendrimères fonctionnalisés RGD sur des surfaces très basse-chargées qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de masse surfacique RGD local. Angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS) et scanning probe microscopy techniques (STM et AFM nanopatterns) Voir la que la densité locale de ligand peut être ajustée en modifiant la concentration initiale dendrimère en solution. La densité de surface locale RGD est quantifiée des images de l’AFM en cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec des expériences de cellules. Par rapport aux autres techniques de structuration4, axée sur les dendrimère durcie est simple et peut être facilement transposé aux larges surfaces, étant donc entièrement compatible avec les applications de culture de cellules. Nanopatterns sont utilisés comme substrats bioactifs pour évaluer l’effet de la densité locale de surface RGD sur cell adhesion28 et sur l’induction chondrogéniques de l’adulte humain MSCs29. Nos résultats montrent que RGD dendrimère-basé nanopatterns soutenir la croissance des cellules et qu’adhésion cellulaire est renforcée par la forte densité de surface locale RGD. Dans les expériences de différenciation, intermédiaires de l’adhérence des cellules aux substrats favorisée condensation MSC et différenciation chondrogéniques précoce. Étant donné la facilité avec laquelle dendrimère groupes périphériques peuvent être modifiées, la méthode décrite ici peut être étendue aux autres ligands ECM qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.

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Protocol

1. préparation du substrat

  1. Recuit de 1,4 x 1,1 cm au (111) sur des substrats de Mica.
    1. Placez le substrat au (111) sur une plaque de cuisson en vitrocéramique et il recuire avec une flamme de butane pour 3 min. autoriser le substrat refroidir sous atmosphère d’argon. Répétez cette étape pour chaque substrat au (111).
      NOTE : Substrats au (111) doivent être utilisés immédiatement après le recuit.
  2. Préparation de Poly (acide L-lactique) (PLLA)-enduit des substrats de verre.
    1. Couper et laver les lames de verre.
      1. Découper des lames de microscope dans 18 diapositives de 1,25 x 1,25 cm avec un cutter pointe diamant. Faire une échancrure petite sur le côté inférieur de la lame, afin que les parties supérieures et inférieures peuvent être distingués par la suite.
      2. Laver soigneusement les lames avec de l’eau désionisée suivie d’éthanol à 96 %. Laissez-les sécher à l’air.
    2. Préparer la solution PLLA 2 %.
      1. Ajouter 200 mg de PLLA à 10 mL de 1, 4-dioxane dans un tube de pression. Ajouter une barre de remuer et bien refermer le tube.
      2. Placer le tube de pression dans un bain de glycérine sur une plaque chauffante à 60 ° C sous agitation douce pendant 24 h et ensuite transvaser la solution dans un flacon en verre de 15 mL.
    3. Revêtement des lames de verre avec la solution PLLA.
      1. Placez les lames de verre et la fiole avec la solution PLLA sur une plaque chauffante propre à 60 ° C. Assurez-vous de placer les lames vers le haut et leur permettre de rester pendant au moins 10 min atteindre la température nécessaire.
      2. Préparer la coucheuse spin et le programme spécifié dans le tableau 1.
      3. Un lieu de la face diapositives sur la coucheuse spin, à l’aide d’un système déprimogène. Avec une pipette Pasteur, appliquer 0,25 mL de la solution PLLA à la diapositive, en s’assurant que toute la surface est couverte. Exécutez le programme d’enduit. Répétez cette étape pour chaque diapositive.

2. dendrimère durcie

  1. Préparation des Solutions de 28 dendrimère RGD fonctionnalisés (RGD-Cys-D1).
    1. Dissoudre 5 mg de la dendrimère dans 6,494 mL d’eau désionisée. Il s’agit de solution A.
      Remarque : Utilisez dendrimère solution mère dans les 6 mois de préparation.
    2. Laisser agir la solution A pendant 10 min et préparer les solutions B et C après le tableau 2.
    3. Laisser agir la solution C pendant 10 min et préparer des solutions D, E et F suivant le tableau 2.
    4. Conserver les solutions B, C, D, E et F à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Solution A peut être stockée à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
  2. Durcie de dendrimères RGD-Cys-D1 sur les substrats
    1. Sous une hotte de culture tissulaire, stériliser les substrats en les irradiant avec lumière UV pendant 13 min.
      Remarque : Cette étape est nécessaire uniquement lorsque nanopatterned substrats vont servir de substrats de culture cellulaire. Dans ce cas, maintenir les conditions stériles (hotte de culture de tissus, matériel stérile, solutions et techniques) pour les étapes suivantes.
    2. Placer chaque substrat de face vers le haut dans les puits d’une plaque, manipuler avec soin avec des pincettes.
    3. Laisser agir pendant 10 min des solutions B, C, D, E et F.
    4. Passer les solutions de dendrimer RGD-Cys-D1 à travers un filtre de diamètre 0,22 µm en utilisant une seringue directement dans les puits contenant les substrats (2 mL/puits). Au moins trois répliques par dendrimère concentration sont recommandés. Fermer et sceller la plaque et laisser à température ambiante (RT) pendant 16 h.
    5. Retirez et jetez les solutions. Laver les substrats avec de l’eau désionisée stérile et sec. Magasin de substrats à 4 ° C.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

3. préparation de substrats de contrôle

Remarque : Toutes les mesures ont été effectuées dans une hotte de vitroplants stérile et uniquement du matériel stérile, solutions et techniques ont été utilisées. Au moins, six contrôler substrats ont été utilisés (trois répliques du contrôle positif) et trois répliques de contrôle négatif.

  1. Sous une hotte de culture tissulaire, stériliser les substrats en les irradiant avec lumière UV pendant 13 min.
  2. Substrats de contrôle pour expérience adhésion des fibroblastes.
    1. Utilisez flamme-recuit au (111) substrats comme contrôle négatif. Or a un effet bien connu de protéine-dénaturation qui confère des propriétés adhésives anti-cellule28. Soniquer toutes les solutions et filtrer avant l’incubation du substrat.
    2. Pour les contrôles positifs, immerger le recuit à la flamme des substrats au (111) dans une solution de PEG RGD modifié thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glycol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 et triéthylène glycol mono-11-mercaptoundecyl éther (PEG-SH) dans un rapport molaire de 1 : 100 en éthanol à 96 % pendant 16 h à température ambiante.
    3. Laver soigneusement les substrats dans l’éthanol, puis séchez-les avec argon. Magasin de substrats à 4 ° C.
  3. Contrôle des substrats pour chondrogenèse.
    1. Utiliser des substrats PLLA vierges comme contrôle négatif. Sans traitement de surface, PLLA montre pauvre interfaçage avec les cellules vivantes. 31
    2. Pour les témoins positifs, préparer les 5 mL de la fibronectine 0,1 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber chaque substrat PLLA avec 1,6 mL de la solution de la fibronectine pendant 1 h à température ambiante.
    3. Retirer et jeter la solution de la fibronectine et laver les substrats avec du PBS. Magasin de substrats à 4 ° C.

4. surface caractérisation

  1. Imagerie de l’AFM
    1. Effectuer l’imagerie AFM de substrats PLLA pour une analyse de la rugosité. Étant donné que les dendrimères ont un diamètre de 4-5 nm, des valeurs de rugosité de 1 nm doit être obtenue pour la visualisation correcte de la nanopatterns. En outre, effectuer imagerie AFM de la nanopatterns. Dans les deux cas, effectuer l’AFM en tapant mode dans l’air.
    2. Sélectionnez un cantilever en silicone avec un ressort de constante k = 40 N/m et une fréquence de résonance ν = 300 kHz et montez-la sur l’équipement de l’AFM.
    3. Monter l’exemple sur la scène du microscope à force atomique. Selon la configuration de l’appareil, tuning et imagerie spécifications peuvent varier. Consulter le manuel du fabricant.
    4. Approcher l’échantillon avec la pointe du microscope jusqu’au contact.
    5. Pour l’image de PLLA pour l’analyse de la rugosité, sélectionnez au moins quatre zones représentatives de 20 x 20 µm par substrat dans trois substrats indépendants. Dendrimère nanopatterns l’image, choisissez au moins trois images représentatives de 5 × 5 µm par substrat de trois substrats indépendants par État (concentration initiale dendrimère dans la solution). Pour éviter d’endommager la couche dendrimère tout en imagerie, réglez la valeur de consigne pour maintenir la force à un minimum.
      Remarque : Le choix de la zone d’imagerie dépend aussi la plage de travail du scanner piézoélectrique. Veuillez consulter le manuel de l’instrument à cet égard.
    6. Processus des images en ajustant la hauteur de l’AFM chaque scan line à polynôme nivellement des fonctions en utilisant le logiciel du fabricant de l’appareil de l’AFM et d’analyser ceux de PLLA pour calculer la rugosité de surface. Moyenne-racine carrée (RMS) analyse peut fournir une option appropriée.
  2. Mesure de masse surfacique RGD local.
    1. Obtenir les seuils d’image des images AFM hauteur transformés pour sélectionner les dendrimères sur la surface.
    2. Déterminer la position de la particule à l’aide d’une logiciel de traitement d’image et utilisez-les pour obtenir les distances minimales entre (dmin).
    3. Tracer les valeursmin den z pour les positions de particule correspondante pour obtenir les cartes de contour de probabilité pour dmin. Ajuster l’échelle colorimétrique de l’intrigue de visualiser les régions de plus haute densité superficielle de RGD locale (dmin < 70 nm).
    4. Quantifier la superficie des régions avec la plus forte densité surface à local RGD en utilisant une logiciel de traitement d’image. Portent sur les domaines des agrégats dendrimère dans le calcul.
  3. Imagerie de la STM.
    Remarque : L’imagerie STM peut être effectuée que pour nanopatterns sur des substrats conducteurs au (111). Mesures sont effectuées dans l’air.
    1. Placer le substrat de nanopatterned dans le porte-échantillon de l’équipement de la STM. Vérifiez la connexion électrique entre l’échantillon et titulaire avec un testeur.
    2. Etch une astuce du matériau sélectionné sonde (i.e. PT 0,8 : Ir 0,2) avec un diamètre qui assure le bon ajustement sur la tête de l’équipement de la STM. La gravure peut être effectuée soit par découpe manuelle ou par gravure électrochimique. 32
      Remarque : La gravure électrochimique rend plus symétrique de conseils.
    3. Monter l’embout dans la tête de l’équipement de la STM et connecter l’échantillon.
    4. Régler le « courant » dans la voie de retour (dans ce type de mesure, actuelle sera constante par le réglage de vos commentaires). Régler la tension de polarisation et l’actuel point de consigne et la taille de scan pour obtenir une image bien résolue une fois que l’extrémité est insérée.
      Remarque : Le choix de la zone d’imagerie dépend aussi la plage de travail du scanner piézoélectrique. Veuillez consulter le manuel de l’instrument à cet égard.
    5. Processus les images topographiques STM en ajustant chaque ligne de numérisation au nivellement polynomiale fonctionne en utilisant le logiciel du fabricant de l’appareil de la STM.
  4. Mesures de CA.
    1. Mesure CA sur les nanopatterned des substrats par la méthode de la goutte sessile à trois positions différentes sur trois substrats indépendants par État (concentration initiale dendrimère en solution) avec un système optique de CA.
    2. Remplir la microseringue avec de l’eau désionisée et réglez les paramètres dans le logiciel CA pour produire des gouttes de 1 µL.
    3. Placez l’échantillon sur la scène afin que la surface de l’échantillon est clairement visible sur l’ordinateur pour l’imagerie.
    4. Placez la seringue avec le micromanipulateur jusqu'à ce qu’il se rapproche de la surface et déposer la goutte dans la surface. Enregistrer l’image immédiatement après la stabilisation de la gouttelette.
      Remarque : Dans les mesures de CA, il est très important de contrôler l’humidité afin d’obtenir des résultats reproductibles.
    5. Analyser le tas mesuré avec le logiciel du fabricant de l’appareil CA. La méthode de lissage peut être ajustée aux besoins des utilisateurs. La méthode de lissage elliptique peut être une option.

5. Culture cellulaire

Remarque : Toutes les mesures ont été effectuées dans une hotte de culture de tissus et uniquement du matériel stérile, des solutions et techniques ont été utilisées.

  1. Expérience d’adhérence des fibroblastes.
    1. La culture de fibroblastes embryonnaires de souris 3 t 3 NIH de premiers passages (< 10) à 37 ° C et 4,6 % CO2 atmosphère dans le milieu de base avec une forte concentration de glucose additionnée de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % L-glutamine, pyruvate de sodium pénicilline-streptomycine et 1 % 1 % (croissance moyenne). T75 flacons pour un ensemencement total de 500 000 cellules par flacon de 10 mL de milieu de croissance sont recommandés.
    2. Éliminer le vieux milieu avec une pipette 10 mL tous les 2 jours et remplacer par 10 mL de milieu de croissance fraîchement préparée.
    3. Cellules en culture dans le milieu de croissance jusqu'à ce qu’ils atteignent près de 80 % de confluence, puis enlevez le milieu et ajoutant 5 mL de trypsine par flacon. Afin d’assurer le détachement cellulaire appropriée du fond de la fiole, maintenir la solution de trypsine en contact avec les cellules pendant 5 min à 37 ° C.
    4. Ajouter 5 mL de milieu de culture par flacon et recueillir les cellules dans un tube à centrifuger. Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de croissance. Déterminer la concentration de cellules utilisant un hémocytomètre.
    5. Transférer les substrats bien en plaques non traitées pour culture de tissus (non adhérents).
    6. Les cellules sur les substrats à une densité de 4 000 cellules/cm2 dans le milieu des semences et les incuber pendant 4,5 heures à 37 ° C et 10 % CO2 atmosphère.
  2. Chondrogéniques Induction de MSCs.
    1. La culture humaines MSCs de passages au début (< 5) à 37 ° C et 4,6 % CO2 atmosphère dans le milieu de croissance de MSC. T75 flacons pour un ensemencement total de 500 000 cellules par flacon de 10 mL de milieu de croissance sont recommandés.
    2. Changer de support tous les 3 jours (voir 5.1.2).
    3. Trypsinize cellules avant la confluence de 80 % est atteint et centrifuger et remettre en suspension dans un milieu de croissance de MSC (tel que décrit au point 5.1.3). Déterminer la concentration de cellules utilisant un hémocytomètre.
    4. Centrifuger les cellules à nouveau et leur resuspendre dans 10 mL de milieu induisant chondrogenèse.
    5. Transférer les substrats des plaques aux nouvelles plaques bien ne pas traitées pour la culture de tissus (non adhérents). Les semences des cellules sur les substrats à une densité de 3 000 cellules/cm2.
    6. Changer le support de chondrogéniques tous les 3 jours (voir 5.1.2).

6. Fixation et immunomarquage des cellules

Remarque : Les étapes suivantes peuvent être effectuées dans des conditions non stériles.

  1. Retirez le support et laver les cellules doucement avec du PBS. Fixez-les en ajoutant une solution de formol à 10 % pendant 20 min à température ambiante.
  2. Retirez le formol et laver les cellules avec du PBS.
  3. Bloquer les groupes aldéhyde libre en ajoutant une solution de 50 mM de chlorure d’ammonium (NH4Cl) dans du PBS. Laissez les cellules pendant 20 min à RT. supprimer NH4Cl solution et laver les cellules avec du PBS.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C.
  4. Retirez les PBS et permeabilize des cellules en ajoutant une solution à 0,1 % de saponine dans la solution de saturation (1 % d’albumine dans du PBS) pendant 10 min à RT. Wash les cellules avec du PBS et transférer les échantillons à une nouvelle plaque bien.
  5. Incuber les cellules avec une solution d’anticorps primaires dans la solution de saturation (tableau 3) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, enlever la solution de l’anticorps primaire et laver les cellules avec du PBS.
  6. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires dans la solution de saturation (tableau 3) pendant 1 h à température ambiante.
    NOTE : Éviter la lumière l’exposition.
  7. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et laver les cellules avec du PBS et sec.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Stocker les échantillons dans du PBS à 4 ° C dans l’obscurité.
  8. Montage d’échantillon pour l’observation de microscope : à l’aide d’un cutter pointe diamant, couper des lamelles couvre-objet en distribuer 50 µL de 1,25 cm x 1,25 cm. de microscopie moyen sur les échantillons de montage et recouvrir délicatement avec les lamelles coupées.
  9. Transférer les échantillons à un destinataire commode, couvrez-la de papier d’aluminium et magasin dans l’obscurité à 4 ° C jusqu’en observation.

7. cellule d’imagerie et d’analyse des données

Remarque : Pour substrats d’axée sur les micro-lames épais et opaque au (111), un microscope vertical doit être utilisé.

  1. Expérience d’adhérence des fibroblastes.
    1. Utiliser un microscope à épifluorescence équipé d’un appareil photo numérique et la basse (X 10) et le grossissement élevé (c'est-à-dire 40 X) objectifs. Effectuer des mesures dans l’air.
    2. Placer l’échantillon sur les noyaux des cellules de la scène et image avec l’objectif de 10 X à l’aide d’une excitation UV, filtre d’émission longpass visualiser la tache de Hoechst/DAPI.
    3. Cytosquelette des cellules image et adhérences focales (FAs) avec l’objectif X 40, en sélectionnant le filtre microscope correspondant aux particularités du fluorochrome anticorps.
    4. Pour la quantification de la FA, utilisez un logiciel de traitement d’images pour convertir les images 8 bits. Supprimer les images de fond et de convertir en binaire en définissant un seuil. Calculer au moins 30 images par échantillon et envisager des FAs de 1 µm2 pour le calcul.
  2. Chondrogéniques Induction de MSCs.
    1. Image des condensats de la cellule aux stades initiaux de l’induction chondrogéniques (< 5 jours) avec un microscope à épifluorescence vertical équipé d’un appareil photo numérique et un plus bas (c'est-à-dire 10 X) objectif de grossissement. Filtre d’émission ultraviolet excitation et longpass permet de visualiser la tache de Hoechst/DAPI.
    2. Pour mesurer les superficies de condensat, utiliser un logiciel de traitement d’image, convertir les images 8 bits, supprimer l’arrière-plan et sélectionnez un seuil qui met en valeur le contour global. Calculer la surface des particules.
    3. Échantillons d’image immunocolorées pour SAF, fibres d’actine cytosquelette et spécifique du cartilage collagène type II alpha 1 (COL2A1) avec un microscope confocal vertical à fort grossissement (c'est-à-dire 40-60 X). Recueillir des sections à un intervalle représentant (soit 0,5 à 1 µm).
    4. Pour traiter la pile, utilisez une logiciel de traitement d’image. Convertir les images 8 bits, supprimer le fond et les rendre binaire en définissant un seuil. Traiter un minimum de trois condensats cellulaire par la condition de trois échantillons indépendants.
    5. Quantifier la protéine FA colorée des secteurs de la zone basale des condensats de la cellule et les exprimer en pourcentage correspondant de zone divisée par le nombre de noyaux de cellules dans l’image.
    6. Pour mesurer la coloration COL2A1, utiliser confocal z-projections et quantifier la somme de la surface projetée (superficie maximale de COL2A1 par exemple). Normaliser la valeur de la zone obtenue contre la zone de l’eau de condensation correspondante.

8. quantitative Reverse Transcription-polymérase Chain Reaction (qRT-PCR) analyse

Remarque : Pour empêcher la contamination de la RNase, utiliser la vaisselle en plastique jetable, stérile et porter des gants jetables lors de la manipulation des réactifs et l’ARN. Toujours utiliser des techniques aseptiques microbiologiques appropriés et utiliser une solution de décontamination appropriée pour éliminer la contamination de RNase de surfaces de travail et des articles réutilisables tels que les centrifugeuses et les pipettes.

  1. Isoler l’ARN total et il pulvérise dans un disrupteur RNA. Traiter des échantillons d’ARN à la DNase et convertissez-les en utilisant un kit de synthèse de cDNA de cDNA.
  2. Conduite qRT-PCR en utilisant des amorces pour le facteur de transcription SOX9. Bêta-2-microglobuline (B2M) et protéine ribosomique L13a (RPL13a) peut être utilisé comme gènes domestiques.
  3. Calculer les niveaux d’expression et normaliser contre le contrôle négatif (PLLA).

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Representative Results

Nous présentons une méthode de structuration qui permet l’adhérence de surface à traiter à l’échelle nanométrique (Figure 1). La structure chimique de la RGD-Cys-D1 est montrée dans la Figure 1 a. Dendrimères ont été modelés sur des surfaces conductrices électriques d’au (111) pour la haute résolution de caractérisation de la STM. Dendrimère faible concentration en solution (jusqu'à 10-5% w/w) a rendu des dendrimères isolés de 4 à 5 nm de diamètre (Figure 1 b), tout en fortement tassée dendrimère agrégats formés à des concentrations plus élevées (Figure 1). Caractérisation de surface AFM (Figures 1-D-G, rangée supérieure) a révélé que la répartition en surface de dendrimères RGD-Cys-D1 peut être ajustée en fonction de la concentration initiale dendrimère en solution. Sur les cartes de contour de probabilité pour dmin, cela se traduit par différentes densités de nanoscale RGD locales sur la surface (Figures 1-D-G, rangée inférieure).

Dans les expériences de culture cellulaire, les membrane de la cellule récepteurs intégrines d’environ 10 nm de diamètre reconnu la séquence RGD sur la périphérie de dendrimères. Bien que huit exemplaires de cette séquence ont été fournis par dendrimère, seulement un dendrimère interagi par intégrine en raison de sa taille (4 à 5 nm mesurée par la STM ; Figure 1 b). Autrement dit, chaque dendrimère fourni un site unique pour la liaison de l’intégrine, ainsi permettant une corrélation directe de dendrimer distribution (comme on le voit dans les images de l’AFM) et la distribution de RGD disponible pour adhésion cellulaire. En outre, aucune variation significative ont été trouvées dans les valeurs de CA obtenues pour les configurations de nanostructures différents qui peuvent influencer la cellule adhérence29. Ces caractéristiques rendent dendrimère nanopatterns sur substrats adéquats surfaces biocompatibles qui modulent et étudient le comportement de la cellule.

Adhérence cellulaire à nanopatterned au (111) a été testé avec les fibroblastes durant le premières 24 h de culture (Figure 2 a) et avec MSCs sur nanopatterned PLLA (Figure 2 b). Dans les deux cas, le pourcentage de surface colorées pour le paxillin de protéine de FA (pax) augmenté progressivement dendrimère concentration, à l’instar du local RGD masse surfacique (pourcentage de la zone de nanopatterned avec dmin sous le seuil de 70 nm à l’adhérence cellulaire efficace ; Tableau 4). Pour une concentration initiale dendrimère de 10-2% w/w et contrôles positifs, le pourcentage de surface colorent pour pax par cellule a diminué et la corrélation avec le pourcentage de la zone de nanopatterned avec dmin < 70 nm a été perdue.

Le pourcentage de la superficie occupée par dmin < 70 nm (rangée inférieure-G de laFigure 1et tableau 4) est une bonne indication de la masse surfacique RGD local pour nanopatterns jusqu'à 10-5% w/w dendrimère initiale concentration, mais pas de ceux jusqu'à 10-2% w/w, en raison de dendrimer agrégation. L’agrégation produit des échantillons très hétérogènes sur le plan de distribution de ligand, avec seulement un petit pourcentage de la surface avec les valeursmin dsous le seuil de 70 nm (rangée inférieure dela Figure 1 et tableau 4). XPS résultats ont montré que ces surfaces présentent une densité RGD globale comparable à 10-5% w/w-dérivé nanopatterns28. Cette observation indique que la densité maximale de RGD a été atteint dans les régions contenant des agrégats de dendrimer et que le pourcentage de la superficie occupée par dmin < 70 nm n’est pas représentative de la densité de surface de RGD locale dans cette affaire.

L’observation que les témoins positifs (revêtements homogènes) avec maximum local RGD masse surfacique ne démontrait pas l’augmentation prévue dans l’adhésion cellulaire peut être attribuée à un effet stérique. Ces résultats indiquent que, par rapport aux surfaces homogènes correspondants couramment utilisés en culture cellulaire, RGD nanopatterns soutenir adhésion cellulaire plus efficacement. Cette constatation souligne donc l’importance de la densité locale de ligand.

Interactions avec le milieu environnant dans la morphogenèse de déclenchent les premières épreuves de la différenciation cellulaire et les propagent jusqu'à la mise en place des structures de tissu complexe final. Pour évaluer les effets de dendrimer nanopatterns sur adhésion cellulaire et la différenciation, nous avons utilisé l’induction chondrogéniques de MSCs comme un modèle. Pendant chondrogenèse, il y a matrice active remodelage, qui joue un rôle instructif dans la direction de cellules à travers les différentes étapes de la formation du cartilage.

MSCs a subi une chondrogenèse sur le nanopatterns (Figure 3). Chondrogéniques différenciation commence par un pas de condensation de cellules, qui implique le recrutement de cellules pour former des condensats denses, l’établissement de la communication de cellule-cellule et des modifications concomitantes dans cellule morphologie33. Figure 3 a montre survenus dans tous les substrats et les condensats de cette condensation de cellules a augmenté dans la zone avec des concentrations croissantes de dendrimer jusqu'à 2,5 x 10-8% p/p la partie condensat puis a diminué à nouveau pour un dendrimère concentration de 10-2% w/w et pour le contrôle positif. L’étape de condensation de cellules dans chondrogenèse se produit par le mouvement de la cellule active, plutôt que par une augmentation de la prolifération cellulaire34. Ce mouvement cellulaire est favorisé par l’adhérence souple avec le substrat : adhérences stables doivent être formés afin de permettre à des forces de traction à déplacer le corps de la cellule, et en même temps, ces adhésions doivent être suffisamment faibles pour permettre la cellule libération du substrat au cours mouvement. Condensation de la cellule est favorisée par une augmentation en densité de surface locale RGD jusqu'à 2.5x10-8% w/w-dérivé de nanopatterns, avec un bon équilibre entre adhésion cellulaire et mouvement cellulaire. 10-2 et le contrôle positif, la densité de surface de RDG locale était trop élevée, altérant ainsi l’événement de la condensation.

Chondrogéniques différenciation produit de condensats prechondrogenic : cellules dans les condensats de devenir plus arrondies et commencer la synthèse des marqueurs spécifiques du cartilage tels que la protéine ECM COL2A1 et la facteur de transcription SOX933, 34 , 35. en conséquence, les substrats avec un intermédiaire de l’adhérence, favorisant la formation de condensats de la cellule, a montré supérieur COL2A1 coloration (Figure 3 b) et des niveaux plus élevés d’expression de l’ARNm SOX9 (Figure 3).

Nos résultats mettent en évidence l’influence des interactions entre la matrice de cellules durant les premiers stades de différenciation chondrogéniques. Ces interactions peuvent être facilement résolues au moyen de nanopatterns dendrimère-basé.

Étape Heure (s) Vitesse (tr/min) Accélération (s/t/min)
1 5 500 300
2 30 3 000 1 500

Tableau 1 : étapes de programme Spinner utilisés pour recouvrir les plaques en verre avec la solution ainsi préparée PLLA. Une première étape d’homogénéisation servait à 500 tr/min avec une accélération de 300 tr/min/s à 5 s. suivie d’une dernière étape à 3 000 tr/min avec une accélération de 1 500 tr/min/s pendant 30 s.

Solution RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) Eau MQ (µL)
A 0,77 5 6 494
RGD-Cys-D1 (% w/w) Solution un (µL)
B 10-2 779 5 220
C 10-5 0,78 6 000
Solution C (µL)
D 2,5 x 10-8 15,0 5 985
E 10-8 6.0 5 994
F 4 x 10-9 2.4 5 998

Tableau 2 : Détails de la préparation des solutions RGD-Cys-D1. Une solution mère de dendrimères RGD-Cys-D1 a été préparée à une concentration finale de 0,77 mg/mL (solution A), d'où les solutions B et C ont été préparées à 10-2 et 10-5% w/w concentrations. Solution C dont la concentration 10-5% p/p de dendrimer RGD-Cys-D1 a été utilisée pour préparer des solutions D, E et F à la concentration finale de 2. 5 x 10-8, 10-8 et 4 x 10-9% p/p, respectivement.

Nom Volume (µL) Tampon de blocage (mL)
Mélange primaire MAb de lapin à la pax 65 12.870
MAb de souris à COL2A1 32,5
Mix secondaire Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris 13 12.961
Anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 568 13
Solution de Hoechst 13

Tableau 3 : préparation de solution d’anticorps. Monoclonal dirigé mélange contenue l’anticorps primaire contre pax produite chez le lapin dilué 1 : 200 dans la solution de saturation avec un anticorps monoclonal contre COL2A1 produites en souris diluée 1 : 400 dans la solution de blocage. Le mélange de l’anticorps secondaire placés la tache de noyaux de cellules Hoechst et l’anticorps secondaires produites par chèvre contre les souris et le lapin respectivement (étiqueté avec Alexa Fluor 488 et 568 fluorophores, respectivement).

Figure 1
Figure 1 : RGD-Cys-D1 dendrimère durcie pour le contrôle de l’échelle nanométrique de masse surfacique RGD local. (A) RGD-Cys-D1 dendrimère structure contenant jusqu'à huit exemplaires du peptide RGD adhésif cellulaire. Images représentant STM (biais = 200 mV, point de consigne = 0,5 nA) de RGD-Cys-D1 nanopatterns au (111) d’une solution aqueuse initiale de 10-8% p/p (barre d’échelle = 3 nm, B) et le profil de hauteur-distance correspondant obtenu sur les pointillés région figurant aux points (B)et (C) de 10-2% w/w montrant dendrimère agrégation (barre d’échelle = 20 nm). (D-G) Images représentant AFM de RGD-Cys-D1 nanopatterns sur PLLA obtient à partir de solutions aqueuses dendrimère correspondante de 10 %-2, 2,5 x 10-8%, 10-8% et 4 x 10-9% w/w, respectivement (section Echelle = 1 µm). La carte de contour de probabilité distance interparticulaires minimale (dmin) correspondante apparaît en dessous de chaque image AFM, à haute densité régions RGD en rouge foncé (dmin < 70 nm). Agrégats de dendrimères et dendrimère sont représentés en noir pour plus de clarté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cell adhesion sur la RGD-Cys-D1 nanopatterns. Terrain de pourcentage de surface coloré pendant la pax FA de protéine par cellule pour les cellules en contact avec le substrat (axe gauche) avec la concentration initiale dendrimère. Les valeurs sont comparées avec la densité de surface locale du RGD (pourcentage de surface dans le nanopatterns contenant les valeursmin dsous le seuil de 70 nm) (axe de droite) avec des coefficients 100 et 0 attribués au positif (+ contrôle) et négatifs (- commande de contrôle), respectivement. Adhérence de fibroblastes (A) sur nanopatterns dendrimère au (111) après 4,5 h de culture. (B) adhésion MSC sur dendrimère nanopatterns sur PLLA évaluée au jour 1 de l’induction chondrogéniques. Les valeurs sont donnés sous forme de moyenne avec l’écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

RGD-Cys-D1 (% w/w) Zone (< dmin = 70 nm) (%) au (111) Zone (< dmin = 70 nm) (%) sur PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 ± 65 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

Tableau 4 : pourcentage de superficie avec d min les valeurs inférieures à 70 nm obtenu pour la déposition de dendrimer RGD-Cys-D1 sur au (111) et PLLA surfaces en fonction des concentrations initiales dendrimère utilisé.

Figure 3
Figure 3 : Chondrogéniques de différenciation de MSCs sur les nanopatterns RGD-Cys-D1. (A) Condensation de MSCs cultivés sur RGD-Cys-D1 nanopatterns sur PLLA après 5 jours d’induction chondrogéniques. Images représentant épifluorescence des noyaux de cellules colorées (Hoechst ; Echelle = 300 µm ; rangée du haut) et l’intrigue de la zone des condensats (rangée inférieure) de la cellule obtenue sur RGD-Cys-D1 nanopatterns dendrimère initiales différentes concentrations. Différenciation procède à l’étape de condensation cellulaire avec l’expression de marqueurs spécifiques chondrogéniques : (B) pourcentage de la superficie de COL2A1 coloration normalisé avec la zone du condensat cellulaire des z-projections confocal correspondants obtenue après 5 jours d’induction chondrogéniques. (C) Relative SOX9 ARNm (contre témoin négatif) après 3 jours d’induction chondrogéniques. Les valeurs sont donnés sous forme de moyenne avec l’écart-type (B) et (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Lors de l’élaboration du protocole décrit, on envisagera un certain nombre d’étapes critiques. Le premier se réfère à la caractérisation de nanostructures avec techniques de microscopie de sonde à balayage. Pour visualiser la nanopatterns, la surface où la structuration est produite doit avoir une valeur de rugosité au-dessous du diamètre moyen des dendrimères, qui est d’environ 4 à 5 nm tel que mesuré par la STM (Figure 1 b). En outre, il devrait tenir compte du fait que l’imagerie haute résolution STM se limite à des substrats conducteurs, en l’occurrence au (111). Toute levée du polymère des coins de la diapositive après l’enduction centrifuge peut être corrigé à l’aide de colle biocompatible.

Dendrimère durcie est un processus permettant de parvenir à sous contrôle de l’adhérence cellulaire locale à l’échelle nanométrique. Basé sur l’auto-assemblage de dendrimères sur la surface par adsorption, cette technique ne nécessite pas un équipement complexe durcie, contrastant ainsi avec précédemment décrit des méthodes axées sur la lithographie36,37, 38. dendrimère durcie peut être facilement transposé aux grandes surfaces et est entièrement compatible avec les protocoles de culture de cellules.

La méthode de durcie de dendrimer décrite ici peut rechercher des futures applications en médecine régénérative. Le contrôle exercé par dendrimère durcie sur l’adhérence cellulaire rend cette technique adapté pour le conditionnement des biomatériaux avant l’implantation, ce qui facilite leur intégration dans les tissus de l’hôte. De plus, la facilité avec laquelle dendrimère portions périphériques peuvent être modifiées rend dendrimère durcie appropriée d’autres ligands qui exercent l’activité dépendante de la concentration sur les cellules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent Oriol Font-Bach et Albert G. Castaño pour leur aide dans la quantificationmin d. Ils reconnaissent également l’unité de microscopie numérique avancé à l’Institut de recherche en biomédecine (IRB Barcelona) pour laisser les auteurs à enregistrer la vidéo dans leurs locaux. Ce travail a été soutenu par le réseautage Biomedical Research Centre (CIBER), Espagne. CIBER est qu'une initiative financée par le VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programme de Consolider, CIBER Actions et l’Instituto de Salud Carlos III, avec le soutien du Fonds européen de développement régional. Ce travail a été soutenu par le Conseil des universités et de la Ministère de l’Innovation, des universités et entreprises de la Generalitat de Catalunya (2014 SGR / 1442). Il a également été financée par les projets OLIGOCODES (no. MAT2012-38573-C02) et CTQ2013-41339-P, décerné par le ministère espagnol de l’économie et la compétitivité, en outre à INTERREG V-A Espagne-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). La CRP reconnaît le soutien financier de la subvention espagnole du ministère de l’économie et la compétitivité (no IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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