मात्रात्मक फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 3 डी मैट्रिक्स में स्तनधारी सेल डिवीजन

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

इस प्रोटोकॉल कुशलता से 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में स्तनधारी सेल विभाजन के सेल विभाजन के तुल्यकालन द्वारा अध्ययन, 3 डी में विभाजन की घटनाओं की निगरानी लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर मैट्रिक्स, समय हल फोकल परावर्तन माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, L., Sneider, A., Chen, W., Karl, M., Prasath, V., Wu, P. H., Mattson, G., Wirtz, D. Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56364, doi:10.3791/56364 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

कैसे स्तनधारी कोशिका विभाजन का अध्ययन एक 3 डी वातावरण में विनियमित है काफी हद तक अपनी शारीरिक प्रासंगिकता और उपचारात्मक महत्व के बावजूद बेरोज़गार रहता है । अंवेषण की कमी के लिए संभावित कारण प्रयोगात्मक सीमाएं और तकनीकी चुनौतियों है कि 3 डी संस्कृति अक्षम में कोशिका विभाजन के अध्ययन प्रदान कर रहे हैं । यहां, हम एक इमेजिंग आधारित विधि का वर्णन कुशलता से स्तनधारी सेल विभाजन और 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में सेल-मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन । फ्लोरोसेंट H2B के साथ लेबल कोशिकाओं thymidine अवरुद्ध और nocodazole उपचार, एक यांत्रिक शेक से तकनीक के बाद के संयोजन का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं । सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं तो एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड रहे हैं । सेल डिवीजन लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की जाती है । के दौरान और कोशिका विभाजन के बाद कोलेजन फाइबर के विरूपण, जो सेल के एक संकेतक-मैट्रिक्स बातचीत है, पर नजर रखी जा सकता है और मात्रात्मक फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी का उपयोग मात्रा. विधि एक कुशल और सामांय दृष्टिकोण स्तनधारी कोशिका विभाजन और सेल मैट्रिक्स एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी वातावरण में बातचीत का अध्ययन प्रदान करता है । यह दृष्टिकोण न केवल सामांय ऊतक और रोगों के विकास के आणविक आधार में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, लेकिन यह भी उपंयास नैदानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोण के डिजाइन के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

कोशिका बँटवारा सेलुलर जीवन में एक महत्वपूर्ण घटना है, जो के विनियमन ऊतक और अंग विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. असामान्य बँटवारा प्राकृतिक आनुवंशिक विविधताओं, मानव बुढ़ापे प्रक्रियाओं में फंसा हुआ है, और कैंसर की प्रगति1,2,3,4,5. ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार की वृद्धि की दर सामान्य कोशिकाओं के साथ तुलना में कैंसर की पहचान में से एक है, तथ्य यह है कि सेल व्यवहार ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के बीच काफी विषम हैं और यहां तक कि रोगियों के बीच. होनहार नैदानिक परिणामों के बावजूद, कुछ नए विकसित antimitotic दवाओं नैदानिक परीक्षणों में प्रभावी होने के लिए नहीं दिखाया गया है6,7,8,9,10 ,11. प्रायोगिक और नैदानिक मॉडलों की प्रासंगिकता पर विचार किया जाना है । कई प्रकार के सामान्य स्तनधारी और कैंसर कोशिकाएं तीन आयामी (3डी) मैट्रिक्स में विभाजित होती हैं, जैसे कोलेजन I-रिच 3डी संयोजी ऊतकों में fibroblasts और fibrosarcoma कोशिकाओं और 3d stromal extracellular मैट्रिक्स (ECM) में मेटास्टेटिक कैंसर कोशिकाएं । हालांकि, स्तनधारी कोशिका विभाजन प्रयोगों और परख के विशाल बहुमत कोशिकाओं पर किया गया है दो आयामी (2d) सब्सट्रेट पर प्रसंस्कृत । एक इंजीनियर 3 डी मैट्रिक्स बेहतर microstructure, यांत्रिक गुणों दोहराऊंगा सकता है, और दोनों सामान्य और रोग ऊतकों के 3 डी ECM के जैव रासायनिक संकेतों12,13,14, 15,16,17.

कैसे स्तनधारी कोशिका विभाजन के अध्ययन 3 डी वातावरण में विनियमित है मोटे तौर पर दोनों शारीरिक प्रासंगिकता और चिकित्सीय महत्व18,19के बावजूद बेरोज़गार रहता है । संभावित कारणों में 3d मैट्रिक्स में कक्ष प्रभाग के अध्ययन से जुड़ी तकनीकी कठिनाइयों और प्रयोगात्मक चुनौतियां शामिल हैं. सेल बँटवारा पूरे सेल चक्र में एक छोटे से लौकिक अंश का गठन20. पिछले काम से पता चला है कि कई स्तनधारी कोशिकाओं के प्रसार की दर, जैसे मानव स्तन ग्रंथिकर्कटता MCF-7, मानव ऑस्टियो U2OS, और मानव जिगर HepG2, 3 डी सब्सट्रेट पर अपने समकक्षों के साथ तुलना में 3d मैट्रिक्स में बहुत कम है21, 22. इसके अलावा, 3d मैट्रिक्स में एंबेडेड कक्ष में और ध्यान से बाहर रहते सेल इमेजिंग के दौरान ले जाएं । इन कारकों के सभी 3d संस्कृति में सेल विभाजन की घटनाओं पर कब्जा करने की अत्यंत कम दक्षता इमेजिंग तकनीक का उपयोग करने में योगदान ।

ECM और कोशिकाओं के बीच बातचीत सेल डिवीजनों को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यहां, हम कुशलतापूर्वक 3d कोलेजन मैट्रिक्स में स्तनधारी सेल डिवीजन अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन । विधि कोशिकाओं को mitotic मार्करों के शामिल करने, सेल विभाजन के तुल्यकालन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3 डी में विभाजन की घटनाओं की निगरानी रहते सेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर मैट्रिक्स, समय हल फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी, और मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण । प्रतिदीप्ति-लेबल citrullinated प्रोटीन H2B पहले mitotic और चरण कोशिकाओं में अंतर करने के लिए एक मार्कर के रूप में कोशिकाओं में पेश किया जाता है । फिर कोशिकाओं thymidine अवरुद्ध और nocodazole उपचार, एक यांत्रिक शेक से तकनीक के बाद के संयोजन का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं । सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं को फिर सीधे 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में समझाया जाता है । सेल डिवीजन के कई कोशिकाओं की घटनाओं को कुशलतापूर्वक कम आवर्धन समय चूक लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं । कोलेजन फाइबर की विकृति है, जो सेल के एक संकेतक-मैट्रिक्स बातचीत है, उच्च आवर्धन पर फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की है ।

हम पहले इस तकनीक का इस्तेमाल किया है पर नजर रखने और सेल मैट्रिक्स बातचीत से पहले, दौरान और दो मेटास्टेटिक कैंसर सेल लाइनों, मानव इनवेसिव डक्टिंग कार्सिनोमा एमडीए-एमबी-२३१ और मानव fibrosarcoma HT1080 कोशिकाओं के बँटवारा के बाद 3 डी कोलेजन में 19मैट्रिक्स । यहां प्रस्तुत तरीके एक 3 डी वातावरण और सेल मैट्रिक्स बातचीत में दोनों स्तनधारी कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और सामांय दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । एमडीए-एमबी-२३१ सेल लाइन एक उदाहरण के रूप में कागज भर में प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल सामांय ऊतक और रोगों के विकास के आणविक आधार में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और भी उपंयास नैदानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोण के डिजाइन के लिए अनुमति सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल प्रदान की Homewood संस्थागत समीक्षा बोर्ड (HIRB) के दिशा निर्देशों के बाद ।

1. H2B की स्थिर अभिव्यक्ति-सेल बँटवारा के लिए एक मार्कर के रूप में mCherry

  1. मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK 293T) कोशिकाओं से lentiviral कणों की पीढ़ी
    1. प्लेट 5 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश पर HEK 293T कोशिकाओं/सेल कल्चर मीडियम में डिश (Dulbecco के संशोधित ईगल के मीडियम (DMEM) से युक्त उच्च ग्लूकोज (४.५ ग्राम/सोडियम पाइरूवेट, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1% पेनिसिलिन-streptomycin (Pen/Strep)). ३७ ° c और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) में 24 घंटे के लिए मशीन । अभिकर्मक के दिन कोशिकाओं के वांछित प्रवाह के बारे में ७०-८०% है ।
      नोट: HEK 293T कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है यहां वायरल कणों का उत्पादन करने के लिए, जो बाद में इस्तेमाल किया जाएगा transduce एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं में आदेश एक सेल लाइन H2B-mCherry व्यक्त छुरा उत्पंन करने के लिए । सुनिश्चित करें कि कक्ष समान रूप से थाली में वितरित कर रहे हैं । कोशिकाओं के अलावा थाली को छोड़ बुद्धिमान, और धीरे थाली आगे और पीछे चलती भी वितरण में सहायता कर सकते हैं । कोशिकाओं को भी अंय आकारों की प्लेटें या बोतल में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, जो वायरल कणों के विभिंन संस्करणों के संग्रह में परिणाम होगा ।
    2. तीन plasmids (lentiviral वेक्टर, सीएमवी ΔR ८.९१, और pMDG-VSVG) के साथ एक अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग करके HEK 293T कोशिकाओं को Transfect । प्लाज्मिड एन्कोडिंग H2B-mCherry एक lentiviral वेक्टर में phosphoglycerate कळेनासे प्रमोटर (PGK) के साथ क्लोन है । सीएमवी ΔR ८.९१ तीन एचआईवी जीन की आवश्यकता होती है, झूठ, पोल, और rev। pMDG-VSVG में VSV-जी लिफाफा जीन होता है.
      नोट: से चुनने के लिए एक से अधिक अभिकर्मक एजेंट्स हैं ।
      1. उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंचने के लिए अभिकर्मक एजेंट की शीशी की अनुमति दें । उल्टे या भंवर शीशी संक्षेप में ।
      2. डीएनए के 16 µ g को मिलाएं, जिसमें घटाए गए सीरम मीडिया के 1 मिलीलीटर में H2B-mCherry प्लाज्मिड, 8 µ जी के सीएमवी ΔR ८.९१, और µ-pMDG के 2 VSVG g के 6 µ g होते हैं । 5 मिनट के लिए आर टी पर मशीन ।
        नोट: राशि और तीन वैक्टर के अनुपात विविध और विभिंन lentiviral स्थानांतरण वैक्टर के लिए अनुकूलित है ।
      3. जोड़ें ४८ µ l (डीएनए के 1:3 अनुपात का उपयोग करें: अभिकर्मक रिएजेंट) अभिकर्मक रिएजेंट के ऊपर डीएनए समाधान में, और फिर आर टी पर कम से 15 मिनट के लिए मशीन ।
        नोट: डीएनए बनाम अभिकर्मक एजेंट का अनुपात अलग है और विभिंन lentiviral स्थानांतरण वैक्टर के लिए अनुकूलित । सुनिश्चित करें कि अभिकर्मक एजेंट १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के पक्ष से संपर्क नहीं है ।
      4. जोड़ें डीएनए-लिपिड जटिल समाधान में बनाया कदम 1.1.2.3 ड्रॉप-बुद्धिमान कोशिकाओं के लिए. थाली में परिसर का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए धीरे से थाली घूमता है ।
    3. लगभग 6 अभिकर्मक के बाद ज, मध्यम महाप्राण और ताजा सेल संस्कृति मध्यम (उच्च ग्लूकोज के साथ DMEM (४.५ g/L), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep) जोड़ें ।
    4. फसल supernatant 24, ४८, और ७२ एच पोस्ट अभिकर्मक । प्रत्येक फसल के बाद मध्यम बदलें (DMEM, ४.५ g/L ग्लूकोज, सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS के साथ, और 1% पेन/Strep).
    5. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एक ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से lentiviral कणों फिल्टर । वैकल्पिक रूप से, supernatant नीचे स्पिन करने के लिए बाहर सेल मलबे अलग । supernatant transduction सही दूर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. सेल लाइंस छुरा H2B-mCherry व्यक्त की पीढ़ी
    नोट: इस प्रोटोकॉल एमडीए-MB-२३१ कक्षों के लिए विवरण में वर्णन किया गया है । प्रयोग में प्रयोग करने से पहले, मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं एमडीए-एमबी-२३१ (भौतिक विज्ञान ऑन्कोलॉजी केंद्र, NIH) उच्च ग्लूकोज युक्त DMEM में संस्कृति रहे हैं (४.५ g/L), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep.
    1. एक ३५ mm संस्कृति डिश में 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं की थाली ।
      नोट: अलग सेल लाइनों के लिए चढ़ाना का घनत्व अनुकूलित किया जाना चाहिए, और इसलिए एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के लिए इष्टतम घनत्व से अलग हो सकता है ।
    2. 24 एच कोशिकाओं को चढ़ाना के बाद, वायरस के 1 मिलीलीटर और ताजा मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ जी/एल), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. रात भर के लिए 6 घंटे के एक समय अवधि के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: दोनों वायरस की मात्रा और मशीन समय अलग सेल लाइनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, अगर कोशिकाओं को स्वस्थ वायरस के अलावा कुछ ही घंटों के बाद नहीं लग रहे हो, का उपयोग 1 मिलीलीटर वायरस और ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ g/L), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep) चरण 1.2.2 के लिए । कदम 1.2.3 में मशीन समय की लंबाई भी कम किया जा सकता है ।
    4. मध्यम महाप्राण और ताजा मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ जी/एल), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS और 1% पेन/Strep) के 10 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c और 5% CO2पर 24 से ७२ h के बीच के लिए मशीन ।
    5. एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं में H2B-mCherry की अभिव्यक्ति की जाँच करें.
      नोट: transduction दक्षता कोशिकाओं में कम है, तो चरण २.२ में वायरस की मात्रा और चरण २.३ में मशीन समय बढ़ाया जा सकता है ।

2. छुरा H2B-mCherry व्यक्त कोशिकाओं का तुल्यकालन

  1. प्लेट ५० पर ६०% की कोशिकाओं को प्रभावित, यानी प्लेट 2 x 104 एमडीए-एमबी-एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं में २३१ कोशिकाओं ।
  2. ३७ ° c और 5% सह 24 घंटे के लिए2 पर संस्कृति की मशीन ।
  3. वृद्धि मध्यम से ०.५ मिलीलीटर (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ g/L), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep) 2 मिमी thymidine युक्त बदलें और 24 घंटे के लिए मशीन में छोड़ दें ।
    नोट: कक्ष विकास (G1)/DNA संश्लेषण (एस) संक्रमण और डीएनए संश्लेषण के निषेध के कारण एस चरण भर के चरण में thymidine करने के लिए उजागर कोशिकाओं को गिरफ्तार कर रहे हैं. मशीन समय की लंबाई विविध और अलग सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  4. उन्हें फास्फेट (पंजाब) तीन बार के साथ धोने से thymidine जोखिम से कोशिकाओं को रिहा. फिर, सामांय कोशिका संस्कृति मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ g/L), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS और 1% कलम/Strep) में 5 एच के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: thymidine एक्सपोजर से कोशिकाओं के रिलीज कोशिकाओं को सेल वृद्धि (G2)/mitotic (एम) पहले G1/s चरण में गिरफ्तार कक्षों के लिए चरण, और एस चरण में पहले गिरफ्तार कोशिकाओं के लिए G1 चरण के लिए प्रगति करने के लिए अनुमति देता है । रिलीज के समय की लंबाई अलग और विभिंन सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  5. 12 एच के लिए nocodazole के २५० एनजी/एमएल के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक ।
    नोट: nocodazole के संपर्क में आने वाली सभी कोशिकाएं G2/ Nocodazole साइटोटोक्सिक है । लंबे समय तक nocodazole के लिए जोखिम apoptosis पैदा कर सकता है । अवधि या विभिन्न सेल लाइनों के लिए जोखिम की एकाग्रता समायोजित करें अगर कोशिका मौतों मनाया जाता है. सफलतापूर्वक सिंक्रनाइज़ किए गए कक्ष एक गोलाकार आकृति विज्ञान प्रदर्शित करेगा ।
  6. ४५ एस 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को हिला १५० पर एक कक्षीय शेखर का उपयोग करने के लिए २०० rpm ।
    नोट: Mitotic कोशिकाओं है, जो सब्सट्रेट करने के लिए थोड़ा पालन किया है, इस प्रक्रिया के दौरान बंद हिल जाएगा ।
  7. मध्यम एक केंद्रापसारक ट्यूब में pipetting द्वारा, कोशिकाओं को निकालने के लिए निकालें, और फिर ताजा मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ g/L), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep) की प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. चरण २.६ और २.७ तीन बार दोहराएँ ।
  9. एकत्र मध्यम mitotic कोशिकाओं से युक्त ८०० x g पर 3 मिनट के लिए ।
    नोट: यह चरण nocodazole को कक्ष माध्यम से निकालने के लिए उपयोग किया जाता है ।

3. कोलेजन मैं मैट्रिक्स में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं का निगमन

नोट: प्रकार मैं कोलेजन मानव शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है और संयोजी ऊतक के ECM में, और इस तरह व्यापक रूप से कैसे युकेरियोटिक सेल कार्यों एक 3 डी वातावरण द्वारा संग्राहक रहे है की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है17,23,24 . कोलेजन एसिटिक एसिड में घुलनशील है । बेअसर और 20-37 डिग्री सेल्सियस के लिए कोलेजन समाधान वार्मिंग के बाद, कोलेजन मोनोमर polymerize कोलेजन तंतुओं के एक meshwork में ।

  1. DMEM पाउडर का एक पैकेट, सोडियम बिकारबोनिट के ३.७ ग्राम (NaHCO3) और 4 की 1 जी-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) आसुत जल की ५० मिलीलीटर में भंग करके 10x DMEM समाधान तैयार करें । समाधान फ़िल्टर, और फिर आसुत जल के ५० मिलीलीटर में 2 ग्राम NaOH छर्रों भंग करके सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के 1 मीटर तैयार । फ़िल्टर और १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में समाधान aliquot ।
    नोट: इस चरण में सामांय DMEM समाधान नहीं किया जाना चाहिए । कोलेजन समाधान की महत्वपूर्ण मात्रा के अलावा मध्यम पतला होगा । इसलिए केंद्रित DMEM समाधान के लिए सुनिश्चित करें कि कोलेजन मैट्रिक्स में DMEM के अंतिम एकाग्रता सामांय DMEM के रूप में ही होगा तैयार है ।
  2. चरण २.९ से एकत्रित कक्षों के साथ कार्य करना जारी रखें । महाप्राण मध्यम, और पुन: निलंबित कक्ष के बारे में ०.२५-०.५ मिलीलीटर में ताजा सेल संस्कृति मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ ग्राम/एल), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% पेन/Strep) ।
    नोट: कोलेजन मैट्रिक्स में एक विशिष्ट कोशिका घनत्व तक पहुंचने के लिए, निलंबन में कोशिकाओं के प्रारंभिक घनत्व बहुत कम नहीं हो सकता । इस प्रकार, कक्षों को पुनः निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम की मात्रा उपलब्ध कक्षों की कुल संख्या पर निर्भर करेगी.
  3. प्लेस 10 µ एल की पुन: निलंबित सेल समाधान से एक hemocytometer पर ३.२ कदम और समाधान में कोशिकाओं के घनत्व गिनती ।
  4. सभी घटकों के लिए आवश्यक वॉल्यूम 3d कोलेजन मैट्रिक्स बनाने के लिए निर्धारित करते हैं । ५०० µ एल के 2 µ जी/µ एल कोलेजन जेल एक उदाहरण के रूप में यहां प्रयोग किया जाता है ।
    1. सेल समाधान की मात्रा की गणना ४०,००० कोशिकाओं/एमएल प्राप्त करने के लिए आवश्यक (या ५०० µ एल के लिए कोलेजन जेल के २०,००० कोशिकाओं) । µ l में यह संख्या X ५० 10x DMEM के µ l की जरूरत होगी. FBS की ५० µ l की जरूरत होगी ।
    2. की मात्रा की गणना कोलेजन मैं स्टॉक की जरूरत है । कोलेजन की एकाग्रता मैं चारों ओर है 4 µ g/µ l µ l में आवश्यक कोलेजन की मात्रा वाई है ।
    3. सोडियम हीड्राकसीड की मात्रा की गणना कोलेजन समाधान में एसिटिक एसिड बेअसर करने की जरूरत: Y µ एल कोलेजन * ०.०२३ * १००० = जेड µ एल NaOH की जरूरत है ।
    4. भरावन समाधान की मात्रा निर्धारित करें: (५०० µ l total gel-X µ l cells-५० µ l 10x DMEM-५० µ l के FBS-Y µ l कोलेजन-Z µ l NaOH) = R µ l
      नोट: भराव समाधान पानी आसुत है । यदि भराव समाधान की गणना की गई मात्रा एक ऋणात्मक संख्या है, तो सेल के निलंबन में मूल कोशिका घनत्व बहुत कम है. कोशिकाओं को फिर से नीचे घूमती है और मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ जी/एल), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS, और 1% कलम/Strep) की एक छोटी मात्रा में पुनः निलंबित की जरूरत है ।
  5. निंनलिखित क्रम में घटकों को एक साफ करने के लिए जोड़ें १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब: मध्यम में कोशिकाओं, 10x DMEM, FBS, (DI) पानी, कोलेजन, NaOH । बर्फ पर घटकों के सभी प्लेस के लिए नीचे कोलेजन समाधान के जमाना धीमा । बुलबुले के गठन को रोकने के लिए उचित pipetting तकनीकों का प्रयोग करें ।
  6. NaOH जोड़ने के बाद, एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ हल ध्यान से मिश्रण ।
    नोट: कोलेजन का जमाना तुरंत NaOH के अलावा के बाद शुरू होगा । मिश्रण सावधानी से और जल्दी से किया जाना चाहिए ।
  7. एक बार हल अच्छी तरह से मिलाया जाता है, 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान के ५०० µ एल जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 24-अच्छी तरह से थाली रखें । ३७ ° c पानी स्नान में ताजा सेल संस्कृति माध्यम प्लेस ।
    नोट: प्लास्टिक नीचे प्लेटें कम आवर्धन लाइव सेल microcopy जिसमें लेंस के काम की दूरी 1 मिमी से ऊपर है के लिए उपयोग किया जाता है । ग्लास नीचे प्लेट उच्च आवर्धन लाइव सेल माइक्रोस्कोपी उच्च के कम काम की दूरी के कारण के लिए उपयोग किया जाता है आवर्धन लेंस ।
  8. ५०० µ l को पूर्व-उष्ण मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज (४.५ g/l), सोडियम पाइरूवेट, 10% FBS और 1% पेन/Strep) की जेल 30 मिनट के ऊपर से ३.७ चरण पूरा करने के बाद जोड़ें ।

4.3d कोलेजन मैट्रिक्स में विभाजित कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग (कम इज़ाफ़ा)

नोट: कोशिकाओं की छवियाँ एक चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोप कि एक 10x उद्देश्य के साथ सुसज्जित है और इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित पर घुड़सवार एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे का उपयोग कर 2 मिनट के अंतराल पर एकत्र कर रहे हैं.

  1. लाइव सेल इकाई चालू करें उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर घुड़सवार । रुको जब तक तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्थिर, CO2 की एकाग्रता 5% पर है और आर्द्रता ७५% पर है ।
  2. माइक्रोस्कोप पर लाइव सेल इकाई में जैल की 24-well प्लेट रखो । प्लेट के नीचे का पता लगाएं और फिर उद्देश्य लेंस ले जाने तक माइक्रोस्कोप प्लेट के नीचे से लगभग ५०० µm पर केंद्रित है ।
    नोट: कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं है कि प्लेट के नीचे भी बंद कर रहे है पूरी तरह से 3 डी मैट्रिक्स में एंबेडेड नहीं हैं । प्लेट के नीचे से दूर ५०० µm इमेजिंग कोशिकाओं है कि कोशिकाओं को बढ़त प्रभाव16,17,25से प्रभावित नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करेगा ।
  3. कक्षों को ढूँढने के लिए अवस्था को चारों ओर ले जाएँ और इमेजिंग के लिए एकाधिक स्थितियाँ चुनें.
  4. समय-चूक प्रयोग को 2-ंयूनतम अंतराल पर सेट करें ।
    नोट: पदों की अधिकतम संख्या है कि 2 मिनट के अंतराल के दौरान लिया जा सकता है मोटर चालित चरण की गति के चलते सीमित है, और छवियों पर कब्जा करने के लिए जोखिम समय की लंबाई ।

5. कोलेजन नेटवर्क कोशिका विभाजन के दौरान विरूपण (उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी)

  1. लाइव सेल इकाई चालू करें उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर घुड़सवार । रुको जब तक तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्थिर, CO2 की एकाग्रता 5% पर है और आर्द्रता ७५% पर है ।
  2. के लिए unसना हुआ 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में कोलेजन फाइबर कल्पना, कॉंफ़िगर एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए केवल प्रतिबिंबित प्रकाश (४८८-एनएम) से ४८८-एनएम के लिए नमूना प्रबुद्ध इस्तेमाल किया लेजर पर कब्जा । लेजर का उपयोग करता है एक 60X जल-विसर्जन उद्देश्य, NA = १.२, WD = २०० µm, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित है ।
  3. नमूना रखो (कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं) रहते सेल इकाई में । प्लेट के नीचे का पता लगाएं और फिर उद्देश्य लेंस ले जाने तक माइक्रोस्कोप प्लेट के नीचे से लगभग १०० µm पर केंद्रित है । इमेजिंग कोशिकाओं है कि प्लेट के नीचे से दूर १०० µm सुनिश्चित करेंगे कि कोशिकाओं को बढ़त प्रभाव से प्रभावित नहीं कर रहे हैं ।
    नोट: यहां एक जल-विसर्जन उद्देश्य के बजाय एक तेल विसर्जन लेंस का प्रयोग किया जाता है क्योंकि तेल-विसर्जन लेंस के काम की दूरी के बारे में केवल १०० µm है । तेल के उपयोग-विसर्जन लेंस प्लेट के तल पर कांच की मोटाई के रूप में एक समस्या बन गया है के बारे में सामांय रूप से १०० µm ।
  4. कक्षों को ढूँढने के लिए अवस्था को चारों ओर ले जाएँ और इमेजिंग के लिए एकाधिक स्थितियाँ चुनें.
    नोट: फोकल माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकली वर्गों नमूने और केवल फोकल विमान से संकेत कब्जा । लाइव कोशिकाओं में और ध्यान से बाहर समय चूक प्रयोग के दौरान बढ़ सकता है । समय की लंबी अवधि के दौरान सेल छवियों के कैप्चरिंग को सक्षम करने के लिए, Z-स्टैक को 5 µm अंतराल पर क्रमिक स्लाइस से छवियां एकत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है । 25 µm फैले कुल 5 स्लाइस imaged हैं ।
  5. समय-चूक प्रयोग को 5 मिनट के अंतराल पर सेट करें ।
    नोट: 5 मिनट के अंतराल के रूप में इस्तेमाल किया है यहां के बजाय 2 धारा 4 में इस्तेमाल मिनट क्योंकि एकाधिक स्कैनिंग मोड, H2B के लिए प्रतिदीप्ति स्कैनिंग सहित-mCherry, कोलेजन के लिए स्कैनिंग प्रतिबिंब, और जेड के लिए स्कैन-ढेर स्कैनिंग, प्रत्येक स्थिति के लिए लागू कर रहे हैं । एकाधिक स्कैनिंग मोड का उपयोग कम आवर्धन इमेजिंग की तुलना में किसी स्थिति को स्कैन करने की गति को कम करता है ।
  6. कण इमेजिंग velocimetry (PIV) उप पिक्सेल संकल्प20के साथ का उपयोग कर उस सेल द्वारा लागू बलों के कारण एक सेल के आसपास के क्षेत्र में कोलेजन मैट्रिक्स की विकृति को बढ़ाता है. 2d छवियों पर इस विश्लेषण प्रदर्शन H2B-mCherry और कोलेजन फाइबर के दोनों संकेतों के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है । लागू अनिसोट्रोपिक कम पास छानने कोलेजन नेटवर्क के संकेत को बढ़ाने के लिए20
  7. आदेश में (xपर स्थित ब्याज की एक उप-छवि क्षेत्र के स्थानीय विस्थापन को मापने के लिए,y) फ़्रेम k से k+ 1 फ़्रेम करने के लिए, फ़्रेम kमें 15 × 15 पिक्सेल पर केंद्रित (x,y) की एक क्षेत्रीय विंडो निकालें । फिर सबसे अच्छा मिलान स्थानों की पहचान (x,y) * उन स्थानों के माध्यम से जो फ़्रेम k+ 1 में प्राप्त छवि में अधिकतम सामान्यीकृत क्रॉस-सहसंबंध गुणांक की सुविधा है । विरूपण वेक्टर (x,y) *-(x,y) के रूप में परिकलित की जाती है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस आलेख का लक्ष्य 3d मैट्रिक्स में स्तनधारी कक्ष विभाजन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक इमेजिंग-आधारित पद्धति प्रस्तुत करना है, और कक्ष और 3d extracellular मैट्रिक्स के दौरान और कक्ष विभाजन के बाद के बीच के इंटरैक्शन को बढ़ाता है. कोशिका बँटवारा के इमेजिंग की सुविधा के लिए, हम एमडीए-एमबी-२३१ lentiviral transduction का उपयोग कर कोशिकाओं में H2B-mCherry शामिल थे. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ H2B संयुग्मित एक mitotic मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है चरण कोशिकाओं से mitotic कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, और सेल बँटवारा के दौरान विभिन्न चरणों को परिभाषित करने के लिए19,20,26. इस विधि का उपयोग कर, हम एमडीए की पूरी डिवीजन प्रक्रिया-एमबी-२३१ की निगरानी करने में सक्षम थे छुरा H2B-mCherry 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में (आंकड़ा 1a) व्यक्त । Mitotic चरण परमाणु झिल्ली के विघटन के साथ शुरू किया (दौर; फ़्रेम 1, चित्र 1a); गुणसूत्रों के पुनः संगठन (prometaphase: फ़्रेम 2); सेल शरीर के बीच में गुणसूत्रों के संरेखण (metaphase; फ़्रेम 3); गुणसूत्रों की जुदाई (anaphase; फ़्रेम 4); गुणसूत्रों और परमाणु झिल्ली के पुनर्गठन, और दो बेटी कोशिकाओं के शवों की जुदाई (telophase/cytokinesis, फ़्रेम 5) ।

एक 3 डी मैट्रिक्स में कोशिकाओं की प्रसार दर आमतौर पर एक 2d सब्सट्रेट, जो 3 डी कम कुशल19में सेल विभाजन की निगरानी renders पर उनके समकक्षों की तुलना में बहुत कम है । 3d कक्ष विभाजन के अध्ययन की दक्षता बढ़ाने के लिए, हम thymidine, nocodazole, और सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक शेक-ऑफ तकनीक को संयोजित करने और एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं है कि mitotic चरण में हैं का चयन करने के लिए एक विधि कार्यरत हैं । सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं तो कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड थे । कई कोशिकाओं की विभाजन प्रक्रिया 10x आवर्धन पर लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर वास्तविक समय में नजर रखी गई थी । के बारे में ७०% पहले 2 एच के भीतर विभाजित कोलेजन मैट्रिक्स के गठन के बाद (चित्रा 2), इस प्रकार 3 डी में बँटवारा की कुशल निगरानी के लिए अनुमति (चित्रा 2).

कोशिकाओं और उनके आसपास कोलेजन मैट्रिक्स के बीच बातचीत की निगरानी करने के लिए, हम छवि कोलेजन फाइबर के लिए फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी संयुक्त, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करने के लिए छवि कोशिकाओं. एक 60X लेंस कोलेजन फाइबर के उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों के कब्जा के लिए अनुमति देता है । इमेजिंग एक उच्च आवर्धन लेंस है, जो देखने के प्रत्येक क्षेत्र में कम कोशिकाओं को कब्जा का उपयोग कर, बहुत कम है 10x या 20X में कम आवर्धन के उपयोग की तुलना में प्रवाह । कोशिकाओं के सफल तुल्यकालन बहुत दक्षता और इस तरह के एक प्रयोग के प्रवाह को बढ़ाता है, के बाद से सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के सबसे पहले 2 के भीतर विभाजन कोलेजन मैट्रिक्स के गठन के बाद । कक्ष विभाजन के दौरान और उसके बाद मैट्रिक्स विकृति की कल्पना की जाती है (प्रतिनिधि स्नैपशॉट आरेख 1bमें दिखाए जाते हैं) और मात्रा कस्टम PIV सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं । हम मात्रा और mitotic चरण में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के लिए चरण और mitotic चरण के दौरान मैट्रिक्स विरूपण की तुलना में । हमने देखा है कि मैट्रिक्स विकृति mitotic चरण (चित्र 3ए) के दौरान बहुत कम बदल गया है, और विरूपण के बाद में मनाया से कम है mitotic चरणों (चित्र बी) । इस परिणाम से पता चलता है कि स्तनधारी कोशिकाओं को ंयूनतम लगाव है और आसपास के मैट्रिक्स के साथ बातचीत करते हुए वे mitotic चरण में हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि एक उच्च आवर्धन live-एक एमडीए-एमबी-२३१ सेल एक कोलेजन मैट्रिक्स कि छुरा H2B-mCherry व्यक्त में एंबेडेड के सेल इमेजिंग वीडियो से प्राप्त माइक्रोग्राफ । (क) एमडीएस-एमबी-२३१ सेल के mitotic प्रगति के विभिन्न चरणों H2B-mCherry के रूप में लाल रंग में लेबल के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं. (ख) mitotic प्रक्रिया के दौरान कोलेजन फाइबर (सफेद) समय पर निर्भर फोकल परावर्तन माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे हैं । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2:3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के विभाजन. कक्ष G2/एम चरण के लिए सिंक्रनाइज़ किया गया और एक कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड । के बारे में ७०% सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के भीतर विभाजन पहले 2 घंटे, जबकि नियंत्रण कोशिकाओं के बिना तुल्यकालन विभाजन बेतरतीब ढंग से । त्रुटि पट्टी SEM = (माध्य की मानक त्रुटि) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ठहराव के लिए मैट्रिक्स विकृति-एमबी-२३१ कोशिकाओं के लिए एक चरण के दौरान और बँटवारा । (क) मैट्रिक्स के परिमाण में परिवर्तन के लिए मैट्रिक्स-एंबेडेड एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं । हरे तीर को इंगित करता है चरण और लाल तीर telophase इंगित करता है । (ख) ठहराव और mitotic चरण के दौरान एमडीएस-एमबी-२३१ कोशिकाओं के लिए मैट्रिक्स विकृति का संकेत है कि मैट्रिक्स विकृति कोशिका विभाजन के दौरान कम है दर्शाता है । त्रुटि पट्टी SEM = (माध्य की मानक त्रुटि) । * p < 0.05. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3डी में सेल डिविजन का पिछला अध्ययन प्रायोगिक सीमाओं और तकनीकी चुनौतियों18,19के कारण कुशल नहीं था । 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में स्तनधारी सेल डिवीजन के कुशल अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: (1) प्रतिदीप्ति के शामिल-कोशिकाओं को mitotic मार्करों लेबल; (2) कक्ष विभाजन का सिंक्रनाइज़ेशन; और (3) 3 डी में विभाजन की घटनाओं की निगरानी लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर मैट्रिक्स, समय-संकल्पित फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी, और मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण.

2d सब्सट्रेट पर Mitotic कोशिकाओं को अपनी आकृति विज्ञान के आधार पर एक चरण कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, अर्थात Mitotic कोशिकाओं दौर कर रहे हैं और बमुश्किल सब्सट्रेट करने के लिए जोड़ जबकि चरण कोशिकाओं बाहर फैले और सब्सट्रेट करने के लिए दृढ़ता से संलग्न. 3 डी मैट्रिक्स में, तथापि, कक्ष आकृति विज्ञान mitotic कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय मार्कर नहीं है क्योंकि कुछ कोशिकाओं को बमुश्किल बाहर फैल और मैट्रिक्स27,28में गोल रहते हैं । इस प्रकार, यह 3 डी मैट्रिक्स में सेल प्रभाग के अध्ययन के लिए कोशिकाओं के लिए एक mitotic मार्कर शुरू करने के लिए आवश्यक है । एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं है, जो चरण, prometaphase, metaphase, anaphase, और telophase सहित अलग mitotic चरणों के लिए एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में सेवा की हम छुरा H2B-mCherry व्यक्त cytokinesis/। हमने पहले 3d मैट्रिक्स में mitotic कक्षों को अंतरित करने के लिए इस approach का उपयोग किया था । इस मार्कर की मदद से, हम भी एक और सेल लाइन के लिए mitotic चरण की लंबाई को मापने के लिए सक्षम थे, HT1080 कोशिकाओं, 2d सब्सट्रेट पर विभाजन और 3 डी मैट्रिक्स में19.

सीरम भुखमरी29, mitotic शेक बंद30,31, डबल thymidine ब्लॉकिंग३२, और nocodazole३२सहित कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए कई तरीके हैं । हम thymidine उपचार और nocodazole उपचार के लिए कुशलतापूर्वक सिंक्रनाइज़ एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं को G2/ thymidine को उजागर कोशिकाओं G1/एस संक्रमण पर और thymidine द्वारा डीएनए संश्लेषण के निषेध के कारण एस चरण में गिरफ्तार कर रहे हैं । thymidine एक्सपोज़र से कक्षों की रिलीज़, G1/s चरण में गिरफ्तार किए गए कक्षों के लिए, और s phase पर गिरफ्तार किए गए कक्षों के लिए g1 के लिए कक्षों की प्रगति करने देती है । nocodazole के संपर्क में आए सभी कोशिकाएं G2/ गोल अप mitotic चरण में प्रवेश कोशिकाओं को फिर हिल रहे थे बंद प्लेट से और सीधे कोलेजन मैट्रिक्स में समझाया । हमें पता चला है कि कोशिकाओं के बारे में ७०% 2 ज के भीतर विभाजन के बाद वे कोलेजन मैट्रिक्स में शामिल कर रहे है (चित्रा 2) । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को तुल्यकालन से पहले कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेड किया जा सकता है, तथापि, क्रॉस-कोलेजन मैट्रिक्स के नेटवर्क से जुड़े एक शारीरिक बाधा प्रस्तुत करता है और आणविक प्रसार और संवहन की दर को कम कर देता है३३, ३४. दरअसल, हम कोलेजन thymidine और nocodazole का उपयोग कर मैट्रिक्स में कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने का प्रयास किया, लेकिन कुशल तुल्यकालन प्राप्त करने में विफल । यह परिणाम अकुशल प्रसार और कोलेजन मैट्रिक्स के माध्यम से दवाओं के संवहन के कारण हो सकता है ।

प्रतिबिंब कोलेजन सहित कई के एक आंतरिक ऑप्टिकल संपत्ति है । फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी तकनीक visualizes और सिंथेटिक पॉलीमर्स और 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स से तैयार छिद्रित quantitates के microtopography23,24,३५,३६ ,३७. हमारी प्रयोगशाला में, हम तकनीक की स्थापना की है कोलेजन फाइबर ध्रुवीकरण में परिवर्तन की निगरानी के रूप में कोलेजन की एकाग्रता बदलता है३८। यहां, हम विधि का वर्णन करने के लिए समय के आधार पर कोलेजन फाइबर की विकृति पर नजर रखने के लिए चिंतनशील फोकल छवियों की चूक वीडियो सेल-मैट्रिक्स बातचीत निरूपित करने के लिए । प्रतिनिधि यहां प्रस्तुत परिणाम बताते है कि mitotic एमडीए के लिए मैट्रिक्स विरूपण-एमबी-२३१ कोशिकाओं के चरण में उन कोशिकाओं की तुलना में काफी छोटा है, जो पता चलता है कि स्तनधारी कोशिकाओं के साथ ंयूनतम लगाव और बातचीत है मैट्रिक्स के आसपास जब वे mitotic चरण19दर्ज करें ।

पहले, हम फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए निगरानी और सेल मैट्रिक्स बातचीत से पहले, के दौरान और HT1080 कोशिकाओं का बँटवारा के बाद । हम भी दोनों चरण और mitotic चरण के दौरान β1-integrin नॉक डाउन HT1080 कोशिकाओं द्वारा मैट्रिक्स विकृति पर नजर रखी । घट β1-integrin काफी मैट्रिक्स के दौरान सेल द्वारा विकृति कम कर देता है । हालांकि, कोई अंतर नहीं है मैट्रिक्स विकृति में mitotic चरण के दौरान राउंड β1-integrin पछाड़ना (KD) कक्षों और HT1080 वाइल्ड प्रकार कक्ष19

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण कोलेजन फाइबर कल्पना करने के लिए प्रतिदीप्ति-संयुग्मित प्रकार मैं कोलेजन को रोजगार है । हम पहले छवि पटरियों के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं द्वारा उत्पंन19। इस दृष्टिकोण, तथापि, fluorescein isothiocyanate (FITC), जो दोनों समय लेने और कम कुशल है के रूप में फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोलेजन के लेबल की आवश्यकता है । दूसरी ओर, फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी सीधे unभएकै कोलेजन पर लागू करने के लिए समय और संसाधनों को बचाने के लिए, और प्रतिदीप्ति photobleaching से जुड़े मुद्दों को बाहर कर सकते हैं । इसके अलावा, इस विधि एक व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट चैनल की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए सभी फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संगत है ।

इस पत्र में प्रस्तुत की विधि संभावित स्तनधारी कोशिकाओं के किसी भी प्रकार है कि एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में विभाजित करने के लिए लागू किया जा सकता है । lentiviral transduction द्वारा अन्य स्तनधारी कोशिकाओं में H2B-mCherry मार्कर का शामिल करना वास्तव में कागज में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करेंगे, हालांकि कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार transduction द्वारा lentivirus के लिए विविध क्षमता हो सकता है ३९. दोनों transduction पर कोशिकाओं के घनत्व और वायरस के titer दक्षता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उच्च transduction दक्षता प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो कक्षों प्रतिदीप्ति सहायक कक्ष सॉर्टिंग (FACS) द्वारा चयनित किया जा सका । Thymidine ब्लॉकिंग और nocodazole स्तनधारी कक्षों के कई अंय प्रकारों को सफलतापूर्वक सिंक्रनाइज़ करने के लिए लागू किए जाते हैं, जैसे कि हेला४०। यांत्रिक शेक बंद किसी भी कोशिका प्रकार है कि ऊपर दौर और बमुश्किल mitotic चरण30,31के दौरान सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, कोलेजन का उपयोग करते हुए फोकल प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी फाइबर की इमेजिंग, और मैट्रिक्स विरूपण के ठहराव सीधे स्तनधारी कोशिकाओं विभाजन के अन्य सभी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.

यहाँ प्रस्तुत विधि एक 3 डी वातावरण में स्तनधारी कोशिका विभाजन और सेल मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और सामान्य दृष्टिकोण है. दृष्टिकोण सामांय ऊतक और रोगों के विकास के आणविक आधार में हमारी जांच की सुविधा है, और उपंयास नैदानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोण के डिजाइन potentiates भविष्य में ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को NIH पलाश R01CA174388 और U54CA143868 ने सपोर्ट किया था. लेखक वी-टोंग चेन के समर्थन के लिए जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय से पुरा पुरस्कार स्वीकार करना चाहते हैं । यह सामग्री अनुदान नहीं १२३२८२५ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित काम पर आधारित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney 293T ATCC
MDA-MB-231 Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM powder ThermoFisher Scientific 12100-046
Fetal bovine serum Hyclone SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X Sigma-Aldrich P0781
Fugene HD Promega E2311
Lipofectamine 2000 Life technologies 11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector Addgene plasmid 21217
Thymidine Sigma-Aldrich T1895
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Sodium bicarbonate GibcoBRL 11810-025
HEPES Sigma-Aldrich 113375-100
Collagen Corning 354236
NaOH J.T. Bake 3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm Millipore SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope Nikon TE2000E
Cascade 1K CCD camera Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software Nikon
Nikon A1 confocal microscope Nikon A1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287, (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122, (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11, (1), 18-21 (2001).
  4. Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
  5. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  6. Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68, (15), 6251-6259 (2008).
  7. Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25, (5), 471-477 (2007).
  8. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18, (1), 51-63 (2012).
  9. Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28, (18), 3015-3022 (2010).
  10. Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127, (1), 63-69 (2012).
  11. Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22, (2), 431-437 (2011).
  12. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (3), 211-224 (2006).
  13. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, (5547), 1708-1712 (2001).
  14. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196, (4), 395-406 (2012).
  15. Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27, (10), 4089-4099 (2013).
  16. Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
  17. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12, (6), 598-604 (2010).
  18. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205, (2), 155-162 (2014).
  19. He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7, (6), 6994-7011 (2016).
  20. Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, (9), 747-754 (2010).
  21. Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7, (10), e48024 (2012).
  22. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33, (35), 9087-9096 (2012).
  23. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
  24. Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
  25. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
  26. Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187, (4), 481-496 (2009).
  27. Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (5), 1943-1948 (2011).
  28. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  29. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
  30. Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
  31. Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120, (2-3), 151-159 (1983).
  32. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
  33. Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8, (11), e82382 (2013).
  34. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  35. Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6, (9), e24891 (2011).
  36. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  37. Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28, (6), 305-310 (2006).
  38. Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
  39. Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9, (14), 932-938 (2002).
  40. Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics