양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

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Bioengineering

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Summary

이 프로토콜은 효율적으로 세포 분열의 동기화를 통합 하 여 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 연구 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 그리고 양적 이미징 분석입니다.

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He, L., Sneider, A., Chen, W., Karl, M., Prasath, V., Wu, P. H., Mattson, G., Wirtz, D. Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56364, doi:10.3791/56364 (2017).

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Abstract

어떻게 포유류의 세포 연구 규제는 3d 환경 크게 그것의 생리 적인 관련성 및 치료의 중요성에도 불구 하 고 미개척 남아. 탐험의 부족에 대 한 가능한 이유는 실험 제한 및 비효율적인 3D 문화에서의 세포 연구를 렌더링 하는 기술적 과제 이다. 여기는 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 상호 작용 3D 콜라겐 매트릭스에 효율적으로 공부 하는 영상 기반 방법에 설명 합니다. 형광 H2B 표시 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 셀 다음 3D 콜라겐 매트릭스에 포함 됩니다. 세포 분열은 라이브 셀 현미경을 사용 하 여 모니터링 됩니다. 변형 콜라겐 섬유의 세포 분열, 세포-매트릭스 상호 작용은, 전후 동안 모니터링할 수 있습니다 그리고 양적 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 계량. 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 순수 관련 3D 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 방법은 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 뿐만 아니라 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

Introduction

세포 유사 분열의 규제 조직 및 장기 개발에 중요 한 역할 세포 인생에서 중요 한 이벤트입니다. 비정상적인 유사 분열은 자연 유전 변이, 인간의 노화 과정과 암1,2,3,,45의 진행에 연루 됩니다. 정상 세포와 비교 하는 종양 세포의 증식의 증가 속도 사실 셀 동작 종양의 종류 및 환자 중 에서도 상당히 이질적인에 불구 하 고 암의 특징 중 하나입니다. 유망한 임상 결과도 불구 하 고 일부 새로 개발 된 antimitotic 약물 임상 시험6,7,,89,10 에에서 효과가 표시 되지 않은 11. 실험 및 전 임상 모델의 관련성 고려 될 수 있다. 많은 유형의 정상 포유류 및 암 세포 섬유 아 세포와 콜라겐-풍부한 3D 결합 조직, fibrosarcoma 셀과 전이성 암 세포는 3D stromal 세포 외 기질 (ECM)에 같은 3 차원 (3D) 행렬에 나눕니다. 그러나, 포유류 세포 분열 실험 및 분석의 대다수가 2 차원 (2D) 기판에 경작 하는 세포에 수행 되었습니다. 미세, 기계적 특성, 및 두 정상과 pathologic 조직12,,1314, 의 3D ECM의 생 화 확 적인 신호 설계 3D 매트릭스 정리 더 수 15,,1617.

어떻게 포유류의 세포 연구 규제 차원에서 환경 생리 관련성 및 치료 중요성18,19도 불구 하 고 크게 미개척 남아. 가능한 이유는 기술적인 어려움 및 3D 매트릭스에서 세포 분열을 공부와 관련 된 실험 과제 포함 됩니다. 세포의 유사 분열 전체 세포 주기20에 극히 일시적인 구성합니다. 이전 작업을 인간 유 방 선 암 MCF-7, 인간의 다리 U2OS, 그리고 인간의 간 같은 많은 포유류 세포의 확산 속도 보이고 있다 HepG2에 훨씬 낮은 3D 매트릭스 2D 기판21에 그들의 대조 물과 비교 22. 또한, 세포 3D 매트릭스에 포함 된 라이브 셀 이미징 동안 초점 밖으로 이동 합니다. 이러한 모든 요소는 이미징 기술을 사용 하 여 3D 문화에서 세포 분열 이벤트 캡처의 매우 낮은 효율에 기여.

세포와 ECM 사이 상호 작용 세포 분열 조절에 중요 한 역할을 재생 합니다. 여기, 우리는 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 효율적으로 공부 하는 방법을 설명 합니다. 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 뿐만 아니라 세포, 세포 분열의 동기화 mitotic 마커의 포함 하는 메서드 및 양적 이미징 분석입니다. 형광 표시 된 히스톤 단백질 H2B mitotic 차별화 및 interphase 셀 표식으로 셀에 처음 소개 된다. 다음 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 세포는 직접 3D 콜라겐 매트릭스에 캡슐화 됩니다. 여러 셀의 세포 분열 이벤트 낮은 확대 경과 라이브 셀 이미징에 효율적으로 사용 하 여 모니터링 됩니다. 세포-매트릭스 상호 작용은, 콜라겐 섬유의 변형 고배율에서 반사 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 모니터링 됩니다.

우리가 감시 하 고 세포-매트릭스 상호 작용 하는 동안과 이후, 이전 두 개의 전이성 암 세포 선, 인간의 침략 적인 ductal 암 MDA-MB-231 및 3D 콜라겐에서 인간의 fibrosarcoma HT1080 세포의 유사 분열을 계량이 기술을 사용한 이전 행렬19. 여기에 제시 된 방법 3D 환경과 세포-매트릭스 상호 작용에서 모두 포유류 세포 분열을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근을 제공 합니다. MDA-MB-231 셀 라인 종이 걸쳐 예제로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 정상 조직과 질병, 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 하 고 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.

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Protocol

제공 하는 프로토콜의는 홈 우드 기관 검토 위원회 (HIRB) 지침을 따릅니다.

1. 안정적인 표현의 H2B mCherry 마커로 세포 유사 분열에 대 한

  1. 인간 미 발달 신장 293T에서에서 lentiviral 입자 (HEK 293T)의 세포
    1. HEK 293T 세포 세포 배양 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 포함 된 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1%에에서 106 셀/접시 x 5의 밀도에서 10 cm 세포 문화 접시에 접시 페니실린-스 (펜/Strep)). 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 24 h에 대 한 품 어. Transfection 당일 셀의 원하는 confluency 약 70-80% 이다.
      참고: HEK 293T 세포는 여기 사용 됩니다 나중 transduce MDA-MB-231 셀을 안정적으로 H2B mCherry 표현 셀 라인을 생성 하려면 바이러스 입자를 생산 하는 데 사용 됩니다. 셀은 접시에 걸쳐 고르게 분포 하 고 있는지 확인 합니다. 셀의 추가 삭제 플레이트, 현명 하 고 부드럽게 이동 뒤로 앞 접시 분산에 도움이 될 수 있습니다. 셀 또는 바이러스 성 입자의 다른 볼륨의 컬렉션 귀 착될 것 이다 다른 크기의 플라스 크에 시드할 수 있습니다.
    2. Transfection 시 약을 사용 하 여 3 개의 플라스 미드 (lentiviral 벡터, CMV ΔR 8.91, 및 pMDG-VSVG)와 HEK 293T 세포 transfect H2B mCherry 인코딩 플라스 미드 lentiviral 벡터 phosphoglycerate 키 발기인 (PGK)에서 복제 됩니다. CMV ΔR 8.91 3 필수 HIV 유전자, 개 그, 회전을 포함합니다. pMDG-VSVG VSV G 봉투 유전자를 포함 되어 있습니다.
      참고: 여러 transfection 에이전트에서 선택할 수 있습니다.
      1. Transfection 시 약 실 온 (RT) 도달의 유리병 사용 하기 전에 수 있습니다. 반전 또는 소용돌이 짧게 유리병입니다.
      2. H2B mCherry 플라스 미드의 6 µ g, CMV ΔR 8.91의 8 µ g의 감소 된 혈 청 미디어의 1 mL에 pMDG-VSVG, 2 µ g으로 구성 된 DNA의 믹스 16 µ g. 5 분에 대 한 RT에서 품 어.
        참고: 금액 및 3 개의 벡터의 비율은 다양 하 고 다른 lentiviral 전송 벡터에 대 한 최적화.
      3. 48 µ L 추가 (DNA의 1:3 비율을 사용 하 여: transfection 시 약) 위의 DNA 솔루션으로 transfection 시 약의 다음 RT에 적어도 15 분 동안 품 어 고.
        참고: transfection 시 약 대 DNA의 비율은 다양 하 고 다른 lentiviral 전송 벡터에 대 한 최적화. Transfection 시 약 1.5 mL 원심 분리기 튜브의 측면을 연결 하지 못한 다는 것을 확인 하십시오.
      4. 셀에 drop-wise 단계 1.1.2.3에서에서 만든 DNA 지질 복잡 한 솔루션을 추가 합니다. 부드럽게 접시에 복잡 한의 동등한 배급을 보장 하기 위해 플레이트를 소용돌이 친다.
    3. Transfection, 후 대략 6 h 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 추가 (DMEM과 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 1% 펜/Strep).
    4. 표면에 뜨는 24, 48, 및 72 h 후 transfection 수확. 각 수확 후 매체를 대체 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당, 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
    5. 세포질 파편을 제거 하는 0.45 μ m 필터를 통해 lentiviral 입자를 필터링 합니다. 또는, 세포 파편 분리 하 상쾌한 아래로 회전 합니다. 상쾌한 변환, 바로 사용할 수 있습니다 또는-80 ° c.에 저장 될 수 있다
  2. 셀의 세대 라인 안정적으로 표현 H2B-mCherry
    참고:이 프로토콜은 MDA-MB-231 셀에 대 한 세부 사항에 설명 되어 있습니다. 실험에 사용 하기 전에 인간의 유 방 암 세포 MDA-MB-231 (물리 과학 종양학 센터, NIH) 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 포함 된 DMEM에 교양 펜/Strep.
    1. 35 mm 문화 접시에 1 x 105 셀의 밀도에서 MDA-MB-231 셀 접시
      참고: 다른 셀 라인에 대 한 도금의 밀도 최적화 해야 하 고 따라서 MDA-MB-231 셀에 대 한 최적의 밀도에서 다를 수 있습니다.
    2. 셀, 도금 후 24 h 1 mL 신선한 매체의 1 mL 및 바이러스의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
    3. 하룻밤에 6 h의 시간 동안 세포를 품 어.
      참고: 바이러스의 외피 시간 모두 볼륨 다른 세포에 최적화 될 필요가 있다. 예를 들어, 셀 보이지 않는 건강 한 바이러스의 추가 후에 몇 시간, 바이러스 및 2 mL 신선한 매체의 1 mL 사용 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 단계 1.2.2. 1.2.3 단계에서 부 화 시간 또한 줄어들 수 있습니다.
    4. 매체를 발음 하 고 10 mL 신선한 매체의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep). 37 ° C, 5% CO2에서 24 ~ 72 시간 사이 품 어.
    5. H2B-mCherry epifluorescence 현미경을 사용 하 여 셀에 식을 확인 합니다.
      참고: 변환 효율 셀에 낮은 경우에, 단계 2.2에서에서 바이러스와 단계 2.3에서에서 보육 시간 볼륨 수 증가.

2. 안정적으로 H2B mCherry을 표현 하는 세포의 동기화

  1. 50 ~ 60 %confluency, 플레이트 2 x 104 MDA-MB-231에서 셀 24-잘 접시의 각 음에 세포 격판덮개.
  2. 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 문화를 품 어.
  3. 매체의 0.5 mL에 성장 매체를 바꿉니다 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 2mm 티 미 딘을 포함 하 고 24 시간에 대 한 인큐베이터에서 두고.
    참고: 셀에 티 미 딘 노출 세포 성장 (G1)의 단계에서 체포 / DNA 합성 (S) 전환 및 DNA 종합의 금지로 인해 S 단계에 걸쳐. 보육 시간 다양 하 고 다른 셀 라인에 대 한 최적화 해야 합니다.
  4. 티 미 딘 노출에서 셀을 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 세 번 그들을 세척 하 여 놓습니다. 다음, 정상적인 세포 배양에 있는 셀을 품 어 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep) 5 h.
    참고: 티 미 딘 노출에서 셀의 릴리스 수 있습니다 세포 성장 (G2)을 진행 하는 세포/셀 mitotic (M) 단계 이전 g 1/S 단계에서 체포 하 고는 S에서 체포 이전 셀에 대 한 g 1 단계로 단계. 출시 시간 다양 하 고 다른 셀 라인에 대 한 최적화 해야 합니다.
  5. 12 h에 대 한 nocodazole의 250 ng/mL로 세포를 차단 합니다.
    참고: 모든 nocodazole에 노출 셀 G2/M 단계에서 체포 됩니다. Nocodazole은 세포 독성. Nocodazole에 장기간된 노출은 apoptosis를 발생할 수 있습니다. 세포 죽음은 관찰 하는 경우 기간 또는 다른 세포에 대 한 노출의 농도 조정 합니다. 성공적으로 동기화 되는 셀 구형 형태를 전시할 것 이다.
  6. 45에 대 한 셀을 흔들어 s 궤도 셰이 커를 사용 하 여 150 ~ 200 rpm에서 1 분.
    참고: 있는 기판에 작은 부착, Mitotic 세포 됩니다 수 동요 과정에서.
  7. 원심 분리기 튜브에 매체를 pipetting으로 세포를 추출 하는 매체를 제거 한 다음 0.5 mL 신선한 매체의 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep) 격판덮개의 각각 잘.
  8. 2.6 및 2.7 3 번 단계를 반복 합니다.
  9. 3 분 동안 800 x g에 mitotic 세포를 포함 하는 수집된 매체 원심
    참고:이 단계는 셀 매체에서는 nocodazole를 제거 하는 데 사용 됩니다.

3. 법인은 동기화의 세포는 콜라겐으로 나 행렬

참고: 유형 I 교원 질은 인간의 신체에서 가장 풍부한 단백질의 결합 조직 ECM에 따라서은 널리 사용 되 고 함수는 3D 환경17,23,24에 의해 변조는 어떻게 진 핵 세포를 조사 하 . 콜라겐은 초 산에 용 해. 중화 후 20-37 ° c 콜라겐 솔루션 온난화, 콜라겐 단위체 교원 질 소의 meshwork에 유해.

  1. DMEM 분말, 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3)의 3.7 g, 증류수 50ml에 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)의 1 g의 패킷을 용 해 하 여 10 x DMEM 솔루션을 준비 합니다. 다음 증류수 50 mL 펠 릿 NaOH 2g을 용 해 하 여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)의 준비 및 솔루션을 필터링 합니다. 필터 하 고 약 1.5 mL 원심 분리기 관으로 수.
    참고: 일반 DMEM 솔루션이이 단계에서 사용할 수 없습니다. 콜라겐 솔루션의 중요 한 볼륨의 추가 매체를 희석 것 이다. 따라서 집중된 DMEM 솔루션 콜라겐 매트릭스에서 DMEM의 최종 농도 정상 DMEM 동일 될 준비가 되어 있습니다.
  2. 세포 단계 2.9에서에서 수집한와 함께 작동 하도록 계속 합니다. 매체, 그리고 중단 다시 셀에 약 0.25-0.5 mL 신선한 세포 배양 매체의 발음 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
    참고: 콜라겐 매트릭스에 특정 세포 밀도 도달 하는에 셀의 초기 밀도 수 없습니다 너무 낮은. 따라서, 다시 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 매체의 볼륨 사용할 수 있는 셀의 총 수에 따라 달라 집니다.
  3. Hemocytometer를 수 용액에 셀의 밀도에 3.2 단계에서 다시 정지 셀 솔루션의 장소 10 µ L.
  4. 3D 콜라겐 매트릭스 수 있도록 모든 구성 요소에 필요한 볼륨을 결정 합니다. 500 µ L 2 µ g / µ L 콜라겐 젤의 사용 예를 들어 여기.
    1. 40, 000 셀/mL (또는 콜라겐 젤의 500 µ L에 대 한 20000 셀)을 얻는 데 필요한 셀 솔루션의 볼륨을 계산 합니다. µ L에이 숫자는 X. 50 µ L 10 x DMEM 필요 하 게 됩니다. FBS의 50 µ L은 필요 합니다.
    2. 콜라겐 나 재고 필요한 볼륨을 계산 합니다. 콜라겐의 농도 4 µ g / µ L 주위입니다. µ L에 필요한 콜라겐의 양은 Y 이다.
    3. 수산화 나트륨의 볼륨 콜라겐 솔루션에 아세트산을 중화 하는 데 필요한 계산: Y µ L 콜라겐 * 0.023 * 1000 = Z µ L NaOH 필요.
    4. 필러 솔루션의 볼륨을 결정: (500 µ L 총 젤-X µL 셀-50 µ L 10 DMEM-FBS의 50 µ L-Y µ L 콜라겐-Z µ L X NaOH) = R µ L
      참고: 필러 솔루션은 증 류 물. 계산된 볼륨 필러 솔루션의 음수 이면 세포 현 탁 액에서 원래 셀 밀도 너무 낮습니다. 셀 다시 스핀 다운을 다시 작은 양의 중간에 중단 해야 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS, 및 1% 펜/Strep).
  5. 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 다음과 같은 순서로 구성 요소를 추가: 매체, 콜라겐, NaOH, 이온된 (DI) 수, FBS, DMEM x 10에에서 셀. 콜라겐 솔루션의 겔 화를 감속 하는 얼음에 모든 구성 요소를 배치 합니다. 적절 한 pipetting 기술을 사용 하 여 거품의 형성을 방지.
  6. NaOH를 추가 후 1 mL를 피펫으로와 솔루션을 신중 하 게 섞는다.
    참고: 콜라겐의 겔 화 시작 됩니다 오른쪽 NaOH의 추가 직후. 혼합 신중 하 고 신속 하 게 수행 되어야 합니다.
  7. 일단 솔루션은 잘 혼합 하 고, 24-잘 접시의 각 음을 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 37 ° C 배양 기에서 24-잘 접시를 놓습니다. 37 ° C 물 목욕에 신선한 세포 배양 매체를 배치 합니다.
    참고: 플라스틱 바닥 접시는 렌즈의 거리는 1 mm. 유리 바닥 고배율 라이브 셀 현미경 높은의 짧은 거리 때문에 사용 되는 접시 위에 낮은 확대 라이브 셀 microcopy 사용 됩니다. 확대 렌즈입니다.
  8. 미리 데워 진된 매체의 500 µ L 추가 (DMEM, 높은 포도 당 (4.5 g/L), 나트륨 pyruvate, 10 %FBS 1% 펜/Strep) 젤 3.7 단계를 완료 한 후 30 분의 상단에.

4. 라이브 셀 이미징 3D 콜라겐 매트릭스 (낮은 배율)에 분할 하는 세포의

참고: 셀의 이미지는 10 X 목표 및 이미징 소프트웨어에 의해 제어 위상 대비 현미경에 장착 된 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 2 분 간격으로 수집 됩니다.

  1. 대물 렌즈 위에 탑재 라이브 셀 단위를 켭니다. 안정화 될 때까지 온도 37 ° C에서, CO2 농도 5%에 습도 75%에서 기다립니다.
  2. 현미경에 라이브 셀 단위로 젤 24-잘 접시를 넣어. 접시의 바닥을 찾아 이동한 다음 목표 렌즈까지 현미경 접시의 바닥에서 약 500 µ m에 초점을 맞추고 있다.
    참고: 셀 콜라겐 매트릭스에 너무 가까이 있는 접시의 바닥에 완전히 3D 매트릭스에 포함 되지 않습니다. 접시의 아래쪽에서 500 µ m 세포 이미징 하는 것은 셀 가장자리 효과16,,1725에 의해 영향을 받지 않습니다 것을 보장 합니다.
  3. 찾을 셀, 무대 주위를 이동 하 고 이미징에 대 한 여러 위치를 선택 합니다.
  4. 시간 경과 실험 2 분 간격을 설정 합니다.
    참고: 위치 2 분 간격 동안 수행할 수 있는 최대 수는 전동된 스테이지의 움직이는 속도 이미지 캡처에 대 한 노출 시간의 길이 의해 제한 됩니다.

5. 콜라겐 네트워크 변형 세포 분열 (고배율 현미경) 동안

  1. 대물 렌즈 위에 탑재 라이브 셀 단위를 켭니다. 안정화 될 때까지 온도 37 ° C에서, CO2 농도 5%에 습도 75%에서 기다립니다.
  2. 흠 없는 3D 콜라겐 매트릭스에 콜라겐 섬유를 시각화 하려면 반사 빛 (488 nm)의 샘플을 밝게 하는 데 사용 하는 488 nm 레이저에서 잡으려고 공초점 현미경을 구성 합니다. 레이저 사용 하 여 물 집중 목표, 나 X 60 = 1.2, WD = 200 µ m 및 이미징 소프트웨어에 의해 제어 됩니다.
  3. 라이브 셀 단위로 샘플 (콜라겐 매트릭스 셀)을 넣어. 접시의 바닥을 찾아 이동한 다음 목표 렌즈까지 현미경 접시의 바닥에서 약 100 µ m에 초점을 맞추고 있다. 접시의 아래쪽에서 100 µ m 세포 이미징 하는 것은 셀 가장자리 효과 의해 영향을 받지 않습니다 것을 보장 합니다.
    참고: 여기 물 침수 목표 사용 됩니다 기름 침수 렌즈 대신 기름 침수 렌즈의 작동 거리는 약 100 µ m만 하기 때문에. 기름 침수 렌즈의 사용으로 접시의 바닥에 유리의 두께 일반적으로 약 100 µ m 문제가 포즈지 않습니다.
  4. 찾을 셀, 무대 주위를 이동 하 고 이미징에 대 한 여러 위치를 선택 합니다.
    참고: Confocal 현미경 광학 샘플 섹션 및만 초점면에서 신호를 캡처. 라이브 셀 시간 경과 실험 기간 동안 초점 밖으로 이동 될 수도 있습니다. 시간의 오랜 기간 동안 셀 이미지를 캡처 수 있도록, Z-스택 5 µ m 간격 연속 분할 영역에서 이미지를 수집 하는 데 사용 됩니다. 25 µ m에 걸친 5 조각의 총 몇 군데 있습니다.
  5. 5 분 간격으로 시간 경과 실험을 설정 합니다.
    참고: 5 분 사용 됩니다 대신 형광 H2B mCherry, 반사, 콜라겐에 대 한 검색 및 Z-스택 스캔에 대 한 검색을 포함 하 여 여러 스캔 모드, 각 위치에 적용 됩니다 때문에 섹션 4에서에서 사용 되는 2 분 간격으로 여기. 여러 스캔 모드를 사용 하 여 낮은 확대 영상에 비해 위치 검색의 속도 감소 시킨다.
  6. 계량 이미징 하위 픽셀 해상도20velocimetry (PIV) 입자를 사용 하 여 해당 셀에 의해 발휘 된 힘으로 인해 셀 주변 콜라겐 매트릭스의 변형. H2B mCherry 신호 콜라겐 섬유 모두의 명확한 시각화 2D 이미지에서이 분석을 수행 할 수 있습니다. 이방성 낮은 통과 콜라겐 네트워크20의 신호를 향상 시키기 위해 필터링을 적용 합니다.
  7. K+ 1 프레임, 15 × 15의 지역 창 추출 프레임에서에서 (x,y)에 있는 관심의 하위 이미지 영역의 로컬 변위를 측정 하기 위해 픽셀 프레임 k에서 (x,y)에 중심으로. 다음 가장 일치 하는 (x,y) 위치 식별 * 프레임 k+ 1에서 얻은 이미지에 최대 정규화 된 교차 상관 계수 기능 위치를 통해. 변형 벡터 (x,y)로 계산 됩니다 *-(x,y).

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Representative Results

이 문서의 목표 3 차원 행렬에 포유류 세포 분열 과정을 공부 하 고 동안 그리고 세포 분열 후 세포와 3 차원 기질 간의 상호 작용을 계량 하는 영상 기반 방법을 제시 하는입니다. 촉진 하기 위해 세포 유사 분열의 이미징, 우리 통합 H2B mCherry lentiviral 변환을 사용 하 여 MDA-MB-231 셀. 형광 단백질 활용 된 H2B interphase 셀, mitotic 세포를 구별 하 고 세포 유사 분열19,,2026동안 여러 단계를 정의 하 mitotic 표식으로 사용 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 안정적으로 H2B-mCherry 3D 콜라겐 매트릭스 (그림 1A)에서 표현 하는 MDA-MB-231 셀의 전체 부문 과정을 모니터 할 수 있었습니다. Mitotic 단계 (의향; 프레임 1, 그림 1A); 핵 막의 해체로 시작 염색체의 개편 (prometaphase: 2 프레임); 세포 체 (분열; 프레임 3); 중간 염색체의 맞춤 (anaphase; 프레임 4); 염색체의 분리 염색체와 핵 막, 2 개의 딸 세포 (telophase/cytokinesis, 프레임 5)의 시체의 분리 개편.

3 차원 행렬에서 셀의 확산 속도가 일반적으로 3D 효율이19에 세포 분열의 모니터링 렌더링 2D 기판에 그들의 대조 물 보다 훨씬 낮은. 3D 세포 분열의 효율성 증가, 우리는 티 미 딘, nocodazole, 및 동기화 하 고 mitotic 단계에 있는 MDA-MB-231 셀 선택 쉐이크-오프 기술을 결합 하는 방법 채택. 동기화 된 셀 다음 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 여러 셀의 분할 프로세스 사용 하 여 실시간 모니터링 했습니다 라이브 셀 이미징에 10 배 확대. 셀의 약 70%는 3d (그림 2) 유사 분열의 효율적인 모니터링 되므로 콜라겐 매트릭스 (그림 2)의 형성 후 첫 2 시간 이내 분할.

셀과 그들의 주변 콜라겐 매트릭스 간의 상호 작용을 모니터링, 우리는 이미지 콜라겐 섬유, 반사 confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 현미경 검사 법 셀의 이미지를 결합. 60 X 렌즈 콜라겐 섬유의 높은 품질의 이미지의 캡처 수 있습니다. 보기의 각 필드에 적은 세포를 캡처하는 고배율 렌즈를 사용 하 여 이미징은 훨씬 낮은 처리량에 비해 낮은 배율 10 배 또는 20 X 사용 하 여. 동기화 된 전지의 대부분 콜라겐 매트릭스의 형성 후 첫 2 시간 이내 분할 이후 셀의 성공적인 동기화 크게 효율성과 같은 실험의 처리량을 향상. 행렬 변형 세포 분열 동안 전후는 시각 ( 그림 1B에서 스냅샷 표시 됩니다) 및 사용자 지정 PIV 소프트웨어를 사용 하 여 계량. 우리 계량 하 고 매트릭스 interphase 셀 mitotic 단계로 동기화 mitotic 단계 동안 변형 비교. 우리 매트릭스 변형 거의 변경 관찰 동안에 mitotic 단계 (그림 3A), 그리고 변형 보다 포스트 mitotic 단계 (그림 3B)에서 관찰 됩니다. 이 결과 포유류 세포는 최소한의 첨부 파일 주변 매트릭스와의 상호 작용 mitotic 단계에 있는 동안 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 안정적으로 H2B mCherry을 표현 하는 콜라겐 매트릭스에 포함 된 대표적인 현미경 MDA-MB-231 셀의 고배율 라이브 셀 이미징 비디오에서 얻은. (A) MDA-MB-231 셀의 mitotic 진행의 다른 단계 빨간색으로 표시 된 H2B mCherry에 의해 정의 됩니다. (B) mitotic 과정에서 콜라겐 섬유 (흰색) 시간에 따른 confocal 반사 현미경으로 시각화 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 동기화 된 3D 콜라겐 매트릭스 셀의. 셀 g 2/M 단계로 동기화 되었고 콜라겐 매트릭스에 포함 된. 반면 컨트롤 동기화 분할 없이 무작위로 세포 동기화 된 세포의 약 70% 첫 2 시간 이내 나눕니다. 오차 막대 SEM는 뜻의 (표준 오차) =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: MDA-MB-231에 대 한 매트릭스 변형 정량화 interphase 및 유사 분열 중 세포. (A) 매트릭스 변형 매트릭스 포함 MDA-MB-231 셀의 크기에서 변화. 녹색 화살표 의향을 나타내고 빨간색 화살표는 telophase를 나타냅니다. (B) 의 부 량 interphase mitotic 단계 동안 MDA-MB-231 셀에 대 한 매트릭스 변형 나타내는 매트릭스 변형 세포 분열 동안 최소 이다. 오차 막대 SEM는 뜻의 (표준 오차) =. * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

3d에서 세포 분열의 이전 연구 실험 제한 및 기술 과제18,19효율적인 아니었다. 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열의 효율적인 연구를 위한 중요 한 단계는: (1) 셀;에 mitotic 마커 형광 표시 관 (2) 세포 분열;의 동기화 (3) 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경 검사 법, 양적 이미지 분석을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링.

2D 기판에 mitotic 세포는 그들의 형태에 따라 interphase 셀에서 구별 될 수 있다, 즉, mitotic 세포는 원형 interphase 세포 밖으로 확산 하 고 기판에 단단히 부착 기판에 간신히 연결. 그러나 3 차원 행렬에서, 세포 형태학 mitotic 세포에 대 한 신뢰할 수 있는 마커 간신히 밖으로 확산 하는 일부 셀부터 이며 매트릭스27,28라운드 유지. 따라서, 3D 매트릭스에서의 세포 연구에 대 한 셀에 mitotic 마커를 소개 하는 것이 필수적입니다. 우리는 안정적으로 H2B-mCherry MDA-MB-231 셀, telophase/cytokinesis, anaphase, 분열, 의향, prometaphase를 포함 하 여 다른 mitotic 단계에 대 한 신뢰할 수 있는 표식으로 봉사에 표현. 우리는 이전 3D 매트릭스에 interphase 셀에서 mitotic 세포를 구별 하는 것이 방식을 사용. 이 표식 기의 도움으로, 우리 또한 수 있었다 HT1080 세포, 다른 셀 라인, mitotic 위상의 길이 측정 하 2D 기판 및 3D 매트릭스19에서 분할.

혈 청 기아29, mitotic 쉐이크-오프30,31,32및 nocodazole32를 차단 하는 이중 티 미 딘을 포함 하 여 셀을 동기화 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 우리는 티 미 딘 치료와 효율적으로 동기화 G2/M 단계에 MDA-MB-231 셀 nocodazole 치료 결합. 티 미 딘에 노출 셀 티 미 딘 G1/S 과도 그리고 DNA 종합의 금지로 인해 S 단계에 걸쳐 체포 됩니다. 티 미 딘 노출에서 셀의 릴리스 셀 g 1/S 단계에서 체포 G2/M 단계 그리고 S 단계에서 체포 하는 셀에 대 한 G1 셀 진행 하자. Nocodazole에 노출 하는 모든 셀 G2/M 단계에서 체포 됩니다. 반올림-최대 셀 mitotic 단계를 입력 했다 다음 동요-오프 접시에서 그리고 콜라겐 매트릭스에 직접 캡슐화. 우리는 후에 그들은 콜라겐 매트릭스 (그림 2)에 통합 하는 세포의 약 70 %2 시간 이내 분할을 보였다. 그러나 또는 셀 동기화 전에 콜라겐 매트릭스에 포함 될 수 있습니다,, 콜라겐 매트릭스의 상호 연결 된 네트워크 물리적 방 벽을 선물 바이오 확산 및 대류33, 의 속도 감소 시킨다 34. 사실, 우리 셀 콜라겐 매트릭스 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 동기화 하려고 하지만 효율적인 동기화를 실패. 이 결과 비효율적인 확산 및 대류 콜라겐 매트릭스를 통해 약물의 수 있습니다.

반사는 많은 biopolymers, 콜라겐 등의 내장 광학 속성입니다. 반사 confocal 현미경 검사 법 기술 시각화와 합성 고분자와 3D 콜라겐 매트릭스23,,2435,36에서 준비 하는 다공성 생체의 microtopography quantitates ,37. 우리 실험실에서 우리는 콜라겐의 농도 차이가38로 콜라겐 섬유 극성에 변경 사항을 모니터링 하는 기술을 설치 했다. 여기, 우리는 콜라겐 섬유 세포-매트릭스 상호 작용을 나타내는 데 반사 공초점 이미지의 시간 경과 비디오에 따라 변형 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 제시 된 대표적인 결과 mitotic MDA-MB-231 셀에 대 한 매트릭스 변형 interphase, 포유류 세포는 최소한의 첨부와 함께 상호 작용 하는 제안에 그 세포 보다 훨씬 작은 표시는 주변 매트릭스 mitotic 단계19들어가면.

이전에, 우리가 감시 하 고 세포-매트릭스 상호 작용 하기 전에, 중 및 후에 HT1080 세포의 유사 분열을 계량 반사 confocal 현미경 검사 법 사용. 우리는 또한 interphase와 mitotic 단계 동안 β1 integrin 눕 HT1080 세포에 의해 매트릭스 변형 모니터링. 크게 β1 integrin를 없애고 interphase 동안 셀에 의해 매트릭스 변형을 줄어듭니다. 그러나, 둥근 β1 integrin 최저 (KD) 세포와 HT1080 야생 타입 셀19mitotic 단계 변형 매트릭스에에서 차이가 있다.

콜라겐 섬유를 시각화 하는 양자 택일 접근 형광 활용 된 고용 하는 유형 I 교원 질. 우리는 이전 셀19에 의해 생성 된 콜라겐 매트릭스에서 이미지 트랙에이 접근을 사용. 그러나이 방법은,, 라벨 fluorescein isothiocyanate (FITC), 둘 다 시간이 소모 하 고 덜 같은 형광 염료와 콜라겐의 효율적인 필요 합니다. 다른 한편으로, confocal 반사 현미경 시간과 리소스를 절약 하 고 형광 photobleaching와 관련 된 문제를 제외 하려면 수정 되지 않은 콜라겐을 직접 적용할 수 있습니다. 또한,이 메서드는 개별 형광 채널을 필요 하지 않습니다 이며 따라서 모든 형광 염료와 호환.

이 문서에 소개 된 메서드는 잠재적으로 모든 유형의 3D 콜라겐 매트릭스에 분할 하는 포유류 세포에 적용할 수 있습니다. H2B mCherry 마커의 설립 lentiviral 변환 하 여 다른 포유류 세포에 따를 것 이다 정확 하 게 동일한 절차는 종이에 설명 된 대로 셀의 종류는 다양 한 수 있습니다 변환에 대 한 효율성 lentivirus에 의해 비록 39. 모두 변환 시 세포의 밀도 및 바이러스 titer 효율성을 위해 최적화 될 수. 높은 변환 효율을 얻을 수 없다, 세포 형광 보조 셀 정렬 (FACS)에 의해 선정 수 있습니다. 티 미 딘 및 nocodazole 헬러40등 포유류 세포, 여러 다른 유형의 동기화에 적용 됩니다. 기계적인 동요-오프 모아 겨우 mitotic 단계30,31동안 기판에 연결 하는 세포 유형에 적용 될 수 있는. 또한, 반사 confocal 현미경 검사 법, 그리고 매트릭스 변형의 정량화를 사용 하 여 콜라겐 섬유의 이미징 포유류 세포 분열의 모든 다른 종류에 직접 적용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 방법은 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 3 차원 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근입니다. 접근 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 우리의 조사를 용이 하 게 하 고 소설 진단의 디자인 potentiates 미래에 치료 접근.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01CA174388 및 U54CA143868를 부여. 저자는 PURA 수상 웨이 통 첸의 지원에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 인정 하 고 싶습니다. 이 자료는 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 보조금 번호 1232825 아래에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney 293T ATCC
MDA-MB-231 Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM powder ThermoFisher Scientific 12100-046
Fetal bovine serum Hyclone SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X Sigma-Aldrich P0781
Fugene HD Promega E2311
Lipofectamine 2000 Life technologies 11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector Addgene plasmid 21217
Thymidine Sigma-Aldrich T1895
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Sodium bicarbonate GibcoBRL 11810-025
HEPES Sigma-Aldrich 113375-100
Collagen Corning 354236
NaOH J.T. Bake 3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm Millipore SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope Nikon TE2000E
Cascade 1K CCD camera Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software Nikon
Nikon A1 confocal microscope Nikon A1

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References

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