치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

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Summary

이 프로토콜의 둘째로 고조파 생성 이미징 및 차동 주사를 사용 하 여 토끼 sclera cross-linking 화학 평가 기법을 설명 합니다.

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Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

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Abstract

치료에 대 한 구조 단백질 (원 collagens)로 화학 채권 (비 효소 cross-linking)을 도입 하 여 조직을 강화 하는 방법 등 광화학 cross-linking 조직 cross-linking (TXL) 방법. 유도 하는 기계적 조직 속성 변경에 대 한 이러한 메서드는 고용 되 고 각 막에 원추 각 막으로 진보적인 근 시에서 sclera (기계적으로 약화) 각 막 숱이 장애에 숱이 고 뒷부분의 약화 공 막과 가능성이 축 신장에 기여 한다. 이러한 조직 강화에 대 한 기본 대상 단백질은 원 collagens 각 막과 공 막에 건조 중량 단백질의 대다수를 구성 하는. 우연히, 원 collagens 조직 세포 외 공간에서 제 2 고조파 발생 신호의 주요 원천입니다. 따라서, 콜라겐 단백질 요법, cross-linking를 통해 유도 등의 수정 수 잠재적으로 감지 되며 두 번째 고조파 세대 현미경 (SHGM) 통해 quantitated. 레이저 적외선 여기 가벼운 현미경 시스템을 스캔을 사용 하 여 신호 모니터링 SHGM 소스는 즐기고 생명 과학 분야에서 광범위 하 게 사용 하는 흥미로운 현대 이미징 방법입니다. 따라서, 현재 연구 에이전트 하위-장부의 공간 (sT), cross-linking 화학 물질의 주입에 따라 토끼 sclera, ex vivo에서 에서 가교 효과 유도 하는 측정 하는 수단으로 SHGM 현미경 검사 법의 사용을 평가 하기 위하여 착수 했다는 사출 접근 즉 안구 마 취 안과 임상 절차 동안에 원인에 대 한 표준 연습. 에이전트 cross-linking 화학 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 에이전트 (FARs)를 방출 하는 포름알데히드로 알려진 화장품 방부 제의 클래스입니다. SMG와 반응에 따라 scleral 변경 SHG 신호 증가 귀착되 고 열 변성 온도에 변화를 서로 평가 하는 표준 방법을 유도 효과 cross-linking 조직.

Introduction

으로 콜라겐 효소 cross-linking 차단 실험 양식 부족 (FD)을 증가 시킬 수 있습니다 (광화학 또는 화학), 비 효소 scleral cross-linking를 통해 치료할 수에 진보적인 근 시 가정은-유도 근1. Elsheikh 및 필립스2 최근 타당성과 표준 A 자외선 방사선 (UVA)를 사용 하 여의 가능성 논의-리 보 플 라빈 광화학 cross-linking (드레스덴 프로토콜 라고도 함), 약식 중재 (리 보 플 라빈 CXL) 여기 근 시 축 신장 중단 후부 scleral 안정화. 이 광화학 방법 keratoconus와 포스트 LASIK keratectasia에서 본 앞쪽 글로브 표면 (, 불 룩 한 각 막)의 불안을 치료에 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나,의 공 막이 CXL 프로토콜 응용 프로그램 액세스는 자외선 (UV) 광원, 뿐만 아니라 훨씬 더 조직 표면 영역을 수정 하려면 필요 후부 sclera에 어려움에 관련 된 문제에 의해 방해 된다. 비록 후부 sclera의 여러 지역 여러 별도 방사선 조사 영역 그 연구3에 필요한 토끼 (tarsorrhaphy)에 의해 박탈 그 말했다 되는, CXL 접근 사용 되었습니다 시각적 형태로 축 신장 중단 하. 대조적으로, 화학 안정화 에이전트의 (, cross-linking 대리인) 세인트 공간을 통해 주입 UV 광원 도입에 대 한 필요성을 피하고 후부 sclera를 수정 하는 간단한 방법을 대표할 수 있었다. 이 주입 기술은 백 내장 수술4,,56등 안과 절차 동안 안구 마 취를 유도 하는 유용한 방법으로 유명 하다. Wollensak7 glyceraldehyde (화학 가교 에이전트 에이전트 (FARs)이이 연구에서 설명 공개 포름알데히드 비슷한 개념)를 사용 하 여 성 주사를 사용 하 여 위에서 설명한는 토끼 sclera 및 genipin 완고 하는 FD 기니 피그8,9축 길이 제한 하는 것을 보였다. 이 광화학 CXL 기술을 통해 수용 성 화학 약품을 사용 하 여의 명확한 이점을 설명 했다. 따라서, scleral cross-linking FARs (, 광장)를 포함 하 여 어떤 종류의 주 사용 화학 약품을 사용 하 여10, scleral 신장에서 근 시의 진행을 중단 하는 가능한 치료 방법을 제공할 수 있다.

여기에 제시 된 프로토콜, 싱가포르로 토끼 눈의 공 막 엔 세인트 주입을 통해 전달의 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 화학 가교 솔루션 사용 하 여. 우리는 각 막에 국 소 화학 cross-linking 이전 유사한 프로토콜을 실행 했다. 그 이전에 보고 된 연구에 특히 집중 효과 cross-linking 종속 얻어질 수 효과 범위를 넘어서는 열 변성 분석11 정한 광화학 CXL와 달성 스패닝 SMG를 사용 하 여 .

여기는 성 주사 scleral 조직, 차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 그리고 두 번째 고조파 세대 현미경 검사 법 (SHGM)를 사용 하 여 열 변성을 통해 전달 하는 SMG의 가교 효과 평가 하기 위해 프로토콜에 설명 합니다.

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 라고도 열 분석를 사용 하 여 열 변성 변화 측정, scleral 조직에는 주로 그들은 대량 대다수 구성 이후 원 collagens의 속성에 의해 유도 단백질. 이 메서드는 콜라겐 분자 구조의 안정성과 교원 질 소 주 3 차 단백질 구조 안정화 복사해올된 채권 평가 합니다. DSC에 난방, 동안 중요 한 전환 온도 트리플 헬릭스, 젤라틴으로 알려져 일반적으로 형성 하는 과정의 풀기 결과 콜라겐 분자의 변성 결과 얻을 수 있다. 이 열 변성 콜라겐 분자를 따라 수소 결합을 방해 하 고 유도 가교 방법12,13더 높은 온도에 이동 될 수 있다. 이 방법은 특히 바이오 산업에에서 많은 십 년간 동안 그리고 가죽 만들기를 포함 하는 프로세스에 대 한 사용 되었습니다. 그러나,이 메서드 sclera 조직 추출 필요 하며 따라서만 수 비보 전 기법으로.

2 차 고조파 생성 현미경 (SHGM) 비 centrosymmetric 분자 환경 특정 재료의 비선형 광학 특성을 기반으로 합니다. 같은 자료, 강렬한 빛에에서 예 빛 레이저에 의해 생성 하, SHG 신호, 사건 빛 주파수에서 두 배가 됩니다 생성 합니다. SHG 신호를 만드는 것으로 알려진 생물학 물자는 콜라겐, microtubules, 및 근육 myosin. 예를 들어 콜라겐 860 nm 파장의 적외선으로 흥분된 430 nm 파장을 가진 보이는 범위에서 SHG 신호를 방출 합니다. 둘째로 고조파 생성 (SHG) 신호 영상 치료 콜라겐 cross-linking 평가 하는 유망한 방법 이다. 그것은 30 년 이상에 대 한 조직에 콜라겐 소 SHG 신호14방출 알려져 있다. 그러나, 최근에 수 고해상도 이미지 얻을 수15 콜라겐 젤19와 조직, 힘 줄16, 피부, 연골17,18, 혈관 등의 다양 한에서.

이 지식을 바탕으로,이 연구 서울시 화학적으로 유도 된 콜라겐의 cross-linking 통해 sclera에 유도 SHG 신호 변화를 평가 합니다. 결과 표시는 공 막의 SMG 수정 SHG 신호 조직 콜라겐 섬유 번들 (높은 순서 제 사기 구조 교원 질 소의 구성)에서 생산을 증가 하 고 또한 콜라겐에 구조적인 형태 론 적 변화를 생산 하 고 섬유 네트워크, 섬유 번들 "교정."에 반영

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Protocol

모든 절차는 그대로 outbred 토끼 머리에서 싱가포르로 토끼 눈을 사용 하 여 수행 되었다. 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 모든 기관 및 국가 지침 따라 했다.

1입니다. 솔루션의 준비

  1. 서울시 의회에 대 한 준비:
    1. 나트륨 중 탄산염 솔루션 (NaHCO3) 솔루션 NaHCO3 파우더는 증류수의 1 mL에 용 해의 0.0165 g를 사용 하 여 0.2 M 농도의 1 mL를 준비 합니다.
    2. 800 mM SMG의 최종 농도를 증류수의 1 mL에 가루 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시)의 0.1016 mg을 디졸브. 나트륨 중 탄산염 해결책 0.1 M NaHCO3 및 400 mM SMG의 최종 농도를 조정 합니다. 원하는 상호 효과 따라 서울시의 농도. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리 사용 40, 100, 400 mM 서울시.

2. subTenon의 주입 SMG를 사용 하 여 의회에 대 한

  1. 400 µ L 제어와 SMG 솔루션 두 1 mL 인슐린 주사기 (바늘 25 G)를 각각 작성.
  2. 쿠션의 도움으로 프로 파일 평면에서 토끼의 머리를 배치. 스티로폼 또는 종이 스택 최적의 위치에 머리를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다.
  3. 소아 안과 검 경으로 눈 꺼 풀을 철회.
  4. 초기 안구 내부 압력 (IOP) applanation tonometry 장치를 사용 하 여 측정 합니다.
  5. 조직 표시와 함께 limbus의 상단 중간 부분에 의도 된 주사의 사이트를 표시 합니다.
  6. 철회 conjunctival 집게 (또는 톱니 모양의 라운드 팁으로 어떤 겸)과 주사의 사이트를 둘러싼 결 막 및 결 막, 입력 표시 limbal 사이트 (, 2-3 단지 약간 넘어 장부의 캡슐을 통해 바늘을 삽입 m m는 limbus에서)입니다. 결 막에 작은 절 개를 통해 장부의 캡슐 바늘의 통과 촉진 하기 위해 아이리스가 위로 만들 수 있습니다.
  7. 한 번 장부의 캡슐 내에서 바늘은 그것에 게 사이드-투-사이드를 이동 하 여 자유롭게 모바일 있는지 확인 합니다. 이 기간 동안, 전 세계 이동 하지 한다. 하위-장부의 (sT)에서 sclera 위에 바늘의 적절 한 배치를 확인 하는이 공간.
  8. 주사기에서 솔루션을 삽입 하 고 바늘을 삭제. 즉시 다음 주입, 액체 결 (, chemosis)을 통해 본 앞쪽 볼록한 만드는 sT 공간에 축적 됩니다.
  9. 그것은 세계의 실수로 구멍 뚫 기 때문에 변경 되지 않았다 확인 IOP 측정을 반복 합니다.
  10. 뚜껑 금속을 제거 하 고 약 2-3 분 동안 닫힌된 눈 꺼 풀을 통해 디지털 마사지를 수행 합니다.
  11. 3.5 h의 잠복기에 대 한 머리를 두고 (실내 온도 18 ° C =), 다음 단계로 이동 하기 전에.

3. 조직 준비

  1. 세계에 대 한 액세스를 최적화 하기 위해 눈 꺼 풀 검 경을 사용 하 여 눈 꺼 풀을 철회. 눈의 크기에 따라 최적으로 크기의 금속을 선택 합니다.
  2. 분리는 limbus를 둘러싼 결. 이미 사출 사이트 근처 베인 되었습니다, 원주 확장 테두리 약 1 x 1 cm의 inoculum 크기를 포함 하는 것 그래서.
  3. Scleral 삽입의 자신의 사이트에 여분의 눈 근육을 잘라.
  4. 안구 후부 측면에서 추진 하는 집게와 함께 상승 합니다. 이 사후 세계에 대 한 액세스를 제공 하 고 안과 동맥 및 정 맥 부근 세계의 후부 극 시 신경의 절단을 촉진 한다.
  5. 잘라는 corneoscleral 복잡 한, 표시 된 주사 사이트를 포함 하 여 외부 테두리와 함께. 얼룩은 여전히는 공 막의 나머지 부분에 표시 되어야 합니다.
  6. 코 퍼스 vitreus 및 조직 집게와 견인을 적용 하 여는 공 막의 안쪽에 연결 된 모든 레이어를 제거 합니다.
    참고: 추가 단계는 수행 중인 다음 절차에 따라 달라 집니다.: 4.-DSC 분석, 5.-SHG 현미경 검사 법.

4. 지역 DSC 분석을 위해

  1. 치료 눈: 4 scleral 분야에서에서 잘라 나머지 scleral 컵은가 위 주사의 사이트 상단 부문에 있으며 중앙 정렬 있도록. 잘라 모두 측면 (, 비 강 및 임시), 측면과 하단에서 남은 3 분야.
    참고: 그림 1A에 시연은 (1-4) 사각형 (1-16)으로 더 분할 되는 섹터의 번호 매기기.
  2. 약 4 x 4 mm 각의 작은 사각형 (1-16)에 scleral 분야 (1-4) 잘라. 섹터 1 9 사각형 (개별 사각 [스퀘어 2] 주입의 정확한 사이트 확인)으로 나눌 수 합니다. 2 및 3 2 사각형으로 (정사각형 10-11, 12-13) 분야 및 부문 4 3 사각형 (사각형 14-16)으로 나눕니다.
  3. 주입 영역의 위치에서 분석 된 조직의 거리를 지역화 하려면 그림 1A와 같이 각 사각형에 숫자를 할당 합니다.
  4. 제어 눈: 후 다음 위치에서 조직의 사각형 조각을 잘라 4 scleral 섹터 (치료 조직에 유사한)에 나누어 조직: 3 사각형 상위 섹터 (섹터 1)에서 각 측 (분야 2, 3), 그리고 1에서 1는 하단 부문 (부문 4)입니다.
  5. 나머지 망막과 안 층 떨어져 긁 고 씻어 두 번 신선한 PBS 각 시간 약 10 솔루션에 잠긴 조각을 떠나 한 번에 s.

5. 대 한 SHG 이미징

  1. 가 위를 사용 하 여 중앙 정렬 하는 주입의 사이트는 1 x 1 cm 영역을 만들려면 sclera의 상단 부분을 잘라.
  2. 나머지 망막 및 맥락 막 층 떨어져 긁 고 씻어 두 번 신선한 PBS 약 10 솔루션에서 조각을 떠날 때마다 s.
  3. 장소 1 mL 튜브에 조직 이미징 시설에 수송을 위한 PBS 솔루션으로 가득합니다. 모든 절차, 보육 시간에 따라 안구의 해 부 시작 1 시간 내에서 수행 되어야 합니다.

6. 현미경 검사 법 프로토콜

참고: 이미지 다시 흩어져 SHG 신호 sclera 조직의 콜라겐에서이 프로토콜은 레이저 현미경 검사에 대 한 지어진 다.

  1. 현미경 검사 법 설정
    1. 최대화 하기 위해 신호 및 해상도 렌즈를 사용 하 여 수행 SHG 현미경 빛과 높은 수 가늠 구멍 (NA)와 적외선 전송 최적화. 우리의 목표는 니콘 Apo LWD 25 x / NA1.1 물 침수.
    2. Coverslip 0.17 밀리미터의 두께이 경우에 샘플의 깊이 맞게 렌즈의 교정 칼라를 조정 합니다.
    3. 25 x 객관적 렌즈를 탑재 하 고 윤 활 샘플을 탑재 하기 전에 이미지 표면 커버를 수성 젤의 관대 한 금액을 추가 합니다. 물 기반 젤 실험 기간 동안 증발 하지 것입니다 하 고 따라서 이미지 품질을 유지 합니다.
    4. episclera와 coverslip 표면 사이 두 개의 25 m m 라운드 coverslips (episcleral 면이 아래로) 제공 최대한 접촉 사이 건조 하지 않고 PBS 1 mL 튜브에서 scleral 조직을 놓습니다.
      참고: 조직의 수 또한 발견에 놓일는 coverslip. PBS의 좋은 금액 이미징 동안 수 화 된 조직을 유지 한다. 이 경우에 cellchamber를 조립 후 조직 조각과 PBS 추가 합니다.
    5. 25 m m 라운드 coverslip, 단일 배치 또는 챔버의 하단 부분에는 샌드위치 기법에 셀 챔버를 조립 하 고 챔버 라운드는 봉인 만들려면 아래로 상단 부분을 나사. 밀접 하 게 사용 될 때 최고 coverslip, 인위적으로 병합을 방지 하 고 조직을 손상 아래로 나사 하지 않습니다.
    6. 현미경 단계에서 조직 샘플 셀 챔버를 탑재.
    7. 에 전송 빛 눈 보기에 대 한 현미경을 설정 합니다.
    8. 무대를 놓고는 샘플의 낮은 표면에 초점, 눈 조각을 통해 밝은 분야 검사에 의해 결정 되는 목표의 높이 조정 합니다.
    9. 컴퓨터 모니터를 제외 하 고 모든 조명을 끄고 알루미늄 호 일 시트 현미경 스테이지에 draped 가능한 모니터에서 많은 빛을 차단. 길 잃은 빛 감지기에 도달 최소화 GaAsP NDD 검출기는 높은 감도 저 잡음 수집, 지킬 것 이다.
    10. 소프트웨어의 Ti 패드 패널에서 렌즈 정의가 올바른지 확인 하십시오.
    11. A1 소형 GUI 패널 이미징에 대 한 IR 레이저를 선택 하 고 NDD 검출기 선택 DAPI 채널 400-450 nm 대역 통과 필터를 장착을 선택 합니다.
    12. A 1 MP GUI 패널에서 설정 적외선 레이저의 파장 860 및 오픈 셔터.
    13. 레이저 스캐닝 A1 소형 GUI 패널에서 다음과 같이 설정 합니다. 선택: (a) Galvano 스캐너, (b) 단방향 검색, (c) 픽셀 망설임 시간 6.2 µs, (d) 프레임 크기 1024 x 1024 픽셀, (e) 선 평균 2 배
      참고: Galvano 스캐너 및 단방향 검색 하면 정확한 포인트에 의해 정렬. 보기의 전체 필드에 대 한 1024 x 1024의 크기는 0.5 μ m /pixel의 픽셀 크기를 변환합니다. 선 평균 이미지에서 총된 소음을 줄일 것 이다.
    14. 레이저 파워 및 검출기 이득을 조정 하 여 A1 소형 GUI 패널에서 이미지를 설정 합니다. 현재 이미지에서 픽셀 휘도 값의 막대 그래프를 표시 하는 테이블을 보고 패널 (Lut)을 엽니다. "찾기" 모드로 라이브 이미징 켜고 레이저 파워 및 검출기 이득을 조정 하 여 픽셀 값의 감지 범위를 극대화. 채도를 하지 마십시오. 일반적인 값은 2.5% 레이저 전원, 2.35 W 860에서의 총에서 및 100 HV (검출기 이득).
    15. 참고:이 설정에 대 한 내부 전원 측정기로 측정 레이저 파워는 5.2 mW. 실험 수행 때마다 다시 조정 레이저 비율 같은 내부 전력 측정은 5.2에서 일정 이미징 세션 간에 mW. 레이저 파워를 설정할 때 주의 해야 합니다. 카멜레온 II 레이저는 3 W 레이저 800 nm와 10% 또는 더 높은 전원 잠재적으로 조직의 손상을 유발 수.
  2. 이미지 수집
    1. 미리 보기 모드에서 XYZ 개요 도구를 사용 하 여 조직 영역을 스캔 합니다.
    2. 이 모드에서 이미지의 인수를 속도를 더 낮은 해상도 (256 x 256 픽셀 및 아무 선 평균)는 이미지를 설정 합니다.
    3. 5 x 5, 3 x 3, 또는 직물의 전체 표면을 커버 하는 보기의 단일 필드를 캡처하십시오. 개요 캡처 전에 각 위치에서 라이브 "스캔" 모드를 설정 하 고 조직 초점을가지고. 참고 조직의 다른 지구 축 방향으로 약간 다른 위치에 있을 것 이다.
    4. 콜라겐 섬유 보기의 전체 필드에서 특정 위치에 단계를 이동 하려면 개요 도구에서 해당 위치를 두 번 클릭 플랫 영역을 찾아.
    5. 라이브 "스캔" 모드, 플레인 초점에는 목표의 Z 위치를 조정 켜고, Ti 패드를 사용 하 여 Z 드라이브 광학 비행기 10-15 μ m이 하단 레이어 위에 이동.
    6. 1024 x 1024 픽셀, 2 x 선 평균, "캡처" 버튼을 사용 하 여 높은 해상도에서 이미지를 취득 합니다.
    7. "+" 버튼을 사용 하 여 XYZ 개요에 위치를 저장 합니다. 이렇게 하면 조직의 같은 지역 탈환 하지.
    8. 직물의 각 조각을 위해 겹치지 시야의 10 이미지를 캡처하십시오.

7. DSC 프로토콜

참고: 조직 준비 지역 DSC 분석을 위해 또는 조직 이미징 SHGM 수행 후에, 완료 되 자 마자이 단계를 진행 합니다.

  1. DSC 팬, 무게와 표시를 준비 합니다.
    참고:이 단계 이루어져야 조직 해 부 하기 전에 조직의 건조를 최소화 합니다.
  2. 흡수 성 조직으로 각 scleral 광장을 건조 하 고 이빨된 집게를 사용 하 여 DSC 팬의 바닥에 평평 하다.
  3. 조직 내부와 곱슬 머리 뚜껑 팬 무게 고 무게 젖은 조직을 적용 (샘플의 질량 5 ~ 11 밀리 그램의 범위에 있어야 합니다).
    참고: 각 인감 다음 조직 샘플을 진행 하기 전에 뇌관 집게를 사용 하 여 이동 합니다. 팬, 열 분석 이전 물 손실 방지 밀봉 밀폐 된다.
  4. 일단 샘플 구겨지지 DSC 트레이에 지정 된 위치에 놓습니다. 컨트롤에 대 한 6 샘플 및 치료 눈에 대 한 16 이어야 한다.
  5. 소프트웨어 관리, 조직의 무게를 지정 하는 악기를 사용 하 여 메서드를 만들고 실행 하는 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 분석: 난방 속도 40 ~ 80 ° C의 온도 범위: 1 ° C/min, 열 흐름: 17.37 mW, 가스 (N2) 흐름: 19.8 mL/min, 가스 압력: 2.2 바.
  6. 완료 되 면, 어떤 열 변성에 전환 온도 피크 발생 관리 소프트웨어 악기를 사용 하 여 추출 하 여 각 샘플에 대 한 데이터를 분석 합니다.

8. 이미지 분석

  1. SHG 신호
    1. 선택 적어도 5-10의 각 치료 및 그것의 통제에서 가장 대표적인 이미지 같은 이미지의 영역 대부분 콜라겐 섬유에 의해 점유 된다.
    2. ImageJ 소프트웨어에서 각 이미지를 업로드 하 고 선택 하 여 평균 픽셀 강도 측정 분석 > 측정 활성 이미지에 대 한.
    3. 추출 값 평균 픽셀 강도로 보고 하 고 메뉴에서 선택 하 여 농도의 히스토그램을 그려서 표시 또한 수 있습니다 분석 > 히스토그램.
    4. 따라 모든 측정된 데이터를 문서에 테이블을 만들고 Excel 시트를 사용 하 여 샘플 id입니다.
    5. 평균 및 각 치료 및 제어 조건에 대 한 픽셀 강도의 표준 편차를 계산 합니다.
    6. 학생의를 사용 하 여 t-검정, 농도 (, 0과 0 대 400 mM 서울시 대 40 m m SMG)의 모든 인덱스도 비교에 대 한 차이 비교 합니다. [P≤0.05]입니다.
  2. 파형
    1. 콜라겐 섬유를 표시 하는 이미지를 선택 합니다. 샘플 당 적어도 10 이미지 (를 포함 하 여 각 농도-총에서 40 이상에 대 한 컨트롤 샘플) 분석 되어야 합니다.
    2. 오픈 ImageJ > 플러그인 > NeuronJ. NeuronJ 사전 설치를 해야합니다.
    3. 모든 imagesby는 열린된 NeuronJ 창에 드래그를 업로드 합니다.
    4. 마우스로 fibril의 윤곽에 따라 섬유를 따라 추적 선 만들기 (그리기 태블릿 펜 사용 될 수), 총 섬유 길이의 거리를 측정 하는 M을 클릭 합니다.
    5. 접선 직선을 그릴 시작과 이전 그려진된 섬유 윤곽선의 끝 연결을 "옵션"을 선택 합니다. 엔드-투-엔드 길이 측정 하는 M을 클릭 하세요.
    6. 이미지 당 적어도 10 소에 동일한 절차를 반복 합니다.
    7. 10 소의 각각에서 그 두 측정을 수집 하 고 각각 길이 [곡선] 및 [선형], 길이 총 섬유 길이 (윤곽선) 및 엔드-투-엔드 길이 (바로 연결 라인)을 표현 하는 excel 스프레드시트에 데이터를 입력 합니다.
    8. 계산 하는 수식을 사용 하 여 파형 인덱스 (W): W = 길이 [곡선] / [선형] 길이.
    9. 수식을 사용 하 여 컨트롤 샘플에서 이미지와 함께 대우 samples(SMG)의 이미지에서 데이터를 비교 하는 파형의 %를 계산: (W [서울시]-1) / (W [제어]-1)
    10. 통계의 차이점 (p-값) 콜라겐 섬유 형태학의 다른 처리 조건 및 제어를 결정 하기 위하여 파형 인덱스 (W)에 대 한 인덱스도 t-테스트를 수행 합니다.

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Representative Results

광장 cross-linking 효과 평가 하는 시험 방법으로 열 변성 온도 (Tm): 토끼 눈의 16 쌍의 총 의회 절차에 대 한이 실험에서 사용 되었다. 이 연구의 초기 부분으로 싱가포르로 토끼 머리에 세인트 공간 통해 SMG 상호 에이전트의 단일 주사에 의해 유도 된 가교 효과의 지역화 평가 했다. 실험의이 유형은 하나 이상의 위치에 주사 sclera의 원하는 영역을 안정화 하는 데 필요한 수 때문에 환자의 임상 치료에 관련이 있다.

것입니다 기본적인 확산 원리에 따라 예측할 수, 효과가 했다 큰 주사의 사이트에서 솔루션의 농도 따라 인접 한 지역 뿐만 아니라, 유도 하는 효과 함께. 그림 1A scleral 분야 (빨간색 빈 번호 글꼴에서 1-4) (더 사각형 (1-16 검은 얇은 숫자 글꼴)으로 분할)와 단일 성 주입 다음 별도 열 변성 분석 경험의 구조 위치를 나타냅니다. 색상 매핑 인덱스입니다. 표 1 은 해당 컨트롤에 비해 번호가 매겨진된 각 부문에 대 한 Tm 값에 변화를 보여준다. 값 40 m m와 400 m m 주사 포함 하 고 최소 3 개의 독립적인 결정의 계산 의미의 표준 오차를 포함.

그림 1B-C 서울시, 40 mM (그림 1B)와 400 mM (그림 1C)의 두 개의 다른 농도 사용 하 여 결과 나타냅니다. 그림 1B, 낮은 농도 40 m m 샘플 광장 2 (주사 사이트)에서 주의 되었다 Tm에 가벼운 변화를 보였다. 유사한 교대 인접 한 사각형 1 3 (밝은 파랑)에서 볼 수 있었다. 사각형 4-6 7-9 주입된 광장에서 통계적으로 유의 한 차이가 없이 한계 교대를 볼 수 있습니다. 아니 Tm shift 주사 사이트에서 가장 먼 분야 대표는 낮은 사각형 14 ~ 16에 보였다.

그림 1C에서 같이, 높은 농도 (400mm) 통계적으로 매우 중요 한 가교 효과 (오렌지의 음영으로 표시)을 했다. 낮은 40 mM 농도에 비해 400mm의 효과에 큰 차이 반영 관련된 작은 표준 편차와 p < 0.05 Tm에 큰 변화가 관찰 되었다. 가장 극적인 효과 부문 1 위 세계에서 지적 했다. 나머지 분야에 관해서는 덜 효과 10-14 (이 되었을 수도 있습니다 가교 유체의 일부 추적으로 인해 뒤로) 사각형에서 관찰 되었다 하 고 영향을 주지 않습니다 사각형 11, 12, 13, 15, 및 16에서에서 관찰 되었다. 전반적으로, 가교 효과 했다 2와 3 섹터 (, 사출 사이트에서 가장 먼 위치), 4에서에서 관찰 아무런 영향 분야에서 한계 40 m m 샘플 비슷합니다. 이러한 결과 표시 '효과의 영역'은 이러한 유형의 패턴 cross-linking 대리인의 세인트 주입에 따라 예상 될 수 있었다. 이 조직의 넓은 지역 효과 유도 하기 위하여 여러 위치에서 주입에 대 한 필요성을 나타낼 수 있습니다.

서울시의 2 개의 농도와 의회를 평가 하는 그대로 눈에서 유도 된 가교 효과의 연구도 수행 되었다. 열 변성 받았다 scleral cross-linking 같은 조직의 분석 수행 되었다. 광장 3 개의 다른 농도, 40을 사용 하 여 3.5 h 했다 시간 cross-linking (Tm = 1.2 + 1.11), 100 (Tm = 2.9 + 5.12), 400 (Tm = 1.1 + 14.34) mM 서울시. 결과는 서울시 복사해올된 조직에서 농도 의존 효과 보여주었다.

둘째로 고조파 생성 (SHG) 광장 cross-linking 효과 평가 하는 방법으로 이미징:

SHG 현미경 이미지 모두 픽셀 강도 SHG 신호 및 섬유 번들 파형의 분석. (400 m m 40)에서 농도 cross-linking의 넓은 범위는 cross-linking 효과의 넓은 범위에 걸쳐 발생할 수 있는 SHG 신호 변화를 탐구 하기 위하여 사용 되었다. 처리 프로그램20피지 이미지에 포함 된 히스토그램 분석 기능을 사용 하 여, quantitate SHG 신호 세인트 주입, 40 m m 400 m m를 사용 하 여 유도 그 효과 비교 하 여 scleral 조직에서 생산 가능 했다. 40 m m에 평균 픽셀 intesities에 평균 차이 66.3 ± 27.7 361.4 ± 28.3 400 m m 샘플, 거의 6-fold 증가에 비해 했다. Tm에 해당 증가 또한 이러한 조건 하에서 주의 되었다 이후이 조직 cross-linking의 증가와 해당 합니다. 그림 2 는 40 밀리미터 (그림 2B)와 400 mM (그림 2C) 컨트롤 (그림 2A)에서 가져온 sclera의 대표적인 SHG 이미지. 평균 밝기 (또는 픽셀 휘도)를 포함 하 여 동반 히스토그램 분석 표시 됩니다. 이미지 분석의 총 수를 했다: 40 m m 및 그 제어; 98 120 400 m m와 그것의 자신의 컨트롤에 대 한 94 121. 조직 영상의 깊이 episcleral 표면에서 10-15 µ m 이었다. 수많은 이미지 필드의 평균 참여, 히스토그램 분석의 결과 표시 cross-linking 효과 (그림 3) 의 높은 농도 더 큰 픽셀 농도 생산.

그림 4에서처럼 이미지 분석 또한 ImageJ 플러그인 '뉴런 J'21을 사용 하 여 심장 혈관 혈관 문학에서 채택 하는 방법으로 수행 되었다. 우리 예상 파형 요소 W = 길이 [곡선] / [선형] 길이 고 우리는 치료 제어 sclera 대 40 m m 및 400 m m 복사해올된 sclera 감소 파형 %로 표시 된 섬유 번들의 교정 결과 cross-linking 관찰 (W % (W [= SMG]-1)/(W[control]-1), 표 2)입니다. 40과 400 m m SMG 취급 샘플 파형에 차이 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다.

Figure 1
그림 1 : 세인트 주입을 사용 하 여 40과 400 mM 서울시를 통해 광장 효과의 지역화.
(A)
사각형 [작은 검은 얇은 글꼴에서 숫자 1-16] (규모 하지 그려) 열 분석 경험을 나누어 sclera 4 scleral 부문 (1-4 대형 빨간색 투명 글꼴에서 숫자)의 도식 대표. 사출 사이트 부문 1에에서 위치한 광장 (광장 2)에 대응 했다. 열 변성 cross-linking 400mm SMG (1B) 40mm SMG와 의회와 (1 C) 의 효과. (D) 색상 (B)(C)에 대 한 온도 눈금 전설 코딩. 이 그림은 권한을22Zyablitskaya 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 농도 의존 증가 SHG에의 대표 이미지 신호 광장 sclera의 세인트 주입을 통해 서울시를 사용 하 여 다음 생산 하는 밝기 레벨 비보 전 . SMG의 농도 (B) 40 m m와 400 m m (C) 표시 됩니다. 각 이미지는 50 µ m 눈금 (오른쪽 하단 모서리) 막대와 평균 픽셀 강도 값 (오른쪽 상단)-절대 값을 포함합니다. 이 그림은 권한을22Zyablitskaya 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Scleral 그대로 글로브 40과 400 m m SMG 솔루션 세인트 주입 (의회)를 통해 십자가에 (같은 토끼 머리에서 쌍된 컨트롤)에 비해 SHG 신호 픽셀 강도 변화 (Δ)의 막대형 차트. 뜻의 표준 오차와 평균 값: 40 m m 및 400 m m 361 ± 28.3 66 ± 27.7. 이 그림은 권한을22Zyablitskaya 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 섬유 파형 분석 (으로 선형성에 의해 표명)의 예. (오른쪽 하단 모서리) 바 50 µ m 규모와 40 mM SMG 농도 제어 샘플의 이미지. 이 그림은 Zyablitskaya 에서 수정 되었습니다. 권한22와. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 세인트 주입의 도식 대표. 영역 1-3 번호가 그림 1A에 표시 영역에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

±Δ Tm
지역 40 m m 400 m m
1 3.4 ±2.8 20.5 0.6
2 3.4 ±0.53 19.58 ± 1.5
3 2.5 ±2.47 17.99 ±3.06
4 0.72 ±0.9 20.36 ±0.19
5 0.85 ±0.55 19.11 ±1.33
6 0.52 ±1.35 18.66 ±4.1
7 0.78 ±1.6 18.44 ±2.8
8 0.56 ±0.9 17.77 ±2.69
9 0.22 0.6 18.92 ±2.6
10 0.46 ±0 8.75 ±10.56
11 0.47 0.18 0.63 ±1.84
12 0.11 ± 0.08 0.66 ±1.52
13 0.08 ± 0.05 0.71 ±2.17
14 0.22 ±0.7 5.71 ±0.29
15 0.32 ± 0.2 0.29 ±0.7
16 0.24 ±0.73 0.26 ±0.79

표 1: DSC는 의회 효과 연구의 지역화에 대 한 결과. 그림 1A에서 묘사 된 샘플링된 각 부문에 대 한 표준 오류로 열 용융 온도 (ΔTm)에 변경이입니다. 각 값은 대응된 컨트롤에 Tm ascompared에 차이 표현 되며 3 독립적인 결정의 최소의 평균입니다.

서울시, mM 파형 파형-% [0 m m SMG] 대 t-검정
0 1.106 ± 0.044 100
40 1.067 ± 0.017 63 p < 0.02
400 1.059 ± 0.009 55 p < 0.003
선형 섬유 1.000 0
(이론)

표 2. 섬유 파형 분석의 결과입니다. SHG 이미지 광장 주입의 영역에서 뉴런 J 소프트웨어를 사용 하 여 섬유 파형의 정도 대 한 분석 했다. 10 섬유 각 이미지에서 선정 되었다 고 약 100 섬유의 총 파형의 정도 대 한 분석 했다. 뜻의 표준 오차와 평균 값 포함 되어 있습니다.

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Discussion

실시 실험 콜라겐 cross-linking sclera, cross-linking 치료에 대 한 모니터링 도구로이 기법을 사용 하 여 미래의 가능성 제기에 효과의 평가 위한 방법으로 SHG 신호 현미경의 사용을 지 원하는 증거를 나타났습니다. 그는 콜라겐 단백질을 대상. 메모의 악기는 이미 잠재적으로이 SHG 신호를 캡처할 수 있는 임상 사용 중에서입니다. 이 악기는 주로 이미징 피부 인간의 피에 대 한 설계, 이미지 각 막과 공 막23성공적으로 사용 되어 있다.

동일한 검색 및 제어를 비교할 때 조건 이미지를 유지 하기 위해 필요한 샘플을 처리 하 고. 2 고조파 세대 sclera 조직에 콜라겐의 현미경 필요 호환 다 광자 영상, 형광 현미경 펄스 적외선 레이저는 GaAsP 등 매우 민감한 검출기에 800-900 nm 파장 범위 조정 비 descanned (NDD) 감지기입니다. 이 원고에 설명 된 지침에는 시작 지점입니다. 조건 또는 다른 시스템에 대 한 새로운 실험에 대 한 구체적으로 결정 되어야 합니다.

각 막과 공 막 또한 있다 평가 동시에이 기술을24,25,,2627을 사용 하 여 연구에. 그것의 기본 상태28,,2930,31에 독립적으로 각 막 조직 검사 여러 연구 SHG 신호 모두 앞뒤로 방향에서 전파를 알면, 32,,3334 및 keratoconus35,36 뿐만 아니라 (아래에 설명)으로 CXL 다음. 이러한 연구의 결과 각 막 신호는 각 막의 투명도 빛 앞으로 분산된 시스템에서 모니터를 조직을 통해 전달 사실 의미가 앞으로 흩어져 방향에 최적화 되어 나타냅니다. 일반적으로 SHG 신호에 파란색 표시 범위 이며 눈 sclera 같은 높은 산란 조직을 통해 전달할 때 크게 감소 될 것 이다. 결과적으로, 앞으로 흩어져 SHG의 조직의 특별 한 광학 설정 뿐만 아니라 50 μ m 또는 더 적은 두께의 얇은 단면도 요구할 것입니다. 대조적으로, 조직 단면 없이 형광 현미경의 일반 빛 경로 통해 다시 흩어져 신호를 캡처할 수 있다 하 고 따라서이 모드는 기본 30-40 μ m의 깊이를 그대로 sclera 조직에 콜라겐을 이미징 하는 경우. 이 연구에서 우리는 신호 밀도 농도 의존 증가 지적 했다. 그러나 그것은 확실히 가능 하다,,는 광장의 sclera, 더 깊은 층에 추가 하 고 비슷한 효과 있 었 하 고 발음 하 고 특히 높은 농도 가진 더 깊은 층을 확장 효과가 더 있을 수 있습니다. 그러나, 제한 SHG 신호 침투는 sclera에이 초기 연구의 목적을 위해, 때문에 우리 가장 피상적 sclera (15 µ m 깊이)에서 가져온 최고의 품질 이미지와 함께 작동 하도록 선택 했습니다. 미래에 연구, 우리 의회 방법이 아니었다 왜 큰 차이도로 추가로 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다 다음 종속 효과 40과 400 mM 처리 샘플 사이 관찰 하는 깊이 고려할 것입니다.

또한, 리 보 플 라빈 CXL 유도 조직 cross-linking 평가 대 한 SHG에의 사용, SHG 현미경 이미징 다음 리 보 플 라빈은 각 막의 CXL 보고 되었습니다 여러 그룹37,,3839, 40 , 41. 스티븐 외에 의해 연구에서 37, CXL 기술을 사용 하 여 각 막 안정화는 '균질' 신호 및 손실의 조직 '주름' 또는 '파동'의 교차 연결 된 샘플에서 본 결과. 그러나 이러한 유형의 변경,, 또한 했다 주의의 기술적인 가능성을 제기 하는 각 막 SHG 신호, IOP에 변화의 효과 평가 연구. 조직에서 더 높은 순서 섬유 번들/플레이트 조직 관점 뿐 아니라에서 fibril sclera 그리고 각 막 다르다 이며 많은 전자 현미경 연구에서 이러한 차이점에 대해 알고 있다. 두 조직 다 fibril 직경 분포 (공 막 엔에 대 한 변수 및 각 막 직경 소에 대 한 작은 균일 한 소) 및 간격 (각 막과 공 막에 대 한 변수 유니폼) 간 fibril fibril 포장에 관해서는. 뿐만 아니라, 더 높은 순서 조직 섬유 번들 (sclera) 대 플레이트 시트 (각 막)으로 매우 다르다. 이러한 구조적 차이이 두 조직에 의해 생성 하는 SHG 신호에 반영 됩니다. 따라서, cross-linking에 의해 유도 된 변화는 다르지만 병렬 방식에서 SHG 신호를 변경할 수 있습니다. 다른 말로 '스트레이트'는 공 막에 섬유의이 연구에는 문학에서 보고 된 각 막에는 신호 '균질 ' 관찰 했다 수정 cross-linking 콜라겐의 두 결과. 따라서, 각 막에 '균질 ' 효과 어떤 식으로든에서 수 여기 보고 되었습니다 sclera의 '스트레이트' 효과에 유사한.

의회에 의해 제작이 스트레이트 효과 발생 메커니즘은 현재 연구에 따라 분명. 한 가능성 수는 조직 어떻게든 '고정 ' 기계적으로 '' 로드 된 위치에 있습니다. 이 유도 하는 관념을 지 원하는 것이 'fibril 및 섬유 안정화' 발생 했다. 안구 내부 압력 가능성이 변화 IOP 이전 및 세인트 주입에 따라 모니터링 안정 유지 이후이 효과에 공헌 하지 않았다. 전반적으로,이 관측의 중요성은 명확 하지 않다 고 추가 연구가 필요할 것 이다. 메모의 이미징 기법 브 릴 루 앵 현미경42, 등 별도는 보였다 양적 측정을 제공 하기 위해 (전단 탄성 계수에 의해 결정)으로 cross-linking의 CXL 광화학 다음에 유용할 수 있습니다 SHG와 결과 확인 이 연구에서 이미지입니다. 그러나, sclera43등 높은 분산 조직 사용 기술 수정 요구 복사해올된 scleral 조직으로 검증 되지 않은 주목 되어야 한다.

분극 레이저 SHG 현미경 검사 법은 중요 한 문제. 레이저 빛은 선형 편광 고 각 콜라겐 섬유에 xy-평면에서 어떤 각도로 SHG 신호 전파의 방향에 수직을 지향. 따라서, xy-평면에 섬유를 잘 정렬 하 고 정확 하 게 수직으로 편광 된 레이저 광을 생산할 예정 이다 (, z-비행기), 입사광에 평행 하 게 그를 포함 하 여 다른 각도에서 그 보다 더 높은 SHG 신호를 생산할 예정 이다는 (때문에 파괴적인 방해) 최저 SHG 신호. Sclera 조직에 관하여 콜라겐 비록 기본 해부학 섬유 방향 존재 하는 미세한 수준에서 다양 한 각도에서 섬유는 지향 세계 위치 기반으로 합니다. 따라서, 생산 SHG 신호는 각 섬유의 xy 평면에 각도 따라 달라 집니다, 이후 전체 신호 보다 적게 될 모든 콜라겐 섬유 (한 힘 줄 같은 조직에서에서 동일한 각도로 정확 하 게 정렬 했다 경우 생성 되는 예를 들면). 따라서,이 연구 되 고 몇 군데 샘플의 특성상 분극의 방향으로 의도적으로 결정 하지는 하지만 연구에 걸쳐 일관성을 유지 했다. 또한, 우리 조직을 처리 했다에서 취급 하 고 섬유 방향 샘플 간의 차이 최소화 동일한 scleral 지역에서 글로브를 제어. 마지막으로, 우리는 강도 값을 얻기 위해 샘플 당 100 개 이상의 이미지를 분석. 이 광범위 한 평가 등록 되었습니다 어떤 탈 SHG 신호를 정규화 해야 합니다. 그 말했다 하 고, 그것이 가능한 결과로 "섬유 스트레이트" 우리 "에 초점 비행기의" 섬유는 SHG의 증가에 기여 할 수 있는 더 큰 비율 (위에서 설명한) 복사해올된 샘플에서 관찰 증가 뿐만 아니라 신호 SHG 신호 큰 xy-평면 정렬에서. 이러한 가능성의 둘 다 유도 가교 효과의 발현 될 것 이다.

서울시의 성 주사에 의해 유도 된 변화 (Tm)에 의해 cross-linking의 지역 분석 수행 되었다. 예상 했던 대로, cross-linking 효과의 수준은 주입의 지역에 집중 되었다. 거의 비슷하게 상호 효과 주입, 알려 지는 무슨이 초음파 지역화44, 에 의해와 같이 세인트 주입에 따라 효과의 지역화에 대 한 일치에서 맞은편 (더 멀리) 지역에서 주의 되었다 45 tomography46계산.

마지막으로, 가교 치료 및 근 시, 각 막의 cross-linking 교원 질 찾는 광범위 한 사용 그리고 keratoconus, 포스트 LASIK keratectasias 용 한계 변성 (PMD)를 포함 하 여 각 막 불안의 치료에는 굴절 수술 절차47겸임입니다. Cross-linking로 막 질병 치료의 성공 그리고, 특히, 높은 근 시2, 다시가 개념에서에서 축 신장 제한 sclera 눈의 뒤에이 치료 방법을 적용 하는 탐험에 주도하는 치료 상호 개념48,49의 아주 초기 단계.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

저자는 세인트 주입;에 대 한 상담에 감사 Tongalp Tezel, 메릴랜드, 테레사 Swayne, 박사, SHG 현미경;에 관한 상담 그리고 디자인 및 생물 통계학 리소스 및 컬럼비아 대학 의료 센터에서 어 빙 연구소의 Biostatistical 핵심 시설에서 지미 둥.

실명 방지 연구에 의해 및 국가 연구소의 건강 보조금 NCRR UL1RR024156, 네이 P30 EY019007, NCI P30 CA013696, 그리고 네이 R01EY020495 (DCP)에 의해 부분에서 지원. 관련된 지적 재산권을 소유 하는 컬럼비아 대학: 발행 하는 미국 특허 아니오: 8,466,203,: 9,125,856. 국제 특허 출원: PCT/US2015/020276.

이미지는 Confocal에 수집 및 전문 현미경 공유 리소스 컬럼비아 대학, NIH에서 지원에서 허버트 어 빙 종합 암 센터의 #P30 CA013696를 부여 (국립 암 연구소). Confocal 현미경 NIH 함께 구매 #S10 RR025686를 부여.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

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