Anden harmonisk Generation signaler i kanin Sclera som et redskab til evaluering af terapeutisk væv Cross-linking (TXL) for nærsynethed

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver teknikker til evaluering af kemiske cross-linking af kanin sclera ved hjælp af andet harmonisk generation imaging og differential scanning kalorimetri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metoder til at styrke væv ved at indføre kemiske bindinger (ikke-enzymatiske cross-linking) i strukturelle proteiner (fibrillar collagens) for terapi omfatter fotokemisk cross-linking og væv cross-linking (TXL) metoder. Sådanne metoder for at fremkalde mekaniske væv egenskabsændringer er ansat til hornhinden i cornea udtynding (mekanisk svækket) lidelser såsom keratoconus samt sclera i progressiv nærsynethed, hvor tyndere og svækkelsen af bageste sclera opstår og sandsynligvis bidrager til aksial brudforlængelse. Primære target proteiner for en sådan styrkelse af væv er fibrillar collagens, som udgør det store flertal af tørvægt proteiner i hornhinden og sclera. Tilfældigvis er fibrillar collagens den vigtigste kilde til anden harmonisk generation signaler i væv ekstracellulære rum. Derfor, ændringer af kollagen proteiner, som dem fremkaldt via cross-linking terapier, kunne potentielt være opdaget og quantitated ved hjælp af anden harmonisk generation mikroskopi (SHGM). Overvågning SHGM signaler ved hjælp af en laser scanning mikroskopi system kombineret med en infrarød excitations lys kilde er en spændende moderne billedbehandling metode, der nyder udbredt skik i de biomedicinske videnskaber. Således, den nuværende undersøgelse blev foretaget for at evaluere brugen af SHGM mikroskopi, som et middel til at måle inducerede tværbindingsmidler effekter i ex vivo kanin sclera, efter en indsprøjtning af et kemikalie cross-linking agent i sub-Tenons plads (sT), en injektion tilgang er standardpraksis for forårsager okulær anæstesi under oftalmologisk kliniske procedurer. De kemiske cross-linking agent, er natrium hydroxymethylglycinat (SMG), fra en klasse af kosmetiske konserveringsmidler kendt som formaldehyd frigive agenter (FARs). Scleral ændringer efter reaktion med SMG resulterede i en stigning i SHG signaler og korreleret med skiftehold i termisk denaturering temperatur, en standard metode til evaluering af induceret væv cross-linking effekter.

Introduction

Progressive nærsynethed er postuleret for at være behandlelige gennem ikke-enzymatiske scleral cross-linking (fotokemisk og kemiske), hvilket giver mening at blokere kollagen enzymatisk cross-linking kan øge eksperimenterende form afsavn (FD)-induceret Nærsynethed1. ElSheikh og Phillips2 for nylig drøftet gennemførlighed og potentiale til at anvende standard ultraviolet-en bestråling (UVA)-riboflavin medieret fotokemisk cross-linking (også kendt som Dresden-protokollen), forkortet her som (riboflavin CXL) for posterior scleral stabilisering at standse aksial brudforlængelse i nærsynethed. Denne fotokemiske metode har held været anvendt til behandling af destabilisering af anterior globe overfladen (dvs., de svulmende hornhinden) set i keratoconus og post-LASIK keratectasia. Dog hæmmes CXL protokollens for sclera af problemer i forbindelse med vanskeligheder i at få adgang til den bageste sclera med en ultraviolet (UV) lyskilde, samt behovet for at ændre en meget større væv areal. At bliver sagt, CXL tilgang har været brugt til at standse aksial brudforlængelse i visuel form berøvet kaniner (af tarsorrhaphy), selv om flere områder af posterior sclera krævede flere separate bestråling zoner i denne undersøgelse3. Derimod kunne injektion af en kemisk stabilisator (dvs, tværbindingsmidler agent) via sT plads repræsentere en enklere måde at ændre den posteriore sclera, undgå behovet for at indføre en UV-lyskilde. Denne injektionsteknik er kendt som en nyttig måde at inducere okulær anæstesi under oftalmologisk procedurer såsom grå stær kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrevet tidligere har brug for en St. injektion ved hjælp af glyceraldehyd (en kemisk tværbindingsmidler agent samme i konceptet til formaldehyd frigive agenter (FARs) beskrevet i denne undersøgelse) at stivne kanin sclera og genipin har vist sig at begrænse aksial længde i FD marsvin8,9. Disse forskere har påvist en klar fordel ved at anvende en opløselig kemisk agens over den fotokemiske CXL teknik. Således scleral cross-linking bruger en injicerbar kemisk agens af nogle typer, herunder FARs (dvs., TXL)10, kunne give en mulig behandlingsmetode til at standse progressionen af scleral brudforlængelse set i nærsynethed.

I protokollerne præsenteres her, bruger vi en kemiske tværbindingsmidler opløsning af natrium hydroxymethylglycinat (SMG), leveret via sT injektion til sclera af dødt kanin øjne. Vi har gennemført lignende protokoller tidligere for aktuel kemiske cross-linking i hornhinden. Især i de tidligere rapporterede undersøgelser, kunne koncentration afhængige cross-linking virkninger være opnået ved hjælp af SMG, med en effekt sortiment spænder godt ovenfor der kan opnås med fotokemisk CXL, som bestemmes af termisk denaturering analyse11 .

Her beskriver vi protokoller for at vurdere den tværbindingsmidler virkning af SMG leveret via sT injektioner til scleral væv, termisk denaturering bruger Differential Scanning kalorimetri (DSC), og anden harmonisk Generation mikroskopi (SHGM).

Ved hjælp af differential scanning kalorimetri (DSC), også kendt som termisk analyse, er en termisk denaturering overgang målt, som for scleral væv er hovedsageligt styret af egenskaberne for de fibrillar collagens, da de udgør hovedparten flertal af protein. Denne metode evaluerer stabiliteten af kollagen molekylære struktur og de krydsrefererede obligationer, at stabilisere kollagen fibriller, principal tertiære protein struktur. Under varme i DSC, er en kritisk overgang temperatur opnået der resulterer i denaturering af kollagen molekyle, hvilket resulterer i uncoiling af triple helix, en proces, der danner hvad er almindeligt kendt som gelatine. Dette termiske denaturering forstyrrer hydrogenbindinger langs kollagen molekyle og kan flyttes til højere temperaturer gennem induceret tværbindingsmidler metoder12,13. Denne metode har været brugt i mange årtier, især i biomaterialer-industri og for processer, der omfatter læder-making. Men denne metode kræver udvinding af sclera væv og kan derfor kun være nyttige som en ex vivo -teknik.

Anden-harmonisk generation mikroskopi (SHGM) er baseret på de ikke-lineære optiske egenskaber af særlige materialer med ikke-centrosymmetric molekylære miljøer. I sådanne materialer, intense lys, for eksempel lys produceret af lasere, genererer SHG signaler, som den indfaldende lys er fordoblet i frekvens. Biologiske materialer, der er kendt for at skabe SHG signaler er kollagen, mikrotubuli og muskel myosin. For eksempel, vil kollagen spændt med et infrarødt lys af 860 nm bølgelængde udsender en SHG signal i det synlige spektrum med 430 nm bølgelængde. Anden harmonisk generation (SHG) signal imaging er en lovende metode til evaluering af terapeutisk kollagen cross-linking. Det har været kendt i mere end 30 år, kollagen fibriller i væv udsender SHG signaler14. Dog kunne først for nylig billeder i høj opløsning opnås15 i en række forskellige væv, herunder senen16, hud, brusk17, blodkar18, og i kollagen geler19.

Baseret på denne viden, vurderer denne undersøgelse SHG signal ændringer induceret i sclera gennem SMG kemisk induceret cross-linking af kollagen. Resultaterne viser, at SMG ændring af sclera øger SHG signaler fremstillet af væv kollagen fiber bundter (højere orden kvaternære struktur består af kollagen fibriller) og producerer også en morfologiske strukturændringer i kollagen fibernet, afspejles i fiber bundle "glatning."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført ved hjælp af dødt kanin øjnene inden for intakt outbred kanin hoveder. Alle institutionelle og nationale retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr blev fulgt.

1. forberedelse af løsninger

  1. SMG forberedelse til TXL:
    1. Forberede 1 mL 0,2 M koncentration af natriumbikarbonat løsning (NaHCO3) løsning med 0.0165 g NaHCO3 pulver opløses i 1 mL destilleret vand.
    2. 0.1016 mg pulveriserede natrium hydroxymethylglycinat (SMG) opløses i 1 mL destilleret vand at få en endelig koncentration på 800 mM SMG. Justere natriumbikarbonat løsning til en endelig koncentration 0,1 M NaHCO3 og 400 mM SMG. Koncentrationer af SMG afhængigt af den tværbindingsmidler effekt ønskes. I protokollen beskrevet her brugte vi 40, 100 og 400 mM SMG.

2. subTenon injektion for TXL bruge SMG

  1. Fylde to 1 mL insulin sprøjter (25G nåle) med 400 µL kontrol og SMG løsning, henholdsvis.
  2. Placer den kanin hoved i en profilen Fly ved hjælp af en pude. Styrofoam eller en papirstakken kan bruges til at rette hovedet i en optimal position.
  3. Trække øjenlåg med en pædiatrisk eye speculum.
  4. Måle den indledende intraokulært tryk (IOP) ved hjælp af en applanation Tonometri enhed.
  5. Mark bestemt injektionsstedet på den øverste midterste del af limbus med en markør, væv.
  6. Trække conjunctiva omkring injektionsstedet med en konjunktival pincet (eller enhver pincet med savtakket rund spids) og indsætte nålen gennem conjunctiva, ind i Tenons kapsel bare lidt ud over det markerede limbal websted (dvs.2-3 mm fra limbus). Et lille snit i conjunctiva kan også laves med iris saks for at lette passagen af nålen gennem Tenons kapsel.
  7. En gang i Tenons kapsel, Sørg for, at nålen er frit mobil ved at flytte den side til side. I løbet af denne tid, bør kloden ikke flytte. Dette bekræfter korrekt placering af nålen ovenfor sclera i sub-Tenon's (sT) plads.
  8. Injicere løsning fra sprøjten og kassér nålen. Umiddelbart efter injektion, vil væsken ophobes i sT rummet skabe en anterior bule set gennem bindehinden (dvs., chemosis).
  9. Gentag IOP-måling for at bekræfte, at det ikke ændrede på grund af en utilsigtet perforation af kloden.
  10. Fjerne låget speculum, og udføre digital massage gennem de lukkede øjenlåg i cirka 2-3 min.
  11. Forlader hovedet for en inkubationstid på 3,5 h (stuetemperatur = 18 ° C), forud for at flytte til det næste trin.

3. væv forberedelse

  1. Trække øjenlågene ved hjælp af øjenlåget speculum for at optimere adgang til hele verden. Vælg den optimalt mellemstore speculum efter størrelse i øjet.
  2. Adskille conjunctiva omkring limbus. Hvis det har allerede været et snit i nærheden af injektionsstedet, circumferentially udvide grænserne, så det vil indeholde et inokulum størrelse af ca 1 x 1 cm.
  3. Skær de ekstra okulære muskler på deres websteder for scleral indsættelse.
  4. Ophøje øjeæblet med pincet, skubber det fra den bageste side. Dette giver adgang til den bageste globe og vil lette tilskæring af synsnerven med oftalmologiske arterie og vene i nærheden af den bageste pol af kloden.
  5. Skåret ud corneoscleral komplekse, med den ydre grænse herunder markant injektionsstedet. Pletten bør stadig være synlig på den resterende del af sclera.
  6. Fjerne corpus vitreus og alle lag knyttet til den indvendige side af sclera ved at anvende trækkraft med væv pincet.
    Bemærk: Yderligere trin afhænger af følgende procedurer udføres: 4. - DSC analyse, 5. - SHG mikroskopi.

4. for regionale DSC analyse

  1. For behandlede øjet: skåret ud fire scleral sektorer fra de resterende scleral cup med saksen, så at injektionsstedet er placeret i den øverste sektor og tilpasset centralt. Skære de resterende 3 sektorer fra både laterale sider (dvs., nasal og tidsmæssige), og i bunden.
    Bemærk: nummerering af sektorer (1-4), som er yderligere inddelt i kvadrater (1-16) er vist i figur 1A.
  2. Skæres de scleral sektorer (1-4) i mindre firkanter (1-16) cirka 4 x 4 mm hver. Sektor 1 bør være opdelt i 9 firkanter (gøre det nøjagtige sted, injektion en individuel pladsen [plads 2]). Opdele sektorer 2 og 3 i 2 firkanter (firkanter 10-11 og 12-13) og sektor 4 i 3 firkanter (firkanter 14-16).
  3. Tildele et nummer til hvert kvadrat, som vist i figur 1A, for at lokalisere afstanden de analyserede væv fra placeringen af det injicerede område.
  4. For kontrol øjet: efter dividere vævet ind i fire scleral sektorer (svarende til det behandlede væv) skåret ud af firkantede stykker af væv fra følgende placeringer: 3 pladser fra den øverste sektor (sektor 1), 1 fra hver side (sektorer 2 og 3), og 1 fra den bunden sektor (sektor 4).
  5. Skrabe ned de resterende retinal og choroidal lag og vaskes to gange med frisk PBS hver gang forlader stykker neddykket i opløsningen til ca. 10 s ad gangen.

5. for SHG Imaging

  1. Skær den øverste del af sclera bruger saks til at oprette en 1 x 1 cm område med injektionsstedet justeret centralt.
  2. Skrabe ned de resterende nethinde og årehinden lag og vaskes to gange med frisk PBS hver gang forlader stykker i løsning for ca. 10 s.
  3. Sted væv i 1 mL rør fyldt med PBS løsning til transport til de billeddiagnostiske facilitet. Alle de procedurer, efter at inkubationstiden og begynder med dissektion af øjeæblet bør udføres inden for en time.

6. mikroskopi protokol

Bemærk: Denne protokol imaging back-spredt SHG signal fra kollagen sclera væv er skræddersyet til laser scanning mikroskop.

  1. Mikroskopi oprettet
    1. For at maksimere optimere signal og opløsning, når de udfører SHG mikroskopi bruger et mål linse for at sende infrarød lys og med en høj numerisk blænde (NA). Vores mål er Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 vand fordybelse.
    2. Justere korrektion kraven af linsen til at matche dybden af stikprøven, i dette tilfælde, er tykkelsen af coverslip, 0,17 millimeter.
    3. Montere 25 x mål linsen og tilføje en generøs mængde af smøreolier vandbaseret gel for at dække de billedbehandling overfladen før montering prøven. Vandbaseret gel vil ikke fordamper under eksperimentet og dermed vil opretholde billedkvaliteten.
    4. Placer den scleral væv fra en 1 mL tube med PBS uden at udtørre mellem to 25-mm runde coverslips (episcleral side ned) giver maksimal kontakt mellem episclera og coverslip overfladen.
      Bemærk: Vævet kan også placeres afsløret på coverslip. En god mængde af PBS skal holde væv hydreret under imaging. I dette tilfælde Tilføj væv stykke og PBS efter montering af cellchamber.
    5. Samle celle kammer ved at placere en 25 mm runde coverslip, enkelt eller i en sandwich teknik, på den nederste del af salen og skrue den øverste del ned for at skabe en forseglet runde kammer. Ikke skrue ned stramt når en top coverslip bruges, for at undgå kunstigt udfladning og beskadige vævet.
    6. Montere celle kammer med vævsprøve på stadiet mikroskop.
    7. Sæt mikroskop for øje se med gennemlysning på.
    8. Placer scenen og justere højden af målet således, at den nedre overflade af prøven er i fokus, som bestemmes af lyse markinspektion gennem øjet brik.
    9. Slukke alt lys undtagen computerskærmen og blokere så meget lys fra skærmen som muligt med aluminium folie ark draperet på stadiet mikroskop. Minimere enhver omstrejfende lyset nå detektorer vil sikre støjsvage erhvervelse, som GaAsP NDD detektorer har høj følsomhed.
    10. I panelet Ti Pad af softwaren, kontrollere, objektiv definition er korrekt.
    11. Vælg IR laser til billedbehandling, Vælg NDD detektorer i panelet A1 Compact GUI og vælg DAPI kanalen, der er udstyret med en 400-450 nm bandpass filter.
    12. I panelet A1 MP GUI bølgelængden af infrarød laser til 860 nm og åbne lukkeren.
    13. Indstille laser scanning betingelser i panelet A1 Compact GUI som følger. Vælg: a Galvano scanner, b envejs scanning, c Pixel dwell tid 6.2 µs, (d) Frame størrelse 1.024 x 1.024 pixel, (e) linje i gennemsnit 2 x
      Bemærk: Galvano scanner og ensrettet scanning sikrer præcise punkt for punkt justering. En størrelse på 1.024 x 1.024 for fuld synsfeltet udmønter sig i en pixelstørrelse på 0,5 μm /pixel. Linje i gennemsnit vil reducere den skudt støj i billedet.
    14. Sæt imaging betingelser i A1 Compact GUI panel ved at justere laser power og detektor gevinst. Åbne panelet ser op tabel (LUTs) der viser et histogram over intensitet pixelværdier i det aktuelle billede. Tænd levende billedbehandling i "Find" tilstand og maksimere det detekterede område af pixelværdier ved at justere laser power og detektor gevinst. Undgå mætning. Typiske værdier er 2,5% laser power, fra alt 2,35 W på 860 nm, og 100 HV (detektor gevinst).
    15. Bemærk: Til denne opsætning, laser power målt med en indre wattmeteret er 5.2 mW. Hver gang et eksperiment udføres, re-justere laser procentdel således, at den interne effektmåling er konstant på 5.2 mW mellem imaging sessioner. Bør udvises forsigtighed, når du indstiller laser power. Kamæleon II laser er en 3 W laser på 800 nm og en 10% eller højere magt kunne potentielt inducere vævsskader.
  2. Billede erhvervelse
    1. I preview mode, scan området væv ved hjælp af værktøjet XYZ oversigt.
    2. Angiv imaging til lavere opløsning (256 x 256 pixels og ingen linje gennemsnit) til at fremskynde købet af billeder i denne tilstand.
    3. Fange 5 x 5, 3 x 3 eller enkelt felter i lyset dækker hele overfladen af vævet. På hvert sted, før fange oversigt tænde de levende "Scan" mode og bringe vævet i fokus. Bemærk, at forskellige områder af væv vil have lidt forskellige positioner i aksial retning.
    4. Finde et fladt område hvor kollagen fibre er set i hele synsfeltet og dobbeltklik på denne placering i værktøjet oversigt til at flytte scenen til den pågældende lokalitet.
    5. Tænd levende "Scan" mode, justere Z position af målet, således at bunden fly er i fokus, og i Ti Pad, bruge Z-drev til at flytte den optiske fly 10-15 μm over denne bundlag.
    6. Erhverve et billede i høj opløsning med 1.024 x 1.024 pixel og 2 x line gennemsnit, ved hjælp af knappen "Capture".
    7. Gemme placeringen i XYZ oversigten ved hjælp af knappen "+". Dette sikrer, at det samme område af væv ikke er generobret.
    8. For hvert stykke væv fange 10 billeder af ikke-overlappende felter i visningen.

7. DSC protokol

Bemærk: Fortsæt til dette trin så snart væv forberedelse er komplette, regionale DSC analyse, eller efter væv imaging når SHGM udføres.

  1. Forberede DSC pander, vejes og mærket.
    Bemærk: Dette trin bør gøres før væv dissektion for at minimere væv udtørring.
  2. Tørre hver scleral firkant med en absorberende serviet og læg den fladt på bunden af en DSC gryde med tandet pincet.
  3. Vejer pan med væv inde og låg krympede og dækket at få vævet vådvægt (masse af prøverne skal være i intervallet 5-11 mg).
    Bemærk: Seal hver panorere ved hjælp af crimper før man går videre til den næste vævsprøve. Pander er hermetisk lukkede, forebygge vandtab af før termisk analyse.
  4. Når prøven er krympede, placere den på den udpegede placering på bakken DSC. Der bør være 6 prøver til kontrol og 16 for behandlede øjet.
  5. Oprette en metode ved hjælp af instrumentet administrationssoftware, angivelse af vægten af væv, og køre den termisk analyse ved hjælp af følgende parametre: temperaturområde på 40 til 80 ° C, varme rate: 1 ° C/min., varme flow: 17.37 mW, gasflow (N2): 19,8 mL/min, Gas tryk: 2,2 bar.
  6. Når først færdig, analysere data for hver prøve ved at udtrække overgang temperatur peak på hvilke termisk denaturering opstår ved hjælp af instrumentet administrationssoftware.

8. billedanalyse

  1. SHG Signal
    1. Vælg mindst 5-10 af de mest repræsentative billeder fra hver behandling og kontrol, således at området i billedet er besat af det meste kollagen fibre.
    2. Uploade hvert billede i ImageJ software og måle den gennemsnitlige pixel intensitet ved at vælge Analyze > foranstaltning for det aktive billede.
    3. Værdierne udvundet er rapporteret som den gennemsnitlige pixel intensitet og kan også påvises ved plotte histogrammet af støtteintensiteter ved at vælge fra menuen Analyze > Histogram.
    4. Ved hjælp af et Excel ark, oprette en tabel for at dokumenterer alle målte data i overensstemmelse hermed at prøve-ID.
    5. Beregning af middelværdi og standardafvigelse af pixel intensitet for hver behandling og kontrol tilstand.
    6. Ved hjælp af student's t-test, sammenligne forskelle for alle parvise sammenligninger af koncentrationer (dvs., 40 mM SMG vs 0 og 400 mM SMG vs 0). [P≤0.05].
  2. Waviness
    1. Vælg et billede, der viser kollagen fibre. Mindst 10 billeder pr. sample skal analyseres (herunder en kontrolprøve for hver koncentration - mindst 40 i alt).
    2. Åben ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ kræver forudgående installering.
    3. Uploade alle imagesby at trække ind i en åbnede NeuronJ vindue.
    4. Oprette sporing linjer langs fibre, efter konturen af fibril med musen (pen tegning tabletter kan bruges), klik på M for at måle afstanden mellem samlede fiber længde.
    5. Vælg "Indstilling" for at tegne en tangent lige linje og forbinde begyndelsen og slutningen af den tidligere trukket fiber kontur. Klik nu på M for at måle den ende til længde.
    6. Gentag den samme procedure på mindst 10 fibriller pr. billede.
    7. Indsamle disse to målinger fra hver af 10 fibriller og input data i et excel-regneark, udtrykker samlede fiber (kontur) og til slut længde (direkte forbinder linje) som [kurve] og længde [lineær], henholdsvis.
    8. Beregne waviness index (W) ved hjælp af formlen: W = længde [kurve] / længde [lineær].
    9. Beregne % af waviness sammenligning af data fra billeder af behandlede samples(SMG) med billeder fra kontrolprøver ved hjælp af formlen: (W [SMG] - 1) / (W [control] - 1)
    10. Udfør en parvis t-test for waviness index (W) for at bestemme statistiske forskelle (p-værdier) af kollagen fiber morfologi mellem forskellige behandling betingelser og kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Termisk denaturering temperatur (Tm) som en analyse metode til at evaluere TXL cross-linking effekt: Ialt 16 par af kanin øjnene blev brugt i disse eksperimenter TXL procedure. Som et første led i denne undersøgelse, blev lokalisering af tværbindingsmidler effekt induceret af en enkelt injektion af SMG tværbindingsmidler agent via sT plads i dødt kanin hoved evalueret. Denne type af eksperiment har relevans for den kliniske behandling af patienter, da injektioner i mere end ét sted kunne være nødvendigt at stabilisere en ønskede område af sclera.

Som ville være forudsagt baseret på grundlæggende diffusivity principper, var effekten størst på injektionsstedet med effekter induceret i tilstødende regioner samt, afhængigt af koncentrationen af løsningerne. Figur 1A repræsenterer skematisk placeringen af scleral sektorer (1-4 i røde hule nummer skrifttype) (yderligere opdelt i kvadrater (1-16 i sort tynd nummer skrifttype)), der undergik separat termisk denaturering analyse efter en enkelt sT injektion med farve kortlægning indeks. Tabel 1 viser ændringen i Tm værdier for hver nummererede sektor i forhold til den tilsvarende kontrol. Værdier er inkluderet for både 40 mM og 400 mM injektioner og omfatter standard fejl af middelværdien beregnes for mindst tre uafhængige bestemmelser.

Tal 1B-C repræsenterer resultaterne ved hjælp af to forskellige koncentrationer af SMG, 40 mM (figur 1B) og 400 mM (figur 1 c). I figur 1B, lavere koncentration 40 mM prøven viste en mild skift i Tm, som konstateredes i square 2 (injektionsstedet). Lignende ændringer sås i tilstødende kvadrater 1 og 3 (lysere blå). Marginale forskydninger er set i firkanter 4 til 6 og 7 til 9 uden statistisk signifikante forskelle fra pladsen injiceres. Ingen Tm Skift blev set i de lavere firkanter 14 til 16, som udgjorde den mest fjerntliggende område væk fra injektionsstedet.

Som vist i figur 1 c, havde den højere koncentration (400 mM) en statistisk meget betydelig tværbindingsmidler effekt (angivet som nuancer af orange). Et stort skift i Tm med tilhørende lille standardafvigelse og p < 0,05 blev observeret, afspejler en stor forskel i effekt af 400 mM i forhold til lavere 40 mM koncentration. De mest dramatiske effekter blev noteret i sektor 1 i den øverste globe. Med hensyn til de øvrige sektorer, en mindre effekt blev observeret i firkanter 10 og 14 (der kan have været på grund af nogle sporing af tværbindingsmidler væske posteriort) og ingen effekt blev observeret i firkanter 11, 12, 13, 15 og 16. Generelt, de tværbindingsmidler virkninger var marginal i sektorer 2 og 3 med ingen effekt observeret i sektor 4 (dvs., de mest fjerntliggende placering fra injektionsstedet), svarende til 40 mM stikprøve. Disse resultater viste, at der var en '' zone af effekt '' og at denne type mønster kunne forventes efter et sT injektion af cross-linking agent. Dette kunne indikere behov for injektion i flere lokationer for at fremkalde virkninger over et stort område af væv.

Undersøgelse af effekterne tværbindingsmidler induceret i intakt øjne vurdere TXL med to koncentrationer af SMG blev også udført. Termisk denaturering analyse af væv, der gennemgik en sådan scleral cross-linking blev udført. Cross-Linking tid var 3,5 h for TXL ved hjælp af tre forskellige koncentrationer, 40 (Tm = 1.11 + / 1.2), 100 (Tm = 5,12 +/-2.9), og 400 (Tm = 14.34 +/-1.1) mM SMG. Resultaterne viste, at der er en koncentration afhængige effekt set i SMG krydsbundet væv.

Andet harmonisk generation (SHG) imaging som en metode til at evaluere TXL cross-linking virkning:

SHG mikroskopi billeder blev analyseret både for pixel intensiteten af SHG signal og fiber bundt waviness. En bred spændvidde af cross-linking koncentrationer (fra 40 til 400 mM) blev anvendt for at udforske de SHG signal ændringer, der kan opstå over en bred vifte af cross-linking effekter. Bruge histogram analyse kapacitet indgår i Fiji billedbehandling program20, var det muligt at kvantificere SHG signalet produceret i sclera væv af sT injektion, sammenligne effekterne på 40 mM til dem fremkaldt ved hjælp af 400 mM. Den gennemsnitlige forskel i gennemsnitlig pixel intesities på 40 mM blev 66.3 ± 27,7 i forhold til 361.4 ± 28,3 400 mM prøverne, en næsten 6-fold stigning. Dette svarer til en stigning i væv danne tvaerbindinger, da tilsvarende stigninger i Tm også blev konstateret under disse betingelser. Figur 2 viser repræsentative SHG billeder af sclera taget fra kontrol (figur 2A), 40 mM (figur 2B), og 400 mM (figur 2 c). Den ledsagende histogram analyse, herunder gennemsnitlige lysstyrke (eller pixel intensitet) er også vist. Det samlede antal billeder analyseret var: 120 på 40 mM og 98 for dens kontrol; 121 for 400 mM og 94 for sin egen kontrol. Dybden af væv imaging var 10 til 15 µm fra episcleral overflade. Resultaterne af de analyser, histogram, som involverede gennemsnit af talrige billedfelter, anført, at højere koncentrationer af cross-linking effekt (figur 3) produceret større pixel intensiteter.

Som vist i figur 4, blev en billedanalyse også udført med metoder fra den kardiovaskulære blodkar litteratur, ved hjælp af ImageJ plugin ''Neuron J''21. Vi anslog waviness faktoren W = længde [kurve] / længde [lineær] og vi observeret at danne tvaerbindinger resulterede i opretning af fiber bundter som angivet ved en nedsat waviness % i 40 mM og 400 mM krydsbundet sclera versus ubehandlet kontrol sclera (W % = (W [ SMG]-1)/(W[Control]-1), tabel 2). Forskellen i waviness mellem 40 og 400 mM SMG behandlet prøver var ikke statistisk signifikant.

Figure 1
Figur 1 : Lokalisering af TXL effekt via sT injektion bruger 40 og 400 mM SMG.
(A)
skematisk fremstilling af 4 scleral sektorer (numre 1-4 i store røde hule skrifttype), med sclera opdelt i firkanter [numre 1-16 i mindre sort tynd skrifttype] (ikke trukket til skala), der undergik termisk analyse. Injektionsstedet svarede til den centralt beliggende pladsen (torvet 2) i sektor 1. Den termiske denaturering cross-linking effekten TXL med (1B) 40 mM SMG og (1 C) 400 mM SMG. (D) farvekodede temperatur skala legend (B) og (C). Dette tal er blevet ændret fra Zyablitskaya et al. med tilladelse22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant billeder af koncentration afhænger af stigninger i SHG signal lysstyrkeniveauer produceret efter TXL bruge SMG via sT injektion af sclera ex vivo . Koncentrationer af SMG er vist som (B) 40 mM og (C) 400 mM. Hvert billede indeholder en 50 µm skala bar (nederste højre hjørne) og gennemsnitlig pixel intensitetsværdien (øverste højre hjørne) - absolutte værdier. Dette tal er blevet ændret fra Zyablitskaya et al. med tilladelse22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Liggende søjlediagram af ændring (Δ) i SHG signal pixel intensitet (i forhold til en parret kontrol fra den samme kanin hoved) i sclera intakt glober tværbunden via sT injektion (TXL) med 40 og 400 mM SMG løsninger. Gennemsnitlige værdier med standard fejl af middelværdien var: 66 ± 27,7 for 40 mM og 361 ± 28,3 for 400 mM. Dette tal er blevet ændret fra Zyablitskaya et al. med tilladelse22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Eksempel på fiber waviness analyse (som udtrykt af linearitet). Billede af kontrolprøve for 40 mM SMG koncentration med en 50 µm skala bar (nederste højre hjørne). Dette tal er blevet ændret fra Zyablitskaya mfl. med tilladelse22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Skematisk fremstilling af sT injektion. Områder nummereret 1-3 svarer til områder repræsenteret i figur 1A. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

±Δ Tm
område 40mM 400mM
1 3.4 ±2.8 20,5 ±0.6
2 3.4 ±0.53 19.58 ±1.5
3 2,5 ±2.47 17.99 ±3.06
4 0,72 ±0.9 20.36 ±0.19
5 0.85 ±0.55 19.11 ±1.33
6 0,52 ±1.35 18.66 ±4.1
7 0,78 ±1.6 18.44 ±2.8
8 0,56 ±0.9 17.77 ±2.69
9 0,22 ±0.6 18.92 ±2.6
10 0.46 ±0 8,75 ±10.56
11 0.47 ±0.18 0,63 ±1.84
12 0,11 ±0.08 0,66 ±1.52
13 0,08 ± 0,05 0.71 ±2.17
14 0,22 ±0.7 5.71 ±0.29
15 0,32 ±0.2 0,29 ±0.7
16 0,24 ±0.73 0,26 ±0.79

Tabel 1: DSC resultater for lokalisering af TXL effekt undersøgelse. Ændring i termisk smeltende temperaturer (ΔTm) med standardfejl for sektorvis stikprøven er afbilledet i figur 1A. Hver værdi er udtrykt som forskellen i Tm ascompared til sin parrede kontrol og er et gennemsnit af mindst 3 uafhængige bestemmelser.

SMG, mM Waviness Waviness-% t-test vs [0 mM SMG]
0 1.106 ± 0.044 100
40 1.067 ± 0.017 63 p < 0.02
400 1.059 ± 0,009 55 p < 0,003
Lineær fibre 1,000 0
(Teoretisk)

Tabel 2. Resultaterne af fiber waviness analyse. SHG billeder fra området i TXL injektion blev analyseret for graden af fiber waviness ved hjælp af Neuron Jørgensen software. Ti fibre blev udvalgt fra hvert billede og ialt ca. 100 fibre blev analyseret for grad af waviness. Gennemsnitlige værdier med standard fejl af middelværdien er inkluderet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gennemført eksperimenter har vist beviser understøtter brugen af SHG signal mikroskopi som en metode til evaluering af kollagen cross-linking effekter i sclera, hæve fremtidige muligheden af at anvende denne teknik som et overvågningsværktøj for danne tvaerbindinger behandlinger at målrette kollagen proteiner. Af note er et instrument, der allerede i klinisk brug, der potentielt kan fange denne SHG signal. Selv om dette instrument var primært designet til billedbehandling hud menneskelige dermis, har det været anvendt med succes til billede hornhinden og sclera23.

Det er nødvendigt at opretholde identiske scanning og imaging betingelser, når man sammenligner kontrol og behandlet prøver. Anden harmonisk generation mikroskopi af kollagen i sclera væv kræver et fluorescens mikroskop kompatibel med multi photon imaging, en pulserende infrarød laser afstemmelige i 800-900 nm bølgelængde rækkevidde, og en yderst følsom detektor som GaAsP ikke-descanned (NDD) detektorer. Retningslinjer beskrevet i dette manuskript er et udgangspunkt. Betingelserne skal fastlægges, specielt til de nye eksperimenter eller til de forskellige systemer.

Hornhinden og sclera er også blevet evalueret samtidigt i undersøgelser ved hjælp af denne teknik24,25,26,27. Vel vidende at SHG signal forplanter sig i både fremad og bagud retninger, har flere studier undersøgt hornhindevæv uafhængigt i sin hjemstat28,29,30,31, 32,33,34 og keratoconus35,36 samt efter CXL (som drøftet nedenfor). Resultaterne af disse undersøgelser tyder på, den hornhinde signal er optimeret i den spredte fremadrettet, som giver mening givet hornhindens gennemsigtighed og det faktum, at lys der passerer gennem væv til at strejke en skærm i fremad spredte systemer. Typisk SHG signalet er i den blå synlige spektrum og vil blive stærkt reduceret, når de passerer gennem et stærkt spredning væv lignende øjet sclera. Som et resultat, ville påvisning af fremad spredte SHG kræve en tynd sektion af væv af 50 μm eller mindre i tykkelsen, samt en særlig optisk set-up. Derimod tilbage-spredt signalet kan opfanges gennem den regelmæssige lys sti af et fluorescens mikroskop uden væv skæring og derfor denne tilstand foretrækkes når imaging kollagen i intakt sclera væv til en dybde af 30-40 μm. I denne undersøgelse bemærkede vi en koncentration afhængige stigning i signalet tæthed. Det er meget muligt, men at TXL kunne have haft yderligere og lignende effekter på dybere lag af sclera, og at effekten kunne være mere udtalt og udvide til dybere lag især med den højere koncentration. Men på grund af den begrænsede SHG signal udbredelse i sclera og i forbindelse med denne indledende undersøgelse valgte vi at arbejde med de bedste kvalitetsbilleder, som blev indhentet fra de mest overfladiske sclera (15 µm dybde). I fremtidige undersøgelser, vil vi overveje dybde afhængige effekter efter TXL metoder, da dette kan give yderligere vigtige oplysninger om, hvorfor selv større forskelle blev ikke observeret mellem 40 og 400 mM behandlede prøver.

Derudover vedrørende brug af SHG til evaluering af riboflavin CXL induceret væv cross-linking SHG mikroskopi imaging følgende riboflavin CXL af hornhinden er blevet rapporteret af flere grupper37,38,39 , 40 , 41. i en undersøgelse af Steven et al. 37, cornea stabilisering ved hjælp af CXL teknik resulterede i en '' homogenisering '' signal og tab af væv '' folder '' eller '' bølger '' set i Kors-forbundet prøver. Disse typer af ændringer, men blev også konstateret i en undersøgelse, evaluere virkningerne af ændringer i IOP på cornea SHG signaler, at øge muligheden for teknisk artefakter. Organisatorisk fra fibril samt den højere orden fiber bundt/gråt organisation synspunkt, sclera og hornhinden er helt anderledes og meget er kendt om sådanne forskelle fra elektronmikroskopi undersøgelser. De to væv er forskellige med hensyn til fibril pakning, som indeholder fibril diameter distribution (små ensartede fibriller for hornhinden og variabel diameter fibriller for sclera) og Inter fibril afstand (ensartet for hornhinden og variabel for sclera). Samt, er den højere orden organisation i gråt ark (hornhinden) versus fiber bundter (sclera) helt anderledes. Sådanne strukturelle forskelle afspejles i SHG signaler produceret af disse to væv. Således kan forandringer som følge af cross-linking alter SHG signal i forskellige men parallelle veje. Med andre ord var den '' glatning '' fibre i sclera observeret i denne undersøgelse, og '' homogenisering '' signal i hornhinden rapporteret i litteraturen, både et resultat af kollagen cross-linking ændring. Således, '' homogenisering '' effekten i hornhinden kunne i nogle måde være analog med '' glatning '' effekten af sclera, der er blevet rapporteret her.

De mekanismer, der resulterer i denne glatning effekt produceret af TXL er uklare baseret på den aktuelle undersøgelse. En mulighed kunne være at vævet var en eller anden måde '' fast '' i en mekanisk '' indlæst '' holdning. Dette vil støtte idéen om, at induceret '' fibril og fiber stabilisering '' havde fundet sted. Ændringer i intraokulært tryk sandsynligvis bidrog ikke til denne effekt da IOP blev overvåget forud for og efter sT injektion og forblev stabil. Samlet set betydningen af disse observationer er uklare og yderligere undersøgelser vil være nødvendige. Af note, separat imaging teknikker såsom Brillouin mikroskopi42, som har vist sig at give kvantitative foranstaltninger for danne tvaerbindinger (som bestemt af shear modulus) følgende CXL fotokemi kan være nyttige i bekræfter resultaterne med SHG Imaging i denne undersøgelse. Dog skal det bemærkes, at dets anvendelse med højt spredning væv såsom sclera43, kræver tekniske ændringer og er ikke blevet valideret med krydsbundet scleral væv.

Laser polarisering og SHG mikroskopi er et vigtigt spørgsmål. Laserlys er lineært polariseret og orienteret vinkelret retning af SHG signal formering og i nogle vinkel i xy-plan til hver kollagen fiber. Således, fibre i xy-plan, der er godt afstemt og nøjagtig vinkelret på den polariserede laserlys vil producere en højere SHG signal end dem på andre vinkler, herunder dem, der parallelt med den indfaldende lys (dvs.z-plan), som vil producere den laveste SHG signal (på grund af destruktiv interferens). Med hensyn til sclera væv baseret kollagen fibrene er orienteret i forskellige vinkler på mikroskopiske niveau, selv om foretrukne anatomiske fiber retningslinjer er kendt for at eksistere på kloden placering. Således da SHG signalet produceret vil variere afhængigt af flyet xy vinkel af hver fiber, vil den samlede signal være mindre end det, der ville blive produceret, hvis alle kollagen fibre blev præcis justeret i den samme vinkel (i et væv såsom en sene for eksempel). Således i denne undersøgelse, på grund af karakteren af prøven er afbildet, retning af polarisering blev ikke forsætligt bestemmes men blev holdt konsekvent i hele undersøgelsen. Desuden sørgede vi for at få væv fra behandlet og styre glober fra identiske scleral regioner, minimere eventuelle forskelle i fiber orientering mellem prøver. Endelig, vi analyseret over 100 billeder per prøve for at opnå intensitetsværdierne. Denne omfattende evaluering bør have normaliseret enhver afvigende SHG signaler, der kan have været registreret. Når det er sagt, er det muligt, at som følge af "fiber glatning" at vi observeret i de krydsrefererede prøver (beskrevet ovenfor), en større andel af "i focal plane" fibre kunne have bidraget til stigningen i SHG signal samt øget SHG signaler fra større flyet xy justering. Begge disse muligheder vil være manifestationer af inducerede tværbindingsmidler virkninger.

En regional analyse af cross-linking ændringer (af Tm) foranlediget af en sT indsprøjtning af SMG blev udført. Som forventet, var niveauet for danne tvaerbindinger effekt koncentreret i området i injektion. Ringe eller ingen tværbindingsmidler effekt blev bemærket i regionen direkte overfor (længst væk) fra injektion, i overensstemmelse med hvad er kendt med hensyn til lokalisering af kraft efter sT injektion, som det fremgår af ultralyd lokalisering44, 45 og beregnet tomografi46.

Endelig, med hensyn til tværbindingsmidler terapi og nærsynethed, kollagen cross-linking af hornhinden er at finde udbredt anvendelse i behandlingen af cornea destabilisering herunder keratoconus, post LASIK keratectasias, Zona marginale degeneration (PMD), og som en supplement til refraktive kirurgiske procedurer47. Succes i behandling af hornhinde sygdom med cross-linking har ført til udforskning til at anvende denne behandling tilgang til bagsiden af øjet og navnlig sclera, for at begrænse aksial brudforlængelse i høj nærsynethed2, et begreb, der går tilbage til den allertidligste stadier af det terapeutiske tværbindingsmidler koncept48,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Forfatterne takke Tongalp Tezel, MD, for høring om sT injektion; Theresa Swayne, ph.d., for konsultation angående SHG mikroskopi; og Jimmy Duong fra Design og Biostatistik ressource og Biostatistisk core facilitet af Irving Institute ved Columbia University Medical Center.

Støttet en del forskning for at forebygge blindhed og nationale institutter for sundhed tilskud NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 og NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University ejer tilknyttede immaterialret: U.S. udstedte patenter no: 8,466,203 og ingen: 9,125,856. International patentanmeldt: PCT/US2015/020276.

Billeder blev indsamlet i Confocal og specialiseret mikroskopi delt ressource af Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, støttet af NIH give #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Konfokal mikroskop blev købt med NIH give #S10 RR025686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59, (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33, (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90, (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196, (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27, (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91, (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35, (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42, (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11, (2), 94 (1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88, (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215, (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10, (83), 20121004 (2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92, (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58, (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14, (6), 064040 (2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13, (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238, (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34, (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32, (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36, (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33, (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24, (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17, (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25, (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17, (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33, (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30, (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87, (3), 279-285 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics