Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Medicine

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Summary

Este protocolo descreve técnicas para a avaliação química do cross-linking de esclera coelho usando a imagem latente de geração segundo harmônico e diferencial de calorimetria de varredura.

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Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

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Abstract

Métodos para fortalecer o tecido com a introdução de ligações químicas (não enzimáticos do cross-linking) nas proteínas estruturais (colagénios fibrillar) para terapia incluem Cross-linking fotoquímicos e tecido do cross-linking métodos (TXL). Tais métodos para induzir alterações de propriedade mecânica do tecido estão sendo empregados para a córnea em afinamento corneano (mecanicamente enfraquecido) doenças como ceratocone, bem como a esclera em miopia progressiva, onde afinamento e enfraquecimento da posterior esclera ocorre e provavelmente contribui para o alongamento axial. As proteínas alvo primário para tal reforço de tecido são fibrillar colágenos, que constituem a grande maioria das proteínas de peso seco na córnea e esclera. Fortuitamente, fibrillar colágenos são a principal fonte de segunda geração harmônica sinais no espaço extracelular de tecido. Portanto, modificações das proteínas de colágeno, tais como aqueles induzida através do cross-linking terapias, potencialmente poderiam ser detectadas e quantificadas através da utilização de microscopia de segunda geração harmônica (SHGM). Acompanhamento SHGM sinaliza através do uso de um laser acoplado com uma luz infravermelha da excitação do sistema de microscopia de varredura fonte é um método de imagem moderno emocionante que está desfrutando de uma utilização generalizada em ciências biomédicas. Assim, o presente estudo foi realizado para avaliar o uso da microscopia SHGM, como um meio para medir induzida do cross-linking efeitos em ex vivo esclera de coelho, após uma injeção de uma substância química do cross-linking agente no espaço do subespiga (sT), uma injeção ou seja abordagem prática padrão para causando anestesia ocular durante os procedimentos de clínicos oftalmológicos. O produto químico agente do cross-linking, hidroximetilglicinato de sódio (SMG), é de uma classe de cosméticos conservantes conhecidos como formaldeído, liberando agentes (FARs). Scleral alterações após reação com SMG resultaram em aumentos no SHG sinais e correlacionadas com mudanças na temperatura de desnaturação térmica, um método padrão para avaliar induzido tecido efeitos do cross-linking.

Introduction

Miopia progressiva é postulada para ser tratável através de não enzimáticos scleral cross-linking (fotoquímicos e/ou química), que faz sentido, dado que o bloqueio do cross-linking enzimática colágeno pode aumentar a privação de forma experimental (FD)-induzido miopia,1. ElSheikh e Phillips2 recentemente discutido a viabilidade e o potencial do uso padrão irradiação ultravioleta-A (UVA)-riboflavina mediada fotoquímica do cross-linking (também conhecido como o protocolo de Dresden), abreviado aqui como (riboflavina CXL) para estabilização posterior scleral travar o alongamento axial na miopia. Esse método fotoquímico utilizou com sucesso no tratamento de desestabilização da superfície do globo anterior (ou seja, a córnea abaulamento) vista em keratectasia do keratoconus e do borne-LASIK. No entanto, aplicação do presente protocolo CXL para a esclera é dificultada por questões relacionadas com dificuldades em acessar a esclera posterior com uma fonte de luz ultravioleta (UV), bem como a necessidade de modificar uma muito maior tecido área de superfície. Que sendo dito, a abordagem CXL tem sido usada para travar o alongamento axial na forma visualmente privado coelhos (por tarsorrhaphy), apesar de várias regiões da esclera posterior necessário várias zonas distintas de irradiação em que estudo3. Por outro lado, a injeção de um agente estabilizador químico (ou seja, agente do cross-linking) através do espaço de sT poderia representar uma forma mais simples para modificar a esclera posterior, evitando a necessidade de introdução de uma fonte de luz UV. Esta técnica de injeção é conhecida como uma maneira útil de induzir anestesia ocular durante procedimentos oftalmológicos, como cirurgia de catarata a4,5,6. Wollensak7 tem descrito anteriormente, o uso de uma injeção de sT usando gliceraldeído (cross-linking agente químico similar em conceito para o formaldeído liberando agentes (FARs) descritos neste estudo) endurecer a esclera coelho e Genipina tem foram mostrados para limitar o comprimento axial em FD cobaias8,9. Estes investigadores demonstraram uma clara vantagem de usar um agente químico solúvel sobre a técnica CXL fotoquímica. Assim, scleral cross-linking usando um agente químico injetável de algum tipo, incluindo FARs (i.e., TXL)10, poderia fornecer um método de tratamento viável para deter a progressão do alongamento scleral visto na miopia.

Os protocolos aqui apresentados, usamos uma solução química do cross-linking de hidroximetilglicinato de sódio (SMG), entregada através da injeção de sT para a esclera dos olhos de coelho cadavérico. Temos implementado protocolos semelhantes anteriormente para reticulação química tópica na córnea. Nomeadamente os estudos anteriormente relatados, concentração dependente do cross-linking efeitos pode ser obtida usando SMG, com uma gama de efeito bem acima de abrangência realizáveis com fotoquímico CXL, conforme determinado pela análise de desnaturação térmica11 .

Aqui descrevemos os protocolos para avaliar o efeito do cross-linking de SMG entregada via sT injeções ao tecido scleral, desnaturação térmica utilizando Calorimetria Diferencial de varredura (DSC) e a segunda harmônica geração microscopia (SHGM).

Utilizando Calorimetria exploratória diferencial (DSC), também conhecido como análise térmica, uma transição de desnaturação térmica é medida, que para tecido scleral é predominantemente guiado pelas propriedades dos colagénios fibrillar, desde que eles constituem a maioria em massa da proteína. Este método avalia a estabilidade da estrutura molecular do colágeno e os laços reticulados que estabilizar as fibrilhas de colagénio, a estrutura principal proteína terciária. Durante o aquecimento no DSC, uma temperatura crítica de transição é alcançada que resulta na desnaturação da molécula de colágeno, resultando no desenrolar da tripla hélice, um processo que forma o que é comumente conhecido como gelatina. Esta desnaturação térmica rompe ligações de hidrogênio ao longo da molécula de colágeno e pode ser deslocada para temperaturas mais altas através de métodos do cross-linking induzido12,13. Este método tem sido usado por muitas décadas, particularmente na indústria de biomateriais e para processos que incluem a fabricação de couro. No entanto, este método requer a extração do tecido esclera e, portanto, só pode ser útil como uma técnica ex vivo .

Microscopia de harmônica de segunda geração (SHGM) baseia-se as propriedades ópticas não-lineares de materiais específicos, com ambientes molecular não-centrossimétricas. Em tais materiais, luz intensa, por exemplo luz produzida por lasers, gera sinais SHG, no qual a luz incidente é duplicada em frequência. Materiais biológicos que são conhecidos para criar sinais SHG são microtúbulos, colágeno e miosina do músculo. Por exemplo, colágeno animado com uma luz infravermelha do comprimento de onda de 860 nm irá emitir um sinal SHG na faixa visível com comprimento de onda de 430 nm. Segunda geração de harmônica (SHG) imagem de sinal é um método promissor para avaliar terapêutico colágeno cross-linking. Tem sido conhecido há mais de 30 anos que fibrilhas de colagénio nos tecidos emitem SHG sinais14. No entanto, só recentemente podem imagens de alta resolução ser obtidas15 em uma variedade de tecidos, incluindo o tendão16, pele, cartilagem17, vasos sanguíneos,18e em gel de colágeno19.

Baseado neste conhecimento, este estudo avalia as alterações de sinal SHG induzidas na esclera através de SMG quimicamente induzida do cross-linking de colágeno. Os resultados indicam que a modificação de SMG da esclera aumenta os sinais SHG produzidos a partir de feixes de fibras de colágeno tecido (a maior ordem quaternária estrutura composta de fibrilas de colágeno) e também produz uma mudança estrutural morfológica em colágeno rede de fibra, refletida na fibra bundle "endireitar".

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Protocol

Todos os procedimentos foram realizados usando olhos de coelho cadavérico dentro de cabeças de coelho outbred intacta. Seguiam-se todos e institucional Nacional orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório.

1. preparação de soluções

  1. Preparação de SMG para TXL:
    1. Prepare-se 1 mL da concentração de 0,2 M de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) de solução usando 0,0165 g de NaHCO3 em pó dissolvido em 1 mL de água destilada.
    2. Dissolva 0,1016 mg de hidroximetilglicinato de sódio em pó (SMG) em 1 mL de água destilada para obter uma concentração final de 800 mM SMG. Ajuste a solução de bicarbonato de sódio a uma concentração final de 0,1 M NaHCO3 e 400 mM SMG. Concentrações de SMG dependendo do efeito do cross-linking desejado. O protocolo descrito aqui usamos 40, 100 e 400 mM SMG.

2. injeção de subTenon para TXL usando SMG

  1. Encha duas seringas de insulina 1 mL (agulhas de 25G) com 400 µ l controlo e solução SMG, respectivamente.
  2. Coloque a cabeça de coelho em um avião de perfil com a ajuda de uma almofada. Isopor ou uma pilha de papel pode ser usada para corrigir a cabeça em uma posição ideal.
  3. Retrai as pálpebras com um espéculo olho pediátrica.
  4. Medir a inicial da pressão intra-ocular (Pio) usando um dispositivo de tonometria de aplanação.
  5. Marca o local da injeção pretendido na parte central superior do limbo com um marcador de tecido.
  6. Retrair a conjuntiva em torno do local da injeção com um fórceps da conjuntiva (ou qualquer pinça com ponta redonda serrilhada) e inserir a agulha através da conjuntiva, inserir a cápsula de Tenon um pouco além do local de estroma marcado (ou seja, 2-3 mm do limbo). Uma pequena incisão na conjuntiva também pode ser feita com uma tesoura de íris para facilitar a passagem da agulha através da cápsula de Tenon.
  7. Uma vez dentro da cápsula de Tenon, certifique-se que a agulha é livremente móvel, movendo-o de lado. Durante este tempo, o globo não deve mover. Isto confirma a correcta colocação da agulha acima a esclera na submarino da-espiga (sT) espaço.
  8. Injetar a solução da seringa e descarte a agulha. Imediatamente após a injeção, o fluido irá acumular no espaço sT criando uma protuberância anterior vista através da conjuntiva (ou seja, quemose).
  9. Repita a medição IOP para confirmar que ele não mudou devido a uma perfuração inadvertida do globo.
  10. Remover o espéculo tampa e realizar a massagem digital através das pálpebras fechadas por cerca de 2-3 min.
  11. Deixe a cabeça por um período de incubação de 3,5 h (temperatura ambiente = 18 ° C), antes de se mudar para a próxima etapa.

3. tecido preparação

  1. Retrai as pálpebras usando o espéculo pálpebra para otimizar o acesso ao globo. Selecione o espéculo otimamente feito sob medido de acordo com o tamanho do olho.
  2. Separe a conjuntiva circundante ao limbo. Se ele já tem sido feito perto do local da injeção, circunferencialmente expanda as fronteiras para iria conter um tamanho do inóculo de aproximadamente 1 x 1 cm.
  3. Corte os músculos extra-oculares em seus locais de inserção escleral.
  4. Eleve o globo ocular com fórceps, empurrando-o do lado posterior. Isto fornece acesso ao globo posterior e facilitará o corte do nervo óptico com a artéria oftálmica e veia localizado perto do polo posterior do globo.
  5. Corte o corneoscleral complexo, com a borda externa, incluindo o local de injeção marcado. A mancha ainda deve ser visível na parte restante da esclera.
  6. Remova o corpus vitreus e todas as camadas anexadas para o lado interno da esclera, aplicando-se tração com pinça de tecido.
    Nota: Outras medidas dependem os procedimentos a seguir sendo executados: 4. - análise de DSC, 5. - microscopia SHG.

4. para análise de DSC Regional

  1. Para o olho Tratado: cortar quatro sectores scleral da Taça scleral restante com a tesoura para que o local da injeção é localizado no setor superior e alinhado centralmente. Corte os restantes 3 setores de ambos os lados laterais (ou seja, nasal e temporal) e a parte inferior.
    Nota: a numeração dos sectores (1-4) que estão divididos em quadrados (1-16) é demonstrada na figura 1A.
  2. Os setores scleral (1-4) corte quadrados menores (1-16) de aproximadamente 4 x 4 mm cada. Setor 1 deveria ser dividida em 9 quadrados (fazer o local exato da injeção um quadrado individual [quadrado 2]). Divida os setores 2 e 3 em 2 quadrados cada (quadrados 10-11 e 12-13) e setor 4 em 3 quadrados (praças 14-16).
  3. Atribua um número a cada quadrado, como mostrado na figura 1A, para localizar a distância do tecido analisado do local da área injetada.
  4. Para o olho de controle: depois dividindo o tecido em quatro sectores scleral (semelhantes do tecido Tratado) corta pedaços de tecido quadrado nos seguintes locais: 3 quadrados do setor superior (setor 1), 1 de cada lado (setores 2 e 3) e 1 a partir da setor de fundo (setor 4).
  5. Raspar as restantes camadas da retina e da coroide e lavar duas vezes com PBS fresco cada vez, deixando as peças submergidas na solução por aproximadamente 10 s de cada vez.

5. para a imagem latente SHG

  1. Corte a parte superior da esclera usando uma tesoura para criar uma área de 1 x 1 cm com o local da injeção, alinhado de forma centralizada.
  2. Raspar as camadas da retina e coroide restantes e lavar duas vezes com PBS fresco cada vez deixando as peças em solução para cerca de 10 s.
  3. Coloque o tecido em 1 mL tubos preenchidos com solução de PBS para o transporte para as instalações de geração de imagens. Todos os procedimentos, após o tempo de incubação e começando com a dissecação do globo ocular devem ser realizados em uma hora.

6. microscopia protocolo

Nota: Este protocolo para imagem sinal SHG espalhados por volta de colágeno do tecido da esclera é adaptado para o microscópio de varredura a laser.

  1. Microscopia de configurar
    1. Para maximizar o sinal e resolução quando realizando microscopia SHG usa uma lente objetiva otimizam para transmitir infravermelho, luz e com uma grande abertura numérica (NA). O nosso objectivo é Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 água de imersão.
    2. Ajuste a coleira de correção de lente para coincidir com a profundidade da amostra, neste caso é a espessura da lamela, 0,17 milímetros.
    3. Montagem da lente da objetiva 25 x e adicione uma generosa quantidade de gel à base de água para cobrir a superfície de imagem antes de montar a amostra de lubrificante. O gel à base de água não se evapore durante o experimento e, consequentemente, manterá a qualidade de imagem.
    4. Coloque o tecido scleral de um tubo de 1 mL com PBS sem secagem entre duas lamelas redondo de 25 mm (episcleral lado para baixo) fornecendo máximo contato a episclera e a superfície da lamela.
      Nota: O tecido pode também ser colocado descoberto na lamela. Uma boa quantidade de PBS deve manter o tecido hidratado durante a imagem latente. Neste caso, adicione o pedaço de tecido e a PBS depois de montar o cellchamber.
    5. Montar a câmara do telemóvel, colocando uma lamela redonda 25 mm, única ou em uma técnica de sanduíche, na parte inferior da câmara e de rosca na parte superior a fim de criar uma selada assembleia. Não aperte para baixo firmemente quando uma lamela superior é utilizada, a fim de evitar artificialmente achatamento e danificar o tecido.
    6. Montagem da câmara de celular com a amostra de tecido no palco microscópio.
    7. Ateou o microscópio para visão com luz transmitida.
    8. Posicione o palco e ajustar a altura do objectivo, tal que a superfície inferior da amostra está em foco, conforme determinado pela inspeção de campo brilhante através da peça de olho.
    9. Desligue todas as luzes, exceto o monitor do computador e bloquear a luminosidade do monitor quanto possível com folhas de alumínio da folha drapejadas no palco microscópio. Minimizar qualquer luz atingindo os detectores garantirá aquisição de baixo ruído, como detectores de GaAsP NDD tem alta sensibilidade.
    10. No painel de Ti Pad do software, verifique se a definição de lente é correta.
    11. No painel de GUI compacto A1, escolher o laser IR para a imagem latente, selecione os detectores NDD e escolher o canal DAPI que está equipado com um filtro de passa-banda 400-450 nm.
    12. No painel A1 MP GUI, defina o comprimento de onda do laser infravermelho para 860 nm e abrir o obturador.
    13. Definir as seguintes condições no painel A1 compacto GUI de exploração do laser. Selecione: (a) Galvano scanner, digitalização (b) unidirecional, (c) Pixel Habitai tempo 6.2 µs, (d) quadro tamanho 1.024 x 1.024 pixels, (e) linha em média 2 x
      Nota: O scanner de Galvano e varredura unidirecional assegura alinhamento preciso ponto por ponto. Um tamanho de 1.024 x 1.024 para o completo campo de visão se traduz em um tamanho de pixel de 0,5 μm /pixel. Linha média irá reduzir o barulho de tiro na imagem.
    14. Conjunto de imagens condições no painel A1 compacto GUI ajustando o ganho de potência e detector de laser. Abra o painel de olhar acima tabela (LUTs) que exibe um histograma de valores de intensidade do pixel na imagem atual. Ligue a imagem ao vivo no modo "Encontrar" e maximizar detectados valores no intervalo de pixel, ajustando o ganho de potência e detector de laser. Evite a saturação. Valores típicos são o poder do laser de 2,5%, de um total de 2,35 W em 860 nm e 100 HV (ganho de detector).
    15. Nota: Para esta configuração, a potência do laser, medida com um medidor de energia interna é 5.2 mW. Cada vez que um experimento é realizado, re-ajustar a porcentagem de laser tal que a medição de energia interna é constante em 5.2 mW entre as sessões de imagem. Tenha cuidado ao definir a potência do laser. O camaleão II laser é um laser W 3 a 800 nm e um 10% ou um poder superior poderia potencialmente induzir dano tecidual.
  2. Aquisição de imagem
    1. No modo de visualização, a área de tecido usando a ferramenta XYZ visão de digitalização.
    2. Defina a imagem de baixa resolução (256 x 256 pixels e nenhuma linha média) para acelerar a aquisição de imagens neste modo.
    3. Captura de 5 x 5, 3 x 3 ou simples campos de visão para cobrir toda a superfície do tecido. Em cada local, antes da captura de visão geral, ligue o modo "Scan" ao vivo e colocar o tecido em foco. Note que diferentes regiões do tecido terão posições ligeiramente diferentes na direção axial.
    4. Encontre uma área plana onde as fibras de colágeno são vistas em todo campo de visão e clique duas vezes nessa posição na ferramenta para mover o palco para esse determinado local de visão geral.
    5. Ativar o modo de "Scan" ao vivo, ajustar a posição de Z do objectivo, tal que o plano de fundo está em foco e, no painel de Ti, usar a unidade Z para mover o plano ótico de 10 a 15 μm acima desta camada de fundo.
    6. Adquira uma imagem em alta resolução com 1.024 x 1.024 pixels e 2 linha de x, em média, usando o botão "Capture".
    7. Salve a localização na visão geral XYZ usando o botão "+". Isso garante que a mesma área de tecido não é recapturada.
    8. Para cada pedaço de tecido capture 10 imagens de disjunto campos de visão.

7. DSC protocolo

Nota: Efectuar este passo como preparação do tecido é completa, para análise de DSC regional, ou depois de tecido de imagem quando SHGM é executada.

  1. Prepare bandejas de DSC, pesava e rotulado.
    Nota: Este passo deve ser feito antes de dissecção de tecidos para minimizar a dessecação do tecido.
  2. Secar cada quadrado scleral com um tecido absorvente e coloque-o sobre o fundo de uma panela de DSC usando fórceps dentado.
  3. Pesar na panela com o tecido no interior e a tampa frisado e coberto obter o tecido molhado peso (a massa das amostras deve ser na faixa de 5 a 11 mg).
    Nota: O selo cada pan usando o frisador antes de prosseguir para a próxima amostra de tecido. As panelas são hermeticamente fechadas, evitando qualquer perda de água antes da análise térmica.
  4. Uma vez que a amostra é frisada, coloque-o na sua localização designada na bandeja do DSC. Deve haver pelo menos 6 amostras para o controle e 16 para o olho Tratado.
  5. Criar um método usando o instrumento gestão software, especificando o peso do tecido, e executar a análise térmica usando os seguintes parâmetros: temperatura na faixa de 40 a 80 ° C, taxa de aquecimento: 1 ° C/min, fluxo de calor: 17,37 mW, fluxo de gás (N2): 19,8 mL/min, Pressão de gás: 2,2 bar.
  6. Depois de concluído, analise os dados para cada amostra, extraindo o pico de temperatura de transição no qual desnaturação térmica ocorre usando o instrumento de gerenciamento de software.

8. análise de imagens

  1. Sinal SHG
    1. Selecione pelo menos 5-10 das imagens mais representativas de cada tratamento e seu controle, tal que a área da imagem é ocupada por principalmente fibras de colágeno.
    2. Upload de cada imagem no software ImageJ e medir a intensidade do pixel média selecionando Analyze > medida para a imagem ativa.
    3. Os valores extraídos são relatados como a intensidade média de pixel e também podem ser mostrados plotando o histograma das intensidades, selecionando no menu Analyze > histograma.
    4. Usando uma folha de Excel, criar uma tabela para documentar todos os dados medidos em conformidade para a identificação de amostra.
    5. Calcule a média e o desvio padrão de intensidade de pixel para cada condição de tratamento e controle.
    6. Usando o student t-teste, comparar as diferenças para todas as comparações emparelhadas das concentrações (isto é, 40 mM SMG vs 0 a 400 mM SMG vs 0). [P ≤ 0,05].
  2. Ondulação
    1. Selecione uma imagem que exibe fibras de colágeno. Pelo menos 10 imagens por amostra devem ser analisadas (incluindo uma amostra de controle para cada concentração - pelo menos 40 no total).
    2. Aberto ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ requer a instalação prévia.
    3. Upload de todos os imagesby arrastar uma janela aberta de NeuronJ .
    4. Criar linhas de rastreamento ao longo das fibras, ao longo do contorno da fibrila com o mouse (caneta comprimidos de desenho pode ser usada), clique em M para medir a distância do comprimento total da fibra.
    5. Selecione a "Opção" para desenhar uma linha reta tangente e conectar o começo e o fim do contorno fibra anteriormente desenhado. Agora clique em M para medir o comprimento de ponta a ponta.
    6. Repita o mesmo procedimento pelo menos 10 fibrilas por imagem.
    7. Coletar essas duas medições de cada um dos 10 fibrilas e os dados de entrada em uma planilha do excel, expressando o comprimento total da fibra (contorno) e comprimento de ponta a ponta (linha de conexão em linha reta) como comprimento [curva] e [linear], respectivamente.
    8. Calcular o índice de ondulação (W) usando a fórmula: W = comprimento [curva] / [linear] de comprimento.
    9. Calcular a % de ondulação comparando dados de imagens de samples(SMG) tratados com as imagens das amostras de controle, usando a fórmula: (W [SMG] - 1) / (W [control] - 1)
    10. Realize um teste-t emparelhado para índice de ondulação (W) para determinar diferenças estatísticas (p-valores) da morfologia das fibras de colágeno entre condições diferentes de tratamento e controle.

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Representative Results

Temperatura de desnaturação térmica (Tm) como um método de ensaio para avaliar TXL cross-linking efeito: Um total de 16 pares de olhos de coelho foram utilizados nesses experimentos para o procedimento TXL. Como uma parte inicial deste estudo, avaliou-se a localização do efeito do cross-linking induzido por uma única injeção de agente do cross-linking de SMG através do espaço de sT na cabeça coelho cadavérico. Este tipo de experimento tem relevância para o tratamento clínico dos pacientes, desde que as injeções em mais de um local podem ser necessárias para estabilizar uma área desejada da esclera.

Como iria ser previsto com base em princípios básicos difusividade, o efeito foi maior no local da injeção com efeitos induzidos em regiões adjacentes, bem como, dependendo da concentração das soluções. Figura 1A representa a localização esquemática de scleral setores (1-4 em fonte número oco vermelho) (divididos em quadrados (1-16 no fonte número fina preta)) que foram submetidos a análise separada de desnaturação térmica após uma injeção única sT com índice de mapeamento de cores. A tabela 1 mostra a mudança em valores de Tm para cada setor numerado em comparação com seu controle correspondente. Valores são incluídos para injeções tanto 40 mM e 400 mM e incluem o erro padrão da média calculada durante um período mínimo de três determinações independentes.

Figuras 1B-C representam os resultados usando duas concentrações diferentes de SMG, 40mm (figura 1B) e 400 mM (Figura 1). Na figura 1B, a amostra de 40 milímetros menor concentração mostrou uma leve mudança no Tm que foi observado na Praça 2 (local da injeção). Mudanças similares foram vistas em quadrados adjacentes 1 e 3 (azul mais claro). Marginais turnos são vistos em quadrados de 4 a 6 e 7 a 9, sem diferenças estatisticamente significativas da Praça injetada. Nenhuma mudança de Tm foi vista nas praças inferiores 14 a 16, que representava o setor mais distante longe do local da injeção.

Como mostrado na Figura 1, a concentração mais elevada (400 mM) teve um efeito do cross-linking estatisticamente altamente significativo (indicado como tons de laranja). Observou-se uma grande mudança no Tm associado pequeno desvio-padrão e p < 0.05, refletindo uma grande diferença no efeito de 400 milímetros comparado com menor concentração de 40 mM. Os efeitos mais dramáticos foram anotados no setor 1 do globo superior. No que diz respeito aos restantes sectores, observou-se um efeito menor em quadrados de 10 e 14 (que pode ter sido devido a um rastreamento de fluido do cross-linking posteriormente) e nenhum efeito foi observado nas praças, 11, 12, 13, 15 e 16. Em geral, os efeitos do cross-linking eram marginais nos setores 2 e 3 com nenhum efeito observado no setor 4 (ou seja, o local mais distante do local da injeção), semelhante da amostra de 40 mM. Estes resultados indicaram que houve uma 'zona de efeito ' e que este tipo de padrão poderia ser esperado após uma injeção de sT de agente do cross-linking. Isso pode indicar a necessidade de injeção em vários locais a fim de induzir efeitos sobre uma vasta área de tecido.

Também foi realizado o estudo dos efeitos do cross-linking induzida em olhos intactos, avaliando TXL com duas concentrações de SMG. Realizou-se análise de desnaturação térmica de tecido que sofreu tal scleral cross-linking. Cross-linking tempo foi 3,5 h para TXL usando três diferentes concentrações, 40 (Tm = 1,11 + /-1,2), 100 (Tm = 5.12 + /-2.9) e 400 (Tm = 14,34 + /-1.1) mM SMG. Os resultados mostraram que existe um efeito dependente de concentração visto no tecido reticulado SMG.

Segundo harmônica geração (SHG) como um método para avaliar TXL cross-linking efeito de imagem:

Microscopia SHG imagens foram analisados tanto para a intensidade do pixel de ondulação de bundle de sinal e fibra o SHG. Um amplo leque de cross-linking concentrações (de 40 a 400 milímetros) foi utilizado a fim de explorar as mudanças de sinal SHG que podem ocorrer ao longo de uma ampla gama de efeitos de cross-linking. Usando a capacidade de análise de histograma incluída no programa20de processamento de imagem a Fiji, foi possível dosar o sinal SHG produzido no tecido scleral por injeção de sT, comparando os efeitos em 40 mM para aqueles induzidos usando 400 mM. A diferença média em média pixel intesities em 40 milímetros foram 66,3 ± 27,7 comparado com 361.4 ± 28,3 para as amostras de 400mm, um aumento de quase 6-fold. Isso corresponde com um aumento no tecido cross-linking, desde que o correspondente aumento Tm também foram observado nestas condições. A Figura 2 mostra imagens SHG representante da esclera, tomadas de controle (Figura 2A), 40mm (Figura 2B) e 400 mM (Figura 2). A análise de histograma acompanhamento, incluindo brilho médio (ou intensidade do pixel) também é mostrada. O número total de imagens analisadas foi: 120 para 40 mM e 98 para seu controle; 121 para 400 mM e 94 para seu próprio controle. A profundidade da imagem latente do tecido era de 10 a 15 µm da superfície episcleral. Os resultados das análises histograma, que envolveu a média de numerosos campos de imagem, indicam que altas concentrações de cross-linking efeito (Figura 3) produziram maiores intensidades de pixel.

Como mostrado na Figura 4, uma análise de imagem também foi realizada com métodos adotados na literatura cardiovascular dos vasos sanguíneos, usando o ImageJ plugin 'Neurônio J'21. Estimamos que o fator de ondulação W = comprimento [curva] / comprimento [linear] e temos observado que cross-linking resultou em alisamento de feixes de fibras, como indicado por uma diminuição da ondulação % na esclera reticulada 40 mM e 400 mM versus esclera de controle sem tratamento (M % = ([W SMG]-1)/(W[Control]-1), tabela 2). A diferença de ondulação entre 40 e 400 mM SMG tratada amostras não foi estatisticamente significativa.

Figure 1
Figura 1 : Localização do efeito TXL via sT injeção usando 40 e 400 mM SMG.
(A)
representação esquemática de 4 sectores scleral (números 1-4 em fonte oco vermelho grande), com esclera dividido em quadrados [números 1-16 no menor fonte fina preta] (não desenhados por escala) que foram submetidos a análise térmica. Local da injeção correspondia à praça central (Praça 2) no setor 1. A desnaturação térmica do cross-linking efeito de TXL com (1B) 40mm SMG e C 1 400 mM SMG. (D) cor codificada lenda de escala de temperatura (B) e (C). Esta figura foi modificada de Zyablitskaya et al . com a permissão de22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imagens representativas dos aumentos dependente de concentração de SHG produzidos na sequência TXL usando SMG através da injeção de sT da esclera de níveis de brilho do sinal ex vivo . Concentrações de SMG são mostradas como (B) 40mm e (C) 400 mM. Cada imagem contém um 50 µm escala bar (canto inferior direito) e um valor de intensidade média pixel (canto superior direito) - valores absolutos. Esta figura foi modificada de Zyablitskaya et al . com a permissão de22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Gráfico de barras da mudança (Δ) de intensidade do pixel sinal SHG (em comparação com um controle pareado a mesma cabeça de coelho) em scleral globos intactas reticulado através da injeção de sT (TXL) com soluções SMG 40 e 400 mM. Valores médios com erro padrão da média foram: 66 ± 27,7 para 40mm e 361 ± 28,3 para 400 mM. Esta figura foi modificada de Zyablitskaya et al . com a permissão de22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Exemplo de análise de ondulação de fibra (conforme expresso pela linearidade). Imagem de amostra de controle para concentração de SMG 40 mM com uma escala de 50 µm bar (canto inferior direito). Esta figura foi modificada de Zyablitskaya et al. com a permissão de22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Representação esquemática da injeção de sT. Áreas numeradas de 1-3 correspondem às áreas representadas na figura 1A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

±Δ Tm
área 40mM 400mM
1 3.4 ±2.8 20.5 0,6
2 3.4 ±0.53 19.58 ± 1,5
3 2.5 ±2.47 ±3.06 17.99
4 ±0.9 0,72 ±0.19 20.36
5 ±0.55 0,85 19.11-±1.33
6 ±1.35 0.52 18.66 ±4.1
7 ±1.6 0,78 18.44 ±2.8
8 ±0.9 0,56 ±2.69 17.77
9 0.22 0,6 ±2.6 18.92
10 ±0 0,46 ±10.56 8,75
11 ±0.18 0.47 ±1.84 0.63
12 0.11 ±0.08 ±1.52 0,66
13 ± 0.05 0.08 ±2.17 0,71
14 0.22 ±0.7 ±0.29 5,71
15 0,32 ± 0,2 ±0.7 0,29
16 ±0.73 0,24 ±0.79 0.26

Tabela 1: Resultados de DSC para localização do estudo do efeito TXL. Mudança nas temperaturas de fusão térmicas (ΔTm) com erros-padrão para cada setor amostrado é como ilustrado na figura 1A. Cada valor é expresso como a diferença de Tm estejamos ao seu controle pareado e uma média de um mínimo de 3 determinações independentes.

SMG, mM Ondulação Ondulação-% teste-t vs [0 mM SMG]
0 1.106 ± 0,044 100
40 1.067 ± 0,017 63 p < 0.02
400 1.059 ± 0,009 55 p < 0.003
Fibras lineares 1,000 0
(Teórico)

Tabela 2. Resultados da análise de ondulação da fibra. Imagens SHG da área de injeção TXL foram analisadas para o grau de ondulação de fibra usando software do neurônio J. Fibras de dez foram selecionadas de cada imagem, e um total de aproximadamente 100 fibras foram analisados para o grau de ondulação. Valores médios com erro padrão da média são incluídos.

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Discussion

Experimentos realizados mostraram evidências que sustentam o uso da microscopia de sinal SHG como um método para avaliação de efeitos na esclera, levantando a possibilidade futura de utilizar esta técnica como uma ferramenta de monitoramento para cross-linking tratamentos do cross-linking de colágeno que destino proteínas de colágeno. De nota, um instrumento já está em uso clínico que potencialmente pode capturar este sinal SHG. Embora este instrumento foi projetado principalmente para imagiologia derme humana de pele, ele utilizou com êxito a imagem córnea e esclera23.

É necessário manter idênticos de digitalização e imagem latente condições quando comparando o controle e tratada amostras. Segunda geração de harmônica, microscopia de colágeno no tecido da esclera requer um microscópio de fluorescência compatível com fóton multi imagem, um infravermelho pulsado laser sintonizável na faixa de comprimento de onda de 800-900 nm e um detector altamente sensível, tais como o GaAsP Não-descanned detectores (NDD). Orientações descritas neste manuscrito são um ponto de partida. As condições devem ser determinadas especificamente para as novas experiências ou para os diferentes sistemas.

A córnea e a esclera também foram avaliadas simultaneamente em estudos utilizando esta técnica24,25,26,27. Sabendo que o sinal SHG propaga-se em direções para a frente e para trás, vários estudos têm examinado o tecido corneal independentemente em seu estado nativo28,29,30,31, 32,33,34 e em ceratocone35,36 , bem como na sequência CXL (como discutido abaixo). Os resultados destes estudos indicam que o sinal da córnea é otimizado no sentido de encaminhamento dispersado, que faz sentido, dado a transparência da córnea e o fato de que a luz passa através do tecido para atacar um monitor em sistemas dispersos para a frente. Normalmente, o sinal SHG está na faixa visível azul e será bastante reduzido ao passar através de um tecido altamente dispersão como a esclera do olho. Como resultado, deteção da frente SHG dispersa exigiria uma seção fina de tecido de 50 μm ou menos em espessura, bem como um set-up óptico especial. Em contraste, o sinal de volta-dispersos pode ser capturado através do caminho de luz regular de um microscópio de fluorescência sem corte de tecido e, portanto, esse modo é preferido quando o colágeno no tecido da esclera intacta a uma profundidade de 30 a 40 μm de imagem. Neste estudo, observamos um aumento de concentração dependente da densidade do sinal. No entanto, é bem possível, que o TXL poderia ter tido efeitos adicionais e similares em camadas mais profundas da esclera, e que o efeito pode ser mais pronunciado e estende a camadas mais profundas, particularmente com a maior concentração. No entanto, devido a limitada SHG sinal penetração na esclera e para os fins deste estudo inicial, escolhemos trabalhar com as imagens de melhor qualidade, que foram obtidas a partir da esclera mais superficial (profundidade de 15 µm). No futuro, estudos, nós consideraremos efeitos dependentes seguindo métodos TXL como este pode fornecer informações adicionais importantes por que mesmo as maiores diferenças não foram observados entre 40 e 400 amostras tratadas milímetros de profundidade.

Além disso, em relação ao uso de SHG para avaliar riboflavina CXL induzidas pelo tecido do cross-linking, SHG microscopia imagem seguinte riboflavina CXL da córnea foram relatadas por vários grupos37,38,39 , 40 , 41. em um estudo realizado por Steven et al 37, estabilização da córnea, utilizando a técnica CXL resultou em uma 'homogeneização ' do sinal e perda de tecido 'dobras ' ou ' ondulações ' vista em amostras não-Cruz-lig. Estes tipos de alterações, no entanto, também se observaram em um estudo avaliando os efeitos de alterações em IOP na córnea sinais SHG, levantando a possibilidade de artefatos técnicos. Organizacionalmente a fibrila, bem como o maior ordem fibra bundle/lamelar organização ponto de vista, a esclera e córnea são bastante diferentes e sabe muito sobre essas diferenças de estudos de microscopia eletrônica. Os dois tecidos diferem no que diz respeito a fibrila de embalagem, que inclui distribuição de diâmetro fibrila (fibrilas pequenas uniformes para as córnea e variável de fibrilas de diâmetro para a esclera) e inter fibrila espaçamento (uniforme para córnea e variável para a esclera). Também, a maior organização de ordem em folhas lamelares (córnea) versus feixes de fibra (esclera) é bastante diferente. Essas diferenças estruturais são refletidas em SHG sinais produzidos por estes dois tecidos. Assim, alterações induzidas pelo cross-linking podem alterar o sinal SHG em maneiras diferentes mas paralelas. Em outras palavras, o 'Alisar ' das fibras na esclera observadas no presente estudo e a homogeneização de ' ' do sinal na córnea relatada na literatura, foram ambos o resultado da modificação do cross-linking de colágeno. Assim, o efeito de ' homogeneização ' na córnea poderia de alguma forma ser análogo ao efeito ' Alisar ' da esclera que relatou aqui.

Os mecanismos que resultam neste alisamento efeito produzido por TXL são claras, com base no estudo atual. Uma possibilidade seria que o tecido era de alguma forma 'fixo ' em posição mecanicamente 'carregada '. Isto iria apoiar a noção de que induzida ' estabilização fibrila e fibra ' tinha ocorrido. Alterações na pressão intraocular provável não contribuiu para esse efeito desde IOP foi monitorada antes e após a injeção de sT e manteve-se estável. Em geral, a importância destas observações não são claras e mais estudos serão necessários. Digno de nota, separado de imagem técnicas tais como a microscopia de Brillouin42, que tem sido mostrado para fornecer medidas quantitativas do cross-linking (conforme determinado pelo módulo de cisalhamento) fotoquímica CXL a seguir pode ser útil em confirmar as conclusões com SHG imagem latente neste estudo. No entanto, deve notar-se que seu uso com altamente dispersão tecidos como a esclera43, requer modificações técnicas e ainda não foi validada com tecido scleral reticulado.

Polarização de laser e microscopia SHG é uma questão importante. A luz laser é polarizada linearmente e orientado perpendicularmente à direção de propagação do sinal SHG e de algum ângulo no plano XY-cada fibra de colágeno. Assim, as fibras no plano xy que estão bem alinhados e exatamente perpendicular a luz polarizada laser produzirá um sinal SHG mais elevado do que aqueles em outros ângulos, incluindo os paralelos de luz incidente (ou seja, z-avião), que produzirá o menor sinal SHG (devido à interferência destrutiva). Em relação ao tecido da esclera, colágeno, as fibras são orientadas em vários ângulos em um nível microscópico, embora orientações fibra anatómica preferencial são sabidas para existir baseado na localização do globo. Assim, desde que o sinal SHG produzido irá variar dependendo do ângulo do plano xy de cada fibra, o sinal global será menor do que aquela que seria produzida se todas as fibras de colágeno foram alinhadas exatamente no mesmo ângulo (em um tecido, como um tendão por exemplo). Assim, neste estudo, devido à natureza da amostra a ser fotografada, a direção de polarização intencionalmente não foi determinada, mas foi mantida consistente ao longo do estudo. Além disso, nós teve o cuidado de obter tecidos de tratados e globos de regiões scleral idênticos, minimizando quaisquer diferenças na orientação de fibra entre as amostras de controle. Finalmente, analisamos mais de 100 imagens por exemplo para obter valores de intensidade. Esta extensa avaliação deve ter normalizado quaisquer sinais SHG aberrantes que podem ter sido registrados. Dito isso, é possível que como resultado a fibra "alisamento" que observamos nas amostras reticuladas (descritas acima), uma proporção maior de "no plano focal" fibras poderiam ter contribuído para o aumento da SHG sinal, bem como aumentado SHG sinais de maior alinhamento do plano xy. Ambos destas possibilidades são manifestações de efeitos do cross-linking induzidas.

Foi realizada uma análise regional de cross-linking alterações (por Tm) induzida por uma injeção de sT de SMG. Como esperado, o nível de efeito do cross-linking concentrou-se na área da injeção. Pouco ou nenhum efeito do cross-linking observou-se na região da frente (longe) de injeção, consistente com o que é conhecido sobre a localização do efeito após injeção de sT, conforme mostrado pelo ultra-som localização44, 45 e computado tomografia computadorizada46.

Finalmente, quanto à terapia do cross-linking e miopia, colágeno cross-linking da córnea é encontrar uso difundido no tratamento de desestabilização da córnea, incluindo o ceratocone, pós LASIK keratectasias, degeneração marginal pelúcida (PMD) e como um complemento para procedimentos cirúrgicos refractive47. O sucesso do tratamento da doença com cross-linking corneal levou à exploração da aplicação desta abordagem de tratamento na parte de trás do olho e, em particular, a esclera, para limitar o alongamento axial na alta miopia2, um conceito que remonta à primeiros estágios da terapêutica do cross-linking conceito48,49.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Os autores agradecer Tongalp Tezel, MD, para consulta a respeito da injeção de sT; Theresa Swayne, PhD, para consulta sobre microscopia SHG; e Jimmy Duong desde o projeto e recurso de Bioestatística e a facilidade do núcleo Biostatistical do Instituto Irving na Columbia University Medical Center.

Suportado em parte pela pesquisa para evitar cegueira e pelos institutos nacionais de saúde subsídios NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 e NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possui propriedade intelectual relacionada: U.S. emitida patentes n: 8.466.203 e não: 9.125.856. Patente pendente internacional: PCT/US2015/020276.

Imagens foram coletadas no Confocal e especializada microscopia recurso compartilhado do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, na Universidade de Columbia, suportado pelo NIH conceder #P30 CA013696 (National Cancer Institute). O microscópio confocal foi comprado com NIH conceder #S10 RR025686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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