بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

الكشف عن الأمراض المتبقية ضئيلة أو قابلة للقياس (MRD) هو العلامات البيولوجية تشخيصية هامة لتحسين تقييم المخاطر والتنبؤ بانتكاسة في سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). هذه مبادئ توجيهية شاملة وتوصيات مع أفضل الممارسات لتحديد هوية ثابتة ودقيقة واكتشاف MRD، يمكن أن تساعد في صنع قرارات علاج فعالة لمكافحة غسل الأموال.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J., Kaspers, G. J., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

معايير الاستجابة في سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) تم مؤخرا إعادة تأسيس، مع دراسة السمات المستخدمة في تحديد ما إذا كان المرضى قد حققت مغفرة كاملة (CR). ما يقرب من نصف المرضى الكبار الذين دخلوا الجمهورية التشيكية سوف الانتكاس في غضون 12 شهرا بسبب ثمرة خلايا مكافحة غسل الأموال المتبقية في نخاع العظام. كوانتيتيشن هذه تبقى خلايا اللوكيميا، المعروفة باسم الأمراض المتبقية ضئيلة أو قابلة للقياس (MRD)، يمكن أن يكون العلامات البيولوجية قوية للتنبؤ بهذه الانتكاسات. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل استعادي للعديد من الدراسات أن وجود MRD في نخاع العظام من المرضى مكافحة غسل الأموال ترتبط ببقاء الفقراء. ليس فقط من مجموع السكان ليوكيميك، وتنعكس إيواء لوكيميا المرتبطة بالخلايا المناعية-النمط/الظاهري (ليب)، المقترنة بالنتائج السريرية، ولكن ذلك هو يتدنى التردد المنخفض غير ناضجة من الخلايا الجذعية اللوكيميا (المهارات)، التي يمكن أن تكون ترصد من خلال التدفق الخلوي MRD أو النهج مثل MRD. توفر فحوصات الحساسة التي تمكن من الكشف عن خلايا اللوكيميا المتبقية (الجذعية) استناداً إلى الميزات الخاصة بالمرض أو المرتبطة بالمرض (الواسمات الجزيئية الشاذ أو الشاذة إيمونوفينوتيبيس) قد تحسنت كثيرا التقييم في مجال مكافحة غسل الأموال. ومع ذلك، نظراً لعدم تجانس المتأصلة والتعقيد لمكافحة غسل الأموال كمرض، أساليب لأخذ عينات من نخاع العظم وإجراء تحليل MRD والمهارات ينبغي مواءمة عندما يكون ذلك ممكناً. في هذه المخطوطة يمكننا وصف منهجية مفصلة لنخاع العظم كافية أسبيراتي أخذ العينات، النقل، ونماذج تجهيز للتقييم الأمثل متعدد الألوان التدفق الخلوي، والنابضة استراتيجيات تقييم MRD والمهارات للمساعدة في اتخاذ القرار العلاجي للمرضى في مجال مكافحة غسل الأموال.

Introduction

سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) خبيثة من نخاع العظام تتسم بعيوب في البرنامج النضج، مع انتشار غير طبيعي وتراكم الخلايا السلف النقوي، تثبيط هيماتوبويسيس العادية، وفي نهاية المطاف فشل نخاع العظم . هذا المرض متغايرة جداً فيما يتعلق مورفولوجيا، إيمونوفينوتيبي، سيتوجينيتيكس، الانحرافات الجزيئية، والتوقيعات تعبير الجينات، وكذلك الاستجابة للمعالجة، ومعالجة نتائج1،2. الإدارة الحالية ويشمل العلاج الكيميائي التعريفي بهدف تحقيق مغفرة كاملة (CR)، تليها مغفرة بعد انتهاء العلاج، التي تسترشد بنتائج الجزيئية والخلوية الوراثية إلى حد كبير، والدراسات إيمونوفينوتيبيك وتتكون من أما عدة دورات من العلاج الكيميائي إضافية أو زرع الخلايا الجذعية (ذاتي أو متمكنة)3. على الرغم من معدلات عالية مغفرة الانتكاس بعد العلاج الكيميائي المكثف لتصل إلى 90%، البقاء على قيد الحياة 5 سنوات في البالغين فقط حوالي 30-40 ٪، أساسا بسبب تطوير التي هي عادة مقاومة للعلاج الكيميائي وصعبة جداً مما يؤدي علاج. نتائج في الأطفال أفضل، على الرغم من أن ما يقرب من ثلث أيضا الانتكاس. ولذلك، الكشف المبكر عن الانتكاس وشيك ستسد حاجة غير ملباة إلى طبية وقد توجه العلاج مغفرة بعد4.

الأمراض المتبقية بعد العلاج قد يعكس مجموع جميع التشخيص والتشخيص بعد انتهاء المقاومة آليات/العوامل؛ وبالتالي قد تكون قياس تشخيصية ومفيداً لتوجيه العلاج. إمكانية المرض defining المتبقية (كان يسمى سابقا الأمراض المتبقية ضئيلة والأمراض المتبقية المشار إليها الآن على أنها قابلة للقياس أو MRD) أقل بكثير من المعيار المورفولوجية للخلايا انفجار 5% هو تغيير المناظر الطبيعية من خطر classification. حاليا طريقتين تستخدم في الغالب للكشف عن MRD تدفق المستندة إلى الخلوي والجزيئي، القائم، هذا الأخير يجري تقييمها بعكس المنتسخة بكر (RT-qPCR)5 ، أو أن كان في مرحلة سابقة لأوانها، من الجيل التالي التسلسل (خ ع). أثبتت دراسات عديدة في البالغين، وكذلك كما هو الحال في الأطفال أن مختلف MRD النهج معلومات تشخيصية قوية في مكافحة غسل الأموال على حد سواء بعد التوجيهي وتدعيم العلاج6،7، وتعريفاً جديداً لعبء المرض ( متفوقة على الجمهورية التشيكية المورفولوجية) يظهر الآن8. وهذا يوحي بأن MRD المقررة بالتدفق و/أو التقنيات الجزيئية وينبغي أن تصبح، وفي الواقع الفعل أصبحت، القياسية في كل التجارب السريرية في مجال مكافحة غسل الأموال.

ويناقش هذه المخطوطة الإجراء الخلوي تدفق تفصيلية للحصول توصيف إيمونوفينوتيبيك دقيقة واستنساخه من MRD في عينات نخاع العظام، بما في ذلك أخذ عينات نخاع العظم وتجهيز الإجراءات السابقة للتدفق الخلوي. توافر عينات نخاع العظام ذات نوعية جيدة في التشخيص والمتابعة أمر حاسم لنجاح هذا القياس عبر المواقع السريرية والتجارب السريرية. في الواقع، هذه الاعتبارات التحليلية السابقة أيضا النهج MRD الأهمية الحيوية الجزيئية (PCR وخ ع). لوصف إيمونوفينوتيبيك MRD، تقترن علامات أبيررانتلي أعرب عادي النقوي وعلامات السلف، لتعريف إيمونوفينوتيبي المرتبطة بسرطان الدم (لايب)9. التدابير الناتجة عن ذلك للعديد من العوامل التي تؤثر على استجابة للعلاج، مثل مقاومة العقاقير اللوكيميا المتأصلة أو المكتسبة والدوائية وحركية من العلاج والترصد المناعي والامتثال. ولذلك، MRD معلمة تنبؤاتها قوية جداً بعد تشخيص المقترنة بالنتائج السريرية عند ديتشوتوميزيد على مستوى إنتاج يحدده تحليل خصائص التشغيل المتلقي (ROC). لأعمالنا فوج مكافحة غسل الأموال الكبار من هوفن 42a الدراسة، يتم تعيين مستوى وقف إنتاج المواد الانشطارية في 0.1% خلايا الدم البيضاء إيجابية إلى مجموع الخلايا ليب. باستخدام هذا المعيار لتحديد مركز MRD إيجابية مقابل السلبية، مجموعة من المرضى يمكن التعرف على الذين لديهم حالات الانتكاس أسوأ بكثير، والبقاء خالية من الانتكاس والإجمالية6. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا قياس خلايا اللوكيميا غير ناضجة، ومقاومة المخدرات مع ميزات مثل الخلايا الجذعية (CD34 + CD38-لوكيميا الخلايا الجذعية، أو المهارات)، الذي يقدم مؤشرا قويا لنتائج المريض10. معا ليب واحلركه نهج نموذج النهج MRD سيتوميتريك التدفق. والنهج ليب مناسبة لما يقرب من 90 في المائة المرضى، بينما يمكن تطبيق النهج احلركه في حوالي 80% من المرضى. معا لأكثر من 95% المرضى ويمكن تقييم معلمة واحدة أو على حد سواء.

وأخيراً، يقدم هذا المنشور وصفاً مفصلاً تشغيلية لتقييم MRD بالتدفق الخلوي. وهذا يشمل: 1) مواءمة و/أو توحيد إجراءات أخذ العينات نخاع العظم، 2) نموذج النقل التوجيه 3) الوصف المفصل للكشف عن الخلايا ليوكيميك مع نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام لوحات جسم عدة بما في ذلك النهج أنبوب خلية مفردة وصف المهارات، 4) إنشاء نظام مراقبة الأصول الميدانية آلات لتوحيد القياسات، 5) برامج تحليلية للقياسات MRD و 6) برامج تحليلية للكشف عن المهارات.

ونحن نهدف إلى إظهار جميع جوانب الإجراء بما في ذلك إعداد عينة حيث أنه نادراً ما تناقش في حين أنها مسألة هامة للنوعية للنتيجة النهائية. تطلع نخاع العظام وخزعة هي الإجراءات السريرية المستخدمة لتقييم الخلايا المكونة للدم داخل نخاع العظام. وتجري هذه مع تعداد الدم الكامل (CBC) وتشهير الدم. الأسلوب الأمثل لتطلع نخاع العظام أمر حاسم لتشخيص دقيق ومتابعة للقياس. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تتضمن aspirate ناجح نخاع العظام خلايا كافية لإجراء تحليل تدفق ليب والمهارات (خلايا قابلة للتطبيق على الأقل 10 مليون). هنا، يمكننا وصف طريقة أداء مطمح نخاع العظام، وتوفر المبادئ التوجيهية التي ينبغي أن يسفر كافية خلية أخذ العينات (وحدود إمكانات تخفيف الدم) اللازمة لتشخيص دقيق وإجراء بحوث إضافية. هذه الاعتبارات التحليلية السابقة أيضا النهج MRD الأهمية الحيوية الجزيئية (PCR وخ ع). ينبغي معالجة جميع العينات إيمونوفينوتيبينج تفضيلي ضمن 24 ساعة جمع. على الرغم من غير المستحب، عينات الدم ونخاع العظام يمكن لا تزال معالجتها وتحليلها عند الاحتفاظ تصل إلى 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إجراء جميع هاندلينجس مع المواد تحت ظروف معقمة، تمكينا لتجميد خلايا عقيمة لأحدث البحوث/نوعية التقييم إلخ.

Protocol

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للتعليمات البرمجية للبحث ولجنة أخلاقيات الأبحاث "المركز الطبي الجامعي فو".

1-نخاع العظام الطموح وعينه تحضير

  1. إعداد المرضى والمواد
    1. ملء المحاقن 10 مل واحد أو اثنين مع يدوكائين 1% باستخدام إبرة قياس 16. استبدال الإبرة لابره قياس 21.
    2. وضع نقطتين يدتا 5% على مشاهدة-زجاج.
    3. إعداد الشرائح الزجاجية (n = 15 مع ترقيم المريض يتفق وتاريخ) لتشويه الأعمال التحضيرية.
    4. وضع المريض في وضع استلقاء جانبية. تحديد موقع العمود الفقري حرقفي الخلفي متفوقة ووضع علامة بالقلم.
      ملاحظة: بشكل عام، هو العمود الفقري حرقفي متفوقة الخلفي يقع العرض يدا واحدة القاصي إلى الحرقفي ومن ناحية العرض الجانبي لخط الوسط. في الإناث، وقد يكون العمود الفقري الفعلي الأفقي أكثر قليلاً، في بعض الرجال الآنسي أكثر قليلاً.
    5. تطهير الجلد مع الكلورهيكسيدين 0.5-1% في الإيثانول من منطقة خزعة المقصود المباشر في الدوائر.
    6. فتح مجموعة قفازات معقمة ووضع قفازات معقمة ووضع الحزمة على الجدول لإنشاء حقل عقيمة. فتح الحزمة مع إبرة الطموح ووضعه على الحقل العقيمة.
    7. اختراق الجلد والنسيج تحت الجلد، وأخيراً السمحاق. في السمحاق، إدارة ليدوكائين بطريقة أنه قد تم تخديره من منطقة قطرها 1 سم.
      ملاحظة: الإدارة الكافية من يدوكائين إلى السمحاق واحد من أهم العوامل لراحة المريض. اختبار ما إذا كان قد تم تخديره في السمحاق على نحو كاف بالتنصت على الموقع المقصود خزعة بالإبرة أدخل وأسأل إذا كان المريض يشعر بأي ألم. ملاحظة: يتم تخديره الأطفال تماما أثناء الإجراء بأكمله.
    8. عقد إبرة أسبيراتي (15 Ga x 2.8 ") مع نهاية الدانية في النخيل والسبابة ضد الجانب رمح الإبرة معدنية قرب الحافة؛ وهذا الموقف يسمح التحكم بصورة أفضل.
    9. إدخال الإبرة مع حركة الدورية (بالتناوب بسرعة حركة بروناتينج/سوبيناتينج) عن طريق الجلد نحو العمود الفقري حرقفي وجلب الإبرة اتصال مع العمود الفقري حرقفي الخلفي.
    10. ضمان أن هو إدخال إبرة إلى منطقة أنيسثيتيزيد في السمحاق؛ وينبغي أن يشعر المريض سوى الضغط ولا الألم. إذا كان المريض يشعر بالألم، وتغيير موضع الإبرة، أو إدارة أكثر من يدوكائين.
    11. استخدام ضغط لطيف ولكن ثابتة، التقدم الإبرة أثناء التناوب في حركة عقارب الساعة تناوب اتجاه حركة عقارب الساعة العداد. تم الكشف عن مدخل داخل تجويف نخاع عموما بانخفاض المقاومة.
    12. إزالة في ستيليت من الإبرة. إرفاق حقنه 10 مل فارغة بالإبرة.
    13. تطبيق الضغط السلبي بسحب المكبس المحاقن مع سحب لطيف. تحذير المريض أنهم قد يشعرون الإحساس بالتشنج والألم عندما يجري يستنشق نخاع. إذا تم إصدارها لا يكفي spicules نخاع العظام، ينبغي إجراء الشفط آخر مع رسم سريع واحد. وسيكون spicules معظم مل 1-2 الأولى التي تم الحصول عليها من السحب الأولى. نضح فقط 1-2 مل لتجنب إضعاف العينة.
      ملاحظة: تمييع سيؤدي إلى تخفيف الدم ويجوز الخلط بين نتائج MRD).
    14. إزالة المحاقن واستبدالها ستيليت إلى إبرة الطموح. إخراج جزء من النخاع مشاهدة-زجاج والباقي في أنبوب 8 مل المغلفة مع الهيبارين.
      ملاحظة: عكس كل أنبوبة فورا بعد وضع aspirate نخاع في أنبوب العينة لضمان منع تخثر الدم كافية. تخثر الدم في نخاع العظام السبب غالباً لمواد غير ملائمة. يمكن أن يستنشق نخاع العظام إضافية من نفس المكان، ولكن يفضل أن يكون ذلك، الإبرة هو متقدمة 5-10 ملم قبل أسبيراتي جديدة في هذا الشأن. يفضل أن يكون ذلك ينبغي اتخاذ توجه لا يزيد عن 2 لكل مستوى الإدراج. تأكد بمناسبة هذه الأنابيب مع زيادة الأرقام تمثل الأول، توجه الثانية و/أو على التوالي. أنها قاعدة مشتركة لاستخدام السحب الأول للتحليل التشخيصي الأكثر صلة بالموضوع.
    15. وبدلاً من ذلك، سحب الإبرة من مكان الإدراج وإدخال ذلك في تجويف نخاع بضعة ملليمترات بعيداً عن مكان الإدراج الأصلي وكرر الإجراء.
      ملاحظة: لا نضح أكثر من 1-2 مل في السحب، لتجنب تلوث الدم كبيرة.
    16. كرر في كثير من الأحيان كما هو مطلوب في المواد. عندما يستنشق مواد كافية للبروتوكول دراسة سريرية محددة بإزالة الإبرة نخاع العظام.
      ملاحظة: في حال تطلعات نخاع العظام بطيئة أو خلاف ذلك من الصعب استخدام المحاقن التي طهرتها مسبقاً مع تخثر الدم قد يكون من المفيد. في حالة صنبور جافة، إجراء خزعة ترفين الذي يقع خارج نطاق هذه المخطوطة.
  2. إعداد مسحات للفحص مورفولوجك
    1. لتقييم الخصائص المورفولوجية الأمثل، اقتطاف spicules (مثلاً باستخدام ملعقة بلاستيكية) من أسبيراتي في مشاهدة الزجاج ووضعها على شريحة زجاجية.
    2. بلطف ضع شريحة زجاجية أخرى على الشريحة النخاع والشريحة بلطف؛ تجنب أي ضغط.
      ملاحظة: فقط في حالة spicules نخاع العظام كبيرة جداً طفيف قد يكون الضغط، لتقليل سمك انتشار الخلايا. فوائد الإجراء من تعليمات من مساعد الذين يمكنهم التعامل مع أنابيب العينة. وضع العلامات دقيقة من الأنابيب مع عدد المرضى وعدد من رسم متسلسلة نخاع العظام أمر بالغ الأهمية.
    3. يجف تماما في الشريحة، ثم قم بتنفيذ Giemsa Grünwald قد تلطيخ (انظر الجدول للمواد). فحص تحت المجهر الخفيفة مورفولوجية (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: يظهر الشكل 1A مسحات نخاع العظام صحية تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا الوظيفية بينما الشكل 1B مريض مكافحة غسل الأموال مع الانفجارات الغالب ليوكيميك. لتحديد عبء ليوكيميك المتبقية بشكل أفضل، إيمونوفينوتيبينج الاحتياجات التي يتعين القيام بها.

2-نقل المواد لمزيد من المعالجة

  1. إعداد العينات للنقل
    1. بغية التأكد من عدم تسرب المواد ولن كسر الأنابيب، ضمان التغليف الصحيح (انظر الشكل 2).
      ملاحظة: من نحن الآخرين تجارب حيوية الخلايا ويتم الاحتفاظ بأفضل عندما يتم الاحتفاظ نخاع العظام في درجة حرارة الغرفة. للنقل طويل الأجل وهذا يتحقق على أفضل وجه باستخدام درجة حرارة الغرفة 'هلام حزمة' للمساعدة في استقرار درجة الحرارة أثناء النقل العابر.
    2. تسمية حزم وإضافة الأشكال الصحيحة لتجنب فقدان الحزمة، النقل المطول أو التبديل للمرضى.
      ملاحظة: يجب أن يتضمن على الأقل: بيانات المريض (شكل 1). وينبغي أن يشمل عدد الدراسة و "تاريخ الميلاد" عادة. الضرورية لتجهيز المواد الحق بعد وصوله إلى المختبر المتلقي، بيان واضح بالتحديد التحاليل المختبرية المطلوبة (التشخيص الجزيئي، إيمونوفينوتيبينج، إلخ MRD) في هذا النموذج. (الشكل 2) عنوان ورقم هاتف الشخص المسؤول، وعند الضرورة، أوراق للجمارك. لتجنب فقدان الحزم في البريد، إعلام المختبر إرسال دائماً المختبر المستقبلة قد أرسلت عينة. يوصي باستخدام "تعقب وتتبع".
  2. تلقي عينات من المعاهد الأخرى
    1. تأكد من أن الخدمات اللوجستية المناسبة في مكان في المعهد استلام العينة في المختبر بمجرد أن يتم تسليمها في المعهد.
      ملاحظة: للتنظيم اللوجستي الأمثل يفضل أن يكون مختبر مركزي المطلوب، الذي يتلقى ويقوم بتجميع جميع المواد من العيادة المحلية والمستشفيات الخارجية. على وجه الخصوص، من الضروري تعيين بروتوكولات للتوزيع والاتصالات واضحة مع مختبرات التنفيذية.
    2. وبعد تلقي العينات، دقة ملاحظة الترقيم المناسبة في أشكال مطبوعة وقاعدة بيانات مؤمنة التي تحتوي على مجالات هامة مثل رقم معرف MRD، رقم التسجيل مستشفى المعهد إرسال، وتاريخ الميلاد، والمواد، رقم معرف محدد المحاكمة نوع (نخاع العظام أو الدم المحيطي) وعدد خلايا الدم البيضاء (WBC)، وتاريخ تطلع نخاع العظام وتاريخ قياس العينة وأي تصريحات ذات الصلة للنوعية للقياس.
      ملاحظة: يفضل أن يكون ذلك، قاعدة البيانات هذه هي مجهزة أيضا لتحتوي على بيانات إضافية (أو ربطها بقواعد البيانات الأخرى) لتحليل النتائج، وكذلك بيانات المريض مثل بيانات المتابعة.

3-تدفق الإعداد سيتوميتير

ملاحظة: يستند هذا القسم على التعليمات يوروفلوو. 11

  1. قم بإعداد من الفولتية ضوئي (PMT) لمعلمات FCS SSC وقنوات fluorescence الهدف
    1. معلمات السفح SSC ابدأ cytometer التدفق وأداء "سيتوميتير الإعداد وتتبع (لجنة العلم والتكنولوجيا)" تشغيل على سيتوميتير التدفق مع الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا (انظر الجدول للمواد). خلايا الدم الحمراء من متبرع سليم (الوارد وصفها في الفرع 4-1).
      1. إنشاء تجربة جديدة (في القائمة: التجربة، "تجربة جديدة"، حدد التجربة فارغة) باستخدام برنامج الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد) مع مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الأرض دوت سيديوارد المبعثر (SSC) لإعداد المعلمات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. اسم هذه التجربة PMT منتدى التعاون الأمني/SCC مع التاريخ. أولاً استخدام الإعدادات الحالية سيتوميتير (انقر بالزر الأيمن: "تطبق لجنة العلم والتكنولوجيا الحالية"). يتم إنشاء هذه الإعدادات مع الاختيار أداء لجنة العلم والتكنولوجيا باستخدام الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا-المعايرة (انظر الجدول للمواد). ضبط منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب تصور اللمفاوية في "إعدادات التجربة العالمية". ملاحظة: في أعمالنا سيتوميتير تدفق هذه هي 285 الخامس و 400 الخامس على التوالي. تحقق من إيقاف تشغيل "تمكين التعويض": إعدادات المفتش/صك/التعويض.
      2. لتقييم حجم الخلايا (FSC) وتقسيمات (SSC) بدء قياس غير مسمى تفكيك خلايا الدم الطرفية بواسطة الدالة "الحصول على خلايا". بوابة لمفاوية وضبط/fine-لحن منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب الفولتية للوصول إلى القيم المستهدفة يعني التالية للسكان اللمفاويات المبوب: منتدى التعاون الأمني: 100,000 (مجموعة 95,000-105,000)؛ التعاون بين بلدان الجنوب: 15,000 (مجموعة 13,000-17,000).
      3. حيازة وتسجيل البيانات عن طريق قياس الأحداث 10,000 على الأقل. التحقق من يعني منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب القيم لبوابات لمفاوية الهدف وإعادة ضبط إذا لزم الأمر.
    2. للحصول على إعداد fluorescence الهدف استخدام قنوات الفولتية PMT 8-ذروة قوس قزح الخرز معايرة جزيئات (انظر الجدول للمواد).
      1. قم بإنشاء تجربة جديدة على نظام مراقبة الأصول الميدانية لقمم 7. إنشاء ورقة عمل "الهدف يعني الفلورسنت الكثافة (MFI)" مع جميع المؤامرات دوت اللازمة (n = 2؛ منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب، فيتك مقابل PE)، رسوم بيانية (n = 8؛ وواحد من الرسم البياني لكل كاشف الأسفار) وإحصاءات تبين المرجع القيم القصوى (مؤسسة مونتانيار ومعامل الاختلاف (CV)) لكل قناة الأسفار.
      2. إعداد طازجة محلول يحتوي على قطره 1 (± 60 ميليلتر) من حبات قوس قزح في 1 مل من dH2"سين بلطف" دوامة مزيج الخرز في الحل.
      3. استخدام إعدادات PMT الفولتية منتدى التعاون الأمني/SSC من أعلاه وابدأ قياس الأسفار الخرز قوس قزح باستخدام الدالة "اكتساب" (بدون تسجيل) معدل تدفق "منخفضة" مع عتبة خمسة آلاف. استخدم الزر "بوابة مستطيلة" إلى بوابة السكان الخرز القميص P1 في منتدى التعاون الأمني مقابل الأرض دوت التعاون بين بلدان الجنوب. بوابة 7ال ذروة-P2 السكان في فيتك مقابل الأرض دوت PE.
      4. مواصلة اقتناء 7-قمم قوس قزح حبة تعليق وضبط/fine-لحن PMT الفولتية في جميع الأسفار القنوات للوصول إلى هدف مؤسسة مونتانيار القيم وفقا للقنوات المستهدفة مؤسسة مونتانيار المشروح كما هو منصوص عليه مع الخرز.
      5. استخدام "سجل" لجمع بيانات أحداث حوالي 10,000 والتحقق من وجود مؤسسة مونتانيار 7th الخرز الذروة. تصحيح الفولتية PMT إذا لزم الأمر. مرة واحدة يتم الوصول إلى القيم "المستهدفة مؤسسة مونتانيار" لذروةال 7، وسجل/الكتابة فوق الملف للقيم PMT النهائية.
      6. حفظ القيم PMT النهائية واسم ملف حفظ الإعداد PMT مع التاريخ، التي سوف تكون في الكتالوج الخاص بالشركة المصنعة البرامج. استخدم هذا الإعداد PMT لتصحيح التسرب أكثر لكل صبغ الأسفار.
  2. إعدادات تعويض الأسفار
    1. تسمية أنبوب لعنصر التحكم أونستينيد وكل جسم fluorochrome مترافق (راجع الجدول S1 فلوروتشروميس المستخدمة). "الماصة؛" 100 ميليلتر من المخزن المؤقت في كل أنبوب.
    2. دوامة قنينة الخرز تعويضات متعددة الألوان (انظر الجدول للمواد) دقة ثم قم بإضافة 1 قطره كاملة (± 60 ميليلتر) من هذه الخرز لكل أنبوبة.
      ملاحظة: تجنب تتساقط حبات أسفل الجانب من الأنبوب أثناء إضافتها إلى كل أنبوبة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تركيز حبة منخفضة ويمكن أن تؤثر على نتائج مصفوفة التعويض.
    3. ماصة يحسب حجم مناسب لاختبار واحد من الأجسام المضادة مترافق fluorochrome كافية (والتي ستكون كافية لوصمة عار 106 خلايا) في أنبوب المقابلة ودوامه تماما. لا تقم بإضافة جسم إلى أنبوب التحكم أونستينيد. احتضان لمدة 15 إلى 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. إضافة 4 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)/0.05% azide-0.1% ألبومين المصل البشري (HSA) (انظر الجدول للمواد)) لكل أنبوبة. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 300غ 10 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه حبة بإضافة 0.2 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل أنبوبة. دوامة الأنابيب تماما.
    5. فتح برامج التحليل الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد)، وخلق تجربة جديدة (في القائمة: التجربة، "تجربة جديدة"، حدد التجربة فارغة) وقم بإعادة تسمية ملف التعويضات مع التاريخ الحالي.
    6. انتقل إلى "إعدادات سيتوميتير" واستخدام الإعداد PMT من قسم 3.1. تأكد من أن العتبة في منتدى التعاون الأمني هو 5000 وقيم جميع فلوروتشروميس المستخدمة التعويض هي صفر.
    7. إنشاء عناصر تحكم التعويض، بما في ذلك الأنابيب الخاصة بالتسمية، حسب الحاجة. تأكد من تضمين عنصر تحكم أونستينيد. حدد من القائمة: التجربة، إعداد التعويض، "تعويض إنشاء عناصر التحكم".
    8. تحميل أنبوب أونستينيد مراقبة وضبط البوابة P1 حول السكان حبة القميص وضمان أن البوابة P1 يحتوي على الخرز القميص فقط.
    9. زر الماوس الأيمن فوق البوابة P1 وحدد "تطبيق لكل تعويض عناصر التحكم". الحصول على بيانات السجل لجميع الأنابيب الفلورية المسمى واحد. تحقق من أن بوابة P2 يشمل السكان إيجابية على كل من الرسم البياني الأسفار. إذا كانت هناك حاجة إلى ضبط البوابة.
    10. حساب التعويض. حدد التجربة، إعداد التعويض، حساب التعويض.
    11. إذا لم يكن حساب التعويض الناجح، يعرض رسالة إعلام بخطأ. قم بعمل التعديلات اللازمة، وإعادة حساب. عند حساب التعويض بنجاح، يظهر مربع حوار العرض لاسم للإعداد تعويضاً.
    12. قم بإدخال اسم (على سبيل المثال إعداد الألوان 8-شهر-ص ص) وانقر فوق الارتباط وحفظ. سيتم أيضا حفظ إعداد التعويض إلى تعويض إعداد النشرة المصورة.
      ملاحظة: يمكن استخدام نفس الإعدادات لكافة تجارب باستخدام فلوروفوريس نفسه.

4-التدفق الخلوي التقييم (ليب والمهارات)

ملاحظة: هنا نحن تصف الإجراء تحلل الجملة قبل التلوين، الذي يتيح لوصمة عار بتركيز مفضل لمكافحة حرائق آبار النفط. معظم البروتوكولات استخدام هذا النهج على الرغم من أن البعض قد استخدمت بنجاح الخيارات الأخرى مثل تلطيخ قبل تفسخ. نخاع العظم كله تلطيخ قبل تحلل يقلل من فقدان الخلايا تفضيلية12، ولكن حرمان تركيزات الخلية منخفض جداً، ولا يمكن التنبؤ بها.

  1. تحلل الجزء الأكبر من الخلايا
    ملاحظة: تبقى العينات unmanipulated الأفقية في الرايت، عندما يتعذر إجراء اقتناء سيتروميتريك تدفق في نفس اليوم من أجل بدء الإجراء بأكمله في اليوم التالي.
    1. ريسوسبيند عينة نخاع العظم أنتيكواجولاتيد إلى التجانس بعكس العينة عدة مرات. تحديد تركيز خلايا نخاع العظام (عدد خلايا الدم البيضاء (WBC)) باستخدام خلية العد الدائرة مع الخلية تلطيخ الحل تويرك (انظر الجدول للمواد).
    2. بيبيت وحدة التخزين اللازمة لنخاع العظام في أنبوب منفصل 15 مل. كمية الخلايا يعتمد على عدد أنابيب المصبوغة منفصلة؛ لتلوين واحد (أنبوب واحد) استخدام حوالي 2 × 106 خلايا الدم البيضاء للقياسات ليب وخلايا الدم البيضاء 8 × 106 لقياس الأنبوب احلركه.
    3. خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة الحل ليسينج (انظر الجدول للمواد). يجب أن يكون حجم المطلوب من ليسينج الحل 10 مرات حجم تعليق خلية.
    4. المزيج بلطف، بعكس واحتضان لمدة 10 دقائق في الرايت الطرد المركزي ل 7 ز 800 دقيقة في تجاهل الرايت المادة طافية (مثلاً باستخدام مضخة فراغ أو ماصة باستور). ريسوسبيند بيليه الخلية في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)/0.05% azide-0.1% ألبومين المصل البشري (HSA) (انظر الجدول للمواد) في استخدام الرايت حجم الحد الأقصى من الأنبوب.
    5. أجهزة الطرد المركزي ل 7 ز 800 دقيقة في الرايت تجاهل المادة طافية (مثلاً باستخدام مضخة فراغ أو ماصة باستور). إعادة تعليق بيليه الخلية في azide-0.1% PBS/0.05% هسا إلى تركيز خلية لمكافحة حرائق آبار النفط/mL 100 × 106 ، وتقسم على عدد أنابيب المقصود.
  2. تلطيخ الخلايا للتدفق الخلوي
    1. بيبيت [مونوكلونل] جسم (موآب) الحل كوكتيل خلط في أنابيب فارز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) الخلية المناسبة تنشيط الأسفار واحتضان مع خلايا النخاع العظمى تفكيك لمدة 15 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: وهذا مهم جداً عندما تستخدم صبغات جنبا إلى جنب. على سبيل المثال، انظر يمزج الأفرقة اصطلاحا المستخدمة في المختبر (S1 الجدول).
    2. المياه والصرف الصحي قد الخلايا مع 3 مل PBS/0.05% azide-0.1%. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 400غ. تجاهل المادة طافية (مثلاً باستخدام مضخة فراغ أو ماصة باستور) وريسوسبيند بيليه الخلية في 300 ميليلتر PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
    3. لقياس المهارات: ريسوسبيند بيليه الخلية في 400 ميليلتر PBS/0.05% azide-0.1% هسا وإضافة 4 ميليلتر من حبات فارغة (مثل سفيروتيتش، انظر الجدول المواد) لاستخدامها كالسكان مراقبة سلبية في التحليل.
    4. فتح MRD أو احلركه التجربة تكمن-الخروج على نظام مراقبة الأصول الميدانية (انظر الجدول للمواد) وتدبير لمكافحة حرائق آبار النفط MRD 100,000 على الأقل عن طريق بوابة الأحداث لقياس عينات المرضى مكافحة غسل الأموال في التشخيص و 1 × 106 مكافحة حرائق آبار النفط لعينات مكافحة غسل الأموال في المتابعة. للمهارات قياس التجارب على الأقل 4 × 106 حرائق في التشخيص والمتابعة لنتيجة احلركه موثوق بها على حد سواء.
    5. حفظ البيانات باستخدام اسم ملف مناسبة موحدة لتحليل النتائج. إجراء جرد لعلامات قياس مختلفة على خلايا مكافحة غسل الأموال وعلى الخلايا الجذعية مكافحة غسل الأموال (إيجابية وسلبية، أكثر من/تحت التعبير)، وتخزين هذه البيانات في دفتر اليومية مختبر.
    6. في حالة وجود لا تشخيص ليب المتاحة، قياس جميع الأنابيب 4 في المتابعة للتأكد من أنه يمكن تحديد أي ليب قابلة للقياس الممكنة في اتباع نهج مختلفة-من-العادية.
    7. اختر LAIP(s) الأكثر موثوقية13 أنشأت في التشخيص والحصول على العديد من الأحداث قدر الإمكان، ولكن > أرقام الحد الأدنى المحدد.

5-تحديد من تعمل المناعية المرتبطة سرطان الدم (ليب): يحلل السكان خلية مختلفة

ملاحظة: يمكن تحليل ملفات السفح مع عدة برنامج حاسوبي للتصور الأمثل للسكان خلية مختلفة (انظر الجدول للمواد).

  1. السكان خلايا الدم البيضاء
    1. بوابة الخلايا CD45 الإيجابية والخلايا تظهر قابلة للحياة، تاركة FSC منخفضة (الخلايا غير قابل للحياة، والخلايا محمر) داخل الأرض منتدى التعاون الأمني/التعاون بين بلدان الجنوب؛ وتتضمن هذه مكافحة حرائق آبار النفط (الشكل 3Aأنا). وتظهر في مكافحة حرائق آبار النفط واستخدام واحدة من علامات بدائية (على سبيل المثال CD34؛ الشكل 3Aالثاني) للمساعدة في التأكد من موقف نهائي من الانفجارات في منطقة CD45dim دو (3A الشكلالثالث).
    2. بوابة الخلايا CD45dim والعودة من بوابة الخلايا في هذه المؤامرة منتدى التعاون الأمني/SSC (الشكل 3Bأنا). إزالة بوابة CD34 (الشكل 3Bii) حين الإبلاغ عن الخلايا % في هذه البوابة كالانفجارات % في شجرة السكان الخاص بك في البرنامج. تظهر الانفجارات التي وقعت في ال SSC/CD34 الأرض وبوابة الخلايا CD34 الإيجابية (Figure3بيي).
  2. الخلايا اللمفية
    1. استخدام الخلايا الليمفاوية كرقابة داخلية: السكان النقوي كعنصر تحكم سلبية والسكان اللمفاوية كعنصر إيجابي.
    2. يبدأ من خلايا الدم البيضاء السكان (الشكل 4 أ). بوابة لمفاوية ك CD45عالية/SSCانخفاض السكان (الشكل 4 باء).
    3. تأكد من أنه لا توجد أي خلايا النقوي في البوابة باستخدام CD34، CD117، CD13 أو CD33، وبوابة للخلايا سلبية سلبية/CD33 CD13 (الشكل 4ج-ه). استدعاء هذا السكان 'اللمفاويات' في شجرة السكان (الشكل 4F).
  3. ليب في التشخيص
    1. بوابة الانفجارات وبعد ذلك الخلايا CD34 الإيجابية في ال SSC/CD34 الأرض وندعو هذه 'علامة البدائية' في شجرة السكان.
    2. رسم الخلايا البدائية، في هذه الحالة CD34 الإيجابية، واللمفاوية في مؤامرة جديدة مع علامة اللمفاوية (CD7) ضد علامة النقوي (CD33). بوابة السكان الشاذة (انظر المبادئ التوجيهية التكميلية ملف 1) وتسميها 'ليب إيجابية' في شجرة السكان.
      ملاحظة: يقال النهائي المختار ليب ك % ليب على السكان الانفجار. يمكن إنشاء حساسية وخصوصية والاستقرار ليبس فقط من قبل موظفين ذوي خبرة وافرة في القياسات MRD. العدد الإجمالي لهذه المعلمات يحدد نوعية ليب. في الشكل 5 ألف-دالأمثلة عن أربعة تقييمات لايب مختلفة في التشخيص.
    3. تحديد التعبير عن ليبس (% على الانفجارات) والمحافظة على هذه البيانات في قاعدة بيانات أو ملف أكسل.
    4. تقديم تقارير لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية والملاحظات من ليبس التي يتعين استخدامها في القياسات MRD.
      ملاحظة: هو إذن تعريف ليبس في فريق من الخبراء أنها سمة أساسية لقياسات دقيقة في المتابعة حتى.
  4. في المتابعة
    1. بوابة الانفجارات كما هو موضح في 5.1 ولكن اعتماداً على هذه النقطة مرة بعد العلاج؛ التقييم الصحيح لهذه البوابة قد يكون أمرا صعباً. التركيز على النمط الظاهري ليب الذي أنشئ في التشخيص وبوابة السكان غير ناضجة.
    2. كما هو موضح في 5.1. العثور على بوابة الانفجار الصحيح استناداً إلى أبيرانسي محددة ويكون على بينه من تجديد نخاع العظام والتعبيرات العادية من أجل بوابة بها
    3. تكرار نفس النابضة استراتيجية المتابعة في جميع النقاط وتحديد MRD بالنسبة المئوية للخلايا ليب في الشعب بكامله من خلايا الدم البيضاء. راجع الأمثلة الشكل 6A 6B.
    4. تقرير MRD الإيجابية عند % من MRD ≥ 0.1% خلايا الدم البيضاء. طباعة البيانات تم تحليلها في شكل موحد لمناقشة أسبوعية مع الفريق. سجل النتائج بعد أن يتم التوصل إلى توافق في الآراء. تسمح النتائج التي ترخص بها المشرف قبل إبلاغ النتائج إلى الأطباء.

6-تحليل الخلايا الجذعية (احلركه أنبوب واحد)14

  1. تحليلات للمهارات في التشخيص والمتابعة
    1. بوابة انفجار الخلايا كما هو موضح في القسم 5.1.
    2. كمراقبة السلبية المحتملة ل CD38-، بوابة الخلايا الحمراء--كسر (أي تبقى خلايا الدم الحمراء بعد تحلل، توصف بأنها SSCمنخفضة/FSCمنخفضة و CD45السلبية). إذا لزم الأمر، يمكن استبعاد الخلايا الميتة والخلية شظايا من بوابة إضافية في هذه المؤامرة.
    3. تحديد داخل البوابة الانفجار ليوكيميك يتدنى مع التعبير عن CD34. حدد ضمن هذه الفئة من السكان CD34+ CD38 الخلايا (تستخدم كوقف إنتاج المواد الانشطارية: الحد العلوي من الخرز معايرة فارغة لتحديد العتبة (انظر الجدول للمواد)، الأحمر-الكسر أو استخدام 103 كنقطة وقف إنتاج المواد الانشطارية). استدعاء هذا السكان 'CD38 المتكفلمنخفضة ' (الشكل 7).
      ملاحظة: انظر التكميلية الملف 1 لمزيد من التفاصيل المتعلقة بتحديد مستويات CD38-وقف بعيداً.
    4. تحديد ضمن هذه الفئة من السكانمنخفضة CD38 الحقيقية CD34 + CD38 السكانمنخفضة جداً الخلايا الجذعية، واستخدام الوسيط للكسر أحمر، الحدود الدنيا من الخرز معايرة فارغة أو اختر 102 كالنقطة الفاصلة (الرقم 7 ). انظر التكميلية الملف 1 لمزيد من التفاصيل حول إعداد مستويات CD38-وقف خارج.
    5. داخل كل السكان، بوابة الخلايا الجذعية ليوكيميك مقابل أن الخلايا الجذعية المكونة للدم العادي (مقابل احلركه HSC) من خلال تحليل كل علامة ليوكيميك قدم في لوحة (أي CD45RA، كومبي-6 (CLEC12A، تيم-3، CD7، CD11b، CD22 و CD56 جميعا في PE)، CD123، CD33 و CD44).
    6. ارسم علامة الخلايا الجذعية للفائدة مقابل الأخرى علامة الخلايا الجذعية لمقارنة الإيجابية/السلبية مع الإيجابية/السلبية لعلامات أخرى وصقل المهارات مقابل HSC التردد.
    7. تبلغ النسبة المئوية للانفجارات غير ناضجة، والخلايا الليمفاوية، والخلايا CD34 +. علامات جميع منفصلة، قائمة الأرقام الإجمالية CD38منخفضة و CD38فيريلوو وأرقام CD38منخفضة و CD38فيريلوو وعلامة إيجابية (والورم وهكذا).
    8. حدد للعلامة أفضل أن يميز الخلايا الجذعية المكونة للدم العادي مقابل ليوكيميك الخلايا الجذعية للمزيد من التحليل. حساب النسبة المئوية للمهارات و HSC كنسبة مئوية من إجمالي مكافحة حرائق آبار النفط.
      ملاحظة: هو عن نسبة مئوية من احلركه ≥ 0.004% كالمهارات الإيجابية في التشخيص، بينما الوقف هو 0.0001% في المتابعة. شاذة من الخلايا الجذعية النابضة في متابعة عينات مشابه للتحليل في التشخيص، ومع ذلك، أرقام الخلية في الخلايا الجذعية السكان يمكن أن تكون صغيرة جداً. ومن ثم ضرورة الحصول على ما يكفي من الأحداث.

Representative Results

90% مرضى مكافحة غسل الأموال يمكن أن يحدد ليب واحد على الأقل. من أجل توليد نسب دقيقة من ليب + الخلايا من الخلايا البدائية الانفجار عند التشخيص، الإعداد المناسب لبوابة الانفجار أمر بالغ الأهمية ويحتاج التحقق كتصور في الشكل 3. مثال لكل مريض إيواء نوع معين من أبيرانسي على الخلايا البدائية CD34 + هو متصور في الشكل 5. لقياس MRD في المتابعة، في وقت سابق المعرفة ليب + الخلايا هي بوابات والمحددة كنسبة مئوية من ليب + خلايا مكافحة حرائق آبار النفط. ومن ثم وضع هذه البوابة أمر حاسم لتحقيق النتائج MRD الحق. ويبين الشكل 6 مريض الذي لا يزال في مغفرة كاملة ومريض أن الانتكاس بعد النتائج الإيجابية (≥ 0.1 ٪) بعد الدورة الثانية من العلاج التعريفي.

البروتوكول الحالي فقط مناسبة لتعريف الخلايا الجذعية في CD34 + الخلايا، حيث وصف دقيق لهذه المقصورة قد أظهرت أن CD38-السكان المرافئ الخلية الجذعية أقوى مثل الكسر. وتستخدم من أجل فصل المهارات من HSC داخل هذا الكسر، علامات إضافية. هي علامات المحدد في أغلب الأحيان لتمييز احلركه CD45RA والقناة كومبي إيواء 6 علامات احلركه محددة وصفت مع PE. استناداً إلى التقييمات السريرية الأخرى، مستوى إنتاج ≥ 0.004% عرف بأنه إيجابي احلركه وترافق مع بقاء أسوأ في التشخيص بينما كان يستخدم الحد الأدنى من 0.0001% في يلي حتى10.

Figure 1
الشكل 1 : لطاخة نخاع العظام. المانحة A) صحية والمريض ب) مكافحة غسل الأموال (النوع الفرعي 5 القوات المسلحة البوروندية). جيمسى وصمة عار في التكبير 100 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تصحيح مواد التغليف للسوائل البيولوجية. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن قواعد وأنظمة نقل السوائل البيولوجية في الموقع15 من مراكز "السيطرة على الأمراض" والوقاية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : استراتيجية لتحديد انفجار الخلايا النابضة. A) النابضة CD45dim، ب) النابضة CD34 + الانفجارات.

Figure 4
الشكل 4 : النابضة لمفاوية. A) الخلايا الزرقاء هي مكافحة حرائق آبار النفط سيظهر في منتدى التعاون الأمني/SSC الأرض، خلايا ب) الخضراء هي الخلايا الليمفاوية تميزت CD45عالية/SSCمنخفضة، ج) أمثلة سلبية ل CD34، د) سلبية ل CD117 و E) سلبية ل CD13، أنواع الخلايا المختلفة و) تظهر في نظرة عامة حول شجرة السكان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : ليبس في تشخيص مكافحة غسل الأموال- A) ليب استناداً إلى الصليب أبيرانسي النسب (CD7 على الخلايا وإذ تعرب عن CD33)، ب) ليب القائم على التفرقة غير متزامن (CD11b على الخلايا CD13 إذ تعرب عن)، ليب ج) استناداً إلى مقارنة بالخلايا العادية (CD34عالية جداً في CD13 معربا عن الخلايا)، أوفيريكسبريشن د). ليب استناداً إلى أونديريكسبريشن مقارنة بالخلايا العادية (الدكتور هلامنخفضة في CD33 التعبير عن الخلايا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : لايب اتباعها أثناء العلاج. تعريف A) ليب في التشخيص (CD34 + CD13 + CD33-) وفقدان ليب أثناء متابعة مريض الذي بقي في مغفرة كاملة متواصلة، تعريف ب) ليب في التشخيص (CD117 + CD7 + CD33 +) واستمرار ليب أثناء متابعة مريض الذي انتكست. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : الخلايا الجذعية النابضة. أ) Gating CD34 مختلفة + CD38 السكان استناداً إلى الخرز (CD38منخفضة أدناه الحد العلوي من الخرز، بينما CD38 تم تعريفها كالخلايا سلبية حقيقية تمثل المهاراتمنخفضة جداً وتوجد أدناه متوسط الخرز)، ب) اثنين أمثلة للمرضى الذين يعانون من التمييز بين HSC والمهارات في المتابعة على أساس CD45RAالراتب والتعبير CD45RAنقاط البيع . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الملف الإضافي 1- الرجاء النقر هنا ل downoad هذا الملف.

ملف إضافي 2- الرجاء النقر هنا ل downoad هذا الملف.

ملف إضافي 3- الرجاء النقر هنا ل downoad هذا الملف.

Discussion

وافرة من البيانات المتاحة التي تظهر الأدلة الإيجابية MRD يجري المرتبطة ببقاء الفقراء، وذلك التقييم MRD قد يحسن نتائج المريض بتوفير معلومات تشخيصية إضافية يمكن أن يكون أساسها القرارات السريرية. ومن ثم، طريقة متسقة ومنسقة لتقييم المناعية المظهرية MRD أمر أساسي لتحسين علاج المرضى في نهاية المطاف. هذا مهم أيضا عند مقارنة الدراسات السريرية عبر مختلف المواقع السريرية، وربما في نهاية المطاف المقرر مساعدة في السريرية مما يجعل وتخدم كنقطة نهاية مركب سريرية للبقاء على قيد الحياة عموما. فكرة أن هناك ما يبرر صلبة من المبادئ التوجيهية للقياسات MRD دقيقة ومتسقة أدى إلى عمل متضافر من شبكة اللوكيميا الأوروبية (جيش التحرير الوطني) لتصميم أحدث المبادئ التوجيهية. هذه الوثيقة الشاملة سيتم نشرها أواخر عام 2017، وسوف تكون مفيدة للعديد من مجموعات الدراسة والمختبرات التي تتحرك إلى الأمام.

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول

هو جانبا هاما، وكثيراً ما يغفل التحليل MRD أثر نوعية العينة على تحديد دقيق ل MRD. هذا أكثر وضوحاً عندما بنقلها إلى المعاهد الأخرى في التجارب السريرية العالمية نظراً للاعتبارات التشغيلية الإضافية التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند إعداد هذه المواد. للحد من خطر الخلط بين المريض المعلومات وتسليم إدارة العينات الكافية في الوقت المناسب أمر حاسم. مرة أخرى، في هذه المرحلة للنقل أشكال الصحيح و/أو استيراد نظم المستشفى الإلكترونية مع مهام واضحة للتحليل المطلوب المطلوب. مشيراً إلى مرحلة العلاج لأخذ العينات MRD هي أيضا حاسمة نظراً لأنها قد تكون ذات صلة للقرارات السريرية (على سبيل المثال بعد الدورة الثانية من العلاج) وذلك أن تعرف تعريفاً واضحا. استخدام بيانات وهمية (مثل على سبيل المثال 1 يناير كل سنة الميلاد) يزيد من خطر الخلط بين المرضى أو تحليلات. إذا كان ذلك مطلوباً بموجب القانون، ينبغي أن تستخدم طريقة مجهولة المصدر بديل لتحديد الهوية.

ينبغي معالجة جميع العينات إيمونوفينوتيبينج تفضيلي ضمن 24 ساعة جمع. على الرغم من غير المستحب، عينات الدم ونخاع العظام يمكن لا تزال معالجتها وتحليلها عند الاحتفاظ تصل إلى 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، جميع هاندلينجس بالمادة يمكن أفضل إجراء تحت ظروف معقمة، حيث نعد المزيد من الخلايا في المصارف الأحيائية (المحلية) ما زالت ذات الصلة: العديد من الدراسات السريرية أن تحاليل إضافية لمواصلة التحقيق خلايا سرطان الدم مع احترام للسمات الجزيئية والمناعية المظهرية والوظيفية المراد تنفيذها في مرحلة لاحقة. إلا أن تفاصيل بيوبانكينج ليست ضمن نطاق هذه المخطوطة.

استخدام MRD كأداة تشخيص يعني أنها بحاجة إلى مختبرات معتمدة، ليس فقط لقياس التدفق، ولكن أيضا فيما يتعلق بمراقبة الجودة لتقييم MRD. وقد يتطلب توزيع العينات إلى مختبرات مرجعية محددة أو (إعادة) تحليل تدفق الملفات مع القياسات MRD فرق إشارة.

توضح هذه المقالة الإجراءات أهم من جمع aspirate نخاع العظام تصميم MRD في العينات السريرية-التي تحتاج إلى فريق كامل من الخبراء بمهام محددة، المسؤوليات، ومع كثرة الاتصالات فعالة الوصف والتحليل. نظراً لكل مهمة حاسمة بالنسبة للإجراء، من المستحسن أن يكون الصوت اللوجستية بما في ذلك البروتوكولات في كل مختبر وكافية أفراد الاحتياطي الذين تدربوا على وجه التحديد للمهمة. وبالإضافة إلى ذلك، أن هناك بعض الخطوات ذاتية نسبيا في جزء من الإجراءات (على خاصة ليب واحلركه تحديد علامة الشاذة)، أنها ضرورية لإجراء مناقشات حول النتيجة النهائية بالفريق، وقد أذنت بها فريق من التقرير النهائي المشرفين. الجهود المبذولة حاليا نسعى لتطوير برامج الكمبيوتر التي ستساعد على توحيد التحليل (ليب والمهارات).

التعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

يمكن أن يكون لكل مختبر مجموعتها الخاصة من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها لتعريف مختلف الفئات السكانية الفرعية على الرغم من أن وجود العمود الفقري موحدة من علامات ضروري لنتائج مماثلة، كما ورد في المبادئ التوجيهية للدولة من الفن جيش التحرير الوطني للوثيقة القياسات MRD المشار إليها أعلاه. بصرف النظر عن علامات المختار وهناك بعض القضايا التي يمكن أن يجعل من الصعب تحليل النتائج وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار.

القيود المفروضة على هذه التقنية

أولاً هو تحديد التعبير علامة الشاذة ليب والمهارات المقررة في التشخيص ورصدها مع مرور الوقت (أثناء وبعد العلاج) لتوصيف دقيق للنمط الظاهري MRD. في حين أن ما يزيد على 95% المرضى يمكن تقييمها عبر ليب أو المهارات (أو كليهما)، لا يزال بعض المرضى قد لا ليبس محددة أو لا CD34 + CD38-أو يقدم مع الانفجارات السلبية CD34، أو عينة تشخيص مفقودة. وفي هذه الحالات، أنها لا تزال جديرة بالاهتمام في محاولة لقياس MRD مع فريق من الأجسام المضادة واسعة كما يسمح عدد الخلايا المتوفرة ثم قم بتحديد الأكثر موثوقية (التمييز أقوى من الخلايا ليوكيميك إعطاء) ليب. وإذ ترى أن نسبة المرضى الذين الانتكاس في نهاية المطاف لا تشبه تماما إيمونوفينوتيبي التشخيص، نظراً لعدم تجانس المرض مكافحة غسل الأموال، وقياس فريق واسع من الأجسام المضادة في MRD يوصي على أية حال. هذه التحولات إيمونوفينوتيبيك وتشمل انفجار الخلايا ولسكس وقد ثبت أن تحدث أثناء العلاج16 ويمكن أن يستند هذا المرض measureable هؤلاء السكان القادمة ما يسمى. في هذا الوقت ومع ذلك، لا تقرر ما إذا كان جميع السكان الفرعية إيمونوفينوتيبيك سوف تؤدي إلى انتكاس المرض، وهو ذلك ممارسة غير شائعة تقرير العلاج مصممة على MRD استناداً إلى هذه الخلايا في التجارب السريرية. من المهم ملاحظة أن يتم تقليل مخاطر احلركه في عداد المفقودين بسبب التحولات السكانية بأنبوب واحد النهج التي هي أهم العلامات المميزة أبيرانسي في واحدة من التدفق الخلوي (PE) قناة14.

أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يعتمد على تعريف ليبس أو أكثر، الخلايا التي يتم اتباعها أثناء العلاج. عيوب هذا الأسلوب أن أنه تم مؤخرا أظهرت أن ليب قد تتغير أثناء العلاج. وبهذه الطريقة قد غاب بعض السكان القادمة مع علامات شاذة مختلفة. للالتفاف على هذا، سيكون من الأفضل لقياس كافة علامات شاذة بدلاً من فقط تلك التي عثر عليها في التشخيص. ثم هذا سيكون مماثلاً للنهج "مختلفة من العادية" التي يتم استخدامها من قبل عدة مختبرات17.

التطبيقات المستقبلية

في الآونة الأخيرة، تلقت MRD اهتمام إضافي لرواية تصميم التجربة السريرية. في العصر من خيارات العلاج المتخصص والعلاج بالعقاقير المستهدفة، باستخدام MRD كتدبير نتائج سوف يقلل الوقت اللازم لإقامة فعالية العلاجات الرواية، في نهاية المطاف مما يتيح إدخال أسرع من حاجة ملحة إلى العلاج السريري خيارات إلى العيادة. أهمية الخدمات اللوجستية المناسبة، وتنفيذ عملية تقييم MRD منسقة ذات أهمية حاسمة لنجاح العلاج مكافحة غسل الأموال في المستقبل كإدارة الأغذية والعقاقير حاليا بالتحقيق في إمكانية استخدام MRD كنقطة نهاية مركب بدلاً من البقاء على قيد الحياة عموما التدابير18.

Disclosures

وقدمت الكوكتيل الأجسام المضادة المستخدمة للتحقق الأنبوب الخلايا الجذعية في العديد من المعاهد المستقلة يرجى دينار بحريني. الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن فيما يتعلق بهذه المخطوطة.

Acknowledgments

دعمت هذه البحوث "سرطان المجتمع الهولندي" (الب 2013-6371) ومؤسسة اجبيرس فونك. ونشكر الفريق الهولندي مكافحة غسل الأموال-MRD للتعاون وإجراء مناقشات مثمرة للتحسين المستمر، والتوحيد القياسي لمكافحة غسل الأموال-.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FACS Canto II  BD Biosciences 338962
CD7 FITC  (50µg/ml) BD Biosciences 555360
CD2 FITC (Unknow) DAKO F076701
CD36 FITC (25µg/ml) Sanquin M1613
CD15 FITC (200 µg in 200 ml) BD Biosciences 332778
CD45RA FITC (50µg/ml) BD Biosciences 335039
CD56 PE (50µg/ml) BD Biosciences 345810
CD22 PE (12,5µg/ml) BD Biosciences 337899
CD14 PE  (50µg/ml) BD Biosciences 345785
CD133 PE (16,5µg/ml) Miltenyi Biotec 130-080-801 Will be replaced soon by Miltenyi for 130-113-108 (75µg/ml) and needs to be titrated
Clec12a PE (Unknow) BD Biosciences 562566
Tim-3 PE (100µg/ml) BD Biosciences 563422
CD7 PE (25µg/ml) BD Biosciences 555361
CD11b PE  (50µg/ml) BD Biosciences 333142
CD34 PERCP-CY5.5 (12,5 µg/ml) BD Biosciences 347222
CD123 PERCP-CY5.5 (25µg/ml) BD Biosciences 558714
CD117 PC7 (12,5µg/ml) Beckman Coulter B49221
CD33 PE-CY7 (25µg/ml) BD Biosciences 333952
CD19 APC (50µg/ml) BD Biosciences 345791
CD11b APC (50µg/ml) BD Biosciences 333143
CD33 APC (12,4µg/ml) BD Biosciences 345800
CD38 APC  (25µg/ml) BD Biosciences 345807
HLA-DR APC-H7  (50µg/ml) BD Biosciences 641411
CD44 APC-H7  (800µg/ml) BD Biosciences 560532
CD13 BV421 (Unknow) BD Biosciences 562596
CD34 BV421  (50µg/ml) BD Biosciences 562577
CD45 Krome Orange (100µg/ml) Beckman Coulter B36294
CD45 HV500c  (100µg/ml) BD Biosciences 655873
CST beads  BD Biosciences 655051
Pharm lysing solution BD Biosciences 555899
Multicolor CompBeads BD Biosciences 644204
FACSDiva software BD Biosciences 659523
Infinicyt  Cytognos CYT-INFINICYT-AOM
Rainbow Calibration Particles, 8 peaks, Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Tuerk solution Brocacef No longer available but can be purchades from different companies
Blank Calibration Particles Beads Spherotech BCP-100-5
Albuman 200g/l Sanquin GTIN8717185830910
Azide Acros Organics 190381000
ddH2O Water demineralized in our institute
10*PBS Lonza BE17-517Q
May Giemsa Grünwald Merck  1.01424.2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129, (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33, (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9, (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014, (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29, (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31, (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24, (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121, (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18, (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9, (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29, (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120, (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30, (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26, (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123, (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31, (7), 1482-1490 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics