Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antwoord criteria in acute myeloïde leukemie (AML) is onlangs hersteld, met de morfologische onderzoek gebruikt om te bepalen of de patiënten volledige verlossing (CR) hebben bereikt. Ongeveer zal de helft van de volwassen patiënten die meededen aan CR terugvallen binnen 12 maanden als gevolg van de uitgroei van residuele AML cellen in het beenmerg. De kwantificatie van deze resterende leukemie cellen, bekend als minimal of meetbare residuele ziekte (MRD), kunnen een robuuste biomarker voor de voorspelling van deze hervallen. Retrospectieve analyse van verschillende studies heeft bovendien aangetoond dat de aanwezigheid van MRD in het beenmerg van AML patiënten met slechte overleven correleert. Niet alleen is de totale leukemische bevolking, weerspiegeld door cellen herbergen een leukemie associated immuun-fenotype (LAIP), gekoppeld aan klinische resultaten, maar zo is de subpopulatie onvolwassen lage frequentie van leukemie stamcellen (LSC), die beide kunnen worden gecontroleerd door stroom cytometry MRD of MRD-achtige benaderingen. De beschikbaarheid van gevoelige tests waarmee detectie van residuele leukemie (stam) cellen op basis van specifieke ziekten of ziekte-geassocieerde functies (abnormale moleculaire merkers of afwijkende immunophenotypes) hebben drastisch verbeterde MRD beoordeling in AML. Echter, gezien de inherente heterogeniteit en de complexiteit van AML als een ziekte, methoden voor bemonstering van beenmerg en het uitvoeren van MRD en LSC analyse geharmoniseerd dienen te worden indien mogelijk. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerde methodologie voor voldoende beenmergaspiraat bemonstering, transport, verwerking voor optimale Multi-Color stroom cytometry beoordeling, en strategieën om te beoordelen MRD en LSC om hulp bij het therapeutische besluitvorming gating proeven voor AML patiënten.

Introduction

Acute myeloïde leukemie (AML) is dat een maligniteit van het beenmerg gekenmerkt door gebreken in het programma van de rijping, met abnormale verspreiding en accumulatie van myeloïde voorlopercellen, remming van de normale Haematopoiese, en uiteindelijk het beenmerg falen . De ziekte is zeer heterogene met betrekking tot de morfologie, immunophenotype, cytogenetica, moleculaire aberraties en gen expressie handtekeningen, alsmede behandeling reactie en behandeling resultaat1,2. Huidige management omvat inductie chemotherapie met het streven naar volledige verlossing (CR), gevolgd door na verlossing behandeling, die wordt grotendeels gestuurd door de resultaten van moleculaire cytogenetische en immunophenotypic bestudeert en bestaat uit een verschillende cursussen van aanvullende chemotherapie of (autologe of allogene) stamcel transplantatie3. Ondanks de hoge kwijtschelding tarieven na intensieve chemotherapie van maximaal 90%, 5-jaars overleving bij volwassenen slechts ongeveer 30% - 40%, voornamelijk als gevolg van de ontwikkeling van is relapses die zijn meestal resistent tegen chemotherapie en daardoor zeer moeilijk te behandelen. Resultaten bij kinderen is beter, hoewel ongeveer eenderde ook terugvallen. Daarom, vroegtijdige opsporing van dreigende instorting vult een onvervulde medische noodzaak en kan begeleiden na verlossing therapie4.

Residuele ziekte na therapie de som van alle diagnose en na diagnose resistentie mechanismen/factoren weerspiegelen kan; Vandaar de meting mogelijk prognostische en instrumentale voor de begeleiding van de behandeling. De mogelijkheid van defining resterende ziekte (voorheen minimale residuele ziekte en nu bedoeld als meetbare residuele ziekte of MRD) ver beneden de morfologische criterium van 5% blast cellen verandert het landschap van risico-classification. Op dit moment zijn de twee methoden die veelal gebruikt voor het opsporen van MRD stroom cytometry- en moleculaire gebaseerde, de laatste wordt beoordeeld door reverse-transcriptase (RT-qPCR) PCR5 of, hoewel in een vroeg stadium, door de volgende generatie sequencing (NGS). Veel studies bij volwassenen ook zoals in kinderen reeds aangetoond dat verschillende MRD benaderingen in AML zowel na inductie en consolidatie therapie6,7, en een nieuwe definitie van de ziekte last (sterke prognostische informatie verstrekken superieur aan morfologische CR) ontstaat nu8. Dit suggereert dat MRD beoordeeld door stroom en/of moleculaire technieken moeten worden, en in feite al steeds, standaard in elke klinische proef in AML.

Dit manuscript bespreekt de gedetailleerde stroom cytometry procedure voor het verkrijgen van een nauwkeurig en reproduceerbaar immunophenotypic karakterisering van MRD in beenmerg monsters, met inbegrip van de bemonstering voor het beenmerg en procedures voorafgaand aan stroom cytometry verwerking. De beschikbaarheid van goede kwaliteit beenmerg monsters op de diagnose en opvolging is cruciaal voor het succes van deze meting over klinische sites en klinische proeven. In feite, zijn deze vooraf analytische overwegingen ook van vitaal belang voor moleculaire (PCR en NGS) MRD benaderingen. Voor immunophenotypic-karakterisatie van MRD, worden aberrantly uitgedrukt markeringen gecombineerd met normale myeloïde en voorlopercellen markers, identificeren een leukemie-geassocieerde immunophenotype (LAIP)9. MRD meet de resultante van vele factoren die beïnvloeden van respons op therapie, zoals leukemie intrinsieke of verworven resistentie, farmacodynamica en kinetiek van therapie, immuun toezicht en compliance. MRD is daarom een zeer sterke na diagnose prognostische parameter klinische resultaten wanneer dichotomized op een niveau van de licht-donkerscheiding bepaald door analyse van de karakteristiek van de ontvanger-operationele (ROC) zijn gekoppeld. Voor onze volwassen AML cohort van de HOVON 42a studie, de licht-donkerscheiding niveau is ingesteld op 0,1% van LAIP positieve cellen/total witte bloedcellen. Met behulp van dit criterium voor het bepalen van de status van positieve versus negatieve MRD, kan een groep van patiënten worden geïdentificeerd die een beduidend slechter herval incidentie, en de algehele instorting-vrije overleving6 hebben. Daarnaast beschrijven we de meting van onrijpe, resistente leukemie cellen met functies van de cel van de stam-achtige (de cellen van de stam van de CD34 + CD38-leukemie, of LSC), die een sterke voorspeller van patiënten uitkomst10biedt. Samen LAIP en LSC benadert vorm de stroom cytometrische MRD aanpak. De LAIP benadering is geschikt voor ongeveer 90% van de patiënten, terwijl de LSC aanpak kan worden toegepast in ongeveer 80% van de patiënten. Samen meer dan 95% van de patiënten kan worden geëvalueerd voor één parameter of beide.

Tot slot, deze publicatie geeft een gedetailleerde operationele beschrijving om te beoordelen MRD door stroom cytometry. Dit omvat: 1) harmonisatie en/of standaardisatie van beenmerg bemonsteringsprocedures, 2) monster transport begeleiding 3) gedetailleerde beschrijving van de detectie leukemische cellen met FACS met behulp van verschillende antilichaam panelen met inbegrip van eencellige buis benaderingen te karakteriseren de LSC, 4) opzet van de FACS machines voor gestandaardiseerde metingen, 5) analytische programma's voor MRD metingen en 6) analytische programma's voor het Certificatieschema opsporen.

Wij streven ernaar om te laten zien van alle facetten van de procedure met inbegrip van de bereiding van de monsters, aangezien die zelden wordt besproken, hoewel het een belangrijke kwestie voor de kwaliteit van het uiteindelijke resultaat. Het beenmerg aspiratie en biopsie zijn klinische procedures gebruikt om te evalueren van de hematopoietische cellen in het beenmerg. Deze worden uitgevoerd samen met een complete blood count (CBC) en bloed-uitstrijkje. De optimale methode voor het beenmerg aspiratie is cruciaal voor de accurate diagnose en opvolging voor MRD meting. Daarnaast moet een succesvolle beenmergaspiraat genoeg cellen voor het uitvoeren van de LAIP en LSC flow analyse (ten minste 10 miljoen levensvatbare cellen) bevatten. Hier beschrijven we de methode voor het uitvoeren van een beenmerg aspiratie en voorzien in richtsnoeren, die in adequate cel bemonstering (en beperken de mogelijkheden voor hemodilution uitmonden moeten) die nodig zijn voor een nauwkeurige diagnose en aanvullend onderzoek. Deze vooraf analytische overwegingen zijn eveneens van vitaal belang voor moleculaire (PCR en NGS) MRD benaderingen. Alle exemplaren voor immunophenotyping moeten bij voorkeur binnen de 24 uur van collectie worden verwerkt. Hoewel niet aan te bevelen, kunnen beenmerg en perifeer bloedmonsters nog steeds worden verwerkt en geanalyseerd wanneer maximaal 72 uur bij kamertemperatuur bewaard. Bovendien moeten alle handelingen met het materiaal worden uitgevoerd onder steriele condities, zodat cryopreservatie van steriele cellen voor later onderzoek/kwaliteitsbeoordeling enz.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de code van het onderzoek en de ethische commissie van onderzoek van het VU medisch centrum.

1. het beenmerg aspiratie en sample voorbereiding

  1. Voorbereiding van de patiënt en materiële
    1. Vul één of twee 10 mL spuiten met 1% lidocaïne met behulp van een naald 16-gauge. Vervang de naald voor een 21-gauge naald.
    2. Doe twee druppels van 5% EDTA op een horlogeglas.
    3. Instellen van glas dia's (n = 15 met consistente patiënt nummering en datum) voor de voorbereidingen van het uitstrijkje.
    4. Plaats patiënt in positie van de laterale decubitus. Zoek de superieure posterieure iliac wervelkolom en Markeer met een pen.
      Opmerking: In het algemeen, de achterste superieure iliac wervelkolom is gelegen enerzijds breedte distale op de iliacale crest en enerzijds breedte zijdelings aan de middellijn. Bij vrouwtjes kunnen de werkelijke wervelkolom een beetje meer laterale, bij sommige mannen een beetje meer mediale.
    5. Desinfecteren van de huid met chloorhexidine 0,5-1% in ethanol uit het beoogde biopsie gebied uiterlijke in cirkels.
    6. Open het pak van steriele handschoenen, zetten de steriele handschoenen en vast van het pakket op tafel om een steriele veld te maken. Openen van het pakket met de naald aspiratie en plaats deze op het steriel veld.
    7. De huid en de subcutane weefsel en ten slotte het beenvlies infiltreren. Beheren op het beenvlies, de lidocaïne op zodanige wijze dat een gebied van 1 cm diameter heeft zijn verdoofd.
      Opmerking: Adequate toediening van lidocaïne aan het beenvlies is een van de belangrijkste factoren voor het comfort van de patiënt. Test of het beenvlies heeft voldoende is verdoofd door te tikken op de beoogde biopsie locatie met de geïntroduceerde naald en vragen als de patiënt pijn voelt. Van de nota: kinderen zijn volledig verdoofd tijdens de hele procedure.
    8. Houd de naald van de aspirate (15 Ga x 2,8") met het proximale eind in de palm en de wijsvinger tegen de zijkant van de metalen schacht van de naald in de buurt van de tip; deze positie geeft u beter controle.
    9. De naald met een roterende beweging introduceren (door snel wisselende pronating/supinating verkeer) door de huid naar de iliacale wervelkolom en breng de naald in contact met de achterste iliac wervelkolom.
    10. Dat wil zeggen zorgen naald wordt geïntroduceerd op de narcose gebied van het beenvlies; de patiënt moet alleen druk en geen pijn voelen. Als de patiënt pijn voelt, verplaatsen de naald of beheren van meer lidocaïne.
    11. Met behulp van zachte maar vastberaden druk, gaan de naald tijdens het draaien met een afwisselend met de klok mee-teller klok beweging. Entree in de holte van het beenmerg is over het algemeen herkend door verminderde weerstand.
    12. Verwijder de stilet uit de naald. Sluit een lege spuit van 10 mL aan op de naald.
    13. Negatieve druk uitoefenen door het intrekken van de zuiger van de spuit met een zachte trekken. Waarschuw de patiënt dat ze een kramp gevoel en pijn voelen kunnen wanneer beenmerg is wordt aanzuiging. Als niet genoeg botsplinters beenmerg worden vrijgegeven, moet een andere ambitie worden verricht met een snelle trekken. Meeste botsplinters zullen in de eerste 1-2 mL verkregen bij de eerste pull. Gecombineerd slechts 1-2 mL Voorkom verdunning van het monster.
      Opmerking: Verdunning zal resulteren in hemodilution en kan verwarren MRD resultaten).
    14. De spuit verwijderen en vervangen van de stilet in de naald aspiratie. Werpen deel van het beenmerg in een horlogeglas en de rest in een 8 mL-buis bedekt met heparine.
      Opmerking: Omkeren elke buis onmiddellijk na het plaatsen van het beenmerg-aspirate in de buis specimen om adequate antistolling. Het beenmerg coagulatie is vaak de oorzaak van ongepast materiaal. Extra beenmerg kan worden aanzuiging van dezelfde plek, maar de naald is bij voorkeur 5-10 mm gevorderd, voordat een nieuwe aspirate wordt genomen. Bij voorkeur moeten niet meer dan 2 trekt per invoeging niveau worden genomen. Zorg ervoor dat ter gelegenheid van de buizen met steeds meer vertegenwoordigt van het eerste, tweede en/of opeenvolgende trekt. Het is de gemeenschappelijke regel te gebruiken de eerste loting voor de meest relevante diagnostische analyse.
    15. U kunt ook intrekken van de naald van de plaats van de invoegpositie en het opnieuw in het beenmerg holte een paar millimeter afstand van de originele plaats van de invoegpositie en herhaal de procedure.
      Opmerking: Niet meer dan 1-2 mL per trekken, om belangrijke bloed verontreiniging te voorkomen gecombineerd.
    16. Zo vaak herhalen als materiaal nodig is. Verwijder de naald beenmerg wanneer voldoende materiaal voor de specifieke klinische studie protocol is aanzuiging.
      Opmerking: In geval van langzame of anders moeilijk beenmerg aspiraties het gebruik van injectienaalden die vooraf gespoeld met antistollingsmiddel waren nuttig kan zijn. In het geval van een droge kraan, een biopsie van de trephine die buiten de werkingssfeer van dit manuscript uit te voeren.
  2. Voorbereiding van uitstrijkjes voor morfologische onderzoek
    1. Voor optimale morfologische beoordeling, uitzoeken van botsplinters (bijvoorbeeld het gebruik van een plastic spatel) van de aspirate in de horloge-glas en leg ze op een glasplaatje.
    2. Voorzichtig plaats een glasplaatje boven de dia met het beenmerg en zachtjes schuif; Vermijd druk.
      Opmerking: Alleen in geval van zeer grote beenmerg botsplinters lichte druk kan worden uitgeoefend, te verminderen van de dikte van de verspreiding van de cel. De voordelen van de procedure van de hulp van een assistent die kan omgaan met de model-buizen. Nauwkeurige etikettering van de buisjes met de patiënt en aantal van de loting sequentiële beenmerg is cruciaal.
    3. Goed afdrogen van de dia, en vervolgens uit te voeren kan Giemsa Grünwald kleuring (zie tabel van materialen). Onderzoeken onder de lichte Microscoop voor morfologie (Zie Figuur 1).
      Opmerking: Figuur 1A blijkt de uitstrijkjes van gezond beenmerg, bestaande uit verschillende functionele celtypes terwijl figuur 1B een AML patiënt met overwegend leukemische ontploffing. Als u wilt beter definiëren de residuele leukemische last, hoeft immunophenotyping te worden uitgevoerd.

2. vervoer van materiaal voor verdere verwerking

  1. Bereiding van de monsters voor vervoer
    1. Om ervoor te zorgen dat het materiaal niet lekken zal en de buizen niet zal breken, zorg voor een juiste verpakking (Zie Figuur 2).
      Opmerking: Uit onze en anderen ervaringen de levensvatbaarheid van de cellen is best bewaard wanneer het beenmerg wordt bewaard bij kamertemperatuur. Voor het vervoer op lange termijn is dit best bereikt met behulp van een kamertemperatuur 'gel-pack' om hulp in stabiliteit van de temperatuur tijdens het vervoer.
    2. Label pakketten en het toevoegen van de juiste formulieren om verlies van het pakket, langdurige vervoer te voorkomen of het schakelen van patiënten.
      Opmerking: Dit moet ten minste bevatten: (formulier 1) patiëntgegevens. Dit moet het nummer van de studie en vaak de 'geboortedatum' bevatten. Essentieel voor de juiste verwerking van het materiaal na aankomst in het ontvangende laboratorium, is een duidelijke verklaring van de specifiek gevraagde laboratoriumanalyses (moleculaire diagnostiek, immunophenotyping, MRD etc.) op dit formulier. (Formulier 2) Adres en telefoon nummer van een contactpersoon, en wanneer nodig, documenten voor de douane. Voorkom verlies van pakketten in de mail, waarschuwt het verzendende laboratorium altijd de ontvangende lab dat een monster is verstuurd. Gebruik van "track and trace" wordt aanbevolen.
  2. Ontvangen van monsters van andere instituten
    1. Zorg ervoor dat de geschikte logistiek in plaats op het Instituut te ontvangen van het monster in het laboratorium, zodra het is afgeleverd aan het Instituut.
      Opmerking: Voor optimale logistieke organisatie bij voorkeur een centraal laboratorium vereist is, ontvangt die en verzamelt al het materiaal uit de lokale kliniek en externe ziekenhuizen. In het bijzonder, is het toekennen van protocollen voor distributie en duidelijke communicatie met de uitvoerende laboratoria essentieel.
    2. Na ontvangst van de monsters, opmerking nauwkeurig de juiste nummering in harde kopie vormen en een beveiligde database met belangrijke terreinen zoals MRD id-nummer, Trial specifieke id-nummer, registratienummer ziekenhuis, verzenden Instituut, datum van geboorte, materiaal type (beenmerg of perifere bloed), witte bloedcellen (WBC), datum van beenmerg aspiratie, datum van meting van het monster en eventuele opmerkingen die van belang voor de kwaliteit van de meting.
      Opmerking: Bij voorkeur deze database is ook uitgerust met aanvullende gegevens bevatten (of naar andere databases worden gekoppeld) van analyseresultaten, en verdere patiëntgegevens zoals follow-up gegevens.

3. flow Cytometer Setup

Opmerking: Deze sectie is gebaseerd op Euroflow instructies. 11

  1. Het instellen van fotomultiplicator (PMT) spanningen voor FCS SSC parameters en doel fluorescentie kanalen
    1. Voor de FCS-WS parameters de stroom cytometer opstarten en uitvoeren van de "Cytometer Setup en Tracking (CST)" uitvoeren op de cytometer van de stroom met CST kralen (zie tabel van materialen). Lyse van rode bloedcellen van een gezonde donor (beschreven in punt 4.1).
      1. Maak een nieuw experiment (In menu: Experiment, nieuwe experimenteren, selecteer lege experiment) met behulp van software van de fabrikant (zie tabel van materialen) met een Forward scatter (FSC) versus zijwaartse (SSC) stip scatterplot voor het instellen van de parameters FSC en WS. De naam van dit experiment FSC/SCC bet met de datum. De huidige instellingen van de cytometer voor het eerst gebruikt (Klik met de rechtermuisknop: "toepassing van de huidige CST"). Deze instellingen zijn gegenereerd met de CST prestaties controleren met behulp van CST-kalibratie kralen (zie tabel van materialen). FSC en SSC om te visualiseren de lymfocyten in "global experiment instellingen" aanpassen. Opmerking: in onze stroom cytometer deze zijn 285 V 400 V respectievelijk en. De "inschakelen compensatie" in afvinken: inspecteur/Instrument instellingen/compensatie.
      2. Om te beoordelen van de grootte van de cellen (FSC) en granulariteit (SSC) lysed start meten labelloze perifere bloedcellen door de functie "verwerven cellen". Poort van de lymfocyten en aanpassen/fine-tune FSC en SSC spanningen te bereiken de volgende gemiddelde streefwaarden voor de gated lymfocyten bevolking: FSC: 100.000 (bereik 95.000-105.000); SSC: 15.000 (bereik 13.000-17.000).
      3. Verwerven en registreren van gegevens door het meten van ten minste 10.000 gebeurtenissen. Controleer of het gemiddelde FSC en WS streefwaarden voor gated lymfocyten en opnieuw aanpassen indien nodig.
    2. Voor de oprichting van de fluorescentie doel gebruiken kanalen bet spanningen 8-piek regenboog kralen kalibratie deeltjes (zie tabel van materialen).
      1. Maak een nieuw experiment op de FACS voor 7-pieken. Maak een werkblad "Target gemiddelde TL intensiteit (MFI)" met alle nodige dot percelen (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammen (n = 8; een histogram voor elke fluorescentiedetector) en statistieken waaruit de verwijzing piekwaarden (MFI en variatiecoëfficiënt (CV)) voor elk kanaal van de fluorescentie.
      2. Bereid vers een oplossing met 1 druppel (± 60 µL) van regenboog parels in 1 mL dH2O. zachtjes vortex te mengen de kralen in oplossing.
      3. Gebruik de instellingen van de bet van de FSC/SSC spanningen van bovenaf en start meten van de fluorescentie van de regenboog parels met behulp van de functie "verwerven" (zonder opnemen) op "Laag" debiet met een drempel van 5.000. Gebruik de "rechthoekig gate button" naar gate de singlet kralen bevolking P1 in de FSC versus SSC dot plot. Poort van de 7th PEAK - bevolking P2 in de FITC versus PE dot plot.
      4. Blijven de verwerving van de 7-peaks Rainbow kraal schorsing en aanpassen/fine-tune bet spanningen in alle kanalen van de fluorescentie te bereiken MFI streefwaarden volgens de geannoteerde MFI doel kanalen zoals bepaald met de kralen.
      5. "Record" gegevens van ongeveer 10.000 gebeurtenissen te verzamelen en controleren van de MFI voor de 7th gebruiken piek kralen. Corrigeer de bet spanningen indien nodig. Eenmaal Target MFI waarden voor de 7th piek bereikt, record/overschrijven van het bestand voor de resultaatwaarden van de bet.
      6. De laatste bet waarden opslaan en de naam van het bestand bet Setup met de datum, die zal worden opgeslagen in de catalogus van de software van de fabrikant. Gebruik deze bet setup voor het verhelpen van de lekkage voor elke kleurstof fluorescentie.
  2. Fluorescentie compensatie-instellingen
    1. Label van een buis voor de onbevlekt controle en elke fluorescerende geconjugeerd antilichaam (zie tabel S1 voor de gebruikte fluorochromes). Pipetteer 100 µL van buffer in elke buis.
    2. Vortex de flacon van multicolor compensatie parels (zie tabel van materialen) grondig en voeg vervolgens 1 volledige druppel (± 60 µL) van deze parels aan elke buis.
      Opmerking: Vermijd druipen van de parels langs de zijkant van de buis terwijl ze aan elke buis toe te voegen. Dit kan leiden tot lage kraal concentratie en de resultaten van de matrix met compensatie kon beïnvloeden.
    3. Pipetteer het juiste volume berekend voor een test van fluorescerende-geconjugeerde antilichaam voldoende (die zou voldoende zijn om vlek 106 cellen) in de overeenkomstige buis en vortex grondig. Voeg geen antilichaam aan de buis onbevlekt controle. Incubeer gedurende 15 tot 30 min in het donker bij kamertemperatuur (RT).
    4. Voeg 4 mL was buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)/0.05% azide-0.1% menselijke serumalbumine (HSA) (zie tabel van materialen)) aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 300g voor 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet kraal door 0,2 mL was buffer toe te voegen aan elke buis. Vortex de buizen grondig.
    5. Open software van de analyse van de fabrikant (zie tabel van materialen) en maak een nieuw experiment (In menu: Experiment, nieuwe experimenteren, selecteer lege experiment) en hernoemen als compensatie bestand met de huidige datum.
    6. Ga naar "cytometer instellingen" en de instelling van de bet van punt 3.1. Zorg ervoor dat de drempel in FSC 5.000 is en de waarden van de compensatie van alle gebruikte fluorochromes nul zijn.
    7. Compensatie besturingselementen, met inbegrip van label-specifieke buizen, zo nodig maken. Zorg ervoor dat een onbevlekt besturingselement opnemen. Selecteer uit het menu: Experiment, compensatie Setup, compensatie-besturingselementen maken.
    8. De buis onbevlekt besturingselement laden en aanpassen van de P1 poort rond de singlet kraal bevolking en zorgt ervoor dat de P1 poort alleen singlet kralen bevat.
    9. Met de rechtermuisknop op de P1 poort, en selecteer 'Toepassen op alle compensatie Controls'. Registratie van de gegevens voor alle buizen van de enkele gelabelde fluorescentie. Controleer of dat P2 poort de positieve bevolking op elke fluorescentie-histogram omvat. Indien nodig aanpassen van de poort.
    10. De compensatie te berekenen. Selecteer Experiment, compensatie Setup, berekenen vergoeding.
    11. Als de berekening van de compensatie niet lukt, wordt er een foutbericht weergegeven. De nodige aanpassingen en herberekenen. Bij de berekening van de compensatie gelukt is, verschijnt een venster gevraagd naar de naam voor de setup van de compensatie.
    12. Voer een naam in (bijvoorbeeld YY-MM-DD 8 kleur instellingen) en klikt u op koppelen en opslaan. De compensatie setup zal ook de compensatie setup catalogus worden opgeslagen.
      Opmerking: Dezelfde instellingen kunnen worden gebruikt voor alle experimenten met behulp van de dezelfde fluorophores.

4. Stroom Cytometry beoordeling (LAIP en LSC)

Opmerking: Hier beschrijven we de bulk lysis van de procedure voor de kleuring, die het mogelijk maakt om een gewenste concentratie van WBC vlek. Meeste MRD protocollen gebruikt deze aanpak, hoewel sommige met succes andere opties gebruikt heb zoals kleuring voor lysis. Hele beenmerg kleuring voor lysis minimaliseert preferentiële cel verlies12, maar heeft het nadeel van onvoorspelbare cellen met een te lage concentraties.

  1. Lysis van de bulk van cellen
    Opmerking: Houd de unmanipulated monsters horizontale op RT, wanneer stroom cytrometric overname kan niet worden uitgevoerd dezelfde dag om te beginnen de hele procedure de volgende dag.
    1. Resuspendeer aan homogeniteit vertonen beenmerg monster door het monster meerdere malen omkeren. Bepaal de concentratie van beenmergcellen (witte bloedcellen (WBC)) met behulp van een cel tellen kamer met cel Tuerk kleurstofoplossing (zie tabel van materialen).
    2. Pipetteer het benodigde volume van het beenmerg in een aparte 15 mL-buis. Het bedrag van de cellen is afhankelijk van het aantal afzonderlijke kleuring buizen; gebruik ongeveer 2 x 106 witte bloedcellen voor de LAIP metingen en 8 x 106 witte bloedcellen voor meting van de LSC buis voor een kleuring (één buis).
    3. Lyse van rode bloedcellen door lysing oplossing toe te voegen (zie tabel van materialen). Vereiste hoeveelheid lysing oplossing moet 10 maal het volume van de celsuspensie.
    4. Meng voorzichtig, door inversie en incubeer gedurende 10 min op RT. Centrifugeer gedurende 7 min 800g bij RT. Discard het supernatant (bijv. met een vacuümpomp of een pipet van Pasteur). Resuspendeer de pellet cel in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)/0.05% azide-0.1% menselijke serumalbumine (HSA) (zie tabel van materialen) op RT. gebruik het maximale volume van de buis.
    5. Centrifugeer gedurende 7 min 800g bij RT. Verwijder het supernatant (bijv. met een vacuümpomp of een pipet van Pasteur). Resuspendeer de pellet cel in PBS/0.05% azide-0.1% HSA tot een concentratie van de cel van 100 x 106 WBC/mL, en verdeel over het aantal beoogde buisjes.
  2. Kleuring van cellen voor stroom cytometry
    1. Pipetteer monoklonaal antilichaam (MoAb) cocktail oplossing mengen in de gewenste cel van de fluorescentie-geactiveerde sorter (FACS) buizen en incubeer met het beenmerg lysed cellen gedurende 15 min. in het donker.
      Opmerking: Dit is zeer belangrijk wanneer tandem-kleurstoffen worden gebruikt. Zie bijvoorbeeld de mengelingen van de panelen bij die gebruikt worden in ons laboratorium (tabel S1).
    2. Wash de cellen met 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% heeft. De cellen gedurende 5 minuten bij 400gcentrifugeren. Het supernatant (bijv. met een vacuümpomp of een pipet van Pasteur) en de resuspendeer de pellet cel in 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA te negeren.
    3. Voor de meting van de LSC: resuspendeer de pellet cel in 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA en voeg 4 µL van lege parels (b.v. Spherotech, zie tabel van materialen) gebruiken als negatieve controle bevolking in de analyse.
    4. Open de MRD of LSC experiment lay-out op de FACS (zie tabel van materialen) en maatregel voor MRD ten minste 100.000 WBC gated gebeurtenissen voor meting van de patiënt monsters AML bij diagnose en 1 X 106 WBC voor AML monsters bij follow-up. Experimenten maatregel voor de LSC ten minste 4 x 106 WBC zowel bij de diagnose en opvolging voor een betrouwbare LSC resultaat.
    5. Sla de gegevens met behulp van een gestandaardiseerde juiste bestandsnaam voor de analyse van de resultaten. Maak een inventaris van de verschillende gemeten markers op de AML-cellen en op de AML stamcellen (positief, negatief, over/onder expressie) en slaat deze gegevens op in het lab dagboek.
    6. In het geval er geen diagnose LAIP beschikbaar, meten alle 4 buizen bij follow-up om ervoor te zorgen dat elk mogelijk meetbare LAIP in een verschillende-van-normale benadering kan worden geïdentificeerd.
    7. Kies de meest betrouwbare LAIP(s)-13 op diagnose vastgesteld en het verwerven van zo vele evenementen mogelijk, maar > min. aantallen gedefinieerd.

5. identificatie van leukemie verbonden Immuno-fenotypes (LAIP): Analyses van verschillende cel populaties

Opmerking: FCS bestanden kunnen worden geanalyseerd met verschillende softwareprogramma voor optimale visualisatie van de andere cel populaties (zie tabel van materialen).

  1. White blood cell bevolking
    1. Poort van de CD45 positieve cellen en de levensvatbare verschijnen cellen, weglaten van lage FSC (niet-levensvatbare cellen, erythroid cellen) binnen de FSC/SSC plot; Deze bevatten de WBC (figuur 3Aik). Toon de WBC en gebruik een van de primitieve markers (bijvoorbeeld. CD34; Figuur 3Aii) om te helpen om na te gaan van het definitieve standpunt van de ontploffing in de CD45dim gebied (figuur 3Aiii).
    2. Poort van de CD45dim cellen en terug de poort van de cellen in de FSC/SSC-plot (figuur 3Bik). Verwijder de CD34 poort (figuur 3Bii) terwijl de rapportage van de cellen van de % in deze poort als % ontploffing in uw structuur van de bevolking in het programma. Toon de ontploffingen in een SSC/CD34 plot en poort van de positieve cellen van CD34 (Figure3Biii).
  2. Lymfocyten
    1. Lymfocyten gebruiken als een interne controle: myeloïde populaties als een negatieve controle en lymfoïde populaties als positieve controle.
    2. Starten vanuit de bevolking van de witte bloedcel (figuur 4A). Gate lymfocyten als de CD45hoge/SSClage bevolking (figuur 4B).
    3. Zorg ervoor dat er geen myeloïde cellen in de poort met behulp van CD34, CD117, CD13 of CD33 en poort voor de CD13 negatief/CD33 negatieve cellen (Figuur 4C-E). Bel me over deze populatie 'lymfocyten' de bevolking boom (figuur 4F).
  3. LAIP tot diagnose
    1. Poort van de ontploffingen en vervolgens de CD34 positieve cellen in een SSC/CD34 plot en noemen deze 'primitieve marker' in de structuur van de bevolking.
    2. De primitieve cellen, in dit geval CD34 positief, en de lymfocyten in een nieuwe plot plot met een lymfoïde marker (CD7) tegen een myeloïde marker (CD33). Poort van de afwijkende bevolking (Zie voor richtlijnen aanvullende bestand 1) en 'LAIP positieve' te noemen in de structuur van de bevolking.
      Opmerking: De finale gekozen LAIP is gerapporteerd als % LAIP op de bevolking van de ontploffing. De gevoeligheid, specificiteit en stabiliteit van de LAIPs kunnen alleen door personeel met ruime ervaring in MRD metingen worden vastgesteld. Het totaal van deze parameters bepaalt de kwaliteit van de LAIP. Voorbeelden van vier verschillende LAIP evaluaties tot diagnose zijn afgebeeld in Figuur 5 A-D.
    3. De expressie van LAIPs (% op ontploffingen) bepalen en bewaren van deze gegevens in een database of excel-bestand.
    4. Maak rapporten van de FACS analyses en de noten van de LAIPs die dienen te worden aangewend ter MRD metingen.
      Opmerking: De definitie van LAIPs is toegestaan in een team van deskundigen omdat het is een wezenlijk kenmerk voor nauwkeurige metingen van de MRD op follow up.
  4. MRD bij follow-up
    1. Poort van de ontploffing, zoals beschreven in punt 5.1, maar afhankelijk van het tijdstip na therapie; juiste beoordeling van deze poort kan worden uitdagende. Focus op het fenotype LAIP dat werd opgericht bij de diagnose en poort van de jonge bevolking.
    2. Zoals beschreven in punt 5.1. vind de juiste blast poort op basis van de gedefinieerde aberrancy en zich bewust zijn van het regenereren van beenmerg en normale expressies om hen uit gate
    3. Herhaal hetzelfde gating strategie helemaal follow-up punten en MRD LAIP cellen in de hele witte bloedcel bevolking in procenten te bepalen. Zie bijvoorbeeld figuur 6A en 6B.
    4. Verslag MRD positiviteit wanneer de gewichtspercenten MRD ≥ 0,1% van de witte bloedcellen. Afdrukken van geanalyseerde gegevens in een standaardindeling te bespreken wekelijks met het team MRD. Registreer de resultaten nadat overeenstemming is bereikt. Laat de resultaten door de toezichthouder worden toegestaan voordat de resultaten naar de clinici communiceren.

6. analyse van de stam cel MRD (LSC één buis)14

  1. Analyses van de LSC bij de diagnose en opvolging
    1. Poort de blast cellen zoals beschreven in paragraaf 5.1.
    2. Gate als potentiële negatieve controle voor CD38-, erytrocyten-fractie (d.w.z. resterende rode bloedcellen na lysis, als SSClaag/FSClaag en CD45negatievegekenmerkt). Indien nodig, kunnen dode cellen en cel fragmenten worden uitgesloten door een extra poort in dit perceel.
    3. Bepalen binnen de leukemische blast-poort de subpopulatie met expressie van CD34. Selecteer binnen deze populatie de CD34+ CD38- cellen (gebruiken als cut-off: bovenste grens van de parels van de lege kalibratie voor drempel bepaling (zie tabel van materialen), de rode-breuk of gebruik 103 als cut-off punt). Bel deze populatie 'CD38lage progenitoren' (Figuur 7).
      Opmerking: Zie aanvullende bestand 1 voor meer informatie over de instelling van de niveaus voor de CD38-cut-off.
    4. Bepalen binnendeze dunbevolkte CD38 de werkelijke CD34 + CD38zeer lage stamcel bevolking, met behulp van de mediaan van de rode breuk, de onderrand van de lege kalibratie kralen of kies 102 als cut-off punt (Figuur 7 ). Zie aanvullende bestand 1 voor meer informatie over het instellen van de niveaus voor de CD38-cut-off.
    5. Binnen beide populaties, gate de leukemische cellen van de stam vs. de normale hematopoietische stamcellen (LSC vs HSC) door het analyseren van iedere leukemische markeerdraad geboden in het deelvenster (dat wil zeggen CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 en CD56 all-in-PE), CD123, CD33 en CD44).
    6. Plot stamcel marker van belang ten opzichte van de andere markeerdraad van de cel van de stam te vergelijken positiviteit/negativiteit met positiviteit/negativiteit van andere markeringen en te fine-tunen van LSC versus HSC frequentie.
    7. Verslag van het percentage van de ontploffingen van de onrijpe lymfocyten, CD34 + cellen. Lijst van alle afzonderlijke markeringen, het totale aantal CD38lage en CD38verylow en het aantal CD38lage en CD38verylow die marker positieve (en dus neoplastische).
    8. Selecteer voor de marker die best onderscheidt normale hematopoietische stamcellen vs. leukemische cellen van de stam voor nadere analyse. Bereken het percentage van de LSC en HSC als percentage van totale WBC.
      Opmerking: Een percentage van de LSC van ≥ 0.004 is gerapporteerd als LSC positieve op diagnose, terwijl de licht-donkerscheiding zich 0,0001% bij follow-up. Afwijkende cellen van de stam gating in follow-up monsters is vergelijkbaar met analyse zoals bij diagnose, cel nummers in de populaties van de cel van de stam kan echter zeer klein. Vandaar de noodzaak van het verwerven van voldoende gebeurtenissen.

Representative Results

In 90% van de patiënten van de AML kan ten minste één LAIP worden geïdentificeerd. Oog op het genereren van de nauwkeurige percentages van LAIP + cellen van de primitieve blast cellen in diagnose, de juiste instelling voor de poort van de ontploffing is cruciaal en moet verificatie zoals gevisualiseerde in Figuur 3. Een voorbeeld van elke patiënt herbergen van een bepaald type aberrancy op de CD34 + primitieve cellen is gevisualiseerd in Figuur 5. Voor meting van MRD op follow-up, de eerder gedefinieerde LAIP + cellen zijn omheinde en gedefinieerd als percentage van LAIP + cellen van de WBC. Vandaar is de instelling van deze poort cruciaal om de juiste MRD resultaten te bereiken. Figuur 6 toont een patiënt die in volledige verlossing blijft en een patiënt die relapses na MRD positieve resultaten (≥ 0,1%) na de tweede cyclus van inductie therapie.

Het huidige protocol is alleen geschikt om te definiëren van stamcellen in CD34 + cellen, sinds grondige karakterisering van dit compartiment is gebleken dat de CD38-bevolking de meest potente cel van de stam als breuk herbergt. Om te scheiden van de LSC van de HSC binnen deze fractie, worden extra markeringen gebruikt. Vaakst geselecteerde markeringen te onderscheiden van de LSC zijn CD45RA en het kanaal van de combi 6 specifieke markers van de LSC aangeduid met PE herbergen. Gebaseerd op verdere klinische evaluaties, een niveau van de licht-donkerscheiding van ≥ 0.004% werd gedefinieerd als LSC-positieve en werd geassocieerd met slechtere overleving bij diagnose terwijl een niveau van de licht-donkerscheiding van 0,0001% werd gebruikt op follw-up10.

Figure 1
Figuur 1 : Het beenmerg uitstrijkje. A) gezonde donor en B) AML patiënt (FAB 5 subtype). Giemsa-kleuring vertoond op 100 x vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Corrigeren van verpakkingsmateriaal voor biologische vloeistoffen. Meer informatie over de regels en voorschriften voor het vervoer van biologische vloeistoffen vindt u op de website15 van de Centers for Disease Control and Prevention. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Strategie voor het definiëren van blast cellen gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + ontploffing.

Figure 4
Figuur 4 : Gating lymfocyten. A) blauwe cellen zijn WBC aangetoond in FSC/SSC perceel, B) groene cellen lymfocyten gekenmerkt door CD45hoge/SSClage, C) voorbeelden van negativiteit voor CD34, D) negativiteit voor CD117 en E) negativiteit voor CD13, F) de verschillende soorten cellen worden weergegeven in een overzicht bevolking boom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : LAIPs bij AML diagnose. A) LAIP gebaseerd op grensoverschrijdende lineage aberrancy (CD7 op CD33 waarin cellen), B) LAIP gebaseerd op asynchrone differentiatie (CD11b op CD13 waarin cellen), C) LAIP gebaseerd op overexpressie in vergelijking met normale cellen (CD34zeer hoog op CD13 uiten van cellen), D). LAIP gebaseerd op underexpression in vergelijking met normale cellen (HLA-DRlaag op CD33 uiting van cellen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : LAIP gevolgd tijdens therapie. A) LAIP definitie tot diagnose (CD34 +/ CD13 +/ CD33-) en verlies van LAIP tijdens de follow-up bij een patiënt die bleef in continue volledige verlossing, B) LAIP definitie tot diagnose (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) en persistentie van LAIP tijdens de follow-up bij een patiënt die recidiverende. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Stamcel gating. A) Gating van de verschillende CD34 +/ CD38 populaties gebaseerd op parels (CD38lage is onder de bovenste grens van de parels, terwijl CD38zeer laag worden gedefinieerd als het ware negatieve cellen vertegenwoordigt de LSC en bevinden zich onder de mediaan van de kralen), B) twee voorbeelden van patiënten met onderscheid tussen HSC en LSC bij follow-up op basis van CD45RA,neg en CD45RApos expressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1. Klik hier voor downoad dit bestand.

Aanvullende bestand 2. Klik hier voor downoad dit bestand.

Aanvullende bestand 3. Klik hier voor downoad dit bestand.

Discussion

Voldoende gegevens zijn beschikbaar die bewijzen voor MRD positiviteit wordt geassocieerd met slechte overleven, en daarom MRD beoordeling geduldige resultaten kan verbeteren door extra prognostische informatie waarop klinische beslissingen kunnen worden genomen. Een consistente en geharmoniseerde methode voor immuno-fenotypische beoordelingvan MRD is dus essentieel om uiteindelijk patiënt therapie. Dit is ook belangrijk bij het vergelijken van klinische studies in verschillende klinische sites, en kan uiteindelijk helpen in de klinische beslissing maken en serveren als een surrogaat klinisch eindpunt voor algehele overleving. De notie dat solide richtsnoeren voor nauwkeurige en consistente MRD metingen zijn gerechtvaardigd heeft geleid tot een gezamenlijke actie van het Europese netwerk voor leukemie (ELN) aan de richtlijnen van de stand van de techniek van het ontwerp. Dit uitgebreide document gepubliceerd eind-2017 zal worden, en zullen instrumentale voor vele studiegroepen en laboratoria vooruit.

Kritische stappen binnen het protocol

Een belangrijke en vaak onderbelicht aspect van MRD analyse is de impact van monster kwaliteit op de nauwkeurige bepaling van MRD. Dit is duidelijker wanneer materiaal worden vervoerd naar andere instituten in wereldwijde klinische tests moet, de extra operationele overwegingen die moeten worden genomen in deze instelling rekening gegeven. Om het risico van het vermengen van patiënt is informatie en tijdige levering van de monsters voldoende administratie cruciaal. Nogmaals, in dit stadium van het vervoer de juiste vormen en/of invoer in elektronische ziekenhuissystemen met duidelijke opdrachten van de gevraagde analyse is vereist. Overwegende het stadium therapie MRD bemonstering is ook cruciaal omdat het relevant kan zijn voor klinische besluitvorming (bijvoorbeeld na de tweede loop van de therapie) en moet daarom duidelijk worden omschreven. Het gebruik van mock gegevens (zoals bijvoorbeeld 1 januari per geboortejaar) verhoogt het risico van het vermengen van patiënten of analyses. Indien vereist door de wet, moet een alternatieve geanonimiseerde manier van identificatie worden gebruikt.

Alle exemplaren voor immunophenotyping moeten bij voorkeur binnen de 24 uur van collectie worden verwerkt. Hoewel niet aan te bevelen, kunnen beenmerg en perifeer bloedmonsters nog steeds worden verwerkt en geanalyseerd wanneer maximaal 72 uur bij kamertemperatuur bewaard. Daarnaast alle handlings met het materiaal kunnen best worden uitgevoerd onder steriele condities, zodat verdere cryopreservatie van cellen in de (lokale) biobanken relevant blijft: veel klinische studies hebben aanvullende analyses ter verdere onderzoeken leukemie cellen met betrekking tot moleculaire, immuno-fenotypische en functionele functies op een later tijdstip moet worden uitgevoerd. Details van biobanking zijn echter niet binnen de werkingssfeer van dit manuscript.

Met behulp van MRD als een diagnostisch hulpprogramma impliceert dat het een erkend laboratorium, niet alleen voor stroom cytometry, maar ook met betrekking tot de kwaliteitscontrole van MRD beoordeling moet. Hiervoor kunnen distribueren monsters aan specifieke referentielaboratoria of (her) analyseren van stroom bestanden met de MRD metingen door verwijzing teams.

Dit artikel beschrijft de belangrijkste acties uit het beenmerg aspirate collectie voor bepaling van MRD in klinische monsters - een volledig team van deskundigen met specifieke taken, verantwoordelijkheden, en met frequente mededeling vereisen voor effectief karakterisering en analyse. Aangezien elke taak cruciaal voor de procedure is, is het aanbevolen om het hebben van geluid logistiek met inbegrip van de protocollen bij elke laboratorium en voldoende personeel van de back-up die speciaal zijn opgeleid voor de taak. Bovendien, aangezien er zijn enkele relatief subjectieve stappen in een deel van de procedures (met name LAIP en LSC aberrant marker identificatie), is het essentieel hebben de discussies over het eindresultaat door het team, en het definitieve verslag gemachtigd door een team van toezichthouders. Huidige inspanningen zijn het nastreven van ontwikkeling van software die u zullen helpen de (LAIP en LSC) MRD analyse te standaardiseren.

Wijziging en probleemoplossing

Elk lab kan een eigen set van antilichamen die kan worden gebruikt voor het definiëren van de verschillende subpopulaties, hoewel met een gestandaardiseerde ruggengraat van markeringen essentieel voor vergelijkbare resultaten, is zoals uiteengezet in de richtsnoeren van de stand van de techniek ELN voor MRD metingen document hebben genoemde. Ongeacht de gekozen markers, er zijn enkele problemen die kunnen bemoeilijken de analyse van de resultaten en moeten in aanmerking worden genomen.

Beperkingen van de techniek

De identificatie van LAIP en LSC aberrant marker-expressie is eerst beoordeeld op de diagnose en trendmatige (tijdens en na de therapie) voor nauwkeurige karakterisering van het fenotype MRD. Terwijl meer dan 95% van de patiënten kan worden geëvalueerd via LAIP of LSC (of beide), nog sommige patiënten hebben geen gedefinieerde LAIPs of geen CD34 + CD38-LSCs presenteren met CD34 negatieve ontploffingen, of hebben een ontbrekende diagnose monster. In deze gevallen is het nog de moeite waard om te proberen en MRD meten met een panel van antilichamen zo breed als het aantal beschikbare cellen mogelijk maakt en selecteer vervolgens het meest betrouwbare (geven de sterkste onderscheid van leukemische cellen) LAIP. Gezien het feit dat een deel van de patiënten die uiteindelijk terugvallen niet volledig lijken op de diagnose immunophenotype, als gevolg van de heterogeniteit van AML ziekte, hoe dan ook een brede panel van antilichamen bij MRD meten wordt aanbevolen. De verschuivingen van deze immunophenotypic omvatten blast cellen en LSCs en is aangetoond dat het optreden tijdens therapie16 en de measureable ziekte kan worden gebaseerd op deze zogenaamde komende bevolking. Op dit moment echter, is niet vastgesteld of alle immunophenotypic subpopulatie tot ziekte herval leiden zal, en is daarom niet gebruikelijk om te rapporteren MRD op maat-therapie op basis van deze cellen in klinische proeven. Het is belangrijk op te merken dat het risico van ontbrekende LSC als gevolg van verschuivingen van de bevolking wordt verminderd door de aanpak van de ene buis waarin de belangrijkste bepalende aberrancy-markers in een stroom cytometry (PE) kanaal14 zijn.

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden

De in dit protocol beschreven methode is afhankelijk van de definitie van een of meer LAIPs, welke cellen worden gevolgd tijdens therapie. Een nadeel van deze methode is dat het heeft onlangs aangetoond dat LAIP tijdens de therapie veranderen kunnen. Op deze manier die sommige aanstaande populaties met verschillende afwijkende markers kunnen worden gemist. Om te omzeilen dit, zou het beste zijn voor het meten van alle afwijkende markeerders in plaats van alleen die gevonden op diagnose. Dit zou vervolgens zijn vergelijkbaar met de "verschillend van normale" aanpak die wordt gebruikt door verschillende laboratoria17.

Toekomstige toepassingen

MRD heeft onlangs, extra aandacht voor nieuwe klinische proefopzet gekregen. In het tijdperk van gespecialiseerde behandelingsopties en gerichte medicamenteuze therapie, het gebruik van MRD als resultaat maatregel zal verminderen de tijd die nodig is om de klinische werkzaamheid van nieuwe behandelingen, uiteindelijk zodat snellere invoering van dringend therapeutische opties in de kliniek. Het belang van passende logistieke en praktische uitvoering van een geharmoniseerde MRD beoordeling zijn cruciaal voor toekomstige AML behandeling succes zoals de FDA onderzoekt momenteel de haalbaarheid van het gebruik van MRD als het eindpunt van een surrogaat in plaats van de totale overleving meet18.

Disclosures

De antilichaam-cocktails gebruikt voor de validatie van de stamcel buis in verschillende onafhankelijke instituten werden beschikbaar gesteld door BD. De auteurs hebben niets te vermelden in verband met dit manuscript.

Acknowledgments

Dit onderzoek heeft al ondersteund door Nederlandse Cancer Society (ALPE 2013-6371) en Egbers foundation voor VONK. We danken de Nederlandse AML-MRD-werkgroep voor de samenwerking en vruchtbare discussies voor continue verbetering en standaardisatie van AML-MRD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FACS Canto II  BD Biosciences 338962
CD7 FITC  (50µg/ml) BD Biosciences 555360
CD2 FITC (Unknow) DAKO F076701
CD36 FITC (25µg/ml) Sanquin M1613
CD15 FITC (200 µg in 200 ml) BD Biosciences 332778
CD45RA FITC (50µg/ml) BD Biosciences 335039
CD56 PE (50µg/ml) BD Biosciences 345810
CD22 PE (12,5µg/ml) BD Biosciences 337899
CD14 PE  (50µg/ml) BD Biosciences 345785
CD133 PE (16,5µg/ml) Miltenyi Biotec 130-080-801 Will be replaced soon by Miltenyi for 130-113-108 (75µg/ml) and needs to be titrated
Clec12a PE (Unknow) BD Biosciences 562566
Tim-3 PE (100µg/ml) BD Biosciences 563422
CD7 PE (25µg/ml) BD Biosciences 555361
CD11b PE  (50µg/ml) BD Biosciences 333142
CD34 PERCP-CY5.5 (12,5 µg/ml) BD Biosciences 347222
CD123 PERCP-CY5.5 (25µg/ml) BD Biosciences 558714
CD117 PC7 (12,5µg/ml) Beckman Coulter B49221
CD33 PE-CY7 (25µg/ml) BD Biosciences 333952
CD19 APC (50µg/ml) BD Biosciences 345791
CD11b APC (50µg/ml) BD Biosciences 333143
CD33 APC (12,4µg/ml) BD Biosciences 345800
CD38 APC  (25µg/ml) BD Biosciences 345807
HLA-DR APC-H7  (50µg/ml) BD Biosciences 641411
CD44 APC-H7  (800µg/ml) BD Biosciences 560532
CD13 BV421 (Unknow) BD Biosciences 562596
CD34 BV421  (50µg/ml) BD Biosciences 562577
CD45 Krome Orange (100µg/ml) Beckman Coulter B36294
CD45 HV500c  (100µg/ml) BD Biosciences 655873
CST beads  BD Biosciences 655051
Pharm lysing solution BD Biosciences 555899
Multicolor CompBeads BD Biosciences 644204
FACSDiva software BD Biosciences 659523
Infinicyt  Cytognos CYT-INFINICYT-AOM
Rainbow Calibration Particles, 8 peaks, Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Tuerk solution Brocacef No longer available but can be purchades from different companies
Blank Calibration Particles Beads Spherotech BCP-100-5
Albuman 200g/l Sanquin GTIN8717185830910
Azide Acros Organics 190381000
ddH2O Water demineralized in our institute
10*PBS Lonza BE17-517Q
May Giemsa Grünwald Merck  1.01424.2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129, (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33, (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9, (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014, (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29, (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31, (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24, (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121, (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18, (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9, (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29, (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120, (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30, (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26, (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123, (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31, (7), 1482-1490 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics