En alternativ kultur metode å opprettholde Genomic Hypomethylation av mus embryonale stamceller MEK hemmer PD0325901 og Vitamin C

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskrevet nærmere to kjemisk-baserte protokoller for dyrking mus embryonale stamceller. Denne nye metoden benytter synergistisk mekanismer for å fremme Tet-mediert oksidasjon (av vitamin C) og repressing de novo syntese av 5-methylcytosine (av PD0325901) for å opprettholde DNA hypomethylation og pluripotency av mus embryonale stamceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Embryonale stamceller (ES) har potensial til å skille ut noen av de tre bakterie lag (endoderm, mesoderm eller ektoderm), og kan generere mange linjene for regenerativ medisin. ES celle kultur i vitro har lenge vært gjenstand for omfattende bekymringer. Klassisk, musen ES celler blir vedlikeholdt i serum og leukemi hemmende faktor (LIF)-som inneholder mediet. Men under serum/LIF forhold, celler Vis heterogenitet morfologi og profilen for expression av pluripotency-relaterte gener, og det meste i en metastable tilstand. Videre kulturperler ES celler viser globale hypermethylation, men naiv ES celler av indre cellemasse (ICM) og primordial bakterie celler (PGCs) er i en tilstand av globale hypomethylation. Hypomethylated staten ICM og PGCs er nært forbundet med deres pluripotency. For å forbedre musen ES celle kultur metoder, har vi nylig utviklet en ny metode basert på selektivt kombinert utnyttelse av to små molekyl forbindelser å vedlikeholde DNA hypomethylated og pluripotent statusen. Her presenterer vi som co behandling vitamin c (Vc) og PD0325901 kan slette ca 90% av 5-methylcytosine (5mC) 5 dager i musen ES celler. Generert 5mC innholdet er sammenlignbar med i PGCs. Mekanistisk undersøkelsen viser at PD0325901 opp regulerer Prdm14 uttrykk for å undertrykke Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) og Dnmt3l (kofaktor av Dnmt3b), ved å redusere de novo 5mC syntese. VC forenkler konvertering av 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) katalysert hovedsakelig av Tet1 og Tet2, som indikerer involvering av både passive og aktive DNA demethylations. Videre under Vc/PD0325901 forhold Vis musen ES celler homogen morfologi og pluripotent tilstand. Kollektivt, foreslår vi en roman og kjemisk-synergy kultur metode for å oppnå DNA hypomethylation og vedlikehold av pluripotency i musen ES celler. Små molekyl kjemisk-avhengige metoden overvinner de store manglene av serum kultur og holder løftet om å generere homogen ES celler for ytterligere kliniske applikasjoner og undersøkelser.

Introduction

ES celler er stammer fra ICM av blastocysten1. Cellene i en pluripotency tilstand og kan danne alle somatiske linjene og germline celler2. Etablering av ES celler gir muligheten til å undersøke utvikling prosesser i vitro og kan generere celler medisinsk relevansen for regenerativ medisin basert på deres pluripotency3.

To grupper seminally etablert musen ES cellelinjer i 1981 og når cellene stammer fra tidlig musen embryoet ble kultivert i fosterets bovin serum (FBS)-inneholder medium med mus embryonale fibroblaster (MEFs) som mater lag1,4 . MEFs ble deaktivert mitotically og ble pre dyrket i retter før dyrking ES celler. MEFs gir støtte for mus ES celle vedlegg og produsere vekstfaktorer for å fremme forplantning og undertrykke differensiering5, mens FBS tilbyr viktige trophic faktorer og hormonene celle spredning. Studier viste at LIF produsert av materen celler var viktige cytokin for selvtillit fornyelse og vedlikehold av pluripotency i musen ES celler og tillegg av LIF til medium kan erstatte mater celler6. Foreløpig er opprettholdelse av musen ES celler i FBS/LIF medium på matere fortsatt standard metode vedtatt av mange forskere. Men oppstår enkelte problemer med denne klassiske kultur. Først mater celler skiller overflødig og ukontrollert faktorer og kan forårsake patogene forurensning7. Å unngå denne forstyrrelser, belegg overflaten av retter med gelatin og tillegg av LIF i serum inneholder medium er alternative metoder for å vedlikeholde musen ES celler uten mater lag celler. I tillegg utstilling musen ES celler dyrket under serum/LIF forhold morfologiske heterogenitet i celle populasjoner og selv i hvilket uttrykk pluripotency-relaterte faktorer8. Nyere studier tyder på at serum/LIF tilfeller pluripotency-relaterte kjernen transkripsjonsfaktorer (inkludert SOX2, Nanog og OCT4) kan opprettholde pluripotency gjennom LIF og WNT signalering; imidlertid spesielt, aktivere de også en fibroblast vekst faktor (FGF) signal utløse differensiering8. Grunn ambivalent dobbelt handlingen av kjernen transkripsjonsfaktorer presentere musen ES celler dyrket i serum heterogenitet, bestående av to utskiftbare befolkninger, en lignende ICM og en annen som ligner primet epiblast staten8. Videre viser musen ES celler i serum ofte globale hypermethylation9, mens ICM og PGCs er i en global hypomethylated tilstand, som er nært forbundet med deres pluripotency9,10.

Det er et betydelig behov å utvikle nye metoder for dyrking musen ES celler. Flere forbedret protokoller har vært etablert siden 200311 men det fortsetter å være noen begrensninger og mangler7. Siden 2008, kombinert utnyttelse av to små molekyl kinase hemmere, PD0325901 (inhibitor av mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) / ekstracellulære signal-regulert kinase (ERK) (MEK)) og CHIR99021 (inhibitor av glykogen syntase kinase 3 (GSK3)), i N2B27 medium med LIF og uten serum har åpnet nye perspektiver for dyrking musen ES celler12. Dette nye definerte mediet er preget av bruk av to hemmere (2i). Mus ES celler kultivert 2i/LIF medium er mer homogen i celle populasjoner og uttrykk for pluripotency faktorer. 2i/LIF-kulturperler musen ES celler utstilling i tillegg DNA hypomethylation globalt, som er nærmere ICM-lignende celler9,13. Likevel har 2i kultur sine ulemper. PD0325901 og CHIR99021 er uløselig i vann generelt er oppløst i dimethyl sulfoxide (DMSO)-basert lager løsning for å legge dem i kultur medium. Studier har vist at langsiktige og lav dose eksponering for celler DMSO kan føre til cytotoksisitet14.

Her vi benyttet to små molekyl forbindelser og utviklet en ny kultur metode for musen ES celler. Metoden romanen kultur kombinerer Vc og MEK hemmer PD0325901 for å fremme DNA hypomethylation raskt og til et tilsvarende nivå for PGC, benevnt effektivt idet Vc/PD0325901 culturing protokollen. Mus ES celler i Vc/PD0325901-lagt serum inneholder medium exhibit homogenitet i morfologi og opprettholdes i bakken tilstand. Sammenlignet med 2i kultur, musen ES celler kultivert vilkår Vc/PD0325901 exhibit raskere kinetics av DNA demethylation og kan nå hypomethylation nivå sammenlignes med PGC. Dessuten, bruk av en enkelt hemmer (PD0325901) reduserer input mengden DMSO til medium i forhold som brukes i 2i (PD0325901/CHIR99021) og reduserer skader celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelser

  1. Forberede en løsning av 1.0 mM PD0325901 (MEK hemmer) og 3.0 mM CHIR99021 (GSK3 hemmer).
    1. Veie 2 mg av PD0325901 og legge 4.15 mL DMSO i et gult hetteglass.
    2. Veie 2 mg av CHIR99021 og legge 1.43 mL DMSO i et gult hetteglass.
    3. Følgende rekonstituering, lagre dele (50 µL/rør i 200 µL PCR rør) på 20 ° C og beskyttet mot lyset. Fjerne et rør som inneholder frosne lager fra en fryser og tine ved romtemperatur før bruk.
  2. Veie 0.0176 g av Vc i 1 mL av en sentrifuge rør og gjeninnføre det med 1 mL steril vann til en siste konsentrasjon av 100 mM før bruk.
  3. Deaktiver FBS: ruge 500 mL FBS i et vannbad på 56 ° C i 30 min.
  4. Forberede 600 mL av grunnleggende medium dyrking musen ES celler.
    1. Bruk en flaske DMEM/høy glukose medium (500 mL) og fjerne 40 mL.
    2. Supplement 460 mL av DMEM/høy glukose medium med 20% inaktivert FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (60 µL av 107 U/mL lagerløsning), 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) (6 mL av 10 mM lagerløsning), 1 mM natrium pyruvate (6 mL av 100 mM lager løsning) , 2 mM L-glutamin (6 mL av 200 mM lagerløsning), 0,1 mM β-mercaptoethanol (600 µL av 100 mM lagerløsning), og 33 IU/mL penicillin og 33 µg/mL streptomycin (2 mL av penicillin-streptomycin blandet løsning (10.000 IU/mL penicillin og 10.000 µg/mL streptomycin)) . Define den grunnleggende mediet som serum medium.
    3. Pipetter 50 µL av lager løsning av PD0325901 (1.0 mM) og Vc (100 mM), henholdsvis i 50 mL av serum mediet (siste konsentrasjon: 1.0 µM PD0325901 og 100 µM Vc), og definere mediet som Vc/PD0325901 medium.
      Merk: Forberede Vc/PD0325901 middels frisk før bruk på grunn av ustabilitet i Vc.
    4. Bruke en pipette, overføre 50 µL av lager løsning av PD0325901 (1.0 mM) og CHIR99021 (3.0 mM), henholdsvis i 50 mL av serum mediet (siste konsentrasjon: PD0325901 1.0 µM og CHIR99021 3.0 µM), og definere mediet som 2i medium.
  5. Lage gelatin-belagt retter.
    1. Forberede 0,1% gelatin løsningen: oppløses 0,3 g gelatin i 300 mL ultrapure vann i en reagens glassflaske med en cap og sterilisere i en autoklav 121 ° c for 20 min. butikken sterilt løsningen ved romtemperatur.
    2. Inkuber celle kultur rettene (6 cm diameter) med 2 mL 0,1% gelatin i 15 min ved romtemperatur og deretter Sug opp gelatin. Tørr rettene i luften, og bruke dem innen 12 timer.
  6. Forberede 10 mL av musen ES celle frysing medium i en 15 mL sentrifuge rør: 90% FBS (9 mL) og 10% DMSO (1 mL). Bruke mediet innen 1 dag.
  7. Forberede en frysing beholder: legge til 100% isopropylalkohol påfyllingsstreken av fryse beholderen, og forkaste gamle isopropyl alkohol. Legge til nye isopropylalkohol direkte etter hver femte bruk.
  8. Gjøre enzymatisk fordøyelsen bufferen: veie 1.2114 g Tris pulver til 100 mL ultrapure vann å forberede 100 mM Tris løsning og legge til konsentrert HCl løsning (ca 12 M) i Tris løsningen å justere pH til 7,6 (ca 0,6 mL konsentrert HCl løsning).
  9. Forberede 50 mL av radio immunoprecipitation analysebuffer (RIPA buffer): 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glyserol, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Supplere med 1 mM DTT, 1 X protease hemmer cocktail og 1 mM PMSF før bruk. Når PMSF er lagt, kan du bruke buffer innen 30 min.

2. dyrke musen ES celler Gelatin-belagt retter

  1. Pre varme musen ES celler (wild type, 129 SvEv) kultur medium, trypsin og fosfat bufret løsning (PBS) i et vannbad på 37 ° C.
  2. Passasje cellene. Sug opp mediet helt fra parabol og pipette 2 mL PBS retter skylle cellene.
    1. Fjerne PBS med en pipette og vask cellene igjen med 2 mL PBS.
    2. Fjerne PBS og legge 0,3 mL av trypsin-EDTA (0,25%) til hver rett.
    3. Dekke hele parabolen med trypsin raskt og deretter fjerne den umiddelbart.
    4. Sette retten i en inkubator ved 37 ° C i 1 min koble cellene fra parabolen. Ta ut retter fra inkubator og legge 2 mL forvarmes serum medium å avslutte handlingen av trypsin.
    5. Distansere celle koloniene i en enkeltcelle suspensjon av resuspending med en pipette (5 mL pipette tips) 10 ganger.
  3. Overføre 150 µL av 2 mL av cellen løsningen (ca 190 000 celler ved å telle med en hemocytometer) i en ny gelatin-belagt parabol og supplere med 3 mL nystekte Vc/PD0325901 medium per 6 cm kultur parabol. Kultur cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  4. Hver 24 timer mens rugende, fjerner gamle kultur medium og legge 3 mL frisk Vc/PD0325901-medium i kultur parabol på grunn av ustabilitet i Vc. forvente 70-80% confluency etter 2-3 dager.
  5. Etter å ha nådd 70-80% confluency, passasje cellene og fortsette å kultur dem som beskrevet i trinnene 2.2-2,4.

3. fryse og tine musen ES celler

  1. Fryse musen ES celler.
    1. Koble cellene fra retter med trypsin ved å følge trinn 2.2.
    2. Overføre cellene i en 15 mL plastrør og sentrifuge på 800 x g og romtemperatur for 3 min.
    3. Dumpe nedbryting forsiktig i et beaker og resuspend celle pellets med 1 mL av nystekte frysing medium. Forberede frysing middels 30 min før dette trinnet å sikre at det er romtemperatur før bruk.
    4. Overføre cellene i iskaldt middels til en 1,8 mL microcentrifuge rør med en 1 mL pipette, og sett microcentrifuge røret i en fryser beholder. Legge til isopropylalkohol påfyllingsstreken av fryse beholderen og holde det ved romtemperatur før du bruker.
    5. La frysing containere over natten i-80 ° C fryser.
    6. Overføre microcentrifuge rør til en flytende nitrogen beholder til 2-3 år.
      Merk: Ikke holde celler i frysing medium i lang tid og raskt overføre cellene til en-80 ° C fryser på grunn av toksisitet av DMSO.
  2. Tine musen ES celler.
    1. Forvarm 50 mL av serum medium i en 37 ° C vannbad.
    2. Ta ut en celle inneholder medisinglass fra beholderen flytende nitrogen og dyppe avkortet ampullen i en 37 ° C vannbad. Riste den raskt i vannbad å tine. Overføre cellene til en 15 mL tube med en 1 mL pipette. Legg 2 mL forvarmes serum kultur medium inn i røret å fortynne frysing medium og deretter virvel på 800 x g og romtemperatur for 3 min.
    3. Fjern nedbryting og forsiktig resuspend celle pellets med 3 mL frisk Vc/PD0325901 mediet bruker en 5 mL pipette.
    4. Overføre cellene fra 15 mL røret til en gelatin-belagt rett og kultur celler for 24 h. kultur cellene igjen som beskrevet i trinn 2.

4. Pakk ut totalt Protein fra celler

  1. Skyll det avhentet celler med 1 mL av PBS og deretter virvel på 800 x g og romtemperatur for 3 min.
  2. Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet grundig med RIPA buffer supplert med DTT, protease hemmer cocktail og PMSF av pipettering forsiktig. Volumet av RIPA bufferen er ca 5 x som cellen pellets.
    Merk: Utføre celle rørets på is.
  3. Holde cellene i RIPA buffer for 30 min på is og sentrifuge 13.000 x g og 4 ° C for 5 min.
  4. Overføre nedbryting til en ny tube og lagre dele på-80 ° C.
  5. Bestemme konsentrasjonen av protein med et Bradford protein analysen kit.

5. ekstra DNA fra celler og fordøye DNA i en enkelt nukleosid bruker enzymer

  1. Samle cellene med trypsin som beskrevet i trinn 3.1.1 og 3.1.2.
  2. Utføre DNA utvinning med en genomisk DNA rensing kit følge instruksjonene fra produsenten.
  3. Lagre utdraget DNA i 1-mL sentrifuge rør. Legg 100 µL ultrapure vann inn i sentrifuge røret, og oppløse DNA av pipettering ca 15 ganger. Bestemme konsentrasjonen og vurdere kvaliteten på DNA ved måling av absorbansen på 260 nm og 280 nm15. DNA konsentrasjonen er rundt 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg DNA i et 50 µL løsning system: legge til 5 µL av 100 mM Tris-HCl løsning, pH 7.6 (siste konsentrasjon: 10 mM), 2 U kalv intestinal fosfatase, 1 U-DNase I 0.005 U snake venom fosfodiesterase jeg, og 5 µg DNA (beregne lagt volumet etter measu rød DNA konsentrasjon, ~ 10 µL) i en sentrifuge rør og øke volumet av løsningen på 50 µL med ultrapure vann. Inkuber blandingen på 37 ° C over natten. Sentrifuge fordøyd DNA løsningen på 1000 g og romtemperatur for 1 min samle løsningen på bunnen av rør.
  5. Overføre fordøyd DNA løsningen fra sentrifuge rør til ultra-filtrering rør (et molekyl vekt cutoff: 3 kDa) og sentrifuger på 13000 g og 4 ° C i 30 minutter til fjerne fordøyelsen enzymer.
  6. Klargjør prøvene for 5mC og 5hmC.
    1. For 5hmC analyse: Pipetter 36 µL filter løsningen å en ny sentrifuge rør (1 mL) og legge 4 µL av 5'-(hydroxymethyl-d3)-2-deoxycytidine ([D3]-5hmC) med den endelige konsentrasjonen av 3 nM.
    2. For 5mC analyse: Legg 196 µL ultrapure vann i en ny sentrifuge tube og Pipetter 4 µL av filteret løsning til røret (50-fold fortynning), på grunn av 5mC i genomic DNA. Overføre 36 µL av utvannet løsningen slik nye sentrifuger og legge 4 µL av (5'-(methyl-d3)-2-deoxycytidine ([D3]-5mC) med den endelige konsentrasjonen av 50 nM. Bruk [D3]-5hmC og [D3]-5mC som interne standard å kalibrere 5hmC og 5mC, henholdsvis.
  7. Overføre prøve løsningen til måling rør og lagre på 4 ° C. Analysere 5mC og 5hmC med ekstremt høy ytelse flytende kromatografi-trippel quadrupole massespektrometri med flere-reaksjon overvåking (UHPLC--MS-/ MS (MRM)) som beskrevet i en tidligere rapport15.

6. analysere 5mC og 5hmC med UHPLC--MS-/ MS15

  1. Angi forskjellige parametere for å analysere 5mC og 5hmC ved hjelp av UHPLC-MS-programvaren.
    1. Opprette en ny metode. Åpne programvaren og klikk "fil | Ny | Metoden". Viser melding-boksen i "Metoden Editor" med innhold "Vil du lagre endringene for den gjeldende" og klikk "Nei".
    2. Bygge parameterne for sampler. Klikk "Sampler | Installasjonsprogrammet | Injeksjon". Velg "Standard injeksjon" og "5 µL ved injeksjon volum"-inngang.
    3. Bygge parametere av pumpen i UHPLC.
      1. Klikk "BinPump2 | Setup"for å bygge parametere av pumpen. Konfigurere "Flyt" på "0,25 mL/min" og "Stopp tid" på "15 min".
      2. Definere "Løsemiddel B på 5%" og "Press grensene" på "Max 600 bar".
      3. Klikk "BinPump2 | Timeplan"bygge isocratic elueringsrør parametere for 5mC analyse. Klikk "Append" for å legge til en rad. Input "0,00" "Tid" og "5.0" på "B %". Klikk "Append" igjen for å legge til en ny rad. Input "15.00" "Tid" og "5.0" på "B %".
      4. Klikk "BinPump2 | Timeplan"å bygge gradient elueringsrør parameterne for 5hmC analyse. Klikk "Legg til for å legge til en rad. Angi 0,00 tid og 5.0 på "B %". Klikk "Append" igjen for å legge til en ny rad. Input "3.00" "Tid" og "5.0" på "B %". Klikk "Append" for en annen 6 ganger legge til 6 rader. Input "3.01" "Tid" og "15,0" på "B %", "6.00" på "Tid" og "15,0" på "B %", "6.01" "Tid" og "100" på "B %", "10.00" "Tid" og "100,0" på "B %", "10,01" ved "Tid" og "5.0" på "B %", "15.00" "Tid" og "5.0" på "B %" i rekkefølge.
        Merk: Utføre analyse av 5mC og 5hmC individuelt på grunn av ulike separasjon forhold av UHPLC.
    4. Bygge parameterne for temperaturen i kolonnen batterirommet (TCC) i UHPLC.
      Klikk "TCC | Installasjonsprogrammet | temperaturen (til venstre) "og"30 ° C".
    5. Opprette parameterne for QQQ-MS/MS.
      1. Klikk "MS QQQ | Stopp | Ingen grense/som pump"," Ion kilde | ESI"," tid filtrering | Topp bredde: 0,07 min ". Definere "gang avsnitt: starttid: 0"; "Scan Type: MRM"; "Div verdi: til MS"; «Delta EMV (+): 200 "og" Delta EMV (-): 0".
      2. Bygge parameterne for overvåking etter overganger i 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC og D3-5hmC
        1. Klikk "MS QQQ | Kjøp | Skanne segmenter: bor: 90»; "Fragmentor: 90"; «Kollisjon energi: 5 "; "Celle Accelerator spenning: 4" og "polaritet: positiv".
        2. Angi "5mC" på "Sammensatte navnet", "242" på "Forløper Ion", "126" på "Produkt Ion" for 5mC analyse. Høyreklikk og velg "Legg til rad" legge til en ny rad. Input "D3-5mC" på "Sammensatte navnet", "245" på "Forløper Ion", "129" på "Produkt Ion" for D3-5mC analyse.
        3. Supplere annen tre rader med samme modus. Inngangen "dC" på "Sammensatte navnet", "228" på "Forløper Ion", "112" på "Produkt Ion" for dC analyse. Angi "5hmC" på "Sammensatte navnet", "258" på "Forløper Ion", "142" på "Produkt Ion" for 5hmC analyse. Input D3-5hmC på sammensatte navnet, "261" på "Forløper Ion", "145" på "Produkt Ion" for D3-5hmC analyse.
      3. Bygge parametere til gasskilde. Klikk "MS QQQ | Kilde | Kilde parametere: gass Temp: 300 ° C "; "Gass flyt: 11 L/min"; "Forstøveren: 15 psi"; "Positiv-kapillære: 3500 V".
      4. Lagre den foreslåtte metoden. Klikk "MS QQQ | Instrument | Lagre metoden som". Velg en sti for den foreslåtte metoden av "Katalog" og gi et navn for metoden ved å legge inn innholdet i "Metode", for eksempel: 5mC og 5hmC.
  2. UHPLC fargeseparasjoner og MS-/ MS analyse av mononucleosides
    1. Forberede den mobile fasen for 5mC og cytosine (C) analyse: den mobile fasen av løsning A og B. løsning A: 500 mL ultrapure vann med 500 µL av maursyre (siste konsentrasjon: 0,1%), og løsningen B: 500 mL 100% metanol. Bland løsning A og B på 95:5 (v: v) som den mobile fasen til elute 5mC og C (angitt i trinn 6.1.3.3). Angi flow rate på 0,25 mL/min (angitt i trinn 6.1.3.1).
    2. Forberede den mobile fasen av løsemiddel A og B for 5hmC analyse. Løsemiddel er 2.0 mM NH4HCO3 vandig løsning (pH 9.0) (500 mL), og løsemiddel B er 100% metanol (500 mL). Separat 5hmC ved en optimalisert gradient elueringsrør: 0-3 min, 5.0% B og 95% en (v: v); 3-6 min, 15,0% B og 85% A; 6-10 min., 100% B; 10-15 min., 5.0% B og 95% et (sett i trinn 6.1.3.4). Angi flow rate på 0,25 mL/min (angitt i trinn 6.1.3.1).
  3. Bruke electrospray MS-/ MS MRM modus (angitt i trinn 6.1.5.1) for å analysere tilsettes kolonnen og vedta positivt ion modus (angitt i trinn 6.1.5.2.1).
    1. Overvåke overganger: 5mC, m/z 242→126 (kollisjon energi, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (angitt i trinn 6.1.5.2.2).
    2. Angi kapillære og fragment spenninger på +3,500 V (angitt i trinn 6.1.5.3) og 90 V (satt i trinn 6.1.5.2.1), henholdsvis.
    3. Angi injeksjon volumet på 5 µL og analysere hver prøve 3 ganger (angitt i trinn 6.1.2). Ansette den tilsvarende standard kurver å vurdere hvor mye 5mC og 5hmC.
      1. Etablere standardkurven av 5mC: overføre 1-50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, siste konsentrasjon) standard løsning av 5mC i sentrifuge rør og legge 50 nM [D3]-5mC til rør. Komplettere det totale volumet til 50 µL. utføre analyse av standard 5mC følge instruksjonene for 5mC prøven (trinn 6).
      2. Bygge standardkurven av 5hmC: overføre 1 – 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, siste konsentrasjon) standard løsning av 5hmC sentrifuge rør og legge 3 nM [D3]-5hmC til rør. Komplettere det totale volumet til 50 µL. utføre analyse av standard 5hmC følge instruksjonene for 5hmC prøven (trinn 6).

7. analyser den statistiske betydningen

  1. Utføre statistisk analyse ved hjelp av programvare.
    1. Åpne programvaren og velg "Kolonne" i "ny tabell & diagram". Angi parameterne som følger: "eksempeldata | Start med en tom datatabell"; "Velg en graf-den første modusen"; «Grafiske gjentak eller feilfelt | Plot | Mener med SEM".
    2. Klikk "Opprett" for å angi de tre gjentak av kontroll og Vc/PD0325901-behandlet i "A" og "B"-linjen henholdsvis. Velg seks data og klikk "Analysere" i "Analyse".
    3. Velg"t tester (og parametriske tester)" i "Kolonnen analyser" og klikk "OK" for å angi det neste grensesnittet.
    4. Angi parameterne som følger: "Velg test | Test navn | Kortet t test; Alternativer | Tosidige"; "Tillit intervaller: 95%"; "Signifikante sifre | Vis 4 signifikante sifre". Klikk "OK" for å få en p -verdi mellom kontrollen og Vc/PD0325901 behandling.
  2. Evaluere den statistiske betydningen mellom kontrollen og eksperimentelle gruppene ansette tosidige og kort Student t-test16.
    Merk: p < 0,05 angir forskjellen ha statistisk signifikans. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VC/PD0325901 indusert synergi globale sletting av musen ES celler. Mus ES celler i serum utstilling DNA hypermethylation, mens pluripotent ICM celler og PGCs globale sletting av DNA metylering og hypomethylated staten er nært forbundet med deres pluripotency9,10.

Tidligere har funnet vi at Vc kan forbedre Tet-mediert 5mC demethylation15,17. I mellomtiden ble 2i også funnet for å hemme de novo syntese av 5mC. I forbindelse med disse funnene foreslått vi ytterligere synergistisk manipulering av musen ES celler ved hjelp av Vc og 2i sammen. Etter analyse av UHPLC--MS-/ MS fant vi at Vc og 2i supplert i serum inneholder mediet kan dramatisk redusere 5mC innholdet 3,2 til 0,33 per 100 C (~ 90% 5mC tap) dag 11 i musen ES celler (figur 1A). I kontrast, forårsaket Vc eller 2i-behandling alene bare 58% sletting jevn nivået på 1,4% 5mC eller 61% reduksjon på nivå med 1,3% 5mC.

2i mediet består av MEK hemmer PD0325901 og GSK3β hemmer CHIR99021. Neste undersøke vi hvilken komponent induserer globale tap av 5mC under co behandling av Vc og 2i. Interessant, forårsaket Vc/PD0325901 en raskere nedgang i nivåer av DNA metylering enn Vc/2i. VC/PD0325901 oppnådd jevn 5mC nivåer (~0.33% 5mC) etter 5 dager, mens Vc/2i nådd et tilsvarende nivå på dag 11. Derimot undertrykt tillegget av CHIR99021 delvis Vc-utløst DNA demethylation (figur 1A). Disse data tyder klart at PD0325901 i 2i bidrar til den globale hypomethylation genomisk DNA musen ES celler, mens CHIR99021 over 2i delvis hemmer sletting av 5mC. Derfor spekulere vi at det raskere DNA demethylation av Vc/PD0325901 i forhold til Vc/2i kan tilskrives delvis hemming av CHIR99021 på demethylation.

Vi hypotese at den globale sletting av 5mC i musen ES celler av Vc/PD0325901 kan være delvis relevant til styrking av DNA demethylation. Derfor undersøkte vi genomisk oksidasjonsprodukter av 5mC. Det har blitt rapportert at 5mC kan konverteres til 5hmC av katalytisk oksidering av Tet familien dioxygenases, som er avhengige av Fe (II) og 2-oxoglutarate18,19. Genomic 5hmC kan bli utvannet av DNA replikering20. Videre 5hmC kan være ytterligere oksidert av Tet dioxygenases å produsere 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC), som kan være effektivt forbrukeravgift av thymine DNA glycosylase (TDG) å gjenopprette unmethylated cytosine, en aktiv DNA demethylation21,22.

I tråd med tidligere arbeid15, Vc inneholder behandling (Vc, Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) økt dramatisk 5hmC frekvens (5hmC/106 C) etter 1 dag, og deretter 5hmC nivåer avslått gradvis (figur 1B) grunn til gradvis reduksjon i 5mC substrat. Spesielt, viste Vc/PD0325901 og Vc/2i raskere kinetics 5hmC tap i forhold til Vc og Vc/CHIR99021 på grunn av raskere reduksjon av 5mC. Dessuten, observert vi også at på dag 1, Vc-behandling stimulert mer generasjon av 5hmC sammenlignet med Vc/CHIR99021, som indikerer at CHIR99021 delvis undertrykt Vc-indusert produksjon av 5hmC og hemmet DNA demethylation. 5hmC tap i 2i behandling bør tilskrives nedgangen av 5mC underlaget. Til sammen disse resultatene viste at Vc forbedret DNA demethylation aktivitet delvis bidro til den synergi hypomethylation i co behandling av Vc/PD0325901 og Vc/2i.

Begge Habibi et al. 23 og von Meyenn et al. 24 rapporterte også at musen ES celler under 2i forhold viste globale DNA hypomethylation og naiv pluripotency. 5mC nivåer viste avta gradvis og nådd en steady-state (~ 1% 5mC) på 12 – 14 dager etter hjemfall fra serum til 2i. I Vc/PD0325901 kultur systemet, co behandling forårsaket raskere DNA demethylation og nådde et stabilt nivå (0,33% 5mC) etter tilskudd av Vc/PD0325901 i serum medium for 5 dager, på grunn av synergistisk effekten av Vc/PD0325901. Nådd methylated nivået (0,33% 5mC) var pronouncedly lavere enn under 2i forhold rapportert av Habibi et al. og von Meyenn et al., mens 5hmC nivåer var høyere på grunn av forfremmet generering av Vc.

PD0325901 forhøyet Prdm14 uttrykk for å undertrykke Dnmt3b og Dnmt3l, men ikke Dnmt3a25. Undersøke virkningen av PD0325901 i forårsaker tap av 5mC, en rekke 5mC-relaterte proteiner uttrykket ble undersøkt, inkludert vedlikehold (Dnmt1) og de novo (Dnmt3a og Dnmt3b) DNA methyltransferases og deres kofaktor (Uhrf1 og Dnmt3l) og regulering protein (Prdm14) 8,9,26. Etter Western blot analyse, ble Prdm14 pronouncedly løftet i PD0325901, inkludert kultur (figur 2). I kontrast, viste Dnmt3b og dens kofaktor Dnmt3l betydelig ned-regulering av protein uttrykk i PD0325901, inkludert behandling (figur 2). CHIR99021 behandling viste ingen eller liten effekt på nivået av Prdm14, Dnmt3b og Dnmt3l. Uttrykk for Dnmt3awas endre ikke årsaken er uklart. I tillegg til vedlikehold DNA methyltransferase Dnmt1 og dens målretting faktor Uhrf1 viste ingen endring og dataene ikke ble vist.

Nyere studier har indikert at Prdm14 kan rekruttere polycomb undertrykkende komplekse 2 (PRC2) til noen genet arrangører å undertrykke deres uttrykk, for eksempel de novo DNA methyltransferases (Dnmt3a og Dnmt3b) og deres kofaktor (Dnmt3l), og bidrar til opprettholde hypomethylation under 2i forhold8,27. Våre data viser at PD0325901 forhøyet hvilket uttrykk Prdm14 å hemme Dnmt3b og Dnmt3l og redusert de novo genomic 5mC syntese av mekanismen.

For å utforske pluripotency vedlikehold av musen ES celler under Vc/PD0325901 forhold, mRNA uttrykk nivåer av kjernen pluripotency knyttet faktorer ble undersøkt, og disse faktorene er bekreftet for å spille viktige roller i pluripotency28. Sanntid PCR analyse fant at Oct4, SOX2, Esrrb og Sall4 viste uniform uttrykk nivåer gjennom 5 dager behandling med Vc/PD0325901 i motsetning til serum kultur (figur 3A). Nanog og Tcf3 1.3-fold og 1.6-fold, henholdsvis. I motsetning Klf4 viste 42% ned-regulering og Rex1 bare redusert med om lag 12%. Disse resultatene tyder på at Vc/PD0325901 co behandling indusert ulike endringer i uttrykk for pluripotency faktorer; men holdt Oct4 og SOX2, de mest core faktorene, nesten konstant nivåer av uttrykk.

Deretter ble alkalisk fosfatase (AP) analysen utført for å vurdere om musen ES celler var i en udifferensierte eller differensiert. Bilder av celler (figur 3B og 3 C) ble innhentet fra et kamera koblet til en invertert mikroskop med 10 ganger forsterkning av en linsen. Etter kontinuerlig dyrking av 26 dager i Vc/PD0325901-lagt serum medium viste musen ES celler homogen morfologi. Videre nesten alle celler var farget lilla-svarte og utstilt en ball-lignende tilstand uten utvekst (Figur 3 c), viser en udifferensierte tilstand. I motsetning under serum forhold, en del av musen ES celler på dag 26 var lilla-svarte etter farging og hadde en ball-lignende tilstand i morfologi, mens andre presentert lys farge med outspreading markert med hvite stiplede ovale linjer (figur 3B); Dette indikerte at serum-kulturperler musen ES celler ble heterogene i morfologi og pluripotent staten, som er i samsvar med tidligere rapporter13. Kollektivt, støttet data at PD0325901 i kombinasjon med Vc kan opprettholde gode morfologi og en udifferensierte stat i musen ES celler.

Figure 1
Figur 1: Vc/PD0325901 synergi indusert globale sletting av genomic 5mCin musen ES celler. (A) 5mC frekvens (5mC/C) og (B) 5hmC frekvens (5hmC/C)-avhengige endring under en 26-dagers behandling av en kontinuerlig komplettere med Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 eller Vc/CHIR99021 i serum inneholder medium. Feilfelt viser standardavviket (SD) fra tre gjentatte analyser av UHPLC-MS/MS. C: cytosine. Dette tallet har blitt endret fra Li et al. 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Protein uttrykk endring av Prdm14 og DNA methyltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b og Dnmt3l). Presentert band (fra venstre til høyre) ble innhentet gjennom en 5 dagers-behandling av serum kultur (kontroll), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 og Vc/2i, henholdsvis. Uttrykket Prdm 14 var opp-regulert og Dnmt3b og Dnmt3l redusert etter PD0325901-inkludert kultur. Dnmt3a viste ingen endring. Β-tubulin ble angitt som interne referanse. Con: Kontroll; PD: PD0325901; LM: CHIR99021. Dette tallet har blitt endret fra Li et al. 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Vc/PD0325901-indusert endring i mRNA uttrykk for pluripotent gener og aktiviteten til isoenzymer. (A) mRNA nivå av delvis pluripotent gener er endret gjennom en 5 dagers behandling av Vc/PD0325901 i forhold under serum forhold (kontroll). Data var representert som betyr ± SD. Den statistiske betydningen ble evaluert og p < 0,05 var statistisk signifikant. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og ns representert ikke betydning. PD: PD0325901. Mus ES celler i serum 26 dager (B) utstilt delvis utvekst preget av hvite stiplede ovale linjer, mens Vc/PD0325901-lagt serum medium opprettholdt stor morfologi og en udifferensierte stat (C). Disse bildene ble anskaffet fra en invertert mikroskop med et kamera i feltet lyse. Dette tallet har blitt endret fra Li et al. 25. skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I arbeidet viste vi en ny metode for å kombinere Vc og PD0325901 for å opprettholde musen ES celler ved en udifferensierte og hypomethylated stat, som ble nådd synergistiske handling for å fremme DNA demethylation av Vc og undertrykke de novo DNA metylering av PD0325901. Videre viste musen ES celler stor morfologi under Vc/PD0325901 kultur-systemet.

For å bedre opprettholde staten musen ES celler i Vc/PD0325901 kultur systemet, finnes det noen viktige trinn. Først må FBS grupper være pre-screenet å finne og lager de beste grupper; hyppige utskifting av serum er også skadelig celle spredning og vedlikehold av pluripotency. For det andre, unngå over pipettering celler under dissociating celle koloniene til en enkeltcelle suspensjon i cellen passasje scenen. For det tredje, for å dempe den negative effekten av trypsin under cellen dyrking, trypsin bør fjernes straks den dekker cellene i retter i celle passaging. I tillegg bør Vc/PD0325901 kultur medium skiftes daglig på grunn av ustabilitet i Vc.

Sammenlignet med den klassiske serum kulturen viser musen ES celler under Vc/PD0325901 forhold mer homogen celle innbyggere (figur 3B, C) og hypomethylated staten, som ligner ICM og PGC. I tillegg sammenlignet med nylig utviklet 2i kulturen, vår metode kan realisere hypomethylation med raskere kinetikk, og bruken av en enkelt hemmer (PD0325901) reduserer input DMSO, dermed redusere skader celler. På grunn av FBS i vår kultur-systemet, kan imidlertid ambivalent to handlinger FBS føre celledifferensiering under langsiktige kultur. Samlet er denne romanen kultur-systemet egnet for vedlikehold og ekspansjon i stor skala musen ES celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne avsløre noen mulige interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation av Kina (21435008 og 21327006 til HW) og strategiske prioritet forskningsprogrammet av det kinesiske vitenskapsakademi (XDB14030200 til HW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52, (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8, (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13, (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484, (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115, (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135, (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8, (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334, (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286, (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13, (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7, (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1, (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39, (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (8), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics