MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

Biochemistry

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Summary

我々 はマウス胚性幹細胞を培養するための 2 つの化学ベースのプロトコルについて説明します。この新しいメソッドは、(ビタミン C)、テトを介した酸化を促進し、DNA 低いメチル化とマウス胚性幹細胞の多能性を維持するために、5-メチルシトシン (PD0325901) でのデノボ合成を抑制の相乗効果のメカニズムを利用しています。

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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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Abstract

胚性幹 (ES) 細胞は 3 つの胚葉 (内胚葉、中胚葉、または外胚葉) のいずれかに分化する可能性があるし、再生医療のための多くの系統を生成できます。ES 細胞培養体外長い広範な懸念の対象とされています。血清及び白血病抑制因子 (LIF) のマウス ES 細胞を維持する古典的な-媒体を含んでいます。しかし、血清/LIF の条件下で細胞は形態および多能性関連遺伝子の発現プロファイルの不均一性を示す、主に準安定状態。さらに、ES 細胞を示すグローバル領域のメチル化が、内部細胞塊 (ICM) の始原生殖細胞 (PGCs) 素朴な ES 細胞は、グローバルの低いメチル化の状態。ICM と始原生殖の hypomethylated 状態は、多能性と密接に関連します。マウス ES 細胞培養方法を改善するために DNA hypomethylated および多能性の状態を維持するために 2 つの低分子化合物の選択的に結合された使用率に基づいて新しい方法最近行った。ここでは、ビタミン C (Vc) の共同治療を示す、PD0325901 はマウス ES 細胞で 5 日で 5-メチルシトシン (5mC) の約 90% を消去できます。生成された 5mC コンテンツは孵卵に匹敵します。PD0325901 アップ調整をする Prdm14 式 Dnmt3b を抑制する制御機構の解明を示します (de novo DNA メチル基転移酵素)、Dnmt3l (Dnmt3b の補因子)、 de novo 5mC 合成を減らすことによって。Vc は、パッシブとアクティブの両方の DNA demethylations の関与を示す 5mC の 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) 主に Tet1 と Tet2、触媒への変換を促進します。さらに, Vc/PD0325901 の条件下でマウス ES 細胞示す同種形態と多能性の状態。総称して、小説と DNA 低いメチル化とマウス ES 細胞の多能性を維持達成するため化学シナジー培養法を提案します。小分子の化学依存法は、血清が文化、さらに臨床応用研究のための均質な ES 細胞を生成する将来性の主要な欠点を克服します。

Introduction

ES 細胞は胚盤胞1の ICM に由来します。細胞は多能性の状態で、すべての体細胞系列と生殖細胞2を形成することができます。ES 細胞の樹立は、開発を調査する機会の in vitroを処理し、多能性3に基づく再生医療医療関連性の細胞を生成することができますを提供します。

2 つのグループは、1981 年にマウス ES 細胞を形づくる設立し、初期のマウス胚由来細胞がウシ胎児血清 (FBS) で培養したとき-フィーダー層の1,4 としてマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 媒体を含む.MEFs 有糸分裂不活化された ES 細胞を培養する前に料理で育った事前.MEFs は、マウス ES 細胞接着と伝播を促進し、FBS は不可欠な栄養因子と細胞増殖のホルモンを提供しています5分化を抑制する成長因子の生成をサポートします。その後の研究は、LIF フィーダー細胞によって産生された自己複製とマウス ES 細胞の多能性維持のためのキーのサイトカインと培地へ添加 LIF フィーダー細胞6の代わりに示されます。現在、FBS/LIF 中の餌箱にマウス ES 細胞の維持はまだ多くの研究者によって採用された標準的な方法です。しかし、この古典文化のアプローチをいくつかの問題が発生します。まず、フィーダー細胞は過剰と制御されていない要因を分泌して7病原汚染を引き起こす可能性があります。血清含有 LIF 添加ゼラチンで料理の表面をコーティング、この干渉を避けるために媒体がフィーダー層セルを持たないマウスの ES 細胞を維持するための代替方法です。さらに、血清/LIF 条件下で栽培したマウス ES 細胞は、細胞集団とも8多能性関連因子の発現レベル形態学的多様性を示します。最近の研究は血清/LIF の条件下で (SOX2, Nanog、OCT4 など) コアの多能性関連転写因子は LIF と WNT シグナル伝達; 多能性を維持できるお勧めただし、特に、彼らもアクティブに分化8をトリガーする線維芽細胞成長因子 (FGF) 信号。コア転写因子のどっちつかずのデュアル アクションによるマウス ES 細胞無血清培養は ICM およびプライミング胚盤葉上層の状態8に似た別に類似した 2 つの交換可能な集団から成るの不均一性を提示します。また、血清中マウス ES 細胞はしばしばグローバル領域のメチル化9を展示する一方、ICM と PGCs の多能性9,10と密接にリンクされているグローバル hypomethylated 状態で。

マウスの ES 細胞を培養するための新しい方法を開発するかなりの需要があります。200311以降いくつか改良されたプロトコルが確立されているが、いくつかの制限事項と短所7が継続します。PD0325901 の 2 つ・小分子キナーゼ阻害剤の結合された使用率、2008 年以来 (マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) の阻害剤/細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) (MEK)) と CHIR99021 (グリコーゲン合成酵素の阻害剤キナーゼ 3 (GSK3)) の培養マウス ES 細胞12N2B27 LIF と血清中が新たな視点を開いたが。この新しい定義された媒体は、2 つの阻害剤 (2 i) の使用によって特徴付けられます。2i/LIF 培地で培養したマウス ES 細胞より均一な細胞集団で多能性因子の発現。加えて、2i LIF 培養したマウス ES 細胞示す DNA 低いメチル化グローバル、ICM のような細胞9,13に近づいています。それでも、2i 文化は、その欠点を持っています。PD0325901 と CHIR99021 が水で溶けるとジメチルスルホキシド (DMSO) で一般に溶解している-ベースの培地でそれらを追加するストック ソリューション。研究は長期的なことを示したが、DMSO にセルの低線量の露出が細胞毒性14につながることができます。

ここでは、我々 は 2 つの低分子化合物を利用、マウス ES 細胞の新しい培養法を開発。新規培養法は、Vc、MEK 阻害剤 PD0325901 DNA 低いメチル化を急速に促進するためを結合し、効果的に Vc/PD0325901 培養プロトコルとして名前を PGC の対等なレベルに。マウス ES 細胞血清含有培地の Vc/PD0325901 追加の形態で均一性を展示し、基底状態の持続します。2i 文化と比較して、Vc/PD0325901 条件下で培養したマウス ES 細胞は DNA 脱メチル化の高速動力学を展示し、PGC に匹敵する低いメチル化レベルに到達することができます。さらに、単一の阻害剤 (PD0325901) の使用減少と比較して 2 i で使用中に DMSO の投入量 (PD0325901/CHIR99021) と細胞へのダメージを軽減。

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Protocol

1. 準備

  1. 1.0 mM PD0325901 のソリューション (MEK 阻害剤) と 3.0 mM CHIR99021 準備 (GSK3 阻害剤)。
    1. PD0325901 の 2 mg の重量を量る、琥珀色のガラス瓶で DMSO の 4.15 mL を追加します。
    2. CHIR99021 の 2 mg の重量を量る、琥珀色のガラス瓶で DMSO の 1.43 mL を追加します。
    3. 次の再構成は-20 ° C で因数 (50 μ L/200 μ L の PCR チューブにチューブ) を格納し、光から保護します。冷凍庫使用する前に室温で解凍から冷凍ストックを含むチューブを取り外します。
  2. 1 mL の遠心管に Vc の 0.0176 グラムの重量を量るし、1 ml の滅菌水を使用する前に 100 mM の最終濃度の再構成します。
  3. FBS を不活性化: 30 分 56 ° C の水浴の FBS の 500 mL を孵化させなさい。
  4. マウスの ES 細胞を培養用基本培地の 600 mL を準備します。
    1. DMEM/高グルコース培地 (500 mL) のボトルを使用し、40 mL を削除します。
    2. サプリメント 460 mL 20 %dmem/高グルコース培地の FBS (120 mL) 1,000 U/mL LIF (107 U/mL 原液の 60 μ L)、0.1 mM 非必須アミノ酸 (NEAA) (10 mM ストック溶液 6 mL)、1 mM ピルビン酸ナトリウム (100 mM ストック溶液 6 mL) を不活化、2 mM L-グルタミン (200 mM ストック溶液 6 mL)、0.1 mM β-メルカプトエタノール (100 mM 原液の 600 μ L)、33 IU/mL ペニシリンと 33 μ g/mL ストレプトマイシン (ペニシリン-ストレプトマイシン混合液 (10,000 IU/mL ペニシリンおよび 10,000 μ g/mL ストマイ) の 2 mL).血清媒体として基本培地を定義します。
    3. PD0325901 のストック溶液 50 μ L をピペット (1.0 mM) と Vc (100 mM)、血清培地 50 mL にそれぞれ、(最終濃度: 1.0 μ M PD0325901 Vc 100 μ m)、Vc/PD0325901 媒体として媒体を定義し、。
      注: は、Vc の不安定性のため使用前に Vc/PD0325901 中新鮮なを準備します。
    4. PD0325901 のストック溶液 50 μ L をピペットを使用して転送 (1.0 mM) と CHIR99021 (3.0 mM)、血清培地 50 mL にそれぞれ、(最終濃度: PD0325901 1.0 μ M と CHIR99021 3.0 μ M)、2i 媒体として媒体を定義し、。
  5. ゼラチン コーティングの料理を準備します。
    1. 0.1% ゼラチン液を準備: キャップと瓶試薬における超純水の 300 mL に 0.3 g のゼラチンを溶解し、常温で滅菌溶液を 20 分ストアの 121 ° C のオートクレーブで滅菌します。
    2. 室温で 15 分間 0.1% ゼラチン溶液 2 mL と細胞培養皿 (直径 6 cm) を孵化し、ゼラチンを吸引します。空気でお皿を拭くし、12 時間以内にそれらを使用します。
  6. マウス ES 細胞培地 15 mL 遠心管中の凍結の 10 mL を準備: 90 %fbs (9 mL) と 10 %dmso (1 mL)。1 日以内に培地を使用します。
  7. 冷凍コンテナーを準備する: 冷凍コンテナーの高さのラインに 100% イソプロピル アルコールを追加し、古いイソプロピル アルコールを破棄します。5 回使用後に直接新しいイソプロピル アルコールを追加します。
  8. 酵素消化バッファーを作る: 7.6 (HCl 溶液の約 0.6 mL) に pH を調整するトリス ソリューションに集約して塩酸溶液 (約 12 M) の純水 100 mM Tris ソリューションを準備し、追加の 100 mL に粉がトリスの 1.2114 グラムの重量を量る。
  9. ラジオ免疫沈降アッセイバッファー (RIPA バッファー) の 50 mL を準備: 20 ミリメートル pH 7.4 では、1 mM MgCl2, 150 mM 20% グリセロール、塩化ナトリウム 0.5 %np40、1 mM EDTA、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸トリス。使用する前に PMSF 1 mM DTT、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、1、1 mM で補足します。PMSF を追加すると、30 分以内のバッファーを使用します。

2 ゼラチン コーティング皿にマウス ES 細胞を育てる

  1. あらかじめ暖かいマウス ES 細胞 (野生型、129 SvEv) 文化媒体、トリプシン、およびリン酸緩衝溶液 (PBS) 37 ° C で水のお風呂
  2. セルを通路します。リンスの細胞に料理に皿やピペット 2 mL の PBS から完全に媒体を吸い出しなさい。
    1. ピペットと PBS を削除し、2 mL の PBS で再びセルを洗浄します。
    2. PBS を削除し、それぞれの皿にトリプシン-EDTA (0.25%) の 0.3 mL を追加します。
    3. トリプシンと全体の料理をすぐにカバーし、すぐに削除します。
    4. 料理をお皿からセルをデタッチするのには 1 分の 37 ° C でインキュベーターに入れてください。インキュベーターから皿を取り出し、トリプシンのアクションを終了するに予め温めておいた血清培地 2 mL を加えます。
    5. 再ピペット (5 mL ピペット チップ) と 10 回で単一細胞懸濁液に細胞コロニーを切り離して考えます。
  3. 細胞液 (約 190,000 細胞診断付き) 2 mL を 150 μ L を新しいゼラチン コーティングの皿に転送、3 ml の培地 Vc/PD0325901 たて 6 cm 培養皿ごとの補足。5% CO2と 37 ° C の定温器の細胞を培養します。
  4. 古い培、抱卵中のすべての 24 h を取り外して 2-3 日後 Vc。 期待の 70年-80% の confluency の不安定性による培養皿に新鮮な Vc/PD0325901-媒体の 3 mL を加えます。
  5. 70-80% の confluency に達し後、セルを通過し、2.2-2.4 の手順の説明に従ってそれらの文化に進みます。

3. 凍結し、マウス ES 細胞を解凍

  1. マウスの ES 細胞を凍結します。
    1. 手順 2.2 でトリプシンで皿からセルをデタッチします。
    2. 15 mL プラスチック チューブと 800 × g、室温で 3 分間遠心にセルを転送します。
    3. ビーカーにそっと上澄みをダンプし、焼きたての凍結培地 1 ml の細胞ペレットを再懸濁します。この手順を使用する前に室温であることを確認する前に凍結中 30 分を準備します。
    4. 1 mL ピペットで 1.8 mL 遠心チューブに培地を凍結のセルを転送し、冷凍コンテナーに遠心チューブを配置します。冷凍コンテナーの塗りつぶし線にイソプロピル アルコールを追加使用する前に室温で保管してください。
    5. -80 ° C のフリーザーで凍結容器を一晩おきます。
    6. 2-3 年間液体窒素容器にマイクロ遠心チューブ用を転送します。
      注: 長い凍結中維持セルではなく時間を行い DMSO の毒性による-80 ° C のフリーザーにセルをすばやく転送。
  2. マウスの ES 細胞を解凍します。
    1. あらかじめ暖かい 50 mL 37 ° C の水浴の血清中。
    2. 液体窒素容器からセル含むの瓶を取り出して、37 ° C の水のお風呂にキャップのバイアルを浸します。すぐに解凍し風呂の水にそれを振る。1 mL ピペットで 15 mL チューブにセルを転送します。凍結培地を希釈し、800 x g と 3 分間室温で遠心分離チューブに予め温めておいた血清培養液 2 mL を追加します。
    3. 上澄みを除去し、やさしく 3 ml の新鮮な Vc/PD0325901 培地 5 mL ピペットを使用して細胞ペレットを再懸濁します。
    4. ゼラチン コーティングの皿に 15 mL チューブからセルを転送し、ステップ 2 で説明されているもう一度セル 24 時間培養の細胞の培養します。

4. 細胞から総蛋白を抽出します。

  1. 1 mL の PBS で収集した細胞を洗浄し、800 x g と 3 分間室温で遠心分離します。
  2. 上清を吸引し、軽くピペッティングして DTT、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、PMSF と補われる RIPA バッファーと徹底的に細胞ペレットを再懸濁します。RIPA バッファーの量は、セルのペレット約 5 x です。
    注: は、氷の上セル巻き上がりを実行します。
  3. 氷で 5 分間遠心する 13,000 × g、4 ° C で 30 分間 RIPA バッファー内の細胞を維持します。
  4. 上清を新しいチューブに転送し、-80 ° C で因数を格納
  5. ブラッドフォード蛋白質の試金キットをもつタンパク質の濃度を決定します。

5 酵素を用いた単一ヌクレオシドにダイジェスト DNA と細胞から DNA を抽出します。

  1. 手順 3.1.1 および 3.1.2 トリプシンで細胞を収集します。
  2. 製造元の指示に従って、ゲノム DNA 精製キット、DNA の抽出を実行します。
  3. 1 mL の遠沈管に抽出した DNA を格納します。遠心管に純水の 100 μ L を追加し、約 15 回のピペッティングにより DNA を溶解します。濃度を決定して 260 で吸光度測定による DNA の品質評価 nm と 280 nm15。DNA 濃度は、約 500 ng/μ L です。
  4. ソリューション システムで 50 μ L の DNA のダイジェスト 5 μ g: 100 mM トリス塩酸溶液、pH 7.6 の 5 μ L を追加 (最終濃度: 10 mM)、2 U ふくらはぎ腸アルカリホスファターゼ、1 U DNase 私、0.005 U ヘビ毒ホスホジエステラーゼの私、そして DNA の 5 μ g (計算、測定によると追加されたボリューム赤の DNA 濃度、~ 10 μ L) 遠心管に純水を 50 μ L にソリューションのボリュームの増加。37 ° C で混合物を一晩インキュベートします。1,000 g とチューブの下にソリューションを収集するために 1 分間室温で消化された DNA 溶液を遠心します。
  5. 超濾過管遠沈管から消化の DNA 溶液に転送 (カットオフ分子重量: 3 kDa) と 13,000 g と消化酵素を削除に 30 分間、4 ° C で遠心します。
  6. 5mC と 5hmC の分析用サンプルを準備します。
    1. 5hmC 解析: 新しい遠心フィルター ソリューションのピペット 36 μ L (1 mL) をチューブし、の 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-デオキシシチジン 4 μ L を追加 ([3D]-5hmC) 最終濃度 3 の nM。
    2. 5mC 分析: genomic DNA の 5mC の高密度のためにチューブ (~ 50 倍希釈) に 196 の新しい遠心管に超純水の μ L とフィルター ソリューションのピペット 4 μ L を追加。新しい遠心管に 36 μ L の希釈液を移しの 4 μ L を追加 (5'-(methyl-d3)-2'-デオキシシチジン ([3D]-5mC) 最終濃度 50 の nM。[3D] の使用-5hmC、[3D]-5mC 5hmC と 5mC をそれぞれ調整する内部標準として。
  7. 測定管にサンプル溶液を移し、4 ° C で保存5mC と 5hmC 複数反応 (クロマト ・ MS/MS (MRM)) を監視は、以前レポート15「超高性能液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析法で分析します。

6. 5mC と 5hmC の分析クロマト ・ MS/MS15を使用して

  1. 5mC と 5hmC を分析するためのさまざまなパラメーターを設定 UHPLC MS ソフトウェアを使用しています。
    1. 新しいメソッドを確立します。ソフトウェアを開きをクリックして"ファイル |新しい |メソッド"。「現在のメソッドの変更を保存するか」「メソッドエディター」コンテンツのメッセージ ボックスを展示し「いいえ」をクリックします。
    2. サンプラーのパラメーターを構築します。クリックして"サンプラー |セットアップ |インジェクション」。「標準的な射出」を選択し、「注入量で 5 μ L」を入力します。
    3. UHPLC でポンプのパラメーターを構築します。
      1. クリックして"BinPump2 |セットアップ"ポンプのパラメーターを構築します。「15 分」で「0.25 mL/分」、「時間停止」での「流れ」を設定します。
      2. 「溶剤 B 5%」を設定「圧の制限」"最大 600 bar"を。
      3. クリックして"BinPump2 |時刻表」、イソクラティック溶出の構築パラメーターを 5mC 分析します。行を追加する「追加」をクリックします。「時間」と「B %」で「5.0」で「0.00」を入力します。もう一度、新しい行を追加する「追加」をクリックします。「時間」と「B %」で「5.0」で「15.00」を入力します。
      4. クリックして"BinPump2 |時刻表「5hmC 分析のグラジエント パラメーターを構築しますします。"行を追加する追加をクリックします。時間と 5.0 では、「B %」で 0.00 を入力します。もう一度、新しい行を追加する「追加」をクリックします。「時間」と「B %」で「5.0」で「3.00」を入力します。6 行を追加する別の 6 回の「追加」をクリックします。シーケンスで「時間」と「B %」で「5.0」で「3.01」で「時間」と「15.0」「B %」で、"6.00"「時間」に、「B %」で「15.0」、「6.01」"時間"と"100"で「B %」で、「10.00」で"時間"と"100.0""B %"で、「10.01」"時間"に、"B %"で"5.0"、「15.00」を入力します。
        注: は、5mC と 5hmC UHPLC の異なる分離状況により個別に解析を実行します。
    4. UHPLC 列区画 (TCC) の温度のパラメーターを構築します。
      クリックして"TCC |セットアップ |温度 (左)"と"30 ° C"を入力します。
    5. QQQ MS/MS のパラメーターを確立します。
      1. クリックして"MS QQQ |時間を止める |いいえに制限/としてポンプ"、"イオン源 |ESI」、「時間フィルタ リング |ピーク幅: 0.07 分」。セットアップ"セグメントの時間: 開始時間: 0";「スキャンの種類: MRM";"Div 値: Ms";「デルタ EMV (+): 200」と「デルタ ・ EMV (-): 0"。
      2. 5mC、D3の遷移を監視するパラメーターを構築-5mC、dC、5hmC、および D3-5hmC
        1. クリックして"MS QQQ |買収 |セグメントをスキャン: 住む: 90";"Fragmentor: 90";「衝突エネルギー: 5";「加速電圧をセル: 4」と「極性: 肯定的な"。
        2. 「化合物名」、「前駆イオン」、5mC 解析のため「製品イオン」で「126」で「242」で"5mC"を入力します。右のボタンをクリックし、「行を追加」を選択して新しい行を追加します。入力"D3-5mC」「化合物名」、「前駆イオン」、D3の「製品イオン」で「129」で「245」で-5mC 分析。
        3. 別に同じモードを使用して 3 つの行を補足します。「化合物名」、「前駆イオン」、dC 解析のため「製品イオン」で「112」で「228」で"dC"を入力します。「化合物名」、「前駆イオン」、5hmC 解析のため「製品イオン」で「142」で「258」で"5hmC"を入力します。入力 D3-D3の「製品イオン」で「145」「前駆イオン」で「261」の化合物名で 5hmC-5hmC 分析。
      3. ガス供給源のパラメーターを構築します。クリックして"MS QQQ |ソース |ソースのパラメーター: ガス温度: 300 ° C";「ガスの流れ: 11 L/分";「ネブライザー: 15 psi";「肯定的なキャピラリー: 3500 V」.
      4. 提案手法を保存します。クリックして"MS QQQ |楽器 |保存法として"。「ディレクトリ」で, 提案する経路を選択し、たとえば「法」内容を入力することにより、メソッドの名前を与える: 5mC と 5hmC の分析。
  2. クロマト分離と mononucleosides の MS/MS 分析
    1. 5mC とシトシンの移動相を準備 (C) 解析: 移動相溶液とギ酸の 500 μ L の純水の B. ソリューション a: 500 mL (最終濃度: 0.1%) と 100% メタノールのソリューション b: 500 mL。として 5mC と C (ステップ 6.1.3.3 で設定) を溶出する移動相溶液 A と B 95:5 (v: v) をミックスします。0.25 mL/分 (ステップ 6.1.3.1 で設定) で流量を設定します。
    2. 5hmC 分析用溶剤 A と B は、移動相を準備します。溶剤は 2.0 mM NH4HCO3水溶液 (pH 9.0) (500 mL)、溶剤 B は 100% メタノール (500 mL)。最適化されたグラジエントで独立した 5hmC: 0-3 分、5.0% と 95% (v: v)、3-6 分、15.0% と 85%6-10 分、100 %b;10-15 分、5.0% と 95% (ステップ 6.1.3.4 のセット)。0.25 mL/分 (ステップ 6.1.3.1 で設定) で流量を設定します。
  3. MRM モード (ステップ 6.1.5.1 で設定) とエレクトロ スプレー ・ MS/MS を利用すると、カラムから溶出を分析し、(6.1.5.2.1 のステップで設定) ポジティブ イオン モードを採用します。
    1. 遷移を監視: 5mC m/z 242→126 (衝突エネルギー、5 eV);[3D]-5mC、m/z 245→129 (5 eV);dC、m/z 228→112 (5 eV);5hmC、m/z 258→142 (5 eV);[3D]-5hmC、m/z 261→145 (5 eV) (6.1.5.2.2 のステップで設定)。
    2. +3,500 V (ステップ 6.1.5.3 で設定) で毛細血管とフラグメントの電圧を設定し、90 V (設定手順 6.1.5.2.1 で)、それぞれ。
    3. 5 μ L で注入量を設定し、(ステップ 6.1.2 で設定) 3 回各サンプルを分析します。5mC と 5hmC の量を評価する対応する標準的なカーブを採用してください。
      1. 5mC の標準曲線の確立: 1-50 nM を転送 (1、5、10、20、50 nM、最終濃度) 遠心分離機に 5mC の標準液管し、50 を追加 nM [3D]-チューブに 5mC。補足容量 50 μ L には、5mC サンプル (手順 6) の手順に従って標準的な 5mC の解析を実行します。
      2. 5hmC の標準曲線を構築: 1-20 nM を転送 (1、2、5、10、20 nM、最終濃度) チューブを遠心し、3 を追加する 5hmC の標準溶液 nM [3D]-チューブに 5hmC。補足容量 50 μ L には、5hmC サンプル (手順 6) の手順に従って標準的な 5hmC の解析を実行します。

7. 統計的有意性を分析します。

  1. ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
    1. ソフトウェアを開き、「新しいテーブル ・ グラフ」の"列"を選択します。次のようにパラメーターを設定:"サンプル データ |空のデータのテーブルを含むを開始";「グラフの最初のモードを選択する」;"レプリケートまたは誤差範囲をグラフ |プロット |SEM と意味」。
    2. "A"と"B"の行のコントロールと Vc/PD0325901 治療グループの 3 つの複製をそれぞれ入力して「作成」をクリックします。六つのデータを選択し、「分析」「分析」で] をクリックしてします。
    3. 「列解析」で「t検定 (とノンパラ メトリック検定)」を選択し、、次のインターフェイスを入力して"OK"をクリックしますします。
    4. 次のようにパラメーターを設定:"選択テスト |テストの名前 |対になっていないt検定;オプション |2 つの尾」。"信頼区間: 95%」。「桁 |表示 4 桁」。コントロールと Vc/PD0325901 治療間のp値を取得する"OK"をクリックします。
  2. コントロールと 2 尾と対になっていない学生のtを用いた実験群間の統計的有意性を評価-16のテストします。
    注: p < 0.05 が統計的有意性を有する違いを示します。* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。

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Representative Results

Vc/PD0325901 相乗的マウス ES 細胞の世界的な消去を誘発します。血清中マウス ES 細胞の多能性 ICM 細胞と始原生殖を示す DNA のメチル化の世界的な消去、hypomethylated 状態が密接に関連付けられて、多能性9,10DNA メチル化を展示します。

以前は、我々 と他の Vc がテトを介した 5mC 脱メチル化15,17を高めることができることを発見します。一方、2 i は、5mC のde novo合成を阻害することもわかった。さらにこれらの調査結果のコンテキストで、一緒に Vc と 2 i を用いたマウス ES 細胞の相乗的操作を提案する.UHPLC MS/MS の分析の後、Vc と 2 i は血清含有培地に添加した大幅に削減できます 5mC コンテンツ 3.2 から 100 ° C (~ 90 %5mc 損失) あたり 0.33 に 11 日目、マウス ES 細胞 (図 1 a) がわかった。対照的に、Vc や 2i 治療だけで、1.3 %5mc のレベルで 1.4 %5mc または 61% 削減で安定したレベルで原因 58% 消去がのみ。

2i 媒体は、MEK 阻害剤 PD0325901 と GSK3β 阻害剤 CHIR99021 で構成されます。次に、コンポーネントの Vc と 2 i の共同治療中に 5mC の世界的な損失を誘発するを調べます。興味深いは、Vc/PD0325901 は Vc/2i より DNA のメチル化のレベルで急速な低下を引き起こした。Vc/PD0325901 Vc/2i 11 日目に匹敵するレベルに達している間 5 日後安定した 5mC レベル (~0.33% 5mC) を達成しました。対照的に、CHIR99021 のサプリメントは部分的 Vc トリガー DNA 脱メチル化 (図 1 a) を抑制しました。これらのデータは明らかに 2 i の CHIR99021 は部分的に 5mC の消去を抑制しながら 2i で PD0325901 がマウス ES 細胞のゲノム DNA のグローバルの低いメチル化に貢献する提案します。したがって、私たちは Vc/PD0325901 Vc/2i 基準による高速 DNA 脱メチル化を脱メチル化で CHIR99021 の部分的な抑制に帰因するかもしれないことを推測します。

我々 の仮説、Vc/PD0325901 マウス ES 細胞における 5mC のグローバルの消去は部分的に DNA 脱メチル化の強化に関連する可能性があります。したがって、5mC のゲノムの酸化生成物を調べた。その 5mC は、鉄 (II) と 2-オキソグルタル酸18,19に依存するテト家族 dioxygenases の触媒酸化法による 5hmC に変換できるといわれています。ゲノム 5hmC は、DNA 複製20希釈することがあります。さらに、5hmC はさらにテト dioxygenases 5 formylcytosine (5 fC) を生成するによって酸化することができます 5-carboxylcytosine (5caC)、チミン DNA グリコシラーゼ (TDG) 非メチル化シトシンを回復するために効率的に摘出することができます、これを示すアクティブな DNA と脱メチル化21,22

以前作品15、に沿って Vc を含む治療 (Vc、Vc/2 i、Vc/PD0325901、Vc/CHIR99021) 劇的に頻度の増加 5hmC (5hmC/106 C) 後 1 日、およびその後 5hmC レベルが徐々 に減少した (図 1 b) ために、5mC 基板が徐々 に減少します。特に、Vc/PD0325901 と Vc/2 i 5mC の高速還元 Vc および Vc/CHIR99021 と比較して 5hmC 損失のより高速な速度を示した。さらに、1 日で Vc 治療刺激の 5hmC Vc/CHIR99021、CHIR99021、一部 5hmC の Vc による生産を抑制し、DNA 脱メチル化を抑制を示すと比較してより多くの世代も見ました。2i 治療の 5hmC 損失は、5mC 基板の減少に起因する必要があります。一緒に取られて、これらの結果を示した Vc が強化された DNA 脱メチル化活性は部分的に貢献、Vc/PD0325901 と Vc/2 i の共同治療に相乗的に低いメチル化。

両方のハビビ23 日フォン ・ Meyenn24はまた 2i 条件下でマウス ES 細胞がグローバル DNA 低いメチル化と素朴な多能性を示したことを報告しました。5mC レベルを示したは徐々 に低下し、2i 血清から復帰後 12-14 日間で定常状態 (~ 1 %5mc) に達した。Vc/PD0325901 培養系における共同治療高速 DNA 脱メチル化を引き起こしたし、Vc/PD0325901 の相乗効果により、5 日間の血清中の Vc/PD0325901 の補充後安定したレベル (0.33 %5mc) に達した。ハビビによって報告された 2i 条件下よりもメチル化レベルに達しました (0.33 %5mc) が低かった顕著・ フォン ・ MeyennVc の昇格の発生による 5hmC レベルが高かった中。

PD0325901 の上昇なく Dnmt3a25Dnmt3l、Dnmt3b を抑制する Prdm14 式。PD0325901 のアクションを調べるため 5mC 損失を誘発するのには、5mC 関連蛋白発現のシリーズを検討した、メンテナンス (Dnmt1) およびde novo (Dnmt3a、および Dnmt3b) を含む DNA メチル化酵素とその因子 (Uhrf1 と Dnmt3l) と調節タンパク質 (Prdm14) 8,9,26。西部のしみの分析の後 Prdm14 顕著 PD0325901 含む文化 (図 2) に昇格。対照的に、Dnmt3b とその因子 Dnmt3l は、PD0325901 含む治療 (図 2) でタンパク質発現のダウンレギュレーションがかなりを示した。CHIR99021 治療 Dnmt3l、Dnmt3b、Prdm14 のレベルにわずかな効果を示した。Dnmt3awas の式は変わりませんでした、原因は明らか。さらに、変質も示さなかったメンテナンス DNA メチル基転移酵素 Dnmt1 とそのターゲット要因 Uhrf1 とデータが表示されません。

最近の研究は、Prdm14 (Dnmt3a と Dnmt3b) de novo DNA メチル化酵素などの補助因子 (Dnmt3l) 発現を抑制するいくつかの遺伝子のプロモーターにポリコーム抑圧的な複雑な 2 (PRC2) を募集することができに貢献することを示されています。2i 条件8,27下の低いメチル化を維持します。我々 のデータでは、PD0325901 が Dnmt3b、Dnmt3l を抑制する Prdm14 の発現レベルを昇格され、機構によるde novoゲノム 5mC 合成を減少を明らかにしました。

Vc/PD0325901 条件下でマウス ES 細胞の多能性維持を探索するいくつかのコアの多能性リンク要因の mRNA 発現レベルを検討したとこれらの要因は、多能性28で重要な役割を果たすが確認されています。リアルタイム PCR 解析は、Oct4、SOX2、Esrrb、Sall4 が (図 3 a) 血清文化と対照をなして Vc/PD0325901 治療 5 日間を通して均一な発現レベルを示したことを発見しました。Nanog 及び増加 1.3-fold、1.6、Tcf3 それぞれ。対照的に、Klf4 42% ダウン規制を示し Rex1 のみ約 12% 減少しました。Vc/PD0325901 共同治療; 多能性因子の発現の多様な変化を誘発したことが示唆します。ただし、Oct4、SOX2、ほとんどのコア要素は、式のほぼ一定のレベルを保持しました。

次に、アルカリフォスファターゼ (AP) アッセイは、マウスの ES 細胞は、未分化か分化状態かどうかを評価するために行った。細胞 (図 3 b3 C) の写真は、対物レンズによって 10 倍増幅倒立顕微鏡に接続されたカメラから得られました。血清中の Vc/PD0325901 追加 26 日間連続栽培後は、マウス ES 細胞は均一な形態を示した。また、ほとんどすべての細胞はパープル ブラックは真っ黒、未分化の状態を示す (図 3) の伸長せずボールのような状態を展示します。対照的に、血清の条件下で 26 日マウス ES 細胞の部分が紫がかった黒後染色と形態、ボールのような状態を持っていた白い楕円形破線 (図 3 b); でマークを outspreading と光の色を提示その他これは血清培養マウス ES 細胞、異種の形態と前のレポート13と一貫性のある多能性の状態で示されます。総称して、Vc との組み合わせで PD0325901 が優れた形態とマウス ES 細胞の未分化状態を維持できること、データがサポートされています。

Figure 1
図 1:Vc/PD0325901 相乗誘導ゲノム 5mCin マウス ES 細胞の世界的な消去します。(A) 5mC 周波数 (5mC/C) と (B) 5hmC 周波数 (5hmC/C) 時刻-血清含有 Vc/CHIR99021 や Vc/PD0325901 Vc/2 i 2 i Vc と継続的なサプリメントの 26 日間の治療中に依存して変更中。誤差範囲は、クロマト ・ MS さん c: シトシンによる 3 つの繰り返し解析から標準偏差 (SD) を示しています。この図は、李から変更されています。25.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:(Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3l) Prdm14 と DNA メチル化酵素のタンパク質発現変化します。(左から右に) 示されたバンドにより、得られた血清文化 (コントロール)、Vc、PD0325901、CHIR99021、2 i、Vc/PD0325901、Vc/CHIR99021、Vc/2i 5 日治療それぞれ。 Prdm 14 発現したし、Dnmt3b、Dnmt3l PD0325901 含む培養後減少しました。Dnmt3a は変化を起こしません。Β-チューブリンは、内部参照として設定されました。コン: 制御;PD: PD0325901;CH: CHIR99021。この図は、李から変更されています。25.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:Vc/PD0325901 誘起変質多能性遺伝子の発現およびアルカリホスファターゼの活動。(A) 血清条件 (制御) を基準にして Vc/PD0325901 の 5 日間の治療で部分的な多能性遺伝子のレベルが変更された mRNA。データは、平均 ± SD. 表されました。統計的有意性が評価されたと p < 0.05 が統計的に有意であった。* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001 と ns が有意ではない表されます。PD: PD0325901。26 日 (B) における血清中マウス ES 細胞は血清中の Vc/PD0325901 追加偉大な形態と未分化の状態 (C) を維持したまま、白い楕円形破線でマーク部分の突起を出展しました。これらのイメージは、明るい分野のカメラと接続されている倒立顕微鏡から買収されました。この図は、李から変更されています。25スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

仕事で行った Vc と PD0325901 未分化と hypomethylated 州は、Vc によって DNA 脱メチル化を促進し、 de novo DNA の抑制の相乗作用によって達成されたマウスの ES 細胞を維持するために組み合わせるの手法PD0325901 によるメチル化。また、マウスの ES 細胞は、Vc/PD0325901 文化システムの下で偉大な形態を示した。

良い Vc/PD0325901 培養系におけるマウス ES 細胞の状態を維持、いくつかの重要な手順があります。まず、FBS バッチを見つけるし、最高のバッチを買いだめする事前選別する必要があります。また、血清の交換の頻度は細胞増殖し、多能性の維持に支障をきたすです。第二に、ピペッティング セルに単一細胞懸濁液に細胞コロニーの解離細胞の道の段階の間に避けます。第三に、細胞培養中にトリプシンの悪影響を減衰させる細胞を継代した料理でセルをカバーした直後にトリプシンが除去されるべき。また、Vc/PD0325901 培は Vc の不安定なため毎日置き換える必要があります。

古典的な血清の文化と比較して Vc/PD0325901 条件下でマウス ES 細胞はより均一な細胞集団 (図 3 b, C) と、ICM および PGC のような hypomethylated 状態を表示します。また、2i の最近開発された文化と比較して、高速な反応速度で低いメチル化を実現できるし、単一阻害剤 (PD0325901) の利用細胞への損傷の減少、DMSO の入力量が減ります。ただし、文化システムの政府短期証券のさらに、FBS のアンビバレントなデュアル アクション長期培養中に細胞分化ことがあります。全体的にみて、この新規培養システムは、マウス ES 細胞の大規模なスケールでの維持・拡大に適しています。

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Disclosures

著者は潜在的な利益相反を開示ないです。

Acknowledgments

この作品は、国家自然科学基金、中国の (21435008、h. w. に 21327006) と中国の科学アカデミーの戦略的な重点研究課題によって支持された (h. w. を XDB14030200)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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