蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

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Immunology and Infection

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Summary

Qa-1 (人間の HLA E) は、クラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b 分子のグループに属しています。Qa-1 結合エピトープと予防接種はティッシュ特定の免疫制御が強化され、いくつかの自己免疫疾患を改善するのに示されています。本蛋白質の Qa 1 エピトープの同定のため重複のペプチド ライブラリ戦略について述べる。

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Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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Abstract

Qa-1 (人間の HLA E) は、(MHC Ib) 分子をクラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b グループに属する。最近のデータでは、Qa 1 分子が細胞の構造と機能の整合性を調査、免疫調節の誘導、ウイルス感染に対する免疫応答を制限することにおいて重要な役割を果たすことを示唆しています。また、CD8 の Qa 1 制限の機能増強+ T 細胞エピトープを通じて予防接種がいくつかの自己免疫疾患動物モデル、例えば実験的アレルギー性脳脊髄炎、治療効果を示しています。コラーゲン誘発関節炎と非肥満の糖尿病。したがって、蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープを効率的かつ迅速に識別できる方法のための緊急の必要性があります。ここでは、CD8 の Qa 1 制限を利用するプロトコルについて述べる+ T 細胞の蛋白質の Qa 1 エピトープを決定するための重複のペプチド (OLP) ライブラリの特定行。この OLP ライブラリを含む 15 mer 重複するペプチド、蛋白質の全体の長さをカバーする、11 のアミノ酸によって隣接するペプチドを重ねます。このプロトコルを使用して、我々 は最近ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 9 mer Qa 1 エピトープを識別しました。この新しくマップされたモグ Qa 1 エピトープはエピトープ固有の Qa 1 制限 CD8 を誘導するために示された+ T 細胞その強化されたミエリン特異免疫調節。したがって、このプロトコルは、将来における新たな標的と CD8 の Qa 1 制限の機能に便利+ T 細胞。

Introduction

Qa 1 はマウス (MHC Ib) 分子非古典的な主要な組織適合性の複雑な 1 b のグループに属しています。その人間の相同物 HLA-E のです。証拠はこれまでは、Qa 1 分子が生体の重要な機能であることを示しています。まず、Qa 1 分子構造と機能の整合性のための細胞の調査で重要な役割を果たします。この点、Qa 1 分子は、細胞の正常な機能を監視するいくつかの戦略を進化してきました。このような戦略の 1 つは、Qa 1 分子加工のリーダー ペプチド (エピトープ)、すなわちQa 1 決定修飾子 (Qdm) 小胞体1古典的 MHC Ia 分子から処理されると錯形成できます。これら後の Qa-1/Qdm の複合体は細胞の表面に表示され、アクティビティ2を殺す NK を抑制する NK 細胞の抑制性 NKG2A 受容体にバインドします。Ia MHC 分子の発現が失われた場合 (例えば悪性細胞) は2を殺す NK に敏感になります。その他の方法により、タップ (抗原処理に関連付けられているトランスポーター) に欠けている細胞の表面の新しい Qa 1/抗原複合体を形成する Qa 1 分子3および/または ERAAP (小胞体アミノペプチダーゼに関連付けられています。抗原処理)4 (両方の欠陥はしばしば悪性細胞に発生します)。これらの新しい Qa 1/抗原複合体を表現する細胞認識およびエピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限によって除去できる+ T 細胞。第二に、Qa 1 分子免疫制御5を誘発します。この点、Qa 1/抗原複合体は、CD8 を刺激するために示されている+自己組織6,7,8 の免疫介在性損傷の防止にとって重要な細胞 (Treg) T、9,10。第三に、Qa 1 制限 CD8+ Treg 細胞はウイルス感染11に対する免疫応答を制限する示されています。

したがって、エピトープ特異 Qa 1 点 CD8 の特定豊胸+ T 細胞は異常細胞の排除、免疫制御の強化との大きさの制御可能性のある有望な戦略ウイルスによる免疫応答。一方、それかどうか決定されていない豊胸エピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限の+ T 細胞は免疫監視を強化でき、ウイルスによる免疫応答を制限、研究所施設、その他ことが明らかQa 1 エピトープと予防接種は CD8 の Qa 1 制限の機能を増やすことが+ Treg 細胞病原性自己免疫性 cd4 陽性の特定+ T 細胞、CD4 の効率的な管理に至る+で T 細胞による自己免疫疾患、さまざまな動物モデルの実験的アレルギー性脳脊髄炎 (人間多発性硬化症の動物モデル)6,10、コラーゲン誘導関節炎 (ひと関節リウマチの動物モデル)7などと非肥満の糖尿病 (ヒト 1 型糖尿病の動物モデル)8。さらに、我々 は免疫組織固有の Qa 1 エピトープが CD8 の増強によってその組織の免疫炎症の特定のコントロールにつながることを発見した+ Treg 細胞12。前臨床試験の上記の成功が Qa 1 エピトープ免疫組織特異免疫介在性疾患の治療のため、潜在的タップの欠陥に関連付けられている他の疾患の治療のための完全な評価の必要性を示すとERAAP。

したがって、蛋白質の Qa 1 エピトープを確実かつ迅速に分析できる技術の需要があります。この点では、生物学的に重要な Qa 1 エピトープの限られた数が記載されています。これら Qa 1 エピトープのほとんどは CD8 の研究中に偶然に識別された+ T 細胞の反応惹起6、原因になるセル セル ERAAP4、欠損、タップ3欠損細胞細菌13 9。したがって、高スループット方法が定義されたタンパク質の生物学的に重要な Qa 1 エピトープの同定のため望ましいです。以下では、マップを使用して Qa 1 resrticted CD8 蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープ重複のペプチド (OLP) ライブラリ戦略について述べる+ T 細胞ライン OLP プール (OLP_pool) 蛋白質のために特定します。

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Protocol

すべての実験は、機関動物愛護と動物の世話とテキサス大学エル ・ パソとロマリンダ大学で利用委員会によって承認プロトコルを使用に準拠して行われました。

1. タンパク質の全体の長さをカバー OLP ライブラリの生成

  1. すべてのペプチドが、長さ 15 mer でその後隣接するペプチドを重複 11 アミノ酸 OLP ライブラリを設計します。
    注: モグ OLP 研究でモグ前駆体 [ハツカネズミ] のシーケンスから取得された NCBI タンパク質データベースこのリンクに従うことによって: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944。報告された Qa 1 (e) HLA 抗原のほとんどが信号ペプチド (例えば Qdm1) に位置していたために、信号と成熟したペプチドを含んだモグ前駆体 (247 アミノ酸) が使用されました。その N 末端から始まる、15 mer ペプチドの配列された 11 アミノ酸 (図 1) によって 2 つの隣接するペプチドがオーバー ラップするように識別されます。したがって、まさに 59 OLPs は MOG の 247 のアミノ酸前駆体で識別されました。一方、最後の OLP 12 蛋白質の長さに応じて 15 mer に範囲することができます。私たちと他の人は 15 mer ペプチド, マクロファージ, 樹状細胞 (Dc) に追加されたときが効率的にすることができます示されているので 15 mer ライブラリの選択また、CD8 による認識エピトープへの処理+ T 細胞14,15.
  2. 商業それぞれの個々 のペプチドを購入します。ペプチドあたり 5 mg はスクリーニングのために十分にする必要があります。OLPs と切り捨てられたペプチド (ステップ 6.1) は、脱塩ペプチド (純度は約 50-70%) をすることができます。四量体の生成と将来の生物学的分析のために使用する最適なペプチド (ステップ 6.2) の純度をする必要があります > 90%。無菌条件下でペプチドを再構成します。
  3. 100 %dmso で 50 mg/mL の個々 のペプチドの株を作る。各チューブに DMSO の 100 μ L ミックス、および-20 ° C でペプチドを格納、各ペプチドの 5 mg を追加これらの株式は、CD8 の世代のための OLP_pool ストックを作るに使用される+ T 細胞ライン、OLP_pool に反応。さらに、これらの株式は 10 mg/mL を個々 のペプチド株式 OLP_pool 反応性 CD8 の Qa 1 制限の応答を刺激するためにそれぞれの個々 のペプチドの機能を決定するためにも使用する+ T 細胞。
  4. 新鮮な管に各ペプチドの等しい量を追加することにより作る OLP_pool ストック。この OLP_pool 株式には 100 %dmso が含まれます。モグ OLP 研究 59 OLPs12があった。したがって、各ペプチド、OLP_pool の濃度は、847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) でした。
  5. 希釈 (5 x) 10 mg/mL の個々 のペプチドの株を作る 50 mg/mL 滅菌 H2O (この株式は、20 %dmso を含んでいる) V 下 96年ウェル プレートで入荷。8 または 12 チャネル マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートでそれぞれの個々 のペプチドの Qa 1 制限応答の決定を実行するため、これらの株式を 96 ウェル プレートで作る。
    注: OLPs と切り捨てられたペプチドを含むすべてのペプチドはどちらか V 下 96年ウェル プレートで薄めるべきまたは 96 ウェル サンプル ラック充填 1 mL 管ペプチド ライブラリ スクリーニングがマルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートで行われるので.場合は、ペプチドを希釈、ペプチドを溶解するために賢明な 1 N 水酸化ナトリウム滴を追加することは困難です。

2 K のプライミングb-/- Db-/- CD8+ OLP_pool パルス K と T 細胞b-/- Db-/-樹状細胞 (Dc)。

注: 2 つの主要な Qa 1 の対立遺伝子がある: Qa 1、1 つは、他の Qa 1bです。一般的にアカデミックな研究に使用される動物、例えばC57BL/6 および Balb/c マウスを運ぶ Qa 1b、このプロトコルは蛋白質のマッピング Qa 1bエピトープの手順を説明します。CD8+ T このプロトコルでセルは K から浄化されるb-/-Db-/-マウス (C57BL/6 背景) が CD8+ T 細胞は主に Qa 1 を含む非古典的 MHC Ib 分子によって制限されています。

  1. 上記12として骨髄由来の Dc を生成します。
    1. 簡単に言えば、RPMI 10 媒体 (10% 牛胎児血清 5.5 x 10-5 M 2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム 1 mM、0.1 mM 非必須アミノ酸添加 RPMI 1640) 骨髄単一細胞懸濁液 (1 x 10 の6セル/mL) の文化します。10 U/mL il-4, 100 U/mL 37 ° c、5% CO26 ウェル プレート (4 mL/ウェル) に GM-CSF を含みます。
    2. 2 日後は、慎重に非付着性のセルを削除し、新鮮なメディアとサイトカインを追加します。
    3. 別の 2 日間、細胞を培養後、新しい 6 ウェル プレートに新鮮なメディアとサイトカインを含む非付着性のセルを転送します。
    4. 別の 2 日間、細胞の培養し、新鮮なメディアと LP を含むサイトカインを補充 (0.1 μ g/mL) Dc をアクティブにします。
    5. 24 h 後、実験のため Dc を収集します。
  2. 3000 ラドと Dc を照射します。
    1. また、マイトマイシン C と Dc (5 x 107セル/mL) の治療 (50 μ g/mL) 20 分の 37 ° C で PBS でチューブ (〜 12 mL) を記入し、g. 破棄清と repea x 300 でテーブル トップ遠心分離機で 10 分のセルをスピン RPMI-0 (血清なし RPMI 1640 年) を追加t 2 回以上洗浄方法。これらの 3 つの洗浄に欠かせない+ T 細胞 DC T 細胞共培養中にマイトマイシン C の任意のトレース量が cd8 陽性の反応を抑制するため。
  3. 5 x 106セル/ml 無血清培地 (目的 V 無血清培 10-5 M 2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム 1 mM、0.1 mM 非必須アミノ酸 x 5.5) に DC の濃度を調整します。
  4. Dc への 100 %dmso が含まれており最終の DMSO 濃度は 0.5% (200 x) になります OLP_pool 原液を追加します。モグ OLP 研究で、OLP_pool 各 OLP の濃度は 847.46 μ g/ミリリットルです。したがって DC 文化各 OLP の最終濃度 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) であった。
しかし、細胞培養の DMSO 濃度 1% 未満の残っている限りこの濃度を 100 μ g/mL まで拡張できます。
  • Dc 3 時間室温で孵化させなさい、優しく 15 分毎にセルを振る。
  • この潜伏期間中に浄化 CD8+ T 細胞収穫脾臓または K のリンパ節からb-/-Db-/-商業 CD8 を用いたマウス+ T 細胞の精製キット、10 x 106セル/ml に細胞濃度を調整50 U/mL のインターロイキン 2 (IL-2) と IL-7 の 100 U/mL を含む無血清培。
  • 今、CD8 を追加 0.5 mL/井戸として 48 ウェル プレートに+ T 細胞 (0.5 mL/ステップ 2.8、CD8 の最終的な集中で OLP_pool パルス Dc の付加の後で+ T 細胞は 5 x 106セル/mL になります)。
    注: CD8+ T、製造元から提供された指示に従って、CD8 陽性分離キットを使用してマウス脾臓およびリンパ節細胞を浄化することが。CD8+ T 細胞はビーズの無料。
  • スピン ・ ダウンした再構成で OLP_pool パルス Dc (300 × g, 10 分) 2 x 106セル/ml 無血清培地に OLP_pool パルス Dc と CD8 を含む 48 ウェル プレートに 0.5 mL/ウェルを追加+ T 細胞 (OLP の最終濃度_pool パルス Dc は 1 × 106セル/mL、CD8 の最終的な集中+ T 細胞は 5 x 106セル/mL、IL-2 の最終濃度が 25 U/mL と IL-7 の最終濃度が 50 U/mL)。37 ° C と 5% の CO2の細胞を培養します。
  • 4 日目、削除および培地の約 400 μ L を破棄し、100 U/mL IL-2 と IL-7 の各井戸の 100U/mL を含む新鮮な無血清培地の 500 μ L を追加します。37 ° C と 5% の CO2のセルを孵化させなさい。
  • 7 または 8 日再活性 OLP_pool 先読み CD8+ T 細胞、OLP_pool。
  • 3. メモリセル プライミング CD8 の再刺激+ T 細胞マクロファージとパルス、OLP_pool

    1. 4 日 OLP_pool 先読み CD8 の再刺激前に+ T 細胞, 2% (v/v) ポリアクリルアミド ビーズ ソリューションの準備: エンドトキシン フリー 20 mL で 2 回ポリアクリルアミド ビーズの 2 g を洗って H2O または PBS。5 分 (400 x g) 遠心分離によってポリアクリルアミド ビーズをペレットし、100 mL の PBS に再懸濁します。室温で 20 分ストア 15 lb/m オートクレーブ。
    2. マウスを単球/マクロファージの腹腔内16への移行を誘致するための無菌 2% ポリアクリルアミド ビーズ溶液の 1 mL/マウスの腹腔内に注入します。
    3. 4 日後、CO2の過剰摂取によって動物を犠牲します。
      1. 無菌条件下で開口部が十分な腹部の中央に小さな開口部をカット 5 mL 転送ピペットを渡すため。RPMI 0 転送ピペットを入力し、開口部を通って腹部キャビティにピペットを挿入します。
      2. ピペッティングによる腹部キャビティをすすいでください。腹部キャビティからできるだけ多くの液体を (これらはマクロファージ) 生殖不能の管にピペットの。洗浄手順 4-5 回繰り返します。
    4. 3000 ラドと腹腔マクロファージを照射します。
      1. また、扱うマイトマイシン C 併用腹腔マクロファージ (ステップ 2.2 で説明されている手順に従ってください)。
    5. 5 x 106セル/ml 無血清培地にマクロファージの濃度を調整します。(最終の DMSO 濃度は 1% 未満) OLP_pool 在庫と M-CSF を追加 (最終濃度 100 U/mL を =)。
      注: このモグ OLP の研究では、0.5 %dmso を使用しています。したがって、モグ OLP_pool 在庫だった (例えば1 モグ OLP_Pool 腹腔マクロファージの 199 μ L に追加された在庫の μ L) x 希釈 200 です。したがって、各 OLP の最終濃度が 4.2 μ g/mL)。
    6. 48 ウェル培養皿で 200 μ L/ウェル (1 x 106細胞/ウェル) を追加し、37 ° C 4 h でプレートを孵化させなさい。
    7. 予め温めておいた RPMI 0 200 μ L/ウェルと穏やかな洗浄によって非付着性のセルとポリアクリルアミド ビーズを削除します。
    8. プール、OLP_pool の収集とプライミング CD8 ステップ 2.10 から+ T 細胞します。調整、OLP_pool プライミング CD8+ 1 x 10 の6セル/ml 25 U/mL IL-2 と IL-7 の 50 U/mL を含む無血清培地に T 細胞濃度。OLP_pool パルス腹腔マクロファージを含む 48 ウェル プレートに 1 mL/ウェルを追加します。
    9. 4 日後、48 ウェル プレート内の媒体を補充します。取り外して 48 ウェル培養皿で培養液の約 400 μ L を廃棄します。各ウェルに新鮮な無血清培地含む 100 U/mL の IL-2 500 μ L と IL-7 の 100 U/mL を追加します。37 ° C と 5% の CO2の細胞を培養します。
    10. 3、4 日後、確認 OLP_pool よみがえって CD8+ T 細胞 OLP_pool 固有の Qa 1 制限対応 immunospot の酵素試金 (しなさい)。これ以降、再活性 CD8+ T 細胞ごとに 7-10 日間。
      注: マクロファージ OLP_pool 先読み CD8 の再刺激に適している+ T 細胞。我々 は気づいた CD8+ T 細胞マクロファージによって再刺激された Dc体外よりよく育った。

    4. OLP_pool 固有の定量、Qa 1 制限応答 OLP_pool よみがえって CD8 T 細胞ラインの+

    注: OLP_pool 固有の Qa 1 制限応答 OLP_pool よみがえって CD8+ T 細胞は、肝腎分泌 C1R または C1R の存在下で OLP_pool によって次の刺激によって決まります。肝腎しなさいアッセイを使用して Qa 1b細胞。C1R 細胞は商業的に入手できます。C1R。Qa 1b細胞は、Qa 1 レンチウイルスベクターと C1R 細胞の伝達によって生成できます。

    1. 追加しなさいプレートのウェルにコーティング バッファー (PBS) で希釈したキャプチャ抗 IFN-γ 抗体の 100 μ L/ウェル。
    シールし、4 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
  • 2 日目、キャプチャ抗 IFN-γ 抗体を含むコーティング バッファーを破棄し 200 μ L/よく blocking ソリューション (無血清培地) を追加し、室温で 2 時間版を孵化させなさい。
  • C1R と C1R を照射します。9,600 ラドと Qa 1b細胞。
    1. また、C1R と C1R を扱います。マイトマイシン C 処理時間は 30 分になりますが手順 2.2 で説明するように Qa 1b細胞。
  • C1R と C1R を調整します。4 × 10 の6セル/mL に無血清培地における Qa 1b細胞。
  • プレートのブロッキング液を捨て、C1R と C1R を追加します。50 μ L/ウェル (200,000 細胞/ウェル) とミックスで Qa 1b細胞。
  • 50 μ L/ウェルの 100 倍希釈 OLP_pool 入荷 (無血清培地) を追加し、ミックスが適切。プレート 2 3 時間室温で孵化させなさい。
  • OLP_pool よみがえって CD8 を調整+ T 細胞の IL-7 の 150 U/mL を含む無血清培地に 10 の6セル/mL x 1-2 に、プレートに 50 μ L/ウェル (50,000-100,000 細胞/ウェル) を追加。プレート (58 x g) 5 分間を遠心します。
  • 37 ° C と 5% の CO2でプレートを一晩インキュベートします。
  • 細胞懸濁液を吸い出しなさい。純水 (DI) (250 μ L/ウェル) で 2 回洗浄します。各洗浄ステップで 5 分間浸漬する井戸を許可します。
  • 洗浄バッファーで洗浄井戸 3 回私 (0.05 %tween20 を含む PBS)。各洗浄ステップで 1 分間浸漬する井戸を許可します。洗浄バッファーを破棄します。
  • 検出抗体希釈バッファー (10% 牛胎児血清 (FBS) を含む PBS) で希釈した 100 μ L を追加します。
  • 2 時間室温で版を孵化させなさい。
  • 検出抗体溶液を破棄します。3 回各洗浄ステップで 1 分間浸漬する 250 μ L/ウェルを洗浄バッファー i. を許可井戸と井戸を洗浄します。
  • 1: 100 希釈で希釈バッファーで希釈した酵素共役 (ストレプトアビジン-HRP) の 100 μ L/ウェルを追加します。
  • 室温で 1 時間版を孵化させなさい。
  • 酵素共役ソリューションを破棄します。各洗浄ステップで 1 分間浸漬する 250 μ L/ウェルを洗浄バッファー i. を許可井戸を 4 回洗浄します。
  • 250 μ L/ウェルを洗浄バッファー II (PBS) で 2 回洗浄します。
  • 各ウェルに 100 μ L の基板の解決 (ミックス 1 ドロップ = 20 μ L AEC 発色の AEC 基板の 1 ml) を追加します。5 に 60 分間スポット開発を監視します。
  • 目的の結果を表示する開始、蒸留水と井戸を洗浄することにより基質反応を停止します。
  • 2 時間室温で板を空気乾燥またはそれが完全に乾燥するまで一晩します。皿の下のプラスチックのトレイの取り外しは乾燥を促進します。解析まで、暗闇の中で密閉されたビニール袋にプレートを格納します。
  • 解剖顕微鏡の下で検査しなさいプレート リーダーを使用して、手動でスポットを列挙します。図 2に代表的な結果を参照してください。
  • 5. OLP_pool 固有 CD8 Qa 1 制限の IFN-γ の分泌を刺激する、OLP_pool の個々 のペプチドの定量+ T 細胞

    1. OLP_pool 固有の OLP_pool 固有 CD8 の Qa 1 点 IFN-γ の分泌を刺激する個々 のペプチッドを決定する+ T セルライン上記を使用して説明しなさい IFN-γ アッセイ (最終濃度使用それぞれの個々 のペプチドのELISOPT のアッセイは、10 μ g/mL)。図 3に代表的な結果を参照してください。
      注: OLP 特定、Qa 1 restircted 応答は、C1R の存在下で応答の少なくとも 3 回は、応答として定義されます。Qa 1b細胞が、OLP なし。モグ OLP 研究、OLP68、OLP96、および OLP105 のすべてはこの基準を満たします。したがって、3 つすべての OLPs 含む Qa 1 エピトープ12 (図 3)。しかし、OLP105 は一貫して強い応答を与えたしたがって、OLP105 の詳細な分析を行った (図 4および図 5)12

    6. OLP_pool 固有 CD8 のエピトープに固有の Qa 1 制限の応答を刺激する 15 mer OLP の最適な Qa 1 エピトープの同定+ T 細胞

    1. 図 4に示すように、15 mer OLP の C と N-末端切り捨てペプチドを合成します。
    2. OLP 固有 CD8 の IFN-γ の分泌を調べる+ T 細胞 CD8 を刺激することによって線切り捨てられたペプチドとして親 15 mer OLP C1R または C1R の存在下での+ T 細胞します。上記を使用して Qa 1b細胞は、IFN-γ しなさいアッセイをについて説明します。なさいアッセイ用各個々 のペプチドの最終濃度は 10 μ g/mL です。ペプチドは最適な Qa 1 エピトープとして定義されている場合、ペプチド: 1) 一貫して C1R の存在下で、元の 15 mer ペプチドと比較すると、類似または強い IFN-γ 応答を与えます。Qa 1b細胞;2) 8 - 10 mer (優先 9 mer ペプチド) 間は MHC に結合ペプチドの長さである-私の分子15,17図 5代表の結果を参照してください。

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    Representative Results

    蛋白質の全体の長さをカバー OLP ライブラリのデザイン

    15 アミノ酸 (15 mer) タンパク質の N 末端から始まる、各ペプチドです。したがって、最初のペプチド 15 の位置に 1 の位置に します。2 番目のペプチドの N 末端は 11 アミノ酸によって最初のペプチドの C 末端と重複します。したがって、2 番目のペプチドにまたがる位置 5 ~ 19。(図 1) タンパク質の C 末端の端に、ペプチドの残りの部分をデザインします。私たちと他の人は 15 mer ペプチド, マクロファージ, 樹状細胞 (Dc) に追加されたときが効率的にすることができます示されているので、我々 は 15 mer ライブラリを選んだ CD8 による認識エピトープへの処理+ T 細胞14,15。ライブラリ内の OLPs の数は、蛋白質の長さによって異なります。さらに、最後の OLP 蛋白質の長さに応じて 15 mer 12 から範囲です。たとえば、ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ)、247 アミノ酸の長さです。モグ OLP ライブラリには、59 OLPs12が含まれています。本稿で示された代表的な結果は、モグ OLP ライブラリの分析からです。

    OLP_pool 固有の Qa 1 制限 OLP_pool 刺激 CD8 反応の定量+ T 細胞

    CD8 を生成した+ K で準備万端だった T 細胞ラインb-/-Db-/- Dc およびモグ OLP_pool (MOG_pool) とパルス MOG_pool パルス K によってよみがえってb-/-Db-/-腹腔マクロファージに記載されている、前述のプロトコル (プロトコル 1、2、および 3)。この CD8 の潜在的な MOG_pool 固有の Qa 1 制限の対応を決定する+ T 細胞ライン、この CD8 の応答を調べた+ C1R または C1R の存在下で MOG_pool に T 細胞ライン。Qa 1b細胞は IFN-γ しなさいアッセイ (プロトコル手順 4) (図 2) を用いたします。私たちのデータが示唆された MOG_pool 刺激 CD8+ T 細胞分泌される IFN-γ C1R の存在下での低レベル。Qa 1b細胞 (32 スポット形成細胞または SFCs) しかし、C1R セル (2 SFCs) ではなく+ T 細胞での Qa-1 結合エピトープ C1R 細胞 (C1R 細胞はヒト B リンパ芽球様細胞) 由来の回答の CD8 の存在を示唆しています。C1R 細胞 (78 SFCs)、井戸の中に、MOG_pool が追加されたとき、SFCs が増加した CD8 の存在を示唆している+ T 細胞非 Qa 1 エピトープへの回答します。SFCs は、C1R を含まれている井戸の中に、MOG_pool が追加されたときに劇的に増加しました。Qa 1b細胞 (320 SFCs)、CD8 の存在を示唆している+ T 細胞の Qa 1 結合ペプチドへの回答します。データはまた、MOG_pool に Qa-1 結合 epitope(s) が含まれていることを示します。

    OLP_pool 反応性 CD8 の Qa 1 制限 IFN-γ 分泌に寄与する、OLP_pool の個々 のペプチドの定量+ T 細胞

    MOG_pool 反応性 CD8 の Qa 1 制限の IFN-γ の分泌を誘導する OLP_pool のペプチドを決定する+ T 細胞ライン、我々 は MOG_pool 反応性 CD8 を刺激+ T 細胞存在下でいずれかの C1R 個々 59 OLPsまたは、C1R。Qa 1b細胞 (プロトコル手順 5) (図 3)。我々 のデータは、C1R セルには、OLPs が含まれている井戸にいくつか SFCs がみを示した。対照的に、SFCs は C1R に含まれているすべての井戸で増加しました。Qa 1b細胞と、OLPs。図 2から私たちが学んだこと CD8 C1R の存在下で+ T 細胞します。また、Qa 1bだけでは SFCs を形成しました。したがって、ほとんど井戸増加 SFCs 非特異的刺激 Qa 1 分子による C1R 細胞における細胞内タンパク質から派生した Qa 1 エピトープのプレゼンテーションの結果可能性があります。ただし、図 3 (B8、D12 と E9)、3 のマッチ 3 の組み立てられた井戸の OLPs、図 3 a (OLP68、OLP96、および OLP105) で OLPs をハイライトとして OLP 固有の Qa 1 制限の IFN-γ 応答を定義するための基準を満たしてプロトコル手順 5.112で説明します。3 OLPs に Qa 1 epitope(s) が含まれていることが示唆された.以来、OLP105 は、最高レベルの対応を一貫して生産、OLP10512の詳細な分析を行った。

    15 mer OLP の切り捨てられたペプチド ライブラリのデザイン

    OLP_pool 反応性 CD8 の Qa 1 制限の IFN-γ の分泌を刺激するために判断された 15 mer OLP+ T 細胞は切り捨てられたペプチド ライブラリを使用して最適なエピトープを分析する必要があります。このような切り捨てられたペプチッド ライブラリは、徐々 に 1 アミノ酸で、N と C の末端 (図 4) によって 15 mer OLP を切り捨てることによって設計されています。他に似たような MHC クラス I 分子は、Qa 1 分子は、主に 8 - 10 mer ペプチドに結合します。したがって、最短の切り捨てられたペプチドである 6-mer の長さをお勧めします。

    OLP_pool 反応性 CD8 の Qa 1 制限の IFN-γ の分泌を刺激する 15 mer OLP の最適な Qa 1 エピトープの同定+ T 細胞

    上記の N- と C 末端切り捨てペプチドが CD8 の刺激の IFN-γ の分泌で強度のテスト+ T 細胞ライン、OLP_pool または上記 IFN-γ しなさいを使用して 15 mer OLP の特定。モグ12Qa 1 エピトープにおける CD8 を生成した+がモグ OLP105 T 細胞株 (図 5 a)。さらに分析は、プロトコル手順 (図 5 b) 6.2 で説明した、N 末端切り捨てられた 9 mer ペプチドとして最適なエピトープの 2 つの基準を満たしていることを実証しました。したがって、9 mer が N 末端切り捨てことと結論したペプチドは最適な Qa 1 エピトープ。

    Figure 1
    図 1: 蛋白質の全体の長さをカバー OLP ライブラリのデザイン。N 末端から始まる、15 アミノ酸 (15 mer) の長さのペプチドが同定されました。最初のペプチドを除いて、各ペプチドの N 末端は 11 アミノ酸によって以前のペプチドの C 末端とオーバー ラップ。

    Figure 2
    図 2: MOG_pool 刺激 CD8+ T 細胞が部分的に MOG_pool、Qa 1 制限12体外CD8+ T モグ OLP_pool (MOG_pool) で刺激した細胞は C1R または C1R の存在下で MOG_pool への応答を調べた。Qa 1b細胞抗原提示細胞の IFN-γ しなさいアッセイを用いたのです。代表しなさいイメージが表示されます。スポット形成の細胞 (SFCs)、各井戸の左上隅に表示されます。CD8+ T 細胞: 50,000 細胞/ウェル。C1R または C1R。Qa 1b細胞: 200,000 細胞/ウェル。

    Figure 3
    図 3: Qa 1 を担当された、MOG_pool で OLPs の解析が応答を制限します(A) 10 mg/mL に含まれている V 下 96年ウェル プレートのレイアウト個々 のモグ OLPs。井戸の中の数字は、OLP Id を表されます。強調表示された 3 井戸には、OLP 固有の Qa 1 制限 IFN-γ 応答プロトコル手順 5.112に記載されている基準を満たしている OLPs が含まれています。(B)代表 SFCs、OLP に含まれる各井戸 (最終濃度 = 4.2 μ g/mL、OLP ID と"A"で一致)、MOG_pool 反応性 CD8+ T 細胞 (50,000 細胞/ウェル) と C1R 細胞 (200,000 細胞/ウェル)。(C)代表 SFCs、OLP に含まれる各ウェルに (最終濃度 = 4.2 μ g/mL、OLP ID と"A"で一致)、MOG_pool 反応性 CD8+ T 細胞 (50,000 細胞/ウェル) と C1R。Qa 1b細胞 (200,000 細胞/ウェル)。3 フレームの井戸には、OLP 固有の Qa 1 制限 IFN-γ 応答12の基準を満たしている OLPs が含まれています。図は参照12から適応されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 4
    図 4: 15 mer ペプチドの切り捨てられたペプチッドのデザイン。15 mer ペプチドは、6 mer に 1 アミノ酸によって N と C の - テルミニでを徐々 に切り捨てられました。15 mer とその切り捨てられたペプチドを合成した、.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 5
    図 5: OLP105 に最適な Qa 1 エピトープの解析。(A) OLP105 刺激 CD8 反応 OLP68、OLP96、C1R または C1R の存在下で OLP105 と+ T 細胞を調べた。Qa 1b細胞の IFN-γ しなさいアッセイを用いたします。代表 IFN-γ SFCs (左上隅の数字) が表示されます。(B) OLP105 固有 CD8+ T 細胞 (A) に示すように調べた個別 N- と C 末端切り捨てペプチドへの応答の図 4C1R の存在のよう。Qa 1b細胞の IFN-γ しなさいアッセイを用いたします。OLP105: 15 mer OLP。N6-14:、OLP105 ペプチド N 末端切り捨てられます。C6-14: C 末端 OLP105 ペプチドを切り捨てられます。CD8+ T 細胞: 50,000 細胞/ウェル。C1R。Qa 1b細胞: 200,000 細胞/ウェル。T 細胞 SFCs 50,000 CD8 あたり+をしたコーナーを左上に番号を付けます。赤い四角形は、6.2 プロトコル手順の説明に従って、OLP の最適な Qa 1 エピトープを定義するための基準を満たしてもマーク。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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    Discussion

    ここでは、蛋白質の Qa 1 エピトープの分析のためのプロトコルを説明しました。このプロトコルに関連していくつかの他の方法は既に報告もしました。まず、同種の CD8+ T 細胞とクローンは Qdm1の識別のために使用されました。第二に、Qdm の解析から推定される Qa-1 結合モチーフは HSP60p216 224 と TCRBV8.1 エピトープ9,18の同定に使用されました。第三に、個別の重複するペプチド蛋白質からは、動物を免疫に使用されました。その後、CD8+ T 細胞免疫動物から分離された、TCRBV8.2 ペプチド p42-50 Qa 16,10,19へのバインドの確認された後を識別するために使用されました。第四に、機能的な CD8+ T 細胞 cDNA ディスプレイ ライブラリと組み合わせて行された FL9 Qa 1 エピトープ4の識別に使用されます。

    前の同種 CD8 の使用の技術を参考+ T 細胞ラインし、5 月のクローン免疫生理時に提示された Qa 1 エピトープの分析には適さない。また、蓄積されるデータは、前述の結合モチーフが部分的にしか Qa 1 分子のペプチド結合容量を表すことをお勧めします。したがって、正確な Qa-1 結合モチーフはまだ知られていない4。さらに、Qa 1 エピトープの同定のための個々 のペプチドの免疫は骨の折れるです。最後に、cDNA ディスプレイ ライブラリ戦略には、セルの transfection のため別のペプチドの長さを運ぶ多くのベクトルの建設が含まれます。対照的に、ここで説明 OLP ライブラリ戦略は単純で、マップされたペプチドは、Qa 1 制限 CD8 を刺激するために知られている+ T 細胞。したがって、私たちの戦略は、ユニークな利点を持っています。

    説明されている方法を使用して OLP_pool 固有 CD8+ T 細胞の in vitroプライミングとメモリセル再刺激によって生成します。CD8 の代替ソース+ T 細胞は k のリンパ節を排水からすることができますb-/-Db-/-ソース タンパク質20で免疫したマウス。このような免疫の CD8+ T 細胞は IFN-γ 応答に OLPs と Qa 1 エピトープの同定に切り捨てられたペプチッドを調査します。理論的には、生体内で免疫 CD8+ T 細胞は CD8 を生成体外よりも生理的状態に近い+ T 細胞。しかし、我々 はその免疫 CD8 の応答を発見+ T 細胞免疫マウスから直接精製された選考結果満足できるペプチドの restimulations 弱いとしばしば必要な体外。さらに、このプロトコルは、HLA E 抗原前記生体内で免疫が実用的ではない人間の研究に将来翻訳向けです。

    技術的には、このプロトコルの重要な部分は CD8 の世代+ T 細胞ライン、OLP_pool または個々 の OLP の固有します。以来、Qa-1/ペプチド複合体が安定しない古典的 MHC ペプチド複合体21、抗原提示細胞は、OLPs やペプチド パルス後に比べてパルスの細胞が広範囲洗っていない必要があります。我々 は失うまたは CD8 を刺激する能力を大幅に削減の広範囲に洗浄する場合をペプチド パルス細胞を発見した+ T 細胞。したがって、前に CD8 と共培養すると、すぐに一度細胞ペプチド パルス抗原提示を洗浄をお勧め+ T 細胞。

    また、Qa-1/ペプチド複合体の不安定のためお勧めしますペプチド パルスの無血清培地の使用と CD8 の刺激+ T 細胞。さらに、我々 は定期的に CD8 中 IL-7 の 50 U/mL を追加+ T 細胞培養と同様、アッセイの IFN-γ しなさい間。IL-7 の目的は生存率および CD8 の機能を維持するために+ T 細胞。IL-7 自体は CD8 を刺激しない+ T 細胞の IFN-γ を生成します。

    すべての戦略と同様に、この戦略によってマップされた Qa 1 エピトープもさらに必要調査生物学的意義のため。たとえば、1 つの重要な問題は、マップされたエピトープをかどうか生理に表示できます。この問題に対処するため Dc はエピトープ ソース蛋白質 (例えば、MOG OLP の MOG 研究) を表現するレンチウイルスベクターを導入することができます。エピトープ特異 CD8 の応答後、+ T 導入された Dc に細胞を調べた。肯定的な反応では、エピトープが生理学的処理され、DCs によって提示を示唆しています。また、CD8 によるエピトープ認識結果として機能的な結果+ T 細胞をさらに調べる必要があります。この点で、Qdm と FL9 Qa 1 エピトープの解析は、Qa 1 分子は免疫監視1,4のために重要という結論につながっています。さらに、HSP60p216、TCRBV8.1 ペプチドの研究 p42 50 はその Qa 1 制限 CD8 の結論につながっている+ T 細胞病原性 CD4 をターゲットにより免疫応答を調節する+ T 細胞6,7 ,9,19。さらに、モグ196の研究が初めて明らかにする Qa 1 制限 CD8+ T 細胞は直接潜在的病原性自己免疫細胞12 によって損傷からそれを防ぐためにティッシュをターゲットによって免疫反応を調整できます。.最後に、エピトープ固有の Qa 1 制限 CD8 の機能解析+ T 細胞は四量体によって支援することができます。このような四量体は、NIH テトラマー中核施設 (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) や会社の製作可能します。4 量体の生成を要求するには、1 つは Qa 1 四量体の生成のための承認の Qa 1 蛋白質に新しくマップされた最適な Qa 1 エピトープのバインディングをサポートする機能のデータを送ることがあります。

    結論としては、先行研究を示しているその Qa 1 制限 CD8+ T 細胞12ローカル免疫応答の調節に重要な役割を果たします。この点では、組織の損傷は直接組織を対象とする免疫反応によって引き起こされることができます。また、担保の損害賠償は侵入病原体をターゲットとする免疫反応によって引き起こされることができます。したがって、これらの 2 つの細胞+ T の Qa 1 制限 CD8 の役割を理解異なる組織の損傷は臨床応用にとって重要です。この目標を達成するため、自己組織の侵入病原体の Qa 1 エピトープの徹底的な分析が必要です。このプロトコルは、これらの解析に適しています。

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    Disclosures

    著者は利益相反を宣言しません。

    Acknowledgements

    彼女の技術支援とこの原稿の準備、ペネロペ ガルシアに感謝しますこの作品は、(681205-2967) ロマリンダ大学医学部から研究イノベーション助成金 (リグ) と XT に国民の多数硬化の社会 (PP1685) からパイロットの助成金によって支持されました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

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    References

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