Überlappende Peptid-Bibliothek zuordnen Qa-1 Epitope in einem Protein

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Immunology and Infection

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Summary

QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b Moleküle. Immunisierung mit QS-1-Bindung Epitope nachweislich erweitern gewebespezifischen Immunregulation und mehrere Autoimmunerkrankungen zu verbessern. Hier beschreiben wir eine überlappende Peptid Bibliothek Strategie zur Identifikation des Qa-1 Epitope in ein Protein.

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Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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Abstract

QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle. Aktuellen Daten geht hervor, dass QS-1-Molekülen in Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität Vermessung, induzierende Immunregulation und Begrenzung der Immunantwort auf virale Infektionen eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus funktionale Augmentation des QS-1-eingeschränkt CD8+ T-Zellen durch Epitop Immunisierung hat therapeutische Effekte in mehreren Autoimmunerkrankung Tiermodellen, z.B. experimentelle allergische Enzephalomyelitis gezeigt Kollagen-induzierte Arthritis und nicht adipösen Diabetes. Daher gibt es eine dringende Notwendigkeit für eine Methode, die schnell und effizient funktionelle QS-1-Epitope in einem Protein identifizieren kann. Hier beschreiben wir eine Protokoll, das QS-1-eingeschränkt CD8 nutzt+ T-Zell-Linien für eine überlappende Peptid (OLP)-Bibliothek für die Bestimmung der QS-1 Epitope in einem Protein spezifisch. Diese OLP-Bibliothek enthält 15-Mer überlappende Peptide, die die gesamte Länge eines Proteins zu decken, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir vor kurzem eine 9-Mer Qa-1 Epitop in Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) identifiziert. Diese neu zugeordnete MOG QS-1-Epitop zeigte sich Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt CD8 induzieren+ T-Zellen, dass verbesserte Myelin-spezifische Immunregulation. Daher eignet sich dieses Protokoll für zukünftige Untersuchung neuartiger Ziele und Funktionen des QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen.

Introduction

QS-1 gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle in den Mäusen. Seine menschliche Homolog ist HLA-E. Vorherigen Nachweis hat gezeigt, dass QS-1-Moleküle wichtige biologische Funktionen haben. Erstens, QS-1-Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Vermessung Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität. QS-1-Moleküle haben in diesem Zusammenhang mehrere Strategien, um die normale Funktion einer Zelle überwachen entwickelt. Eine solche Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu Form-komplexe mit einer verarbeiteten Führer Peptid (Epitop), d.h. der QS-1 Determinante Modifikator (Qdm), die von klassischen MHC-Ia-Moleküle in das endoplasmatische Retikulum1verarbeitet wird. Diese QS-1/Qdm komplexe später auf der Oberfläche einer Zelle anzeigen und binden an hemmenden NKG2A Rezeptoren auf NK-Zellen, NK Aktivität2töten zu hemmen. Wenn die Expression von MHC-Ia Moleküle verloren geht, wird eine Zelle (z. B. eine maligne Zelle) empfindlich auf NK2töten. Die andere Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu bilden neue QS-1/Epitop komplexe auf der Oberfläche einer Zelle, die einen Mangel an TAP (Transporter mit Antigen Verarbeitung verbunden) ist3 und/oder ERAAP (endoplasmatische Retikulum Aminopeptidase zugeordnet Antigen Processing)4 (beide Mängel treten oft in bösartiger Zellen). Die Zelle, die diese neuen QS-1/Epitop komplexe drückt dann erkannt und eliminiert durch die Epitop-spezifischen CD8 QS-1-eingeschränkt werden kann+ T Zellen. Zweitens, induzieren QS-1-Moleküle Immunregulation5. In diesem Zusammenhang Qa-1/Epitop-komplexe haben gezeigt, dass CD8 stimulieren+ regulatorische (Treg) T-Zellen, die wichtig für die Vermeidung von immunvermittelte Schäden selbst-Gewebe6,7,8 ,9,10. Drittens, QS-1-eingeschränkt CD8+ Treg Zellen gezeigt worden, haben um Immunantworten gegen virale Infektion11zu begrenzen.

Daher bestimmte Vermehrung der Epitop-spezifische QS-1-Restrictred CD8+ T Zellen ist eine potenziell vielversprechende Strategie für die Beseitigung von abnormen Zellen, für die Verbesserung der Immunregulation und für die Kontrolle des Ausmaßes der Virus-induzierte Immunantwort. Während es steht nicht fest ob Brustvergrößerung Epitop-spezifischer CD8 QS-1-eingeschränkt+ T Zellen erweitern Immunüberwachung und Virus-induzierte Immunantwort zu begrenzen können, unsere Labore und andere haben eindeutig gezeigt, dass Immunisierung mit QS-1 Epitope kann die Funktion des QS-1-eingeschränkt CD8 ergänzen+ Treg Zellen spezifische für pathogene autoimmune CD4+ T Zellen, führt zu effizienten Kontrolle von CD4+ T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen in eine Vielzahl von Tier-Modelle wie experimentelle allergische Enzephalomyelitis (Tiermodell der menschlichen multiplen Sklerose)6,10, Kollagen-induzierte Arthritis (einem Tiermodell der menschlichen rheumatoide Arthritis)7, und nicht adipösen Diabetes (Tiermodell für menschliche Typ 1 Diabetes)8. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass die Immunisierung mit einem gewebespezifischen Qa-1 Epitop führt zu spezifischen Kontrolle der immun-vermittelte Entzündung in diesem Gewebe durch Vermehrung der CD8+ Treg Zellen12. Die oben genannten Erfolge von präklinischen Studien zeigen eine Notwendigkeit für eine umfassende Bewertung der QS-1 Epitop Immunisierung für die Behandlung von gewebespezifischen immunvermittelte Erkrankungen und möglicherweise für die Behandlung von anderen Erkrankungen im Zusammenhang mit Mängeln in Hahn und ERAAP.

Dementsprechend gibt es ein Bedarf für eine Technologie, die zuverlässig und schnell Qa-1 Epitope in einem Protein analysieren kann. In diesem Zusammenhang wurde eine begrenzte Anzahl von biologisch wichtigen Epitope Qa-1 beschrieben. Die meisten dieser QS-1-Epitope wurden während des Studiums der CD8 serendipitously identifiziert+ T Zelle Antworten auf Bakterien13, einen Mangel an TAP3Zellen und Zellen einen Mangel an ERAAP4Zellen, die dazu führen, EAE6dass, 9. Daher ist eine hoher Durchsatz-Technik für die Identifizierung von biologisch wichtigen QS-1-Epitopen in einem definierten Protein wünschenswert. Im folgenden beschreiben wir eine überlappende Peptid (OLP) Bibliothek-Strategie, die funktionale Qa-1 Epitope in einem Protein mit QS-1-Resrticted CD8 Karten+ T-Zell-Linien bestimmten für den OLP-Pool (OLP_pool) eines Proteins.

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Protocol

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit einer institutionellen Animal Care und Einsatz-Protokoll durch Animal Care and Use Committee an der University of Texas at El Paso und der Loma Linda Universität genehmigt.

1. Generation einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins

  1. Entwerfen Sie eine OLP-Bibliothek, in der alle Peptide sind 15-Mer in der Länge, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren.
    Hinweis: In der MOG OLP-Studie Abfolge von MOG Vorläufer [Mus Musculus] wurde abgerufen von NCBI Proteindatenbank unter folgendem Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Der MOG-Vorläufer (247 Aminosäuren), der Signal- und Reifen Peptide enthielt, wurde verwendet, weil die meisten der gemeldeten Qa-1 (HLA-E) Epitope in Signal-Peptide (z.B. Qdm1) befanden. Beginnend bei der N-Terminus, wurden die Sequenzen von 15-Mer Peptide identifiziert, so dass zwei benachbarte Peptide von 11 Aminosäuren (Abbildung 1) überlappt. In 247 Aminosäure MOG Vorläufer wurden daher genau 59 OLPs ermittelt. Allerdings reichen die letzten OLP von 12 bis 15-Mer abhängig von der Länge des Proteins. Darüber hinaus wählen wir 15-Mer Bibliothek, weil wir und andere gezeigt haben, dass 15-Mer Peptide, wenn in dendritischen Zellen (DCs) oder Makrophagen, hinzugefügt effizient weiterverarbeitet Epitope für die Anerkennung von CD8 Zellen+ T14,15 .
  2. Erwerben Sie jede einzelne Peptid im Handel. 5 mg pro Peptid sollten reichen für das Screening. OLPs und abgeschnittene Peptide (Schritt 6.1) kann entsalzten Peptide (Reinheit ist ca. 50-70 %). Die Reinheit der optimale Peptid (Schritt 6.2), die für die Erzeugung von Tetramer und für zukünftige Analysen verwendet werden soll > 90 %. Wiederherzustellen Sie die Peptide unter sterilen Zustand.
  3. Machen Sie 50 mg/mL in 100 % DMSO individuelle Peptid-Aktien. Fügen Sie 5 mg jedes Peptid 100 μL von DMSO in jedem Röhrchen mischen und speichern die Peptide bei-20 ° C. Diese Bestände werden verwendet, um ein OLP_pool-Lager für die Generation der CD8 machen+ T-Zell-Linien auf den OLP_pool reagiert. Darüber hinaus werden diese Bestände auch verwendet werden, um 10 mg/mL machen individuelle Peptid Bestände zur Bestimmung der Fähigkeit jedes einzelnen Peptid, eine QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool-reaktive CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie.
  4. Machen OLP_pool Lager durch Hinzufügen zum gleichen Volumen jedes Peptid in ein frisches Gefäß. Diese OLP_pool enthält 100 % DMSO. In der MOG OLP-Studie gab es 59 OLPs12. Daher war die Konzentration der jedes Peptid in der OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. 10 mg/mL individuelle Peptid Bestände durch verdünnen (5 X) machen die Aktie 50 mg/mL in sterilen H2O in einem V-Boden-96-Well-Platte (diese Lager enthält 20 % DMSO). Machen Sie diese Bestände in einer 96-Well-Platte, da die Bestimmung der QS-1-eingeschränkt Antwort von jedem einzelnen Peptid in eine 96-Well-Platte mit einem 8- oder 12-Kanal Mehrkanal-Pipette ausgeführt wird.
    Hinweis: Alle Peptide, einschließlich OLPs und abgeschnittene Peptide, sollte entweder eine V-Boden-96-Well-Platte verdünnt werden oder eine 96-Well-Probenrack mit 1 mL Röhrchen gefüllt, da das Peptid-Bibliothek-Screening in 96-Well-Platten mit einer Mehrkanal-Pipette durchgeführt wird. Wenn es schwierig, eine Peptid zu verdünnen, Tropfen Sie 1 N NaOH weisen zu helfen, das Peptid auflösen.

2. Priming von Kb-/- Db-/- CD8+ T-Zellen mit dem OLP_pool-gepulste Kb-/- Db-/- dendritische Zellen (DCs).

Hinweis: Es gibt zwei große QS-1-Allel: einer ist QS-1ein, und der andere ist QS-1b. Da die Tiere häufig verwendet für die akademische Forschung, z.B. C57BL/6 und Balb/c Mäuse, Qa-1b, dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Zuordnung Qa-1b Epitope in ein Protein. CD8+ T Zellen, die in diesem Protokoll verwendeten werden gereinigt, von Kb-/-Db-/- Mäuse C57BL/6 (im Hintergrund) in welche CD8+ T Zellen sind meist durch nicht-klassischen MHC-Ib-Moleküle, einschließlich QS-1 eingeschränkt.

  1. Knochenmark stammenden DCs als zuvor beschriebenen12produzieren.
    1. Kurz, Kultur des Knochenmarks Einzelzelle Suspensionen (1 x 106 Zellen/mL) in RPMI-10 Medium (RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentliche Aminosäure 0,1 mM) enthält 10 U/mL IL-4 und 100 U/mL GM-CSF in einem 6-Well-Platte (4 mL/Na) bei 37 ° C, 5 % CO2.
    2. Zwei Tage später, entfernen Sie nicht anhaftende Zellen vorsichtig und fügen Sie hinzu, neue Medien und Zytokine.
    3. Nach der Kultivierung der Zellen für weitere zwei Tage, nicht anhaftende Zellen mit frischen Medien und Zytokine in eine neue 6-Well-Platte zu übertragen.
    4. Die Zellen für weitere zwei Tage Kultur und aufgefüllt mit frischen Medien und Zytokine mit LPS (0,1 µg/mL), die DCs zu aktivieren.
    5. 24 h später, sammeln die DCs für Experimente.
  2. Die DCs mit 3000 Rads zu bestrahlen.
    1. Alternativ behandeln die DCs (5 x 107 Zellen/mL) mit Mitomycin C (50 μg/mL) mit PBS-Puffer bei 37 ° C für 20 min. RPMI-0 (RPMI 1640 ohne Serum) hinzufügen, um das Rohr (12 mL) füllen und drehen Sie die Zellen für 10 min in einer Tischplatte Zentrifuge bei 300 x g. verwerfen Überstände und Nummer t des Waschvorgangs noch zweimal. Diese drei Wäschen kritisieren weil jede Spur Menge Mitomycin C die Reaktion der CD8 hemmen kann+ T Zellen während der DC-T Co Zellkultur.
  3. Passen Sie die DC-Konzentration bis 5 x 106 Zellen/mL in einem serumfreien Medium (AIM-V serumfreien Medium ergänzt mit 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentliche Aminosäure 0,1 mM).
  4. Fügen Sie die OLP_pool-Stammlösung, die 100 % DMSO auf die DCs enthält, so dass DMSO Endkonzentration 0,5 % (200 X). In der MOG OLP-Studie wurde die Konzentration von jedem OLP in der OLP_pool 847.46 μg/mL; Daher war die Endkonzentration von jedem OLP in der DC-Kultur 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Jedoch kann diese Konzentration bis zu 100 μg/mL skaliert werden, solange die DMSO-Konzentration in der Zellkultur weniger als 1 ist %.
  • Brüten Sie die DCs bei Raumtemperatur für 3 h und schütteln Sie die Zellen leicht alle 15 min.
  • Während dieser Inkubationszeit reinigen CD8+ T-Zellen aus dem geernteten Milz oder Lymphknoten von Kb-/-Db-/- Mäuse mit einem kommerziellen CD8+ T Zelle Reinigung Kit, passen Sie die Zellkonzentration bis 10 x 106 Zellen/mL in die serumfreien Medium mit 50 U/mL Interleukin 2 (IL-2) und 100 U/mL IL-7.
  • Fügen Sie nun die CD8+ T-Zellen in einem 48-Well-Platte als 0,5 mL/gut (nach der Zugabe von 0,5 mL/gut von der OLP_pool-gepulste DCs in Schritt 2,8, die Endkonzentration der CD8+ T Zellen werden 5 x 106 Zellen/mL).
    Hinweis: CD8+ T Zellen aus Maus Milz und Lymphknoten können gereinigt werden, indem, dass CD8 positiven Isolierungskit entsprechend den Anweisungen des Herstellers. CD8+ T-Zellen sind frei von Perlen.
  • Spin-down der OLP_pool-gepulste DCs (300 X g, 10 min) bei RT rekonstruieren die DCs OLP_pool gepulst bis 2 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium und fügen 0,5 mL/Brunnen in der 48-Well-Platte, die die CD8 enthält+ T-Zellen (Endkonzentration von der OLP _pool-gepulste DCs ist 1 x 106 Zellen/mL, Endkonzentration von CD8+ T Zellen ist 5 x 106 Zellen/mL und Endkonzentration von IL-2 ist 25 U/mL Endkonzentration von IL-7 ist 50 U/mL). Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.
  • Am 4. Tag entfernen Sie und entsorgen Sie etwa 400 μl des Kulturmediums und 500 μL der frischen serumfreien Medium mit 100 U/mL IL-2 und 100U/mL IL-7 in jede Vertiefung. Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.
  • Am Tag 7 oder 8, neu stimulieren die OLP_pool grundiert CD8+ T-Zellen mit den OLP_pool.
  • (3) Restimulation grundiert CD8+ T Zellen mit Makrophagen gepulst mit der OLP_pool

    1. Vier Tage vor der erneuten Stimulation des OLP_pool grundiert CD8+ T-Zellen, 2 % (V/V) Polyacrylamid Wulst Lösung vorbereiten: waschen 2 g Polyacrylamid Perlen zweimal in 20 mL Endotoxin-freie H2O oder PBS. Pellet-Polyacrylamid-Perlen durch Zentrifugieren (400 X g) für 5 min und in 100 mL PBS aufzuwirbeln. Autoklaven bei 15 lb/m für 20 min. Store bei Raumtemperatur.
    2. Injizieren Sie Mäusen intraperitoneal mit 1 mL/Maus der sterilen 2 % Polyacrylamid Wulst Lösung für die Migration von Monozyten/Makrophagen in die Bauchhöhle16zu gewinnen.
    3. Vier Tage später, die Tiere durch CO2 Überdosierung zu opfern.
      1. Unter sterilen Bedingungen, schneiden Sie eine kleine Öffnung in der Mitte des Bauches, so dass die Öffnung gerade genug ist für das Bestehen einer 5 mL-Transfer-Pipette. Füllen Sie die Transferpipette mit RPMI-0 und legen Sie die Pipette in den Bauch Hohlraum durch die Öffnung.
      2. Spülen Sie den Bauch Hohlraum durch pipettieren. Pipette, soviel Flüssigkeit wie möglich aus dem Bauch Hohlraum in ein steriles Röhrchen (diese sind peritonealen Makrophagen). Wiederholen Sie spülen-Schritt 4 - 5 Mal.
    4. Die peritonealen Makrophagen mit 3000 Rads zu bestrahlen.
      1. Alternativ behandeln Sie die peritonealen Makrophagen mit Mitomycin C (folgen Sie den beschriebenen Schritt 2.2).
    5. Passen Sie die Konzentration der peritonealen Makrophagen, 5 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium. Fügen Sie OLP_pool Lager (die Endkonzentration von DMSO ist weniger als 1 %) und M-CSF (Endkonzentration = 100 U/mL).
      Hinweis: In dieser Studie MOG OLP verwendet wir 0,5 % DMSO. Somit bestand MOG OLP_pool verdünnte 200 x (z.B. 1 μL des MOG OLP_Pool Lager in 199 μL der peritonealen Makrophagen hinzugefügt wurde). Daher wurde die Endkonzentration von jedem OLP 4.2 μg/mL).
    6. Fügen Sie 200 μl/Well (1 x 106 Zellen/Na) in einer Gewebekultur 48-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 4 h.
    7. Entfernen Sie die nicht-anhaftende Zellen und Polyacrylamid-Perlen durch sanftes waschen mit 200 μl/Well des vorgewärmten RPMI-0.
    8. Sammeln und Pool die OLP_pool grundiert CD8+ T-Zellen aus Schritt 2.10. Passen Sie die OLP_pool grundiert CD8+ T-Zell-Konzentration bis 1 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium mit 25 U/mL IL-2 und 50 U/mL IL-7. Fügen Sie 1 mL/gut, die 48-Well-Platte, die die OLP_pool-gepulste peritonealen Makrophagen enthält.
    9. Ergänzen Sie vier Tage später das Medium in der 48-Well-Platte. Entfernen Sie und entsorgen Sie ca. 400 μl des Kulturmediums in die Kultur 48-Well-Platten. Fügen Sie 500 μL der frischen serumfreien Medium mit 100 U/mL IL-2 und 100 U/mL IL-7 in jede Vertiefung. Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.
    10. Drei oder vier Tage später, untersuchen Sie die OLP_pool-restimuliert CD8+ T-Zellen für OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkte Reaktion durch Enzym-linked Immunospot Assay (ELISPOT). Nach diesem Zeitpunkt neu stimulieren die CD8+ T Zellen alle 7-10 Tage.
      Hinweis: Makrophagen werden bevorzugt für die erneute Stimulation der OLP_pool grundiert CD8+ T Zellen. Wir haben festgestellt, dass CD8+ T Zellen wieder angeregt durch Makrophagen wuchs besser als DCs in Vitro.

    (4) Bestimmung der OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkte Reaktion in eine OLP_pool restimuliert CD8+ T-Zell-Linie

    Hinweis: OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool restimuliert CD8+ T-Zell-Linie richtet sich nach IFNγ Sekretion nach Stimulation durch die OLP_pool in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1b -Zellen mit einem IFNγ ELISPOT Assay. C1R Zellen sind kommerziell erhältlich. C1R. QS-1b -Zellen können durch transducing die C1R Zellen mit der QS-1 Lentivirale Vektor erzeugt werden.

    1. Fügen Sie 100 μl/Well eines Capture Anti-IFN-γ-Antikörpers in Beschichtung Puffer (PBS) in die Vertiefungen eines ELISPOT-Platte verdünnt.
    Verschließen und über Nacht die Platte bei 4 ° C inkubieren.
  • Am zweiten Tag verwerfen Sie die Beschichtung-Puffer mit der Capture-Anti-IFN-γ-Antikörper und fügen Sie 200 μl/well-Blocker-Lösung (serumfreien Medium) und inkubieren Sie die Platte für 2 h bei Raumtemperatur.
  • Die C1R und C1R zu bestrahlen. QS-1b -Zellen mit 9.600 Rads.
    1. Alternativ behandeln Sie die C1R und C1R. QS-1b -Zellen mit Mitomycin C, wie in Schritt 2.2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Behandlungszeit 30 min werden.
  • Passen Sie die C1R und C1R. QS-1b -Zellen in serumfreien Medium 4 x 106 Zellen/mL.
  • Entsorgen Sie die blockierende Lösung in der Platte und fügen Sie die C1R und C1R. QS-1b -Zellen bei 50 μl/Well (200.000 Zellen/Na) und Mix.
  • Fügen Sie 50 μL/gut 100 x OLP_pool Lager (in serumfreien Medium) verdünnt und mischen Sie richtig. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für ca. 2-3 h.
  • Passen Sie die OLP_pool-restimuliert CD8+ T auf 1 bis 2 x 106 Zellen/mL in serumfreien Medium mit 150 U/mL IL-7 Zellen und die Platte 50 μl/Well (50.000-100.000 Zellen/Na) hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte (58 X g) für 5 min.
  • Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 über Nacht.
  • Aspirieren Sie Zellsuspension. Waschen Sie Brunnen 2 Mal mit entionisiertem Wasser (DI) (250 μl/Well). Lassen Sie Brunnen für 5 min bei jedem Waschschritt einweichen.
  • Waschen Brunnen 3 Mal ich mit waschen Puffer (PBS mit 0,05 % Tween20). Lassen Sie Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen. Waschpuffer zu verwerfen.
  • Fügen Sie 100 μL der Detektionsantikörper verdünnt in einen Verdünnungspuffer (PBS mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).
  • Inkubieren Sie die Platten in 2 h bei Raumtemperatur.
  • Antikörperlösung Erkennung zu verwerfen. Waschen Sie Brunnen 3 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer I. ermöglichen Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen.
  • Fügen Sie 100 μl/Well des Enzym-Konjugat (Streptavidin-HRP) in Verdünnungspuffer bei 1: 100 Verdünnung verdünnt.
  • Inkubieren Sie die Platten für 1 h bei Raumtemperatur.
  • Enzym-Konjugat-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie Brunnen 4 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer I. ermöglichen Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen.
  • Waschen Sie Brunnen 2 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer II (PBS).
  • Jedes gut 100 µL Substratlösung (Mischung 1 Tropfen = 20 µL des AEC-Chromogen mit 1 mL der AEC-Substrat) hinzufügen. Vor Ort Entwicklung für 5 bis 60 min zu verfolgen.
  • Wenn die gewünschten Ergebnisse beginnen zu erscheinen, vorbeischauen Sie der Substratreaktion Brunnen mit destilliertem Wasser waschen.
  • An der Luft trocknen der Platten bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bis es völlig trocken ist. Entfernung von der Plastikschale unter den Platten erleichtert trocknen. Speichern Sie Platten in einem verschlossenen Plastikbeutel im Dunkeln, bis es analysiert wird.
  • Auflisten von Flecken manuell durch Inspektion unter dem sezierenden Mikroskop oder mit einem ELISPOT-Platte-Reader. Das repräsentative Ergebnis in Abbildung 2zu sehen.
  • 5. Ermittlung der einzelnen Peptide in der OLP_pool die die eingeschränkte Qa-1 IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-spezifische CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie

    1. Bestimmen die einzelnen Peptide, die die OLP_pool-spezifisch, QS-1-Restrictred IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-spezifische CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie mit den oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT Assay (Endkonzentration von jedem einzelnen Peptid verwendet für die ELISOPT ist Assay 10 μg/mL). Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3zu sehen.
      Hinweis: Ein OLP-spezifisch, QS-1-Restircted Antwort eine Antwort bezeichnet, die mindestens drei Mal die Reaktion in Anwesenheit von C1R. QS-1b -Zellen, aber ohne die OLP. In der MOG OLP Studie, OLP68, OLP96 und OLP105 erfüllt dieses Kriterium. Deshalb enthalten alle drei OLPs potenziell Qa-1 Epitope12 (Abbildung 3). Jedoch gaben die OLP105 konsequent die stärkste Reaktion; Daher führten wir eine detaillierte Analyse der OLP105 (Abbildung 4 und Abbildung 5)12.

    6. Identifikation der optimale QS-1-Epitop in einem 15-Mer OLP die stimuliert die Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt Reaktion in einer OLP_pool-spezifische CD8+ T-Zell-Linie

    1. C - und N-Terminal abgeschnitten Peptide von einem 15-Mer OLP wie in Abbildung 4gezeigt zu synthetisieren.
    2. IFN-γ Sekretion in einer OLP-spezifischen CD8 untersuchen+ T-Zell-Linie durch die Stimulierung der CD8+ T-Zellen mit jeweils die abgeschnittenen Peptide als auch die elterliche 15-Mer OLP in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1b -Zellen mit den oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT Assay. Die Endkonzentration von jedem einzelnen Peptid für ELISPOT Assay verwendet ist 10 μg/mL. Eine Peptid ist definiert als die optimale QS-1-Epitop, wenn das Peptid: 1) konsequent gibt ähnliche oder stärkere IFN-γ Antwort, im Vergleich zu den ursprünglichen 15-Mer Peptid in Anwesenheit von C1R. QS-1b -Zellen; (2) ist zwischen 8 - 10-Mer (9-Mer Peptid bevorzugt) welches sind die Peptid-Längen, gebunden an MHC-ich Moleküle15,17. Vertreter Ergebnisse in Abbildung 5zu sehen.

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    Representative Results

    Entwurf einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins

    Beginnend am N-Terminus eines Proteins, ist jedes Peptid 15 Aminosäuren (15-Mer). Daher umfasst das erste Peptid Position 1 auf Position 15. Der N-Terminus des zweiten Peptids überschneidet sich mit dem C-Terminus des ersten Peptids durch 11 Aminosäure. Daher umfasst das zweite Peptid die Position 5 auf Position 19. Entwerfen Sie den Rest der Peptide bis zum Ende des C-Terminus des Proteins (Abbildung 1). Wir haben 15-Mer-Bibliothek, weil wir und andere gezeigt haben, dass 15-Mer Peptide, wenn in dendritischen Zellen (DCs) oder Makrophagen, effizient weiterverarbeitet Epitope für die Anerkennung von CD8 Zellen+ T14,15. Die Anzahl der OLPs in einer Bibliothek richtet sich nach der Länge eines Proteins. Darüber hinaus kann die letzten OLP von 12 bis 15-Mer abhängig von der Länge des Proteins reichen. Z. B. hat Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) eine Länge von 247 Aminosäuren. Die MOG OLP-Bibliothek enthält 59 OLPs12. Repräsentative Ergebnisse, die in dieser Handschrift sind aus der Analyse der MOG OLP-Bibliothek.

    Bestimmung der OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool-stimulierten CD8+ T-Zell-Linie

    Wir generiert eine CD8+ T-Zell-Linie, die durch K grundiert wurdeb-/-Db-/- DCs gepulst mit MOG OLP_pool (MOG_pool) und durch MOG_pool-gepulste K restimuliertb-/-Db-/- peritonealen Makrophagen wie beschrieben in der oben genannten Protokoll (1, 2 und 3). Ermittlung möglicher MOG_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkt Antwort in diesem CD8+ T-Zell-Linie, untersuchten wir die Antwort von diesem CD8+ T-Zell-Linie, die MOG_pool in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1b -Zellen mit IFN-γ ELISPOT Assay (Abbildung 2) (Protokoll (Schritt 4). Unsere Daten zeigten, dass die MOG_pool stimuliert CD8+ T-Zell-Linie abgesondert ein niedriges Niveau der IFN-γ in Anwesenheit von C1R. QS-1b -Zellen (32 Spot bildenden Zellen oder SFCs) aber nicht C1R Zellen (2 SFCs), was darauf hindeutet das Vorhandensein von CD8+ T Zellen, die geantwortet haben, QS-1-Bindung Epitope von C1R Zellen (C1R sind menschliche B Lymphoblastoid Zellen) abgeleitet. SFCs wurden erhöht, wenn die MOG_pool in den Brunnen hinzugefügt wurde, die enthaltene C1R Zellen (78 SFCs), was darauf hindeutet das Vorhandensein von CD8+ T Zellen, die auf nicht-QS-1 Epitope reagiert. SFCs wurden drastisch erhöht, wenn die MOG_pool in den Brunnen hinzugefügt wurde, die C1R enthalten. QS-1b -Zellen (320 SFCs), was darauf hindeutet das Vorhandensein von CD8+ T-Zellen die QS-1-Bindung Peptide reagiert. Die Daten zeigen auch, dass die MOG_pool Epitope(s) QS-1-Bindung enthält.

    Bestimmung der einzelnen Peptide in der OLP_pool die zur QS-1-eingeschränkt IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-reaktive CD8 beitragen+ T-Zell-Linie

    Die Peptide in der OLP_pool zu bestimmen, welche die QS-1-eingeschränkt IFN-γ Sekretion in ein MOG_pool-reaktive CD8 stimuliert+ T-Zell-Linie, wir stimuliert die MOG_pool reaktive CD8+ T-Zellen mit einzelnen 59 OLPs in Anwesenheit von entweder C1R oder C1R. QS-1b -Zellen (Abbildung 3) (Protokoll (Schritt 5). Unsere Daten zeigen, dass einige SFCs in den Vertiefungen beobachtet wurden, die C1R Zellen und die OLPs enthalten. Im Gegensatz dazu erhöht SFCs in alle Vertiefungen, die C1R enthalten. QS-1b -Zellen und die OLPs. Aus Abbildung 2, wir erfuhren, dass CD8+ T-Zellen in Anwesenheit von C1R. QS-1b allein gebildet auch SFCs. Daher könnte die erhöhte SFCs in die meisten Brunnen durch unspezifische Stimulation durch die Darstellung von Qa-1 Epitopen intrazelluläre Proteine in den C1R Zellen durch die QS-1-Moleküle abgeleitet sein. Jedoch die OLPs in 3 gerahmten Brunnen in Abbildung 3 (B8, D12 und E9), die die 3 abgestimmt hervorgehoben OLPs in der Abbildung 3A (OLP68, OLP96 und OLP105), erfüllt das Kriterium für die Definition einer OLP-spezifische, QS-1-eingeschränkt IFN-γ Antwort als in dem Protokoll Schritt 5.112beschrieben. Die Daten deuten darauf hin, dass die 3 OLPs QS-1-Epitope(s) enthalten. Da die OLP105 konsequent die höchsten Reaktion produziert, haben wir detaillierte Analyse des OLP10512durchgeführt.

    Design einer abgeschnittenen Peptid-Bibliothek für ein 15-Mer OLP

    Ein 15-Mer OLP, bestimmt, QS-1-eingeschränkt IFN-γ Sekretion in der OLP_pool-reaktive CD8 stimulieren+ T-Zell-Linie, muss für die optimale Epitop mithilfe einer abgeschnittenen Peptid-Bibliothek analysiert werden. So verkürzte Peptid-Bibliothek soll von nach und nach Abschneiden der 15-Mer OLP durch 1 Aminosäure an seiner N - und C-Termini (Abbildung 4). Ähnlich wie andere MHC Klasse I Moleküle, QS-1-Moleküle vor allem an 8 - 10-Mer Peptide binden. Wir empfehlen daher, das kürzeste abgeschnittene Peptid 6-Mer in der Länge ist.

    Identifizierung des optimalen QS-1-Epitop in ein 15-Mer OLP die QS-1-eingeschränkt IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-reaktive CD8 stimuliert+ T-Zell-Linie

    Die oben genannten N - und C-Terminal abgeschnitten Peptide sind für eine starke stimulierende IFN-γ Sekretion in eine CD8 getestet+ T-Zell-Linie speziell für die OLP_pool oder die Verwendung der oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT 15-Mer OLP. In der Studie von Qa-1 Epitopen MOG12, generierten wir eine CD8+ T-Zell-Linie, die spezifisch für das MOG-OLP105 war (Abb. 5A). Weitere Analysen zeigten, dass die N-Terminal verkürzten 9-Mer Peptid trafen sich die beiden Kriterien für eine optimale Epitop als im Protokoll Schritt 6.2 (Abbildung 5 b) beschrieben. Deshalb schlossen wir, dass die N-Terminal 9-Mer abgeschnitten Peptid wurde die optimale QS-1-Epitop.

    Figure 1
    Abbildung 1: Design einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins. Beginnend am N-Terminus, wurden Peptide 15 Aminosäure (15-Mer) Länge identifiziert.Der N-Terminus des jedes Peptid, mit Ausnahme der ersten Peptid überlappt mit dem C-Terminus des vorherigen Peptids durch 11 Aminosäuren.

    Figure 2
    Abbildung 2: MOG_pool-stimulierten CD8+ T Zellen waren teilweise MOG_pool spezifisch und QS-1-eingeschränkt12. In-vitro- CD8+ T Zellen angeregt durch das MOG-OLP_pool (MOG_pool) wurden als Reaktion auf die MOG_pool in Anwesenheit von C1R oder C1R untersucht. QS-1b -Zellen als antigenpräsentierende Zellen unter Verwendung eines IFN-γ ELISPOT Assays. Vertreter ELISPOT Bilder angezeigt werden. Zahlen vor Ort bilden Zellen (SFCs) sind an den oberen linken Ecken jedes gut dargestellt. CD8+ T Zellen: 50.000 Zellen/gut. C1R oder C1R. QS-1b -Zellen: 200.000 Zellen/gut.

    Figure 3
    Abbildung 3: Analyse der OLPs in die MOG_pool, die zuständig für die Qa-1 waren eingeschränkt Antwort. (A) Layout der V-Boden-96-Well-Platte, die die 10 mg/mL enthalten einzelne MOG OLPs. Zahlen in den Vertiefungen dargestellt OLP-IDs. Die hervorgehobenen 3 Brunnen enthielt die OLPs, die das Kriterium für eine OLP-spezifische, QS-1-eingeschränkt IFN-γ-Antwort wie beschrieben im Protokoll Schritt 5.112erfüllt. (B) Vertreter SFCs in jede Vertiefung, die ein OLP enthalten (Endkonzentration = 4,2 μg/mL, OLP-ID zugeordnet, die in "A"), die MOG_pool-reaktive CD8+ T Zellen (50.000 Zellen/Na ja), und C1R (200.000 Zellen/Na). (C) Vertreter SFCs in jede Vertiefung, die ein OLP enthalten (Endkonzentration = 4,2 μg/mL, OLP-ID zugeordnet, die in "A"), die MOG_pool-reaktive CD8+ T Zellen (50.000 Zellen/Na) und C1R. QS-1b -Zellen (200.000 Zellen/Na). Die 3 gerahmten Brunnen enthielt die OLPs, die das Kriterium für eine OLP-spezifische, QS-1-eingeschränkt IFN-γ Antwort12erfüllt. Die Figur wurde von Verweis12angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4: Design von abgeschnittenen Peptiden ein 15-Mer Peptid. Eine 15-Mer Peptid wurde schrittweise an die N - und C-Termini durch 1 Aminosäure, 6-Mer abgeschnitten. Das 15-Mer und die abgeschnittenen Peptide wurden dann synthetisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5: Analyse der optimalen QS-1-Epitop in der OLP105. (A) ein OLP105-stimulierten CD8+ T-Zell-Linie wurde für die Reaktion auf die OLP68, OLP96 und OLP105 in Anwesenheit von C1R oder C1R untersucht. QS-1b -Zellen mit einer IFN-γ ELISPOT Assay. Vertreter IFN-γ SFCs (Nummern an den oberen linken Ecken) werden angezeigt. (B) die OLP105-spezifische CD8+ T-Zell-Linie, wie in (A), wurde geprüft, für die Beantwortung der einzelnen N - und C-Terminal abgeschnitten Peptide, wie in Abbildung 4, in Anwesenheit von C1R dargestellt. QS-1b -Zellen mit IFN-γ ELISPOT Assay. OLP105: eine 15-Mer OLP. N6-14: N-Terminal abgeschnitten OLP105 Peptide. C6-14: C-unheilbar abgeschnitten OLP105 Peptide. CD8+ T Zellen: 50.000 Zellen/gut. C1R. QS-1b -Zellen: 200.000 Zellen/gut. Zahlen in der oberen linken Ecke SFCs pro 50.000 CD8+ wurden T-Zellen. Rotes Rechteck markiert die Brunnen, der die Kriterien für die optimale QS-1-Epitop in einer OLP definieren, wie im Protokoll Schritt 6.2 beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Discussion

    Hier haben wir ein Protokoll für die Analyse von Qa-1 Epitope in einem Protein beschrieben. In Bezug auf dieses Protokoll wurden mehrere andere Strategien auch zuvor gemeldet. Erstens die allogene CD8+ T-Zell-Linien und Klone wurden für die Identifizierung des Qdm1verwendet. Zweitens wurde ein vermeintlicher QS-1-Bindung-Motiv aus der Analyse der Qdm für die Identifizierung von HSP60p216-224 und eine TCRBV8.1 Epitop9,18verwendet. Drittens: individuelle überlappende Peptide aus einem Protein wurden verwendet, um Tiere zu impfen. Anschließend CD8+ T Zellen von den immunisierten Tieren isoliert wurden verwendet, um das TCRBV8.2 Peptid p42-50 zu identifizieren, die anschließend für die Bindung an QS-16,10,19bestätigt wurde. Vierte, funktionale CD8+ T-Zell-Linien in Kombination mit cDNA Bibliothek wurden für die Identifizierung der FL9 Qa-1 Epitop4verwendet.

    In Anlehnung an die bisherigen Techniken, den Einsatz der allogenen CD8+ T-Zell-Linien und Mai-Klone sind nicht geeignet für die Analyse von QS-1-Epitope, die während der physiologischen Immunantwort dargestellt werden. Darüber hinaus zufolge anfallende Daten das zuvor beschriebene Bindung Motiv nur teilweise die Peptid-Bindungskapazität der QS-1-Moleküle darstellen kann. Daher ist die genaue QS-1-Bindung-Motiv4noch nicht bekannt. Darüber hinaus ist Immunisierung mit individuellen Peptid für die Identifizierung von Qa-1 Epitopen mühsam. Zu guter Letzt umfasst cDNA Display Bibliothek Strategie den Bau viele Vektoren, die verschiedenen Peptid Längen zur Zelle Transfektion tragen. Im Gegensatz dazu die hier beschriebene Strategie zur Bibliothek der OLP ist einfach, und die zugeordneten Peptide sind dafür bekannt, QS-1-eingeschränkt CD8 stimulieren+ T Zellen. Unsere Strategie hat daher einen einzigartigen Vorteil.

    Die beschriebene Strategie nutzt hier OLP_pool-spezifische CD8+ T-Zellen, die durch in-vitro- Grundierung und Restimulation entstehen. Eine alternative Quelle der CD8+ T Zellen kann von der Entwässerung Lymphknoten einer kb-/-Db-/- Maus, die mit der Quelle Protein20immunisiert ist. Solchen immun CD8+ T Zellen können dann für IFN-γ Responses to OLPs und abgeschnittene Peptide für die Identifizierung von Qa-1 Epitopen geprüft werden. Theoretisch, die in Vivo immun CD8+ T Zellen sind näher an den physiologischen Zustand als die in Vitro CD8 generierten+ T Zellen. Aber wir fanden, dass die Reaktion des Immunsystems CD8+ T Zellen direkt von immunisierten Mäusen gereinigt war schwach und oft erforderlichen in-vitro- Restimulations für eine zufrieden stellende Peptid screening-Ergebnis. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für zukünftige Übersetzung ins menschliche Studie von HLA-E Epitopen ausgelegt, wobei in Vivo Immunisierung nicht praktikabel ist.

    Technisch gesehen ist der kritische Teil dieses Protokolls die Generation der CD8+ T-Zell-Linien, die sind spezifisch für die OLP_pool oder eine individuelle OLP. Da QS-1/Peptid-komplexe instabil im Vergleich zu klassischen MHC-Ich/Peptid-komplexe21 sind, nachdem antigenpräsentierende Zellen mit der OLPs oder ein Peptid gepulst sind, sollten die gepulsten Zellen nicht ausgiebig gewaschen werden. Wir haben festgestellt, dass Peptid-gepulste Zellen, wenn Sie ausgiebig, gewaschen verlieren oder deutlich die Fähigkeit reduzieren, CD8 stimulieren+ T Zellen. Daher empfehlen wir waschen die Peptid-gepulste Antigen-präsentierenden Zellen einmal unmittelbar bevor sie Co kultiviert mit CD8 sind+ T Zellen.

    Auch wegen der Instabilität der QS-1/Peptid-komplexe, empfehlen wir die Verwendung von einem serumfreien Medium für das Peptid pulsieren und die Stimulation von CD8+ T Zellen. Darüber hinaus fügen wir routinemäßig während CD8 50 U/mL IL-7+ T Zellkultur als auch während der IFN-γ ELISPOT assay. Die IL-7 dient zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Funktion der CD8+ T Zellen. IL-7 selbst regt nicht CD8+ T-Zellen, IFN-γ produzieren.

    Ähnlich wie bei allen Strategien, QS-1-Epitope zugeordnet, indem diese Strategie auch weitere Untersuchungen nötig machen für biologische Bedeutung. Beispielsweise ist eine wichtige Frage, ob die zugeordnete Epitop physiologisch präsentiert werden kann. Um diese Frage zu lösen, können DCs mit einem Lentivirale Vektor ausgestrahlt werden, die das Epitop Quelle Protein (z.B. MOG In MOG OLP-Studie) ausdrückt. Anschließend die Antwort des Epitop-spezifische CD8+ T Zellen, transduced DCs untersucht. Eine positive Reaktion zeigt, dass die Epitop kann physiologisch verarbeitet und von DCs dargestellt. Darüber hinaus funktionellen Konsequenzen aufgrund der Epitop Anerkennung durch CD8+ T Zellen weiter untersucht werden. In diesem Zusammenhang haben die Analysen der Qdm und FL9 Qa-1 Epitope zu dem Schluss geführt, dass QS-1-Moleküle wichtig für die Immunüberwachung1,4 sind. Darüber hinaus die Studien von HSP60p216, TCRBV8.1 Peptid und p42-50 führten zu dem Schluss, dass QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen regulieren Immunantworten durch pathogene CD4 targeting+ T Zellen 6,7 ,9,19. Darüber hinaus hat das Studium der MOG196 für das erste Mal, dass offenbart QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen könnte Immunantwort regulieren, indem Sie direkt auf ein Gewebe zu verhindern Schäden durch potenziell pathogenen autoimmune Zellen12 . Zu guter Letzt Funktionsanalyse ein Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt CD8+ T-Zellen können durch Tetramer unterstützt werden. NIH Tetramer Core Facility (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) oder einer Gesellschaft kann solche Tetramer hergestellt werden. Um die Generierung von einem Tetramer zu beantragen, kann man die Funktionsdaten senden, die Bindung von neu zugeordnete optimale QS-1-Epitop, QS-1-Protein für ihre Zustimmung zur Erzeugung von einem QS-1-Tetramer zu unterstützen.

    Zusammenfassend, frühere Studien haben gezeigt, dass QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des lokalen Immunantwort12. In diesem Zusammenhang können Gewebeschäden durch eine Immunreaktion, die richtet sich direkt an das Gewebe verursacht werden. Darüber hinaus können zusätzliche Schäden durch eine Immunantwort verursacht werden, die einen eindringenden Erreger richtet sich an. Daher Verständnis der Rolle der QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen in diesen beiden verschiedenen Gewebeschäden ist wichtig für ihre klinischen Anwendungen.Um dieses Ziel zu erreichen, ist eine gründliche Analyse der QS-1 Epitope in eine selbst-Gewebe oder einem eindringenden Erreger notwendig. Dieses Protokoll wird für diese Analysen geeignet.

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    Disclosures

    Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

    Acknowledgements

    Wir danken für ihre technische Unterstützung und Vorbereitung dieser Handschrift Penelope Garcia. Diese Arbeit wurde durch eine Forschung Innovation Grant (RIG) von der Abteilung für Medizin an der Loma Linda University (681205-2967) und ein pilot Stipendium der National Multiple Sclerosis Society (PP1685), XT unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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