Biblioteca de péptido superpuestas a epitopos Qa-1 en una proteína

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Immunology and Infection

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Summary

QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de moléculas de histocompatibilidad no clásicas complejas 1b. Inmunización con epítopos de Unión-1-control de calidad se ha demostrado para aumentar la regulación inmune del tejido específico y mejorar varias enfermedades autoinmunes. Adjunto describimos una estrategia de biblioteca de péptidos superpuestas para la identificación de los epitopos de Qa-1 en una proteína.

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Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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Abstract

QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de 1b complejo mayor de histocompatibilidad no clásicas moléculas (MHC-Ib). Los datos recientes sugieren que las moléculas de Qa-1 desempeñan papeles importantes en topografía las células para la integridad estructural y funcional, induciendo la regulación inmune y limitar las respuestas inmunes a las infecciones virales. Además, el aumento funcional de CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células a través del epítopo inmunización ha demostrado efectos terapéuticos en varios modelos animales de enfermedad autoinmune, por ejemplo, encefalomielitis alérgica experimental, artritis inducida por colágeno y la diabetes no obesos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de un método que puede eficientemente y rápidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionales en una proteína. Aquí, describimos un protocolo que utiliza CD8 restringidas de 1 Qa+ T cell líneas específicas para una biblioteca de péptidos (LPO) superpuestas para determinar Qa-1 epitopos en una proteína. Esta biblioteca OLP contiene péptidos traslapados 15-mer que cubren toda la longitud de una proteína y péptidos adyacentes se superponen por 11 aminoácidos. Mediante este protocolo, se identificaron recientemente un epítopo de Qa-1 9-mer en la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG). Este epítopo MOG Qa-1 recién asignada fue demostrado para inducir CD8 específicos del epítopo, restringido a Qa-1+ T las células que mayor regulación inmune específicos de mielina. Por lo tanto, este protocolo es útil para la investigación futura de nuevos objetivos y funciones de CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células.

Introduction

QA-1 pertenece a un grupo de 1b complejo mayor de histocompatibilidad no clásicas moléculas (MHC-Ib) en ratones. Su homólogo humano es HLA-E. Pruebas anteriores se ha demostrado que moléculas de Qa-1 funciones biológicas importantes. En primer lugar, las moléculas Qa-1 juegan un papel importante en la topografía de las células para la integridad estructural y funcional. En este sentido, Qa-1 moléculas han desarrollado varias estrategias para controlar la función normal de una célula. Una estrategia de este tipo permite Qa-1 moléculas para formar complejos con un péptido líder procesados (epitope), es decir, el control de calidad-1 determinante modificador (Qdm) que se procesa de moléculas clásicas de MHC-Ia en el retículo endoplásmico1. Estos complejos de control de calidad-1/Qdm luego mostrar en la superficie de una célula y enlazar a inhibitorio NKG2A receptores en las células NK para inhibir NK matando a actividad2. Si se pierde la expresión de moléculas MHC-Ia, una célula (por ejemplo, un maligno) se vuelve sensible a NK matando a2. La otra estrategia permite Qa-1 moléculas formar nuevos complejos de Qa-1/epítopos en la superficie de una célula que es deficiente en grifo (transportador asociado con el procesamiento de antígeno)3 o ERAAP (aminopeptidasa de retículo endoplasmático asociada a procesamiento de antígeno)4 (ambas deficiencias a menudo ocurren en las células malignas). La célula que expresa estos nuevos complejos de control de calidad-1/del epítopo puede reconocida y eliminada por la específica del epítopo CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células. En segundo lugar, las moléculas de Qa-1 inducen regulación inmune5. En este sentido, Qa-1/epitopo complejos han demostrado estimular CD8+ las células reguladoras T (Treg) que son importantes para la prevención de daño inmune-mediado de uno mismo-tejidos6,7,8 ,9,10. En tercer lugar, CD8 restringidas de 1 Qa+ Treg células se ha demostrado que limitar las respuestas inmunes contra infección viral11.

Por lo tanto, el aumento específico de específicos del epítopo CD8 de Qa-1-restrictred+ T las células es una estrategia potencialmente prometedora para la eliminación de células anormales, para la mejora de la regulación inmune y para el control de la magnitud de respuesta inmune inducida por virus. Mientras que no se ha determinado si el aumento de específicos del epítopo CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células pueden mejorar la vigilancia inmune y limitan la respuesta inmune inducida por virus, nuestros laboratorios y otros han demostrado claramente que inmunización con epitopos Qa-1 puede aumentar la función de CD8 restringidas de 1 Qa+ Treg células específicos para patógenos autoinmunes CD4+ T las células, hasta el eficiente control de CD4+ enfermedades autoinmunes mediada por células T en un modelos de variedad de animales tales como encefalomielitis alérgica experimental (un modelo animal de la esclerosis múltiple humana)6,10, artritis inducida por colágeno (un modelo animal de artritis reumatoide humana)7, y diabetes no obesos (un modelo animal de diabetes del tipo 1 humano)8. Además, hemos descubierto que la inmunización con un Qa-1 de tejidos específicos del epítopo conduce al control específico de la inflamación mediada inmune en ese tejido a través del aumento de CD8+ Treg células12. Los éxitos anteriores de los estudios preclínicos indican la necesidad de una evaluación completa de las Qa-1 epitopo vacunas para el tratamiento de enfermedades inmune-mediadas tejidos específicos y potencialmente para el tratamiento de otras enfermedades asociadas con deficiencias en el grifo y ERAAP.

En consecuencia, existe una demanda para una tecnología que puede confiablemente y rápidamente analizar epitopos Qa-1 en una proteína. En este sentido, se ha descrito un número limitado de epitopos biológicamente importantes de Qa-1. La mayoría de estos epitopos Qa-1 se identificaron casualmente durante el estudio de CD8+ T respuestas a bacterias13, las células deficientes en grifo3, las células deficientes en ERAAP4y las células que causan EAE6, de la célula 9. Por lo tanto, una técnica de alto rendimiento es deseable para la identificación de los epitopos de Qa-1 biológicamente importante en una proteína definida. A continuación, describimos una estrategia de biblioteca péptido (LPO) superpuestas que epitopos de Qa-1 funcionales en una proteína CD8 Qa-1-resrticted+ T cell líneas específicas para el grupo de la OLP (OLP_pool) de una proteína.

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Protocol

Todos los experimentos se realizaron en cumplimiento de una institucional Animal cuidado y Protocolo de uso aprobado por el cuidado Animal y uso de la Universidad de Texas en El Paso y la Universidad de Loma Linda.

1. generación de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína

  1. Diseño de una biblioteca de la OLP en el que los péptidos son 15-mer en longitud y péptidos adyacentes se superponen por 11 aminoácidos.
    Nota: En el estudio de la OLP MOG, secuencia del precursor del MOG [Mus musculus] fue obtenido de la base de datos NCBI proteína siguiendo este enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. El precursor MOG (247 aminoácidos), que contiene péptidos maduros y señal, fue utilizado porque la mayoría de los epitopos de Qa-1 (HLA-E) divulgado fueron situada en péptidos de señal (e.g. Qdm1). Empezando por su N-terminal, las secuencias de péptidos de 15-mer se identificaron tales que dos péptidos adyacentes comprometidos por 11 aminoácidos (figura 1). Por lo tanto, exactamente 59 adquisiciones fueron identificados en el precursor MOG de 247 aminoácidos. Sin embargo, la OLP último puede variar de 12 a 15-mer dependiendo de la longitud de la proteína. Además, elegimos 15-mer biblioteca porque nosotros y otros hemos demostrado que péptidos de 15-mer, cuando se añade a las células dendríticas (DCs) o macrófagos, pueden ser eficientemente transformado en epítopos para reconocimiento por CD8 de las células+ T14,15 .
  2. Adquirir comercialmente cada péptido individual. 5 mg por péptido debe ser suficiente para la proyección. Adquisiciones y péptidos truncados (paso 6.1) pueden ser péptidos desaladas (pureza es aproximadamente 50-70%). La pureza del péptido óptimo (paso 6.2) que se utilizará para la generación de tetrámero y para futuros análisis biológicos debe ser > 90%. Reconstituir los péptidos bajo condiciones de esterilidad.
  3. Hacer 50 mg/mL las acciones individuales del peptide en 100% DMSO. Para 5 mg de cada péptido, agregue 100 μL de DMSO en cada tubo, mezclar y almacenar los péptidos a-20 ° C. Estas acciones se utilizarán para hacer un caldo de OLP_pool para la generación de CD8+ T cell líneas reactiva a la OLP_pool. Además, estas acciones también se utilizarán para hacer 10 mg/mL acciones individuales del peptide para determinar la capacidad de cada péptido individual para estimular una respuesta restringida de 1 Qa en una OLP_pool reactiva CD8+ T cell line.
  4. Hacer OLP_pool acción agregando un volumen igual de cada péptido en un tubo nuevo. Este stock de OLP_pool contiene 100% DMSO. En el estudio de la OLP MOG, había 59 adquisiciones12. Por lo tanto, la concentración de cada péptido en la OLP_pool fue 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Hacer 10 mg/mL las acciones individuales del peptide por dilución (5 x) el stock de 50 mg/mL en estéril de H2O en una placa de 96 V-fondo-bien (esta bolsa contiene 20% DMSO). Hacer estas acciones en una placa de 96 pocillos porque la determinación de la respuesta restringida de 1 Qa de cada péptido individual se realizará en una placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal de 8 o 12 canales.
    Nota: Todos los péptidos, incluyendo adquisiciones y péptidos truncados, deben diluirse en una placa de 96 V-fondo-bien o un rack de 96 pocillos muestra lleno de tubos de 1 mL ya que la proyección de la biblioteca de péptidos se realiza en placas de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Si es difícil de diluir un péptido, añadir 1 gota de NaOH N sabia ayudar a disolver el péptido.

2. cebado de Kb-/- Db-/- CD8+ las células T con el K OLP_pool-pulsadab-/- Db-/- las células dendríticas (DCs).

Nota: Existen dos alelos principales de Qa-1: uno es Qa-1unay la otra es Qa-1b. Desde los animales utilizados para la investigación académica, por ejemplo C57BL/6 y Balb/c mice, llevar control de calidad-1b, este protocolo describe el procedimiento para asignación Qa-1b epitopos en una proteína. CD8+ T las células utilizadas en este protocolo son purificadas de Kb-/-Db-/- ratones C57BL/6 (de fondo) en que CD8+ T las células están restringidas por las moléculas de MHC-Ib no clásicas como Qa-1.

  1. DCs de médula ósea de producir como describieron anteriormente12.
    1. Brevemente, la cultura suspensiones de célula de médula ósea (1 x 106 células/mL) en Medio RPMI-10 (RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino, 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM y 0,1 mM aminoácido no esencial) que contiene 10 U/mL de IL-4 y GM-CSF de 100 U/mL en una placa de 6 pozos (4 mL/pocillo) a 37 ° C, 5% CO2.
    2. Dos días más tarde, eliminar las células no adherentes con cuidado y añadir citocinas y medios frescos.
    3. Después de cultivar las células durante otros dos días, transferir las células no adherente que contiene medios frescos y citoquinas en una nueva placa de 6 pozos.
    4. Las células de la cultura durante otros dos días y llenado con medios de comunicación fresca y citoquinas que contiene LPS (0,1 μg/mL) para activar los controladores de dominio.
    5. 24 h después, recoger el DCs para experimentos.
  2. Irradiar el DCs con 3000 Rads.
    1. También puede tratar el DCs (5 x 107 células/mL) con mitomicina C (50 μg/mL) en PBS a 37 ° C durante 20 min añadir RPMI-0 (1640 RPMI sin suero) para llenar el tubo (~ 12 mL) y centrifugar las células durante 10 min en una centrífuga de mesa 300 x sobrenadantes de descarte de g. y repite t el procedimiento de lavado dos veces más. Estos tres lavados son críticos porque cualquier cantidad de rastro de la mitomicina C puede inhibir la respuesta de CD8+ T las células durante el co-cultivo de células DC-T.
  3. Ajustar la concentración DC a 5 x 106 células/mL en un medio libre de suero (objetivo V libre de suero suplementado con 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM y 0,1 mM aminoácido no esencial).
  4. Añadir la solución stock de OLP_pool, que contiene 100% DMSO, a los controladores de dominio que la concentración final de DMSO será 0,5% (200 x). En el estudio de la OLP MOG, la concentración de cada LPO en el OLP_pool fue 847.46 μg/mL; por lo tanto, la concentración final de cada LPO en la cultura de DC fue 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Sin embargo, esta concentración puede escalarse hasta 100 μg/mL como la concentración de DMSO en cultivo celular sigue siendo menos del 1%.
  • Incubar el DCs a temperatura ambiente durante 3 h y agitar las células suavemente cada 15 minutos.
  • Durante este período de incubación, purificar CD8+ T de las células de la cosecha del bazo o de ganglios de Kb-/-Db-/- ratones utilizando un comercial CD8+ T kit de purificación de la célula, ajustar la concentración de células a 10 x 106 células/mL en el medio libre de suero que contiene 50 U/mL interleucina 2 (IL-2) y 100 U/mL de IL-7.
  • Ahora, agregue el CD8+ T las células en una placa de 48 pozos como 0.5 mL/pozo (después de la adición de 0,5 mL/pozo de las DCs OLP_pool-pulsada de paso 2.8, la concentración final de los CD8+ T las células serán 5 x 106 células/mL).
    Nota: CD8+ T células de bazo de ratón y de los ganglios linfáticos pueden ser purificadas con CD8 positivos aislamiento Kit siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. CD8+ T las células obtenidas son libres de granos.
  • Desactivación de las DCs OLP_pool pulsada (300 x g, 10 min) en RT. reconstituir el DCs OLP_pool pulsada a 2 x 106 células/mL en el medio libre de suero y agregar 0.5 mL/pocillo en la placa de 48 pozos que contiene la CD8+ T las células (concentración final de la OLP _pool-pulsada DCs es 1 x 106 células/mL, concentración final de CD8+ T células es 5 x 106 células/mL, concentración final de IL-2 es de 25 U/mL y concentración final de IL-7 es 50 U/mL). Cultura de las células a 37 ° C y 5% CO2.
  • El día 4, retire y deseche unos 400 μL de medio de cultivo y añadir 500 μL del medio fresco libre de suero que contiene 100 U/mL IL-2 y 100U/mL de IL-7 a cada pocillo. Incube las células a 37 ° C y 5% CO2.
  • El día 7 o 8, volver a estimular el CD8 cebada OLP_pool+ T las células con el OLP_pool.
  • 3. restimulation de la cebada CD8+ T células con macrófagos pulsada con el OLP_pool

    1. Cuatro días antes de la estimulación de los CD8 OLP_pool cebada+ T células, preparar solución grano poliacrilamida al 2% (v/v): lavar 2 g de granos de la poliacrilamida en 20 mL libre de endotoxina H2O o PBS. Los granos de poliacrilamida de pellets por centrifugación (400 x g) durante 5 minutos y resuspender en 100 mL de PBS. Autoclave a 15 lb/m durante 20 min tienda a temperatura ambiente.
    2. Inyectar a ratones por vía intraperitoneal con 1 ratón mL de la solución estéril al 2% poliacrilamida grano atraer la migración de monocitos/macrófagos en la cavidad peritoneal16.
    3. Cuatro días más tarde, sacrificio de los animales por sobredosis de CO2 .
      1. Bajo condiciones estériles, cortar una pequeña apertura en el centro del abdomen que la apertura es suficiente para pasar una pipeta de 5 mL. Llenar la pipeta con RPMI-0 e Inserte la pipeta en la cavidad del abdomen a través de la abertura.
      2. Enjuagar la cavidad del abdomen mediante pipeteo. Pipetear en un tubo estéril (estos son los macrófagos peritoneales) tanto líquido como sea posible de la cavidad del abdomen. Repetir el enjuague 4 - 5 veces.
    4. Irradian de los macrófagos peritoneales con 3000 Rads.
      1. Por otra parte, tratar los macrófagos peritoneales con el mitomycin C (siga el procedimiento descrito en el paso 2.2).
    5. Ajustar la concentración de macrófagos peritoneales a 5 x 106 células/mL en el medio libre de suero. Se añade caldo de OLP_pool (la concentración final de DMSO es menos del 1%) y M-CSF (concentración final = 100 U/mL).
      Nota: En este estudio de OLP MOG, utilizamos DMSO 0,5%. Así, MOG OLP_pool stock fue diluida 200 x (por ejemplo, 1 μL de MOG OLP_Pool acción se añadió 199 μL de macrófagos peritoneales). Por lo tanto, la concentración final de cada LPO fue 4,2 μg/mL).
    6. Agregar 200 μL/pocillo (1 x 106 células/pocillo) en una placa de cultivo de tejidos de 48 pozos e incubar la placa a 37 ° C durante 4 horas.
    7. Eliminar las células no adherentes y los granos de poliacrilamida por lavado suave con 200 μL/pocillo del precalentado RPMI-0.
    8. Piscina el OLP_pool y recoger cebada CD8 células+ T de paso 2.10. Ajustar el OLP_pool cebada CD8+ T cell concentración a 1 x 106 células/mL en el medio libre de suero que contiene IL-2 de 25 U/mL y 50 U/mL de IL-7. Añadir 1 mL/pocillo de la placa de 48 pozos que contiene los macrófagos peritoneales OLP_pool pulsado.
    9. Cuatro días más tarde, reponer el medio en la placa de 48 pozos. Retire y deseche unos 400 μL de medio de cultivo en placas de cultivo 48-bien. Añadir 500 μL de fresco medio libre de suero que contiene 100 U/mL IL-2 y 100 U/mL de IL-7 en cada pocillo. Cultura de las células a 37 ° C y 5% CO2.
    10. Tres o cuatro días más tarde, examinar el CD8 restimulated OLP_pool+ T las células para la respuesta específica de OLP_pool, Qa-1-restringido por análisis enzima-ligado del immunospot (ELISPOT). Después de este punto, volver a estimular el CD8+ T células cada 7-10 días.
      Nota: Los macrófagos son preferibles para estimular a los CD8 cebada OLP_pool+ T las células. Nos dimos cuenta de que CD8+ T re-estimulada por el macrófago células crecieron mejor que DCs in vitro.

    4. determinación de OLP_pool específica, respuesta restringida de 1 Qa en un CD8 restimulated OLP_pool+ línea de la célula de T

    Nota: Respuesta OLP_pool específica, restringida de 1 Qa en un CD8 restimulated OLP_pool+ de células T está determinada por la secreción de IFNγ por estimulación de la OLP_pool en presencia de C1R o C1R. QA-1b las células usando un análisis de ELISPOT IFNγ. C1r células pueden obtenerse comercialmente. C1R. QA-1b células pueden ser generadas por transducción de las células de C1R con el vector lentivirales Qa-1.

    1. Añadir 100 μL/pocillo de anticuerpos anti-IFN-γ captura diluido en tampón de recubrimiento (PBS) en los pocillos de una placa ELISPOT.
    Sello e incubar la placa a 4 ° C durante la noche.
  • En el segundo día, desechar el tampón de recubrimiento que contiene el anticuerpo de captura anti-IFN-γ y agregar 200 μL/bien-blocking solución (medio sin suero) e Incube la placa por 2 h a temperatura ambiente.
  • Irradiar la C1R y C1R. QA-1b células con 9.600 Rads.
    1. Por otra parte, tratar las C1R y C1R. QA-1b células con mitomicina C como se describe en el paso 2.2, salvo que la duración del tratamiento será de 30 minutos.
  • Ajustar el C1R y C1R. QA-1b las células en el medio libre de suero a 4 x 106 células/mL.
  • Deseche la solución de bloqueo en la placa y añadir el C1R y C1R. Células de QA-1b en 50 μL/pozo (200.000 células/pocillo) y mezclar.
  • Añadir 50 μL/pocillo de 100 x diluido OLP_pool stock (en el medio libre de suero) y mezclar bien. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2-3 h.
  • Ajustar el CD8 restimulated OLP_pool+ T las células 1-2 x 106 células/mL en el medio libre de suero que contiene 150 U/mL de IL-7 y añadir 50 μL/pocillo (50.000-100.000 células/pocillo) a la placa. Centrifugar la placa (58 x g) durante 5 minutos.
  • Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO2 durante la noche.
  • Aspirar la suspensión celular. Lavar los pocillos 2 veces con agua desionizada de (DI) (250 μL/pocillo). Permiten pozos en remojo durante 5 minutos a cada paso de lavado.
  • Pozos de lavar 3 veces con tampón de lavado I (PBS que contenga 0.05% Tween20). Permiten pozos en remojo durante 1 min a cada paso de lavado. Desechar el tampón de lavado.
  • Añada 100 μL de anticuerpo de detección diluido en un tampón de dilución (PBS con 10% suero bovino fetal (FBS)).
  • Incubar las placas a temperatura ambiente durante 2 h.
  • Deseche la solución de detección de anticuerpos. Lavar los pocillos 3 veces con 250 μL/pocillo de lavado Tampón I. permitir pozos en remojo durante 1 min a cada paso de lavado.
  • Añadir 100 μL/pocillo del Conjugado enzimático (HRP-estreptavidina) diluido en el tampón de dilución en dilución 1: 100.
  • Incubar las placas por 1 h a temperatura ambiente.
  • Deseche la solución de Conjugado enzimático. Lavar los pocillos 4 veces con 250 μL/pocillo de lavado Tampón I. permitir pozos en remojo durante 1 min a cada paso de lavado.
  • Lavar los pocillos 2 veces con 250 μL/pocillo II de tampón de lavado (PBS).
  • Añadir 100 μl de solución sustrato (mezcla 1 gota = 20 μl de cromógeno AEC con 1 mL de sustrato AEC) a cada pocillo. Desarrollo punto de monitor durante 5 a 60 minutos.
  • Cuando resultados deseados comienzan a aparecer, lavar los pocillos con agua destilada para detener la reacción del sustrato.
  • Secar las placas a temperatura ambiente durante 2 h o toda la noche hasta que esté completamente seca. Facilitará la extracción de la bandeja de plástico debajo de las placas de secado. Almacenar las placas en una bolsa plástica sellada en la oscuridad hasta que se analiza.
  • Enumerar puntos manualmente por inspección con un microscopio de disección o con un lector de ELISPOT. Ver el resultado representativo en la figura 2.
  • 5. determinación de péptidos individuales en el OLP_pool que estimula a la secreción de IFN-γ Qa-1 restringido en un CD8 específicas OLP_pool+ de células T

    1. Determinar los péptidos individuales que estimulan OLP_pool-específico, la secreción de Qa-1-restrictred IFN-γ en un CD8 específicas OLP_pool+ T cell línea con lo anterior descrito ensayo ELISPOT de IFN-γ (concentración final de cada péptido individual utilizado para el ELISOPT análisis es 10 μg/mL). Ver resultados representativos en la figura 3.
      Nota: Un LPO-específico, Qa-1-restircted respuesta se define como una respuesta que al menos tres veces de la respuesta en presencia de C1R. QA-1b células pero sin la OLP. En el estudio de la OLP MOG, OLP68, OLP96 y OLP105 cumplan con este criterio. Por lo tanto, todas las tres adquisiciones potencialmente contienen epitopos de Qa-112 (figura 3). Sin embargo, el OLP105 dio siempre la respuesta más fuerte; por lo tanto, realizamos un análisis detallado de la OLP105 (figura 4 y figura 5)12.

    6. identificación de la óptima epitopo de Qa-1 en un LPO 15-mer que estimula la respuesta específicos del epítopo, Qa-1-restringido en un CD8 específicas OLP_pool+ de células T

    1. Sintetizar péptidos C - y N-terminalmente truncado de una OLP 15-mer como se muestra en la figura 4.
    2. Examinar la secreción de IFN-γ en un CD8 específicas de la OLP+ línea de células T estimulando el CD8 células+ T con cada uno de los péptidos truncados como la OLP los padres 15-mer en presencia de C1R o C1R. QA-1b células usando lo anterior describen ensayo ELISPOT de IFN-γ. La concentración final de cada péptido individual utilizado para el análisis de ELISPOT es 10 μg/mL. Un péptido es definido como el epitopo Qa-1 óptima si el péptido: 1) da constantemente similar o más fuerte respuesta de IFN-γ, en comparación con el original 15-mer péptido, en presencia de C1R. QA-1b células; 2) es entre 8 - 10-mer (9-mer péptido preferido) que son las longitudes de péptido a la MHC-I moléculas15,17. Ver Resultados de representante en la figura 5.

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    Representative Results

    Diseño de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína

    Empezando por el N-terminal de una proteína, cada péptido es 15 aminoácidos (15-mer). Por lo tanto, el primer péptido abarca posición 1 a la posición 15. El N-terminal del péptido segunda se superpone con el c-terminal del péptido primero por 11 aminoácidos. Por lo tanto, el segundo péptido abarca la posición 5 a la posición 19. Diseñar el resto de los péptidos al extremo del c-terminal de la proteína (figura 1). Elegimos la biblioteca 15-mer porque nosotros y otros hemos demostrado que péptidos de 15-mer, cuando se añade a las células dendríticas (DCs) o macrófagos, pueden ser eficientemente transformado en epítopos para reconocimiento por CD8 de las células+ T14,15. El número de adquisiciones de una biblioteca depende de la longitud de una proteína. Además, la OLP último puede variar de 12 a 15-mer dependiendo de la longitud de la proteína. Por ejemplo, glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG) tiene una longitud de 247 aminoácidos. La biblioteca de MOG OLP contiene adquisiciones 5912. Resultados representativos presentados en este manuscrito son a partir del análisis de la biblioteca de la OLP MOG.

    Determinación de la respuesta específica de OLP_pool, Qa-1-restringido en un CD8 estimulado OLP_pool+ de células T

    Generamos un CD8+ línea de la célula de T que fue preparado por Kb-/-Db-/- DCs pulsó con MOG OLP_pool (MOG_pool) y restimulated por K MOG_pool-pulsadab-/-Db-/- los macrófagos peritoneales, como se describe en el mencionado protocolo (Protocol 1, 2 y 3). Para determinar la potencial respuesta específica de MOG_pool, Qa-1-restringido en este CD8+ línea celular T, se examinó la respuesta de este CD8+ línea de la célula de T a la MOG_pool en presencia de C1R o C1R. QA-1b las células usando el análisis ELISPOT de IFN-γ (figura 2) (paso 4 del Protocolo). Nuestros datos demostraron que los CD8 estimulado MOG_pool+ de células T secretan un bajo nivel de IFN-γ en presencia de C1R. QA-1b células (32 puntos formando células o SFCs) pero no células de C1R (2 SFCs), sugiriendo la presencia de CD8 células+ T que respondió a epítopos de Unión Qa-1 derivados de células de C1R (C1R células son las células linfoblastoides de humana B). SFCs aumentaron cuando el MOG_pool fue agregado en el pozo que contenía células de C1R (78 SFCs), sugiriendo la presencia de CD8 células+ T que respondió a epitopos Qa-1. SFCs aumentaron dramáticamente cuando el MOG_pool fue agregado en el pozo que contenía C1R. Las células de QA-1b (320 SFCs), lo que sugiere la presencia de CD8+ T células que respondió a péptidos de Unión Qa-1. Los datos también demuestran que el MOG_pool contiene epitopo Unión Qa-1.

    Determinación de péptidos individuales en el OLP_pool que contribuyen a la secreción de IFN-γ Qa-1-restringido en una OLP_pool reactiva CD8+ de células T

    Para determinar los péptidos en el OLP_pool que estimula la secreción de restricción de 1 Qa IFN-γ en un CD8 MOG_pool-reactivo+ línea celular T, estimuló la CD8 MOG_pool-reactivo+ T células con 59 adquisiciones individuales en presencia de ambos C1R o C1R. QA-1b células (figura 3) (paso 5 del Protocolo). Nuestros datos demostraron que pocos SFCs fueron observados en los pozos que contenían células de C1R y las adquisiciones. Por el contrario, SFCs aumentaron en todos los pocillos que contenían C1R. QA-1b las células y las adquisiciones. De la figura 2, nos enteramos que CD8+ T las células en presencia de C1R. QA-1b sola también formó SFCs. Por lo tanto, el SFCs creciente en la mayoría de los pozos podrían ser debido a estimulación no específica como resultado de la presentación de epítopos de Qa-1 derivados de proteínas intracelulares en las células de C1R por las moléculas de Qa-1. Sin embargo, las adquisiciones en los 3 pozos enmarcados en la figura 3 (B8, D12 y E9), que los 3 destacó adquisiciones en la Figura 3A (OLP68, OLP96 y OLP105), se reunió el criterio para definir una respuesta de IFN-γ específico de la OLP, Qa-1-restringido como se describe en el paso 5.1 del protocolo12. Los datos sugieren que las 3 adquisiciones contienen epitopo Qa-1. Ya que el OLP105 constantemente produce la respuesta más alta, se realizó un análisis detallado de la OLP10512.

    Diseño de una biblioteca de péptidos truncados por una OLP 15-mer

    Un LPO 15-mer, que se ha determinado que estimula la secreción de restringido por Qa-1 IFN-γ en los CD8 OLP_pool-reactivo+ línea celular T, debe ser analizado para el epitopo óptima utilizando una biblioteca de péptidos truncados. Tal biblioteca péptido truncado está diseñado por truncar progresivamente la OLP 15-mer en 1 aminoácido en su N - y C-termini (figura 4). Similar a otros MHC de clase I moléculas, moléculas de Qa-1 se unen principalmente a 8 - 10-mer péptidos. Por lo tanto, recomendamos que el péptido truncado menor es 6-mer en longitud.

    Identificación del óptima epitopo de Qa-1 en un LPO 15-mer que estimula la secreción de restricción de 1 Qa IFN-γ en una OLP_pool reactiva CD8+ de células T

    Los péptidos N - y C-terminal truncado anteriormente son probados para la fuerza de estimular la secreción de IFN-γ en un CD8+ línea de células T específico para la OLP_pool o la OLP 15-mer usando la EXTRAPOLACIÓN de IFN-γ descrita anteriormente. En el estudio de los epitopos de Qa-1 en el MOG12, generamos un CD8+ línea de la célula de T que era específico para el OLP105 de MOG (figura 5A). El análisis adicional demostró que la N-terminalmente truncado 9-mer péptido reunieron los dos criterios para un epitopo óptima como se describe en el paso 6.2 (figura 5B) del protocolo. Por lo tanto, concluimos que el N-terminal truncado 9-mer péptido fue el óptimo epitopo Qa-1.

    Figure 1
    Figura 1: diseño de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína. Empezando por el N-terminal, se identificaron péptidos de 15 longitud del aminoácido (15-mer).El N-terminal de cada péptido, excepto el primer péptido, coincidía con el c-terminal del péptido anterior por 11 aminoácidos.

    Figure 2
    Figura 2: MOG_pool-estimulado CD8+ T las células fueron parcialmente MOG_pool específico y restringido de 1 Qa12. In vitro CD8+ T las células estimuladas por el MOG OLP_pool (MOG_pool) fueron examinadas para la respuesta a la MOG_pool en presencia de C1R o C1R. Células de QA-1b como antígeno que presenta las células usando un análisis ELISPOT de IFN-γ. Se muestran imágenes de ELISPOT representante. Números de punto formando células (SFCs) se muestran en las esquinas superiores izquierdas de cada pozo. CD8+ T células: 50.000 células/pocillo. C1r o C1R. Las células deb de QA-1: 200.000 células/pocillo.

    Figure 3
    Figura 3: Análisis de las adquisiciones en el MOG_pool que eran responsables de Qa-1 restricción respuesta. (A) diseño de la placa V-fondo 96 pocillos que contenía 10 mg/mL adquisiciones individuales de MOG. Números en los pozos representan OLP IDs. El destacado 3 pozos contienen las adquisiciones que cumplen el criterio de una respuesta de IFN-γ específico de la OLP, Qa-1-restringido como se describe en el paso 5.1 del protocolo12. (B) representante SFCs en cada pozo que contenía un LPO (concentración final = 4,2 μg/mL, ID de LPO que concuerda en "A"), CD8 MOG_pool-reactivo+ T células (50.000 células/pocillo) y células de C1R (200.000 células/pocillo). (C) representante SFCs en cada pozo que contenía un LPO (concentración final = 4,2 μg/mL, ID de LPO que concuerda en "A"), CD8 MOG_pool-reactivo+ T células (50.000 células/pocillo) y C1R. QA-1b células (200.000 células/pocillo). Los 3 pozos enmarcados figuran las adquisiciones que cumplen el criterio de un específico de la OLP, restringido a Qa-1 IFN-γ respuesta12. La figura ha sido adaptada de la referencia12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figure 4
    Figura 4: diseño de péptidos truncados de un péptido de mer 15. Un péptido de 15-mer progresivamente fue truncado en su N - y C-termini por 1 aminoácidos a 6-mer. 15-mer y sus péptidos truncados entonces fueron sintetizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figure 5
    Figura 5: análisis del epitopo óptima de Qa-1 en el OLP105. (A) un CD8 estimulado OLP105+ de células T fue examinado para la respuesta a la OLP68, OLP96 y OLP105 en presencia de C1R o C1R. QA-1b las células usando un análisis ELISPOT de IFN-γ. SFCs representante IFN-γ (números en las esquinas superiores izquierdas) se muestran. (B) los CD8 específicas OLP105+ línea celular T, como se muestra en (A), fue examinado para la respuesta a los péptidos individual N - y C-terminal truncada, como se muestra en la figura 4, en presencia de C1R. QA-1b las células usando el análisis ELISPOT de IFN-γ. OLP105: 15-mer LPO. N6-14: N-terminalmente había truncado péptidos OLP105. C6-14: C-terminal había truncado péptidos OLP105. CD8+ T células: 50.000 células/pocillo. C1R. Las células deb de QA-1: 200.000 células/pocillo. Números en la superior izquierda las esquinas fueron SFCs por 50.000 CD8+ las células de T. Rectángulo rojo marcó el pozo que cumplieron con los criterios para definir el óptimo epitopo Qa-1 en un LPO como se describe en el paso 6.2 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Aquí, hemos descrito un protocolo para el análisis Qa-1 epitopos en una proteína. En relación con este protocolo, varias otras estrategias también fueron divulgados previamente. Primero, trasplante allogeneic CD8+ líneas celulares T y clones fueron utilizados para la identificación del Qdm1. En segundo lugar, un motivo de Unión Qa-1 supuesto del análisis de Qdm fue utilizado para la identificación de la HSP60p216-224 y TCRBV8.1 del epítopo9,18. Se utilizaron péptidos traslapados en tercer lugar, individuales de una proteína para inmunizar animales. Posteriormente, CD8+ T células aisladas de animales inmunizados fueron utilizadas para identificar la TCRBV8.2 péptido p42-50 que fue confirmada posteriormente por la Unión a Qa-16,10,19. CD8 en cuarto lugar, funcional+ T cell líneas en combinación con la pantalla biblioteca de cDNA fueron utilizadas para la identificación del epitopo FL9 Qa-14.

    En referencia a las técnicas anteriores, el uso de allogeneic CD8+ T cell líneas y clones de mayo no sea adecuada para el análisis de epitopos de Qa-1 que se presentan durante la respuesta inmunitaria fisiológica. Además, acumulando los datos sugieren que el motivo de Unión previamente descritos sólo parcialmente puede representar la capacidad de unión a péptido de moléculas Qa-1. Por lo tanto, el motivo de Unión-1-control de calidad exacto todavía no se sabe4. Además, la inmunización con péptidos individuales para la identificación de los epitopos de Qa-1 es laboriosa. Por último, cDNA pantalla biblioteca estrategia involucra la construcción de muchos vectores que llevan largos péptidos diferentes para la transfección de la célula. En contraste, la estrategia de la biblioteca de LPO descrita aquí es simple, y los péptidos asignados son conocidos por estimular el CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células. Por lo tanto, nuestra estrategia tiene una ventaja única.

    La estrategia descrita aquí utiliza CD8 específicas OLP_pool+ T de las células que se generan por cebado en vitro y restimulation. Una fuente alternativa de los CD8+ T las células pueden ser de drenaje de los ganglios linfáticos de un kb-/-Db-/- ratón que es inmunizado con la proteína de la fuente20. Tan inmune CD8+ T las células pueden ser examinadas entonces las respuestas de IFN-γ a adquisiciones y péptidos truncados para la identificación de los epitopos de Qa-1. Teóricamente, el en vivo inmune CD8+ T las células son más cercanos a la condición fisiológica que la en vitro genera CD8+ T las células. Sin embargo, encontramos que la respuesta inmunológica CD8+ T las células directamente purificadas de ratones inmunizados fue débil y a menudo requiere en vitro restimulations para un péptido de satisfactorio resultado de detección. Además, este protocolo está diseñado para la futura traducción al estudio humano de epitopos de HLA-E en donde no está práctica la inmunización en vivo .

    Técnicamente, la parte crítica de este protocolo es la generación de CD8+ T cell líneas que son específicos para el OLP_pool o un LPO individual. Desde complejos péptido-1/Qa son inestables en comparación con el clásico de complejos MHC/péptido21, después de que presenta células de antígeno se pulsan con las adquisiciones o de un péptido, las células pulsadas no deben ser lavadas extensamente. Hemos encontrado que pulsada de péptido de las células, si se lava mucho, perder o reducen significativamente la capacidad de estimular CD8+ T las células. Por lo tanto, se recomienda lavar la pulsada de péptido antígeno que presenta las células una vez inmediatamente antes se cultivan conjuntamente con CD8+ T las células.

    También, debido a la inestabilidad de los complejos péptido/Qa-1, se recomiendan el uso de un medio libre de suero para la pulsación del péptido y la estimulación de CD8+ T las células. Además, habitualmente añadimos 50 U/mL de IL-7 en CD8+ T de la célula cultura, así como durante el IFN-γ ELISPOT análisis. El propósito de la IL-7 es mantener la viabilidad y función de CD8+ T las células. IL-7 por sí sola no estimula CD8+ T las células para producir IFN-γ.

    Similar a todas las estrategias, Qa-1 epitopos asignadas por esta estrategia también requieren una investigación adicional de importancia biológica. Por ejemplo, una cuestión importante es si el epitopo asignado puede presentarse fisiológicamente. Para abordar esta cuestión, pueden ser transduced DCs con un vector lentivirales que expresa la proteína de fuente del epítopo (e.g. estudio de MOG en el MOG LPO). Posteriormente, la respuesta de los específicos del epítopo CD8+ T las células transduced DCs se examina. Una respuesta positiva sugiere que el epitopo puede ser procesado y presentado por DCs fisiológicamente. Además, consecuencias funcionales como resultado el reconocimiento del epítopo CD8+ T las células deben ser investigada más a fondo. En este sentido, el análisis de los epitopos Qdm y FL9 Qa-1 han llevado a la conclusión de que Qa-1 moléculas son importantes para la vigilancia inmune1,4. Además, los estudios de HSP60p216, TCRBV8.1 de péptido, y p42-50 han llevado a la conclusión de que CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células regulan las respuestas inmunitarias a través contra patógenos CD4+ T células 6,7 ,9,19. Además, el estudio de MOG196 tiene por primera vez reveló que CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células podrían regular las respuestas inmunes dirigiéndose directamente a un pañuelo para evitar que se dañen las células autoinmunes potencialmente patógenos12 . Por último, el análisis funcional de un CD8 específicos del epítopo, restringido a Qa-1+ T cell puede ser asistido por tetrámero. Puede producir tal tetrámero en instalaciones de centrales de tetrámero de NIH (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) o una empresa. Para solicitar la generación de un tetrámero, uno puede enviar los datos funcionales que apoyan Unión del epitopo de Qa-1 óptima recién asignado a la proteína Qa-1 para su aprobación para la generación de un tetrámero de Qa-1.

    En conclusión, los estudios anteriores han demostrado que CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células juegan un papel importante en la regulación de la respuesta inmune local12. En este sentido, daño del tejido puede ser causada por una respuesta inmune que se dirige directamente a los tejidos. Además, los daños colaterales pueden ser causadas por una respuesta inmune que se dirige a un patógeno invasor. Por lo tanto, entender el papel de CD8 restringidas de 1 Qa+ T de las células en estos dos daños diferentes tejidos es importante para sus aplicaciones clínicas.Para lograr este objetivo, es necesario un análisis minucioso de los epitopos de Qa-1 en un mismo tejido o de un patógeno invasor. Este Protocolo será adecuado para estos análisis.

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    Disclosures

    Autores no declaran ningún conflicto de interés.

    Acknowledgements

    Agradecemos a Penelope Garcia por su asistencia técnica y la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca de innovación de investigación (RIG) desde el Departamento de medicina en la Universidad de Loma Linda (681205-2967) y una donación de piloto de la National Multiple Sclerosis Society (PP1685) para XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

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    References

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