Bibliothèque de Peptide qui se chevauchent pour mapper les épitopes de Qa-1 dans une protéine

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Immunology and Infection

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Summary

QA-1 (HLA-E chez l’homme) appartient à un groupe de molécules 1 b complexe majeur d’histocompatibilité non-classique. Vaccination avec Qa-1-liaison épitopes s’est avérée augmenter tissu-spécifique régulation immunitaire et d’améliorer plusieurs maladies auto-immunes. Dans les présentes, nous décrivons une stratégie de bibliothèque de peptide qui se chevauchent pour l’identification des épitopes Qa-1 en une protéine.

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Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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Abstract

QA-1 (HLA-E chez l’homme) appartient à un groupe de 1 b complexe majeur d’histocompatibilité non-classique molécules (MHC-Ib). Des données récentes suggèrent que Qa-1 molécules jouent un rôle important dans l’arpentage pour l’intégrité structurale et fonctionnelle des cellules, induisant la régulation immunitaire et en limitant la réponse immunitaire aux infections virales. En outre, augmentation fonctionnelle de Qa-1-accès restreint CD8+ T des cellules par l’intermédiaire d’épitope vaccination a montré des effets thérapeutiques dans plusieurs modèles animaux de maladies auto-immunes, par exemple l’encéphalomyélite allergique expérimentale, l’arthrite induite par le collagène et le diabète non obèses. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’une méthode qui permet d’identifier rapidement et efficacement des épitopes de Qa-1 fonctionnelles dans une protéine. Nous décrivons ici un protocole qui utilise Qa-1-accès restreint CD8+ des lymphocytes T lignes spécifiques pour une bibliothèque de peptide (PLO) qui se chevauchent pour déterminer les épitopes de Qa-1 en une protéine. Cette bibliothèque de PLO contient 15-mer peptides qui se chevauchent qui couvrent toute la longueur d’une protéine, et chevauchent les peptides adjacents de 11 acides aminés. Utilisant ce protocole, nous avons récemment identifié un épitope de Qa-1 9-mer en glycoprotéine de myéline oligodendrocyte (MOG). Cet épitope MOG Qa-1 nouvellement mappé a été montré pour induire des CD8 spécifiques d’épitope, Qa-1-accès restreint+ T cells accrue myéline spécifique immunitaire duditrèglement. Par conséquent, ce protocole est utile pour l’enquête future de nouvelles cibles et fonctions du CD8 Qa-1-accès restreint+ T des cellules.

Introduction

QA-1 appartient à un groupe de 1 b complexe majeur d’histocompatibilité non-classique molécules (MHC-Ib) chez la souris. Son homologue humain est HLA-E. Témoignage antérieur a démontré que les molécules de Qa-1 ont des fonctions biologiques importantes. Tout d’abord, Qa-1 molécules jouent un rôle important dans l’arpentage pour l’intégrité structurale et fonctionnelle des cellules. À cet égard, Qa-1 molécules ont évolué plusieurs stratégies pour surveiller la fonction normale d’une cellule. Une telle stratégie permet aux molécules de Qa-1 pour former des complexes avec un peptide leader transformés (épitope), c'est-à-dire le Qa-1 déterminant modificateur (Qdm) qui est transformés à base de molécules de MHC-Ia classiques dans le réticulum endoplasmique1. Ces complexes de Qa-1/Qdm plus tard affichent sur la surface d’une cellule et se lient aux récepteurs de NKG2A inhibitrices sur les cellules NK pour inhiber NK tuant l’activité2. Si l’expression de molécules MHC-Ia est perdue, une cellule (par exemple une cellule maligne) devient sensible à NK tuant2. L’autre stratégie permet aux molécules de Qa-1 former de nouveaux complexes de Qa-1/épitope sur la surface d’une cellule qui est déficiente en TAP (transporter associé au traitement de l’antigène)3 et/ou ERAAP (aminopeptidase de réticulum endoplasmique associé traitement de l’antigène)4 (les deux défauts se produisent souvent dans les cellules malignes). La cellule qui exprime ces nouveaux complexes de Qa-1/épitope peut ensuite être reconnue et éliminée par l’épitope spécifique CD8 Qa-1-accès restreint+ T des cellules. Deuxièmement, Qa-1 molécules induisent immunorégulation5. À cet égard, Qa-1/épitope complexes ont été montrés pour stimuler CD8+ des lymphocytes T (Treg) régulateurs qui sont importants pour la prévention des dommages immunitaire du self-tissus6,7,8 ,9,10. Troisièmement, Qa-1-accès restreint CD8+ Treg cellules auraient dû être divulgués afin de limiter les réponses immunitaires contre les infections virales,11.

Par conséquent, augmentation spécifique de l’épitope spécifique Qa-1-restrictred CD8+ T des cellules est une stratégie potentiellement prometteuse pour l’élimination des cellules anormales, pour le renforcement de la régulation immunitaire et pour le contrôle de l’ampleur des Viro-induite des réponses immunitaires. Tandis qu’il n’a pas été déterminé si augmentation des épitopes spécifiques CD8 Qa-1-accès restreint+ T cellules peuvent améliorer la surveillance du système immunitaire et limiter Viro-induite des réponses immunitaires, nos laboratoires et autres ont clairement démontré que immunisation avec des épitopes Qa-1 capable de compléter la fonction de Qa-1-accès restreint CD8+ Treg cellules spécifiques pour CD4 auto-immunes pathogènes+ T cellules, menant à un contrôle efficace des CD4+ T cell-mediated des maladies auto-immunes dans un variété des animaux modèles tels qu’encéphalomyélite allergique expérimentale (un modèle animal de la sclérose en plaques humaine)6,10, arthrite induite par le collagène (un modèle animal de la polyarthrite rhumatoïde)7, et diabète non obèses (un modèle animal du diabète de type humain 1)8. En outre, nous avons découvert que la vaccination avec un épitope de Qa-1 tissu-spécifique conduit à contrôle spécifique de l’inflammation immunitaire dans ce tissu par augmentation de CD8+ Treg cellules12. Les succès ci-dessus des études précliniques indiquent un besoin pour une évaluation complète de l’immunisation d’épitope Qa-1 pour le traitement des maladies à médiation immunitaire tissu-spécifique et, éventuellement, pour le traitement d’autres maladies associées aux carences dans le robinet et ERAAP.

En conséquence, il y a une demande pour une technologie qui permet d’analyser rapidement et de façon fiable des épitopes de Qa-1 en une protéine. À cet égard, un nombre limité de biologiquement importants épitopes Qa-1 a été décrite. La plupart de ces épitopes Qa-1 ont été identifiée par hasard au cours de l’étude des CD8+ T cell réponses aux bactéries13, cellules déficientes en robinet3, cellules déficientes en ERAAP4et les cellules qui causent de l’EAE6, 9. Par conséquent, une technique à haut débit est souhaitable pour l’identification des épitopes de Qa-1 biologiquement importants dans une protéine définie. Dans ce qui suit, nous décrivons une stratégie de bibliothèque de peptide (PLO) qui se chevauchent qui mappe des épitopes de Qa-1 fonctionnelles dans une protéine à l’aide de CD8 Qa-1-resrticted+ des lymphocytes T lignes spécifiques pour le pool de PLO (OLP_pool) d’une protéine.

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Protocol

Toutes les expériences ont été faites conformément à un protocole d’utilisation approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université du Texas à El Paso et Université de Loma Linda et animalier et d’institutionnels animalier.

1. génération d’une bibliothèque de PLO couvrant toute la longueur d’une protéine

  1. Concevez une bibliothèque de PLO dans lequel tous les peptides sont 15-mer en longueur, et chevauchent les peptides adjacents de 11 acides aminés.
    Remarque : Dans l’étude de MOG OLP, séquence du précurseur MOG [Mus musculus] ont été extraites de la base de protéine NCBI en suivant ce lien : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Le précurseur MOG (247 acides aminés), qui contenait le signal et peptides matures, a été utilisé parce que la plupart des épitopes de Qa-1 (HLA-E) signalés était située dans les peptides signaux (p. ex. Qdm1). Partant de son extrémité N-terminale, les séquences de peptides 15-mer ont été identifiés tels que deux peptides adjacents se chevauchaient de 11 acides aminés (Figure 1). C’est pourquoi exactement 59 achats ont été identifiés dans le précurseur MOG de 247 acides aminés. Toutefois, le dernier PLO peut varier de 12 à 15-mer selon la longueur de la protéine. En outre, nous choisissons bibliothèque 15-mer parce que nous et autres avons démontré que les peptides de 15-mer, lors de l’ajout dans les cellules dendritiques (CD) ou des macrophages, peuvent être efficacement transformé les épitopes de reconnaissance par CD8+ T cells14,15 .
  2. Acheter chaque peptide individuel dans le commerce. 5 mg / peptide devrait être suffisant pour le dépistage. Achats et peptides tronqués (étape 6.1) peuvent être des peptides dessalées (pureté est d’environ 50-70 %). La pureté du peptide optimale (étape 6.2) qui sera utilisé pour la génération de tétramère et pour les futures analyses biologiques devrait être > 90 %. Reconstituer les peptides dans des conditions stériles.
  3. Faites 50 mg/mL de stocks individuels peptide à 100 % DMSO. 5 mg de chaque peptide, ajouter 100 μL de DMSO dans chaque tube, mélanger et stocker les peptides à-20 ° C. Ces stocks seront utilisés pour faire un stock de OLP_pool pour la génération de CD8+ T cell lines réactive à la OLP_pool. En outre, ces stocks se serviront aussi à faire 10 mg/mL de stocks de peptide individuels pour déterminer l’aptitude de chaque peptide individuel pour stimuler une réponse Qa-1-accès restreint dans un OLP_pool-réactive CD8+ lignée de cellules T.
  4. Fabrication OLP_pool stock en ajoutant un volume égal de chaque peptide dans un nouveau tube. Ce stock de OLP_pool contient 100 % DMSO. Dans l’étude de MOG OLP, comptait 59 achats12. Par conséquent, la concentration de chaque peptide dans le OLP_pool était 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Faire 10 mg/mL les stocks individuels de peptide par dilution (x 5) le stock de 50 mg/mL stérile H2O dans une plaque de fond en V 96 puits (ce stock contient 20 % DMSO). Faire ces stocks dans une plaque à 96 puits, parce que la détermination de la réponse de Qa-1-accès restreint de chaque peptide individuel se dérouleront dans une plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux de 8 ou 12 canaux.
    Remarque : Tous les peptides, y compris les achats et les peptides tronqués, doivent être dilués en soit une plaque de fond en V 96 puits ou un rack de 96 puits échantillon rempli de tubes 1 mL étant donné que le criblage de peptide est réalisé en plaques 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. S’il est difficile diluer un peptide, ajouter 1 goutte de NaOH N sage pour aider à dissoudre le peptide.

2. amorçage de Kb-/- Db-/- CD8+ cellules de T avec le K OLP_pool-pulséb-/- Db-/- les cellules dendritiques (CD).

Remarque : Il y a deux allèles de Qa-1 principaux : l’un est Qa-1unet l’autre est Qa-1b. Depuis les animaux couramment utilisés pour la recherche universitaire, par exemple C57BL/6 et souris Balb/c, Qa-1b, ce protocole décrit la procédure pour les épitopes de cartographie Qa-1b à une protéine. CD8+ T cellules utilisées dans le présent protocole sont purifiés de Kb-/-Db-/- souris C57BL/6 (en arrière-plan) dans lequel CD8+ T cellules se limitent pour la plupart par des molécules de MHC-Ib non-classique dont Qa-1.

  1. Produits dérivés de la moelle osseuse DCs décrite précédemment12.
    1. En bref, la culture suspensions seule cellule de la moelle osseuse (1 x 106 cellules/mL) dans un milieu RPMI-10 (RPMI 1640 additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 5,5 x 10-5 M 2-mercaptoéthanol, pyruvate de sodium 1 mM et d’acides aminés non essentiels de 0,1 mM) contenant 10 U/mL IL-4 et 100 U/mL GM-CSF dans une plaque de 6 puits (4 mL/puits) à 37 ° C, 5 % de CO2.
    2. Deux jours plus tard, enlever les cellules non adhérentes avec précaution et ajouter les cytokines et les supports neufs.
    3. Après mise en culture des cellules pendant encore deux jours, transférer les cellules non adhérentes contenant des supports neufs et cytokines dans une nouvelle plaque 6 puits.
    4. Les cellules de la culture pendant encore deux jours et alimentée par les supports neufs et cytokines contenant LPS (0,1 µg/mL) pour activer les contrôleurs de domaine.
    5. 24 h recueillir plus tard, les contrôleurs de domaine pour des expériences.
  2. Irradier la DCs avec 3000 Rads.
    1. Vous pouvez également traiter les contrôleurs de domaine (5 x 107 cellules/mL) avec la mitomycine C (50 μg/mL) dans du PBS à 37 ° C pendant 20 min. ajouter le RPMI-0 (RPMI 1640 sans sérum) pour remplir le tube (~ 12 mL) et faire tourner les cellules pendant 10 min dans une centrifugeuse de table-top à 300 x surnageants Discard g. et repea t la procédure de nettoyage deux fois plus. Ces trois lavages sont essentiels parce que n’importe quel montant de trace de la mitomycine C peut inhiber la réponse de CD8+ T des cellules au cours de la co-culture de cellules DC-T.
  3. Ajuster la concentration de DC à 5 x 106 cellules/mL dans un milieu sans sérum (AIM-V sans sérum additionné à 5,5 x 10-5 M 2-mercaptoéthanol, pyruvate de sodium 1 mM et d’acides aminés non essentiels de 0,1 mM).
  4. Ajouter de la solution mère de OLP_pool, qui contient 100 % DMSO, sur les contrôleurs de domaine, telle que la concentration finale de DMSO s’élèvera à 0,5 % (200 x). Dans l’étude de l’OLP MOG, la concentration de chaque PLO dans la OLP_pool était 847.46 μg/mL ; C’est pourquoi la concentration finale de chaque PLO dans la culture de la DC était 4.2 μg/mL (μg/mL 847.46 ÷ 200).
Cependant, cette concentration peut évoluer jusqu'à 100 μg/mL aussi longtemps que la concentration de DMSO dans la culture de cellules reste inférieure à 1 %.
  • Incuber à température ambiante pendant 3 h, les contrôleurs de domaine et secouez les cellules toutes les 15 min.
  • Au cours de cette période d’incubation, purifier CD8+ T les cellules de la rate récolté ou les ganglions lymphatiques de Kb-/-Db-/- souris à l’aide d’un commercial CD8+ T cell kit de purification, ajuster la concentration cellulaire de 10 x 106 cellules/mL dans le le milieu sans sérum contenant 50 U/mL interleukine 2 (il-2) et 100 U/mL de l’IL-7.
  • Maintenant, ajoutez le CD8+ T des cellules dans une plaque de 48 puits comme 0,5 mL par puits (après l’addition de 0,5 mL/puits de la DCs OLP_pool-pulsé dans étape 2.8, la concentration finale du CD8+ T cellules sera de 5 x 106 cellules/mL).
    NOTE : CD8+ T les cellules des ganglions lymphatiques et la rate de souris peuvent être purifiés à l’aide de CD8 positifs Isolation Kit en suivant les instructions fournies par le fabricant. CD8+ T cellules obtenues sont libres de perles.
  • Tournez en bas les DCs OLP_pool-pulsé (300 x g, 10 min) au RT. reconstituer la DCs OLP_pool-pulsé à 2 x 106 cellules/mL dans le milieu sans sérum et ajouter 0,5 mL par puits dans la plaque de 48 puits qui contient le CD8+ T cells (concentration finale du PLO DCs _pool pulsé est de 1 x 106 cellules/mL, la concentration finale de CD8+ T cellules est de 5 x 106 cellules/mL, la concentration finale d’il-2 est de 25 U/mL et la concentration finale de l’IL-7 est 50 U/mL). La culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
  • Jour 4, enlever et jeter environ 400 μl de milieu de culture et ajouter 500 μl de milieu sans sérum frais contenant 100 U/mL IL-2 et 100U/mL de l’IL-7 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
  • Jour 7 ou 8, re-stimuler le CD8 sensibilisées OLP_pool+ T des cellules avec la OLP_pool.
  • 3. restimulation de la couche d’apprêt CD8+ T avec les Macrophages, les cellules pulsé avec le OLP_pool

    1. Quatre jours avant la re-stimulation de la OLP_pool-amorcé CD8+ T cellules, préparer la solution à 2 % (v/v) polyacrylamide perle : laver 2 g de perles de polyacrylamide deux fois dans 20 mL exempte d’endotoxine H2O ou PBS. Les perles de polyacrylamide de granule par centrifugation (400 x g) pendant 5 min et remettre en suspension dans 100 mL de PBS. Autoclave à 15 lb/m pendant 20 min. magasin à la température ambiante.
    2. Injecter par voie intrapéritonéale souris avec 1 mL/souris de la solution stérile de perle polyacrylamide de 2 % pour attirer la migration des monocytes/macrophages dans la cavité péritonéale16.
    3. Quatre jours plus tard, sacrifier les animaux en surdose de CO2 .
      1. Dans des conditions stériles, coupez une petite ouverture au centre de l’abdomen, telle que l’ouverture soit juste assez pour faire passer une pipette de 5 mL. Remplir la pipette de transfert avec RPMI-0 et insérer la pipette dans la cavité de l’abdomen à travers l’ouverture.
      2. Rincer la cavité de l’abdomen par pipetage. Pipetter sur autant de liquide que possible de la cavité de l’abdomen dans un tube stérile (ce sont des macrophages péritonéaux). Répétez l’étape de rinçage 4 - 5 fois.
    4. Irradier les macrophages péritonéaux avec 3000 Rads.
      1. Vous pouvez également traiter les macrophages péritonéaux avec la mitomycine C (suivez la procédure décrite au point 2.2).
    5. Ajuster la concentration des macrophages péritonéaux à 5 x 106 cellules/mL dans le milieu sans sérum. Ajouter OLP_pool stock (la concentration finale de DMSO est inférieure à 1 %) et M-CSF (concentration finale = 100 U/mL).
      Remarque : Dans cette étude de MOG OLP, nous avons utilisé 0,5 % DMSO. Ainsi, MOG OLP_pool stock a été dilué 200 x (par exemple 1 μL de MOG OLP_Pool stock a été ajouté en 199 μL des macrophages péritonéaux). Par conséquent, la concentration finale de chaque PLO était 4.2 μg/mL).
    6. Ajouter 200 μL/puits (1 x 106 cellules/puits) dans une plaque de culture tissulaire 48 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant 4 h.
    7. Supprimer les cellules non adhérentes et les cordons de polyacrylamide par des lavages doux à 200 μL/puits du préchauffé RPMI-0.
    8. À frais virés et piscine la OLP_pool amorcée CD8+ T les cellules de l’étape 2.10. Ajuster la OLP_pool amorcée CD8+ concentration de cellules T à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu sans sérum contenant 25 U/mL IL-2 et 50 U/mL de l’IL-7. Ajouter 1 mL/puits de la plaque de 48 puits contenant les macrophages péritonéaux pulsé OLP_pool.
    9. Quatre jours plus tard, reconstituer le milieu de la plaque de 48 puits. Retirer et jeter environ 400 ml de milieu de culture dans les plaques de 48 puits de culture. Ajouter 500 μl de frais moyen sans sérum contenant 100 U/mL IL-2 et 100 U/mL de l’IL-7 dans chaque puits. La culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
    10. Trois ou quatre jours plus tard, examiner le CD8 restimulés OLP_pool+ T des cellules d’intervention spécifiques OLP_pool, Qa-1-accès restreint par dosage immunoenzymatique immunospot (ELISPOT). Après ce point, re-stimuler le CD8+ T cellules tous les 7-10 jours.
      NOTE : Les Macrophages sont préférés pour la re-stimulation de la CD8 OLP_pool-amorcé+ T des cellules. Nous avons remarqué que CD8+ T re-stimulé par les macrophages des cellules croissent mieux que DCs in vitro.

    4. détermination de la OLP_pool spécifique, réponse Qa-1-accès restreint dans un OLP_pool-restimulés CD8+ T Cell Line

    NOTE : Réponse spécifique OLP_pool, Qa-1-accès restreint dans un OLP_pool-restimulés CD8+ lignée de cellules T est déterminée par la sécrétion d’IFNγ après stimulation par l’OLP_pool en présence de C1R ou C1R. QA-1b des cellules à l’aide d’un test ELISPOT IFNγ. C1r cellules peuvent être obtenues sur le marché. C1R. Cellules de QA-1b peuvent être générés par transduction C1R cellules avec le vecteur lentiviral Qa-1.

    1. Ajouter 100 μL/puits d’un anticorps anti-IFN-γ de capture dilué dans un tampon enduit (PBS) dans les puits d’une plaque d’ELISPOT.
    Sceller et incuber la plaque à 4 ° C durant la nuit.
  • Le deuxième jour, ignorer le buffer de revêtement contenant l’anticorps anti-IFN-γ de capture et ajouter 200 μL/well-blocking solution (milieu sans sérum) et incuber la plaque pendant 2 h à température ambiante.
  • Irradier la C1R et C1R. Cellules de QA-1b avec 9 600 Rads.
    1. Vous pouvez également traiter les C1R et C1R. Cellules de QA-1b avec la mitomycine C tel que décrit dans l’étape 2.2, sauf que le temps de traitement sera de 30 min.
  • Ajustez la C1R et C1R. Cellules de QA-1b dans le milieu sans sérum à 4 x 106 cellules/mL.
  • Jeter la solution de blocage dans la plaque et ajouter les C1R et C1R. Cellules de QA-1b à 50 μL/puits (200 000 cellules/puits) et mélanger.
  • Ajouter 50 μL par puits de 100 x dilué OLP_pool stock (dans le milieu sans sérum) et mélanger bien. Incuber les plaques à température ambiante pendant 2-3 h.
  • Ajuster le CD8 restimulés OLP_pool+ T des cellules à 1-2 x 106 cellules/mL dans le milieu sans sérum contenant 150 U/mL de l’IL-7 et ajouter 50 μL/puits (50 000-100 000 cellules/puits) sur la plaque. Centrifuger la plaque (58 x g) pendant 5 min.
  • Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant la nuit.
  • Aspirer la suspension cellulaire. Laver les puits 2 fois avec l’eau désionisée (DI) (250 μL/puits). Permettre aux puits à tremper pendant 5 min à chaque étape de lavage.
  • Puits de laver 3 fois avec le tampon de lavage j’ai (PBS contenant 0,05 % Tween20). Permettre aux puits à tremper pendant 1 min à chaque étape de lavage. Jeter le tampon de lavage.
  • Ajouter 100 μL de l’anticorps de détection dilué dans un tampon de dilution (PBS contenant 10 % sérum fœtal (SVF)).
  • Incuber les plaques à température ambiante pendant 2 h.
  • Jeter la solution de détection des anticorps. Laver les puits 3 fois avec 250 µL/puits puits de laver un tampon I. permettre à tremper pendant 1 min à chaque étape de lavage.
  • Ajouter 100 μL par puits de conjugué enzymatique (streptavidine-HRP) dilué dans le tampon de dilution à une dilution au 1/100.
  • Incuber les boîtes pendant 1 h à température ambiante.
  • Jeter la solution conjugué enzymatique. Laver les puits 4 fois avec 250 µL/puits puits de laver un tampon I. permettre à tremper pendant 1 min à chaque étape de lavage.
  • Laver les puits 2 fois avec 250 µL/puits de tampon de lavage II (PBS).
  • Ajouter 100 µL de Solution de substrat (mélange 1 goutte = 20 µL d’AEC chromogène avec 1 mL de substrat AEC) dans chaque puits. Surveiller le développement comptant de 5 à 60 min.
  • Lorsque les résultats escomptés commencent à apparaître, arrêter la réaction du substrat en lavant les puits avec de l’eau distillée.
  • Sécher les plaques à température ambiante pendant 2 heures ou toute la nuit jusqu'à ce qu’elle soit totalement sèche. Retrait du bac en plastique sous les plaques facilitera le séchage. Stocker les plaques dans un sac en plastique scellé dans l’obscurité jusqu'à ce qu’il est analysé.
  • Énumérer les taches manuellement en inspectant sous un microscope à dissection ou en utilisant un lecteur de plaque ELISPOT. Voir le résultat représentatif dans la Figure 2.
  • 5. détermination des Peptides individuels dans le OLP_pool qui stimulent à la sécrétion d’IFN-γ Qa-1 restreint dans un CD8 spécifiques OLP_pool+ T Cell Line

    1. Déterminer les peptides individuels qui stimulent la OLP_pool spécifiques, sécrétion de Qa-1-restrictred IFN-γ dans un CD8 spécifiques OLP_pool+ ligne de cellules T à l’aide de ce qui précède décrit test ELISPOT IFN-γ (concentration finale de chaque peptide individuel utilisé pour le ELISOPT essai est 10 μg/mL). Voir les résultats représentatifs dans la Figure 3.
      NOTE : Un PLO-spécifique, Qa-1-restircted réponse est défini comme une réponse qui soit au moins trois fois de la réponse en présence de C1R. QA-1b cellules mais sans le PLO. Dans l’étude de MOG OLP, OLP68, OLP96 et OLP105 toutes remplies à ce critère. Par conséquent, tous les trois achats contiennent potentiellement Qa-1 épitopes12 (Figure 3). Cependant, le OLP105 a systématiquement répondu comme plus fort ; Nous avons donc effectué une analyse détaillée de la OLP105 (Figure 4 et Figure 5)12.

    6. l’identification de l’épitope Qa-1 optimale dans un PLO 15-mer qui stimule la réponse épitope spécifique, Qa-1-accès restreint dans un CD8 spécifiques OLP_pool+ T Cell Line

    1. Synthétiser des peptides C - et N-terminale tronqué à un PLO 15-mer tel qu’illustré à la Figure 4.
    2. Examiner la sécrétion de l’IFN-γ dans un CD8 spécifiques PLO+ ligne de cellules T en stimulant le CD8+ T cells avec chacun des peptides tronqués ainsi que le PLO parentale 15-mer en présence de C1R ou C1R. QA-1b des cellules à l’aide de ce qui précède décrit test ELISPOT IFN-γ. La concentration finale de chaque peptide individuel utilisé pour le test ELISPOT est de 10 μg/mL. Un peptide est défini comme l’épitope Qa-1 optimale si le peptide : 1) donne toujours semblable ou plus forte réponse IFN-γ, par rapport à l’original 15-mer peptide, en présence de C1R. Cellules de QA-1b ; 2) se situe entre 8 - 10-mer (peptide 9-mer préféré) qui sont les longueurs de peptide liés à MHC-I molécules15,17. Voir les Résultats de représentant à la Figure 5.

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    Representative Results

    Conception d’une bibliothèque de PLO couvrant toute la longueur d’une protéine

    Partant de l’extrémité N-terminale d’une protéine, chaque peptide est 15 acides aminés (15-mer). Par conséquent, le premier peptide s’étend sur la position 1 à la position 15. N-terminal du second peptide chevauche l’extrémité C-terminale du premier peptide de 11 acides aminés. Par conséquent, le second peptide s’étend sur la position 5 à position 19. Concevoir le reste des peptides à la fin de la partie C-terminale de la protéine (Figure 1). Nous avons choisi la bibliothèque 15-mer car nous et autres avons démontré que les peptides de 15-mer, lors de l’ajout dans les cellules dendritiques (CD) ou des macrophages, peuvent être efficacement transformé les épitopes de reconnaissance par CD8+ T cells14,15. Le nombre d’achats dans une bibliothèque dépend de la longueur d’une protéine. En outre, le dernier PLO peut varier de 12 à 15-mer selon la longueur de la protéine. Par exemple, glycoprotéine de myéline oligodendrocyte (MOG) a une longueur de 247 acides aminés. La bibliothèque de MOG OLP contient 59 achats12. Représentant résultats présentés dans ce manuscrit proviennent de l’analyse de la bibliothèque de MOG OLP.

    Détermination de la réponse spécifique OLP_pool, Qa-1-accès restreint dans un CD8 stimulée par l’OLP_pool+ lignée de cellules T

    Nous avons généré un CD8+ ligne de cellules T qui a été amorcée par Kb-/-Db-/- DCs pulsé avec MOG OLP_pool (MOG_pool) et restimulés par pulsé MOG_pool Kb-/-Db-/- des macrophages péritonéaux tel que décrit dans le protocole susmentionné (protocole 1, 2 et 3). Pour déterminer la réaction potentielle de MOG_pool spécifiques, Qa-1-accès restreint dans cette CD8+ lignée de cellules de T, nous avons examiné la réponse de cette CD8+ ligne de lymphocytes T pour la MOG_pool en présence de C1R ou C1R. Cellules de QA-1b en utilisant le test ELISPOT IFN-γ (Figure 2) (étape 4 du protocole). Nos résultats ont montré que le CD8 stimulée par le MOG_pool+ lignée de cellules T sécrétée à un faible niveau d’IFN-γ en présence de C1R. Cellules de QA-1b (32 place formant des cellules ou SCTS-m) mais pas C1R cellules (2 SCTS-m), suggérant la présence de CD8+ T cells qui a répondu aux épitopes Qa-1 compromettante provenant de cellules C1R (C1R cellules sont des cellules lymphoblastoïdes B humaines). SCTS-m ont augmenté quand le MOG_pool a été ajouté dans le puits contenant des cellules C1R (SCTS-78 m), suggérant la présence de CD8+ T cells qui a répondu aux épitopes non Qa-1. SCTS-m ont été considérablement augmenté lorsque le MOG_pool a été ajouté dans le puits qui contenait C1R. Des cellules de QA-1b (320 SCTS-m), suggérant la présence de CD8+ T des cellules qui ont répondu aux peptides Qa-1 compromettante. Les données montrent également que le MOG_pool contient epitope(s) Qa-1 compromettante.

    Détermination des peptides individuels dans les OLP_pool qui contribuent à la sécrétion d’IFN-γ Qa-1-accès restreint dans un OLP_pool-réactive CD8+ lignée de cellules T

    Pour déterminer les peptides dans le OLP_pool qui stimule la sécrétion d’IFN-γ Qa-1-accès restreint dans un MOG_pool-réactive CD8+ lignée de cellules de T, nous avons stimulé le CD8 réactifs MOG_pool+ T cells avec individuels 59 achats en présence soit C1R ou C1R. Cellules de QA-1b (Figure 3) (étape 5 de protocole). Nos résultats ont montré que quelques SCTS-m ont été observés dans les puits contenant les cellules C1R et les achats. En revanche, SCTS-m a augmenté dans tous les puits qui contenait C1R. Les cellules de QA-1b et les achats. De la Figure 2, nous avons appris que CD8+ T des cellules en présence de C1R. QA-1b seul formé également SCTS-m. Par conséquent, le SCTS-m accru dans la plupart des puits pourrait être due à la stimulation non spécifique à la suite de la présentation des épitopes Qa-1 dérivés de protéines intracellulaires dans les cellules C1R par les molécules de Qa-1. Cependant, les achats dans les 3 puits encadrées dans la Figure 3 (B8, D12 et E9), qui correspondait à la 3 a mis en évidence des achats dans le chiffre 3 a (OLP68, OLP96 et OLP105), satisfaisaient au critère permettant de définir une réponse d’IFN-γ PLO spécifiques, Qa-1-restreint comme décrites dans le protocole étape 5.112. Les données suggèrent que les 3 achats contiennent epitope(s) Qa-1. Depuis toujours, la OLP105 produit la réponse plus haute, nous avons effectué une analyse détaillée de la OLP10512.

    Conception d’une bibliothèque de peptide tronqué pour une PLO 15-mer

    Un PLO 15-mer, qui a été déterminé pour stimuler la sécrétion d’IFN-γ Qa-1-accès restreint dans le CD8 OLP_pool-réactive+ lignée de cellules de T, doit être analysée pour l’épitope optimale en utilisant une bibliothèque de peptide tronqué. Telle bibliothèque de peptide tronqué est conçu en tronquant progressivement le PLO 15-mer par 1 acide aminé à ses N - et C-termini (Figure 4). Semblables aux autres MHC classe I molécules, Qa-1 molécules se lient principalement à 8 - 10-mer peptides. Par conséquent, nous recommandons que le peptide le plus court tronqué est 6-mer en longueur.

    Identification de l’épitope Qa-1 optimale dans un PLO 15-mer qui stimule la sécrétion d’IFN-γ Qa-1-accès restreint dans un OLP_pool-réactive CD8+ lignée de cellules T

    Les peptides N - et C-terminale tronqué ci-dessus sont testés pour la force en stimulant la sécrétion de IFN-γ dans un CD8+ ligne de lymphocytes T spécifique pour le OLP_pool ou le PLO 15-mer à l’aide de l’ELISPOT IFN-γ décrit ci-dessus. Dans l’étude des épitopes Qa-1 MOG12, nous avons généré un CD8+ ligne de lymphocytes T qui est spécifique de la OLP105 de MOG (Figure 5 a). Une analyse plus approfondie a démontré que le N-terminale tronquée 9-mer peptide satisfait aux deux critères d’un épitope optimal comme décrit dans l’étape de protocole 6.2 (Figure 5 b). Par conséquent, nous avons conclu que le N-terminale tronqués 9-mer peptide était l’épitope Qa-1 optimale.

    Figure 1
    Figure 1 : conception d’une bibliothèque de PLO couvrant toute la longueur d’une protéine. Peptides de 15 acides aminés (15-mer) longueur partant de l’extrémité N-terminale, ont été identifiés.Le N-terminale de chaque peptide, sauf pour le premier peptide, chevauche l’extrémité C-terminale du précédent peptide de 11 acides aminés.

    Figure 2
    Figure 2 : MOG_pool-stimulée CD8+ T les cellules ont été partiellement MOG_pool spécifique et restreint Qa-112. In vitro CD8+ T cellules stimulées par le MOG OLP_pool (MOG_pool) ont été examinés pour la réponse à la MOG_pool en présence de C1R ou C1R. QA-1b cellules présentatrices d’antigènes des cellules à l’aide d’un test ELISPOT IFN-γ. Image représentant ELISPOT sont affichées. Numéros de place formant des cellules (SCTS-m) sont indiquées dans les coins supérieurs gauche de chaque puits. CD8+ T cellules : 50 000 cellules par puits. C1r ou C1R. Cellules de QA-1b : 200 000 cellules/puits.

    Figure 3
    Figure 3 : analyse de l’achats dans les MOG_pool qui étaient responsables de la Qa-1 limitée réponse. Mise en page (A) de la plaque de fond en V 96 puits contenant les 10 mg/mL individuels MOG achats. Dans les puits, les nombres représentés PLO IDs. Les puits en surbrillance 3 contenaient les achats qui satisfont au critère d’une réponse de IFN-γ PLO spécifiques, Qa-1-restreint tel que décrit dans le protocole étape 5.112. (B) représentant SCTS-m dans chaque cupule contenant un PLO (concentration finale = 4,2 µg/mL, PLO ID correspondait à celui de « A »), le CD8 réactifs MOG_pool+ T cellules (50 000 cellules/puits) et C1R (200 000 cellules/puits). (C) représentant SCTS-m dans chaque cupule contenant un PLO (concentration finale = 4,2 µg/mL, PLO ID correspondait à celui de « A »), le CD8 réactifs MOG_pool+ T cellules (50 000 cellules/puits) et C1R. Cellules de QA-1b (200 000 cellules/puits). Les 3 puits encadrés figurant les achats qui satisfont au critère pour un PLO spécifiques, Qa-1-restreint IFN-γ réponse12. La figure a été adaptée de référence12S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 : concevoir des peptides tronqués d’un peptide 15-mer. Un peptide 15-mer a été progressivement tronqué à sa N - et C-termini par 1 acide aminé à 6-mer. Le 15-mer et ses peptides tronqués ont été ensuite synthétisés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5 : analyse de l’épitope Qa-1 optimale dans le OLP105. (A) un CD8 stimulée par l’OLP105+ lignée de cellules T a été examinée pour la réponse à la OLP68, OLP96 et OLP105 en présence de C1R ou C1R. QA-1b des cellules à l’aide d’un test ELISPOT IFN-γ. Représentant IFN-γ SCTS-m (numéros dans les coins supérieurs gauche) est indiquées. (B) le CD8 spécifiques OLP105+ ligne de lymphocytes T, comme indiqué en (A), a été examinée pour la réponse pour les peptides différents N - et C-terminale tronquée, comme illustré à la Figure 4, en présence de C1R. Cellules de QA-1b en utilisant le test ELISPOT IFN-γ. OLP105 : un PLO 15-mer. N6-14 : Tronqué en position N-terminale des peptides OLP105. C6-14 : Tronqué terminalement peptides OLP105. CD8+ T cellules : 50 000 cellules par puits. C1R. Cellules de QA-1b : 200 000 cellules/puits. Nombres en haut à gauche les coins étaient SCTS-m pour 50 000 CD8+ de cellules T. Rectangle rouge marqué du puits qui remplissaient les critères permettant de définir l’épitope Qa-1 optimale dans un PLO comme décrit dans l’étape de protocole 6.2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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    Discussion

    Ici, nous avons décrit un protocole pour l’analyse des épitopes Qa-1 en une protéine. En ce qui concerne le présent protocole, plusieurs autres stratégies ont également été signalés auparavant. Tout d’abord, allogéniques CD8+ des lignées de cellules T et les clones ont été utilisées pour l’identification de la Qdm1. Deuxièmement, un motif de liaison-1-Qa putatif de l’analyse du Qdm a été utilisé pour l’identification de l’HSP60p216-224 et un épitope-TCRBV8.19,18. Troisièmement, les peptides qui se chevauchent d’une protéine servaient à vacciner les animaux. Par la suite, CD8+ T cellules isolées des animaux vaccinés ont servi à identifier les TCRBV8.2 peptide p42-50 qui a été confirmé par la suite pour se lier à Qa-16,10,19. Quatrièmement, fonctionnelle CD8+ T cell lines en combinaison avec affichage d’ADNc ont été utilisées pour l’identification des épitopes FL9 Qa-14.

    En ce qui concerne les techniques précédentes, l’utilisation de CD8 allogéniques+ T cell lines et clones mai ne pas être approprié pour l’analyse des épitopes de Qa-1 qui sont présentés au cours des réactions immunitaires physiologiques. En outre, accumulant des données suggèrent que le motif de liaison décrites précédemment ne représente que partiellement la capacité de fixation du peptide de molécules Qa-1. Par conséquent, le motif exact de Qa-1 compromettante ne sait toujours pas4. En outre, la vaccination par un peptide individuel pour l’identification des épitopes Qa-1 est laborieuse. Enfin, stratégie d’ADNc affichage bibliothèque comprend la construction de nombreux vecteurs qui transportent les longueurs de différents peptides pour la transfection de cellules. En revanche, la stratégie de bibliothèque de PLO décrite ici est simple, et les peptides mappées sont connus pour stimuler la Qa-1-accès restreint CD8+ T des cellules. Par conséquent, notre stratégie a un avantage unique.

    La stratégie décrite ici utilise CD8 spécifiques OLP_pool+ T des cellules qui sont générés par in vitro d’amorçage et restimulation. Une autre source de la CD8+ T les cellules peuvent être de vider les ganglions lymphatiques d’un kb-/-Db-/- souris qui est immunisée avec la protéine de source20. Ces immunitaires CD8+ T cellules peuvent ensuite être examinés réponses IFN-γ, d’achats et de peptides tronqués pour l’identification des épitopes Qa-1. Théoriquement, in vivo immunitaires CD8+ T les cellules sont plus proches de la condition physiologique que l' in vitro a généré CD8+ T des cellules. Cependant, nous avons constaté que la réponse du système immunitaire CD8+ T cellules directement purifiés à partir de souris immunisées a été faible et souvent nécessaire le in vitro restimulations pour un peptide satisfaisant résultat de dépistage. En outre, ce protocole est conçu pour une traduction future étude humaine épitopes HLA-E dans lequel in vivo la vaccination n’est pas pratique.

    Techniquement, l’élément essentiel de ce protocole est la génération de CD8+ T cell lines qui sont spécifiques pour la OLP_pool ou un PLO individuel. Complexes de Qa-1/peptide étant instables par rapport à la classique de complexes MHC-I/peptide21, après que les cellules présentatrices d’antigène sont pulsés avec les achats ou un peptide, les cellules pulsés ne doivent pas être lavés abondamment. Nous avons trouvé que peptide-pulsé cellules, si lavé abondamment, perdent ou réduisent de façon significative la capacité de stimuler des CD8+ T des cellules. Par conséquent, nous vous recommandons de laver le pulsé peptide antigène présentant des cellules une fois immédiatement avant, ils sont cultivés conjointement avec CD8+ T des cellules.

    En outre, en raison de l’instabilité des complexes de peptides/Qa-1, nous recommandons l’utilisation d’un milieu sans sérum pour la pulsation de peptide et la stimulation des CD8+ T des cellules. En outre, nous ajoutons régulièrement 50 U/mL de l’IL-7 au cours de CD8+ T culture cellulaire ainsi qu’au cours de l’ELISPOT IFN-γ de dosage. L’IL-7 vise à maintenir la viabilité et la fonction des CD8+ T des cellules. IL-7 en soi ne stimule pas CD8+ T les cellules pour produire l’IFN-γ.

    Semblable à toutes les stratégies, Qa-1 épitopes mappés par cette stratégie exigent aussi plus enquête pour signification biologique. Par exemple, une question importante est si l’épitope mappé peut être physiologiquement présenté. Pour répondre à cette question, contrôleurs de domaine peuvent être transduites avec un vecteur lentiviral qui exprime la protéine de source épitope (p. ex. étude de MOG dans le PLO MOG). Par la suite, la réponse de l’épitope spécifique CD8+ T des cellules sur les contrôleurs de domaine transduits est examinée. Une réponse positive donne à penser que l’épitope peut être physiologiquement traité et présenté par les contrôleurs de domaine. En outre, les conséquences fonctionnelles à la suite de la reconnaissance de l’épitope par CD8+ T cellules devraient être étudiées plus loin. À cet égard, les analyses des épitopes Qdm et FL9 Qa-1 ont conduit à la conclusion que les molécules Qa-1 sont importantes pour la surveillance immunitaire1,4. En outre, les études de HSP60p216, TCRBV8.1 peptide, et le p42-50 ont conduit à la conclusion que CD8 Qa-1-accès restreint+ T cellules réglementent les réponses immunitaires grâce à ciblage pathogènes CD4 des cellules de+ T 6,7 ,9,19. En outre, l’étude de MOG196 a pour la première fois révélé que Qa-1-accès restreint CD8+ T cellules pouvaient réglementer les réponses immunitaires en ciblant directement un mouchoir en papier pour l’empêcher de dommages causés par des cellules auto-immunes potentiellement pathogènes12 . Enfin, l’analyse fonctionnelle d’un épitope spécifique, Qa-1-restreint CD8+ des lymphocytes T peut être aidé par tétramère. Ce tétramère peut être produit au laboratoire central de NIH tétramère (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) ou une entreprise. Pour demander la génération d’un tétramère, on peut envoyer les données fonctionnelles qui prennent en charge la liaison de l’épitope de Qa-1 optimale nouvellement mappé à Qa-1 protéine pour leur approbation pour la génération d’un tétramère de Qa-1.

    En conclusion, les études antérieures ont démontré que CD8 restreint Qa-1+ T cellules jouent un rôle important dans la régulation des réponses immunes locales12. À cet égard, les dommages de tissu peuvent être causées par une réponse immunitaire qui cible directement le tissu. En outre, les dommages collatéraux peuvent être causées par une réponse immunitaire qui cible un pathogène envahissant. Par conséquent, comprendre le rôle des CD8 Qa-1-accès restreint-+ T cellules dans ces deux tissus différents dommages est important pour leurs applications cliniques.Pour atteindre cet objectif, une analyse approfondie des épitopes Qa-1 dans un self-tissu ou un pathogène invasion est nécessaire. Ce protocole sera adapté à ces analyses.

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    Disclosures

    Auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

    Acknowledgements

    Nous remercions Penelope Garcia pour son assistance technique et la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Innovation recherche (RIG) du département de médecine à l’Université de Loma Linda (681205-2967) et une subvention pilote de la National Multiple Sclerosis Society (PP1685) à XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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