Overlappende peptid Bibliotek kortlægge Qa-1 epitoper i et Protein

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

QA-1 (HLA-E i menneskelige) tilhører en gruppe af ikke-klassisk store histocompatibility komplekse 1b molekyler. Vaccination med Qa-1-bindende epitoper har vist sig at forøge væv-specifik immun regulering og rette op på flere autoimmune sygdomme. Heri beskrives en overlappende peptid bibliotek strategi til identifikation af Qa-1 epitoper i et protein.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

QA-1 (HLA-E i menneskelige) tilhører en gruppe af ikke-klassisk store histocompatibility komplekse 1b (MHC-Ib) molekyler. De seneste data tyder på, at Qa-1 molekyler spiller en vigtig rolle i landmåling celler til strukturelle og funktionelle integritet, inducerende immun forordning og begrænse immunrespons Virale infektioner. Derudover funktionelle augmentation af Qa-1-begrænset CD8+ T-celler gennem epitop immunisering har vist terapeutiske virkninger i flere autoimmune sygdom dyremodeller, fx eksperimentelle allergisk encephalomyelitis, kollagen induceret artritis, og ikke-overvægtig diabetes. Derfor er der et presserende behov for en metode, der kan effektivt og hurtigt identificere funktionelle Qa-1 epitoper i et protein. Her, vi beskriver en protokol, der udnytter Qa-1-begrænset CD8+ T-celle linier specifikke for en overlappende peptid (OLP) bibliotek til bestemmelse af Qa-1 epitoper i et protein. Denne OLP bibliotek indeholder 15-mer overlappende peptider, der dækker hele længden af et protein, og tilstødende peptider overlappe med 11 aminosyrer. Ved hjælp af denne protokol, identificeret vi for nylig en 9-mer Qa-1 epitop i myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). Dette nyligt tilknyttede MOG Qa-1 epitop blev vist sig at fremkalde epitop-specifikke, Qa-1-begrænset CD8+ T celler, forbedret myelin-specifik immun jf. Denne protokol er derfor nyttig for fremtidige undersøgelse af nye mål og funktioner af Qa-1-begrænset CD8+ T celler.

Introduction

QA-1 tilhører en gruppe af ikke-klassisk store histocompatibility komplekse 1b (MHC-Ib) molekyler i mus. Dens menneskelige homolog er HLA-E. Tidligere beviser har vist, at Qa-1 molekyler vigtige biologiske funktioner. For det første, Qa-1 molekyler spiller en vigtig rolle i landmåling celler til strukturelle og funktionelle integritet. I denne henseende har Qa-1 molekyler udviklet flere strategier til at overvåge den normale funktion af en celle. En sådan strategi giver Qa-1 molekyler til form komplekser med en forarbejdede leder peptid (epitop), dvs Qa-1 determinant modifier (Qdm), der er forarbejdet på basis af klassisk MHC-Ia molekyler i det endoplasmatiske reticulum1. Disse Qa-1/Qdm komplekser senere vises på overfladen af en celle og binde til hæmmende NKG2A receptorer på NK-celler til at hæmme NK dræbe aktivitet2. Hvis udtryk af MHC-Ia molekyler er tabt, bliver en celle (f.eks. en ondartet celle) følsom over for NK dræbe2. Anden strategien giver Qa-1 molekyler til at danne nye Qa-1/epitop komplekser på overfladen af en celle, der er mangelfuld i TAP (transporter tilknyttet antigen behandling)3 og/eller ERAAP (endoplasmatiske reticulum aminopeptidase tilknyttet antigen behandling)4 (begge mangler ofte forekommer i maligne celler). Den celle, der udtrykker disse nye Qa-1/epitop komplekser kan derefter blive anerkendt og elimineret af epitop-specifikke Qa-1-begrænset CD8+ T celler. For det andet fremkalde Qa-1 molekyler immun regulation5. I denne henseende Qa-1/epitop komplekser har vist sig at stimulere CD8+ regulerende T (langsomme) celler, der er vigtige for forebyggelse af immun-medieret beskadigelse af self-væv6,7,8 ,9,10. For det tredje, Qa-1-begrænset CD8+ langsomme celler har vist sig at begrænse immunrespons mod viral infektion11.

Derfor specifikke augmentation af epitop-specifikke Qa-1-restrictred CD8+ T celler er et potentielt lovende strategi for fjernelse af unormale celler, styrkelse af immunforsvaret regulering og kontrol af omfanget af virus-induceret immunrespons. Mens det er ikke fastslået om forstærkning af epitop-specifikke Qa-1-begrænset CD8+ T celler kan øge immune overvågning og begrænse virus-induceret immunrespons, vores laboratorier og andre har klart vist, at vaccination med Qa-1 epitoper kan forøge funktionen af Qa-1-begrænset CD8+ langsomme celler specifikke for patogene autoimmune CD4+ T celler, fører til effektiv kontrol af CD4+ T-celle-medieret autoimmune sygdomme i en række dyre modeller som eksperimentelle allergisk encephalomyelitis (en dyremodel af human multipel sklerose)6,10, kollagen induceret artritis (en dyremodel af human leddegigt)7, og ikke-fede diabetes (en dyremodel af human type 1 diabetes)8. Derudover har vi opdaget, at vaccination med en væv-specifikke Qa-1 epitop fører til specifikke kontrol af immun-medieret betændelse i dette væv gennem forstærkning af CD8+ langsomme celler12. De ovenstående succeser i prækliniske studier indikerer et behov for en fuld evaluering af Qa-1 epitop immunisering til behandling af væv-specifik immun-medierede sygdomme og potentielt til behandling af andre sygdomme forbundet med fejl og mangler i TAP og ERAAP.

Derfor er der et krav om en teknologi, der kan hurtigt og pålideligt analysere Qa-1 epitoper i et protein. I denne forbindelse er et begrænset antal biologisk vigtige Qa-1 epitoper blevet beskrevet. De fleste af disse Qa-1 epitoper blev identificeret serendipitously i løbet af undersøgelsen af CD8+ T celle svar til bakterier13, celler mangelfuld i TAP3, celler mangelfuld i ERAAP4og celler, der forårsager EAE6, 9. Derfor er en høj overførselshastighed teknik ønskeligt for identifikation af biologisk vigtige Qa-1 epitoper i et defineret protein. I følgende beskriver vi en overlappende peptid (OLP) bibliotek strategi, der knytter funktionelle Qa-1 epitoper i et protein ved hjælp af Qa-1-resrticted CD8+ T-celle linier specifikke for OLP pool (OLP_pool) af et protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med en institutionel Animal Care og brug protokol godkendes af Animal Care og brug Udvalget på University of Texas i El Paso og Loma Linda University.

1. generation af en OLP biblioteket der dækker hele længden af et Protein

  1. Designe en OLP bibliotek hvor alle peptider er 15-mer i længden, og tilstødende peptider overlappe med 11 aminosyrer.
    Bemærk: I undersøgelsen MOG OLP sekvens af MOG forløber [Mus musculus] blev hentet fra NCBI protein database ved at følge dette link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. MOG forløber (247 aminosyrer), der indeholdt både signal og modne peptider, blev brugt, fordi de fleste af rapporterede Qa-1 (HLA-E) epitoper var placeret i signal peptider (f.eks. Qdm1). Begynder på sin N-terminus, blev sekvenser af 15-mer peptider identificeret sådan at to tilstødende peptider overlappes af 11 aminosyrer (figur 1). Derfor, præcis 59 OLPs blev identificeret i 247 aminosyre MOG forløber. Men den sidste OLP kan variere fra 12 til 15-mer afhængigt af længden af proteinet. Derudover vælger vi 15-mer bibliotek, fordi vi og andre har vist, at 15-mer peptider, når de lægges ind dendritiske celler (DCs) eller makrofager, kan være effektivt forarbejdes til epitoper for anerkendelse af CD8+ T celler14,15 .
  2. Køb hver enkelte peptid kommercielt. 5 mg pr. peptid burde være nok for screening. OLPs og afkortet peptider (trin 6.1) kan være afsaltede peptider (renhed er ca. 50-70%). Renheden af optimal peptid (trin 6.2), der skal bruges for generation af tetramer og fremtidige biologiske analyser bør være > 90%. Rekonstruere peptider under steril tilstand.
  3. Gøre 50 mg/mL individuelle peptid bestande i 100% DMSO. For 5 mg af hvert peptid, tilføje 100 μL af DMSO i hver tube, mix, og gemme peptider ved-20 ° C. Disse lagre skal bruges til at gøre en OLP_pool status for generation af CD8+ T-celle linier reaktiv til OLP_pool. Disse bestande vil derudover også bruges til at gøre 10 mg/mL individuelle peptid bestande til bestemmelse af hver enkelt peptid evne til at stimulere en Qa-1-begrænset svar i en OLP_pool-reaktiv CD8+ T-cellelinje.
  4. Fremstil OLP_pool lager ved at tilføje et lige saa stort volumen af hver peptid ind i en frisk rør. Denne OLP_pool lager indeholder 100% DMSO. I MOG OLP undersøgelse var der 59 OLPs12. Derfor var koncentrationen af hver peptid i OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Gøre 10 mg/mL individuelle peptid bestande af fortynde (5 x) 50 mg/mL bestanden i sterile H2O i en V-bund 96-brønd plade (denne bestand indeholder 20% DMSO). Gøre disse bestande i en 96-brønd plade, fordi fastsættelsen af hver individuel peptid Qa-1-begrænset reaktion vil blive udført i en 96-brønd plade ved hjælp af en 8 - eller 12-kanals multikanalpipette.
    Bemærk: Alle peptider, herunder OLPs og afkortet peptider, skal fortyndes i enten en V-bund 96-brønd plade eller en 96-godt prøve rack fyldt med 1 mL rør da peptid bibliotek screening er udført i 96-brønd plader ved hjælp af en multikanalpipette. Hvis det er vanskeligt at udvande et peptid, tilsættes 1 N NaOH dråbe klogt at hjælpe opløse peptid.

2. priming af Kb-/- Db-/- CD8+ T celler med den OLP_pool-pulserende Kb-/- Db-/- dendritiske celler (DCs).

Bemærk: Der er to store Qa-1 alleler: en er Qa-1en, og den anden er Qa-1b. Da dyrene normalt bruges til akademisk forskning, fx C57BL/6 og Balb/c mus, bære Qa-1b, denne protokol beskriver proceduren for kortlægning Qa-1b epitoper i et protein. CD8+ T celler, der bruges i denne protokol er renset fra Kb-/-Db-/- mus (C57BL/6 baggrund) i hvilken CD8+ T celler er begrænset det meste af ikke-klassisk MHC-Ib molekyler herunder Qa-1.

  1. Producere knoglemarv-afledte DCs som tidligere beskrevet12.
    1. Kort, kultur knoglemarv enkelt celle suspensioner (1 x 106 celler/mL) i RPMI-10 medium (RPMI 1640 suppleret med 10% føtal bovint serum, 5,5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvat og 0,1 mM uvæsentlige aminosyre) indeholdende 10 U/mL IL-4 og 100 U/mL GM-CSF i en 6-godt plade (4 mL/hul) ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. To dage senere, fjerne ikke-tilhænger celler omhyggeligt og tilføje frisk medier og cytokiner.
    3. Efter dyrkning af celler til en anden to dage, overføres ikke-tilhænger celler med friske medier og cytokiner i en ny 6-godt plade.
    4. Kultur cellerne til en anden to dage og genopfyldes med friske medier og cytokiner som indeholder LP'ER (0,1 µg/mL) hen til aktivere DCs.
    5. 24 timer senere, indsamle DCs for eksperimenter.
  2. Bestråle DCs med 3000 Rads.
    1. Alternativt, behandle DCs (5 x 107 celler/mL) med mitomycin C (50 μg/mL) i PBS ved 37 ° C i 20 min. Tilføj RPMI-0 (RPMI 1640 uden serum) til at fylde røret (~ 12 mL) og spin celler i 10 min i en tabel-top centrifuge på 300 x g. udsmid analysere og repea t vask proceduren to gange mere. Disse tre vasker er kritiske fordi nogen spor mængde af mitomycin C kan hæmme svar af CD8+ T celler under DC-T celle Co kultur.
  3. Justere DC koncentration på 5 x 106 celler/mL i et serumfrit medium (AIM-V serumfrit medium suppleret med 5,5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvat og 0,1 mM uvæsentlige aminosyre).
  4. Tilføje stamopløsning OLP_pool som indeholder 100% DMSO, til domænecontrollerne, således at endelige DMSO koncentration vil være 0,5% (200 x). I undersøgelsen MOG OLP var koncentrationen af hver OLP i OLP_pool 847.46 μg/mL; dermed var den endelige koncentration af hver OLP i DC kultur 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Denne koncentration kan skaleres op til 100 μg/mL, så længe koncentrationen af DMSO i cellekultur er mindre end 1%.
  • Inkuber DCs ved stuetemperatur for 3 h og ryst cellerne forsigtigt hver 15 min.
  • Under denne inkubationsperiode, rense CD8+ T celler fra høstede milt eller lymfeknuder kb-/-Db-/- mus ved hjælp af en kommerciel CD8+ T celle rensning kit, justere celle koncentration på 10 x 106 celler/mL i i serumfrit medium indeholdende 50 U/mL interleukin 2 (IL-2) og 100 U/mL af IL-7.
  • Nu tilføje CD8+ T-celler i en 48-godt plade som 0,5 mL/hul (efter tilsætning af 0,5 mL/godt af de OLP_pool-pulserende DCs i trin 2.8, den endelige koncentration af CD8+ T celler vil være 5 x 106 celler/mL).
    Bemærk: CD8+ T celler fra mus milt og lymfeknuder kan renses ved hjælp af CD8 Positive isolering Kit ved at følge instruktionen leveres af producenten. CD8+ T celler fremstillet er fri for perler.
  • Spin ned til OLP_pool-pulserende DCs (300 x g i 10 min.) på RT. rekonstruere de OLP_pool-pulserende DCs til 2 x 106 celler/mL i serumfrit medium og tilsæt 0,5 mL/hul i 48-godt pladen, der indeholder CD8+ T-celler (endelig koncentration af OLP _pool-pulserende DCs er 1 x 106 celler/mL, endelige koncentration af CD8+ T celler er 5 x 106 celler/mL, endelige koncentration af IL-2 er 25 U/mL og endelige koncentration af IL-7 er 50 U/mL). Kultur cellerne ved 37 ° C og 5% CO2.
  • Dag 4, fjerne og kassere omkring 400 μL af substratet og tilsæt 500 μL af frisk serum-frit medium indeholdende 100 U/mL IL-2 og 100U/mL af IL-7 i hver brønd. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2.
  • På dag 7 eller 8, igen stimulere OLP_pool-pulverlak CD8+ T celler med OLP_pool.
  • 3. restimulering af PRIMES CD8+ T celler med makrofager pulserende med OLP_pool

    1. Fire dage før re stimulation af det OLP_pool-pulverlak CD8+ T celler, forberede 2% (v/v) polyacrylamid perle løsning: vask 2 g af polyacrylamid perler to gange i 20 mL endotoxin-fri H2O eller PBS. Pellet polyacrylamid perler ved centrifugering (400 x g) i 5 min og resuspend i 100 mL PBS. Autoklave på 15 lb/m for 20 min. butik ved stuetemperatur.
    2. Injicere mus intraperitoneal med 1 mL/mus af sterile 2% polyacrylamid perle løsningen at tiltrække migration af monocytter/makrofager ind i bughulen16.
    3. Fire dage senere, ofre dyr af CO2 overdosis.
      1. Under sterile forhold, skære en lille åbning på midten af maven, så åbningen er lige nok til passerer 5 mL overførsel pipette. Fyld overførsel pipette med RPMI-0 og indsætte pipetten i maven hulrum gennem åbningen.
      2. Skyl maven hulrummet af pipettering. Afpipetteres ud så meget væske som muligt fra maven hulrum i en steril tube (disse er peritoneal makrofager). Gentag trinnet skyl 4 - 5 gange.
    4. Bestråle de peritoneale makrofager med 3000 Rads.
      1. Alternativt kan du behandle de peritoneale makrofager med mitomycin C (Følg fremgangsmåden i trin 2.2).
    5. Justere koncentrationen af de peritoneal makrofager til 5 x 106 celler/mL i serumfrit medium. Tilføj OLP_pool lager (slutkoncentration DMSO er mindre end 1%) og M-CSF (slutkoncentration = 100 U/mL).
      Bemærk: I denne MOG OLP undersøgelse brugte vi 0,5% DMSO. MOG OLP_pool lager var således fortyndede 200 x (f.eks. 1 μL af MOG OLP_Pool bestand blev tilføjet i 199 μL af peritoneal makrofager). Derfor, den endelige koncentration af hver OLP var 4,2 μg/mL).
    6. Tilføje 200 μl/brønd (1 x 106 celler/brønd) i en 48-godt vævskultur plade og inkuberes plade ved 37 ° C i 4 timer.
    7. Fjern de ikke-tilhænger celler og polyacrylamid perler ved skånsom vask med 200 μl/brønd af den pre varmede RPMI-0.
    8. Indsamle og swimmingpool i OLP_pool primet CD8+ T celler fra trin 2.10. Justere OLP_pool primet CD8+ T-celle koncentration til 1 x 106 celler/mL i serumfrit medium indeholdende 25 U/mL IL-2 og 50 U/mL af IL-7. Tilsættes 1 mL/hul til 48-godt pladen, der indeholder de OLP_pool-pulserende peritoneal makrofager.
    9. Fire dage senere, genopbygge mediet i 48-godt plade. Fjern og kassér omkring 400 μL af næringssubstratet i 48-og kultur plader. Tilsæt 500 μL af frisk serum-frit medium indeholdende 100 U/mL IL-2 og 100 U/mL af IL-7 i hver brønd. Kultur cellerne ved 37 ° C og 5% CO2.
    10. Tre eller fire dage senere, undersøge de OLP_pool-restimuleret CD8+ T-celler til OLP_pool-specifikke, Qa-1-begrænset svar af enzym-forbundet immunospot assay (ELISPOT). Efter dette punkt igen stimulere CD8+ T celler hver 7-10 dage.
      Bemærk: Makrofager foretrækkes for fornyet stimulering af de OLP_pool-pulverlak CD8+ T celler. Vi har bemærket, at CD8+ T celler igen stimuleres af makrofag voksede bedre end DCs in vitro.

    4. bestemmelse af OLP_pool-specifikke, Qa-1-begrænset svar i en OLP_pool-restimuleret CD8+ T-celle linje

    Bemærk: OLP_pool-specifikke, Qa-1-begrænset svar i en OLP_pool-restimuleret CD8+ T-cellelinje bestemmes af IFNγ sekretion efter stimulation af OLP_pool C1R eller C1R. QA-1b -celler ved hjælp af en IFNγ ELISPOT analyse. C1r celler kan opnås kommercielt. C1R. QA-1b -celler kan frembringes af transducing C1R celler med Qa-1 lentiviral vektor.

    1. Tilsæt 100 μL/brønd af et capture anti-IFN-γ antistof fortyndet i coatingbuffer (PBS) i hullerne i en ELISPOT plade.
    Forsegle og inkuberes plade ved 4 ° C natten over.
  • På andendagen, kassere coatingbuffer indeholdende capture anti-IFN-γ antistof og tilføje 200 μl/godt-blocking løsning (serumfrit medium) og inkuberes plade i 2 timer ved stuetemperatur.
  • Bestråle C1R og C1R. QA-1b -celler med 9.600 Rads.
    1. Alternativt, behandle C1R og C1R. QA-1b -celler med mitomycin C som beskrevet i trin 2.2 bortset fra at behandlingstiden vil være 30 min.
  • Justere C1R og C1R. QA-1b -celler i serumfrit medium til 4 x 106 celler/mL.
  • Kassér den blokerende løsning i pladen og tilføje C1R og C1R. QA-1b -celler på 50 μL/brønd (200.000 celler/brønd) og blandes.
  • Tilsæt 50 μL/brønd af 100 x fortyndet OLP_pool bestand (i serumfrit medium) og blandes ordentligt. Inkuber plade ved stuetemperatur i 2-3 timer.
  • Justere OLP_pool-restimuleret CD8+ T-celler til 1-2 x 106 celler/mL i serumfrit medium indeholder 150 U/mL af IL-7 og tilføje 50 μL/brønd (50.000-100.000 celler/brønd) til pladen. Der centrifugeres plade (58 x g) i 5 min.
  • Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 natten over.
  • Opsug cellesuspension. Vask brønde 2 gange med deioniseret vand (DI) vand (250 μL/brønd). Tillad brønde i blød i 5 min på hver vask trin.
  • Vask wells 3 gange med vaske Buffer (PBS indeholdende 0,05% Tween20). Tillad brønde i blød i 1 minut på hver vask trin. Kassér wash buffer.
  • Tilsæt 100 μL af påvisning antistof fortyndet i en fortynding buffer (PBS, som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS)).
  • Inkuber plader ved stuetemperatur i 2 timer.
  • Kassér påvisning antistof løsning. Vask wells 3 gange med 250 µL/brønd vaske Buffer I. tillade brønde i blød i 1 minut på hver vask trin.
  • Tilsæt 100 μL/brønd af enzymkonjugat (Streptavidin-HRP) fortyndet i bufferen til fortynding på 1: 100 fortynding.
  • Inkuber plader i 1 time ved stuetemperatur.
  • Kassér enzym konjugat løsning. Vask wells 4 gange med 250 µL/brønd vaske Buffer I. tillade brønde i blød i 1 minut på hver vask trin.
  • Vask brønde 2 gange med 250 µL/brønd vaske Buffer II (PBS).
  • Tilsæt 100 µL af substratopløsning (mix 1 dråbe = 20 µL af AEC kromogen med 1 mL af AEC substrat) til hver brønd. Overvåge spot udvikling i 5-60 min.
  • Når ønskede resultater begynder at dukke op, substrat reaktionen standses ved vask brønde med destilleret vand.
  • Lufttørre plader ved stuetemperatur i 2 timer eller natten over indtil det er helt tørt. Fjernelse af den plast bakke under pladerne vil lette tørring. Opbevar plader i en forseglet plasticpose i mørke, indtil det er analyseret.
  • Optælle steder manuelt ved inspektion under et dissekere mikroskop eller bruge en ELISPOT Pladelæser. Se repræsentative resultatet i figur 2.
  • 5. bestemmelse af individuelle peptider i OLP_pool, som stimulerer til Qa-1 begrænset IFN-γ sekretion i en OLP_pool-specifikke CD8+ T-cellelinje

    1. Bestemme de enkelte peptider, der stimulerer OLP_pool-specifikke, Qa-1-restrictred IFN-γ sekretion i en OLP_pool-specifikke CD8+ T-cellelinje ved hjælp af den ovenfor beskrevne IFN-γ ELISPOT assay (endelig koncentration på hver enkelte peptid bruges for ELISOPT er assay 10 μg/mL). Se repræsentative resultater i figur 3.
      Bemærk: En OLP-specifik, Qa-1-restircted svar er defineret som en reaktion, der er mindst tre gange af svar i overværelse af C1R. QA-1b -celler, men uden OLP. I MOG OLP undersøgelse, OLP68, OLP96 og OLP105 opfyldt alle dette kriterium. Derfor, alle tre OLPs potentielt indeholde Qa-1 epitoper12 (figur 3). OLP105 gav imidlertid konsekvent den stærkeste svar; Vi har dermed udført en detaljeret analyse af OLP105 (figur 4 og figur 5)12.

    6. identifikation af det optimale Qa-1 epitop i en 15-mer OLP, som stimulerer de epitop-specifikke, Qa-1-begrænset svar i en OLP_pool-specifikke CD8+ T-cellelinje

    1. Syntetisere C - og N-terminalt afkortet peptider af en 15-mer OLP som vist i figur 4.
    2. Undersøge IFN-γ sekretion i en OLP-specifikke CD8+ T-cellelinje ved at stimulere CD8+ T celler med hver af de trunkerede peptider samt ægteskabssager 15-mer OLP C1R eller C1R. QA-1b -celler ved hjælp af den ovenfor beskrevne IFN-γ ELISPOT assay. Den endelige koncentration af hver individuel peptid anvendes til ELISPOT analysen er 10 μg/mL. Et peptid er defineret som den optimale Qa-1 epitop hvis peptid: 1) konsekvent giver lignende eller stærkere IFN-γ svar, i forhold til de oprindelige 15-mer peptid, i overværelse af C1R. QA-1b celler; 2) er mellem 8 - 10-mer (9-mer peptid foretrak) som er peptid længder bundet til MHC-jeg molekyler15,17. Se Repræsentant resultaterne i figur 5.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Design af en OLP biblioteket der dækker hele længden af et protein

    Begynder på N-terminus af et protein, er hver peptid 15 aminosyrer (15-mer). Dermed, det første peptid spænder fra position 1 til positionen 15. N-terminus af den anden peptid overlapper med C-terminus af den første peptid af 11 aminosyre. Derfor, den anden peptid spænder position 5 position 19. Design resten af peptider til slutningen af C-terminus protein (figur 1). Vi valgte biblioteket 15-mer, fordi vi og andre har vist, at 15-mer peptider, når de lægges ind dendritiske celler (DCs) eller makrofager, kan være effektivt forarbejdes til epitoper for anerkendelse af CD8+ T celler14,15. Antallet af OLPs i et bibliotek, afhænger af længden af et protein. Derudover kan den sidste OLP spænder fra 12 til 15-mer afhængigt af længden af proteinet. For eksempel, har myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) en længde på 247 aminosyrer. MOG OLP bibliotek indeholder 59 OLPs12. Repræsentative resultater præsenteres i dette håndskrift er fra analysen af MOG OLP bibliotek.

    Bestemmelse af OLP_pool-specifikke, Qa-1-begrænset svar i en OLP_pool-stimuleret CD8+ T-cellelinje

    Vi genereret en CD8+ T-cellelinje, der var fyldt af Kb-/-Db-/- DCs pulserende med MOG OLP_pool (MOG_pool) og restimuleret af MOG_pool-pulserende Kb-/-Db-/- peritoneal makrofager som beskrevet i den ovennævnte protokol (protokol 1, 2 og 3). At bestemme potentielle MOG_pool-specifikke, Qa-1-begrænset svar i denne CD8+ T-cellelinje, vi undersøgte svar af denne CD8+ T-cellelinje til MOG_pool enten C1R eller C1R. QA-1b -celler ved hjælp af IFN-γ ELISPOT assay (figur 2) (protokol trin 4). Vores data viste, at den MOG_pool-stimulerede CD8+ T-cellelinje udskilles et lavt niveau af IFN-γ i overværelse af C1R. QA-1b -celler (32 stedet danner celler eller SFCs) men ikke C1R celler (2 SFCs), tyder på tilstedeværelsen af CD8+ T celler, som reagerede på Qa-1-bindende epitoper stammer fra C1R celler (C1R celler er menneskelige B lymphoblastoid celler). SFCs blev øget, da MOG_pool blev tilføjet i brønden, der indeholdt C1R celler (78 SFCs), hvilket tyder på tilstedeværelsen af CD8+ T celler, som reagerede på ikke-Qa-1 epitoper. SFCs var vokset dramatisk, da MOG_pool blev tilføjet i brønden, der indeholdt C1R. QA-1b -celler (320 SFCs), hvilket tyder på tilstedeværelsen af CD8+ T celler, som reagerede på Qa-1-bindende peptider. Dataene viser også, at MOG_pool indeholder Qa-1-bindende epitope(s).

    Bestemmelse af individuelle peptider i OLP_pool, som bidrager til Qa-1-begrænset IFN-γ sekretion i en OLP_pool-reaktiv CD8+ T-cellelinje

    Til at bestemme peptider i den OLP_pool, som stimuleres Qa-1-begrænset IFN-γ sekretion i en MOG_pool-reaktiv CD8+ T-cellelinje, vi stimuleret MOG_pool-reaktiv CD8+ T celler med individuelle 59 OLPs i nærværelse af enten C1R eller C1R. QA-1b -celler (figur 3) (protokol trin 5). Vores data viste, at par SFCs blev observeret i brøndene, der indeholdt C1R celler og OLPs. Derimod steg SFCs i alle brønde, der indeholdt C1R. QA-1b -celler og OLPs. Fra figur 2, vi lærte at CD8+ T-celler i overværelse af C1R. QA-1b alene også dannet SFCs. De øgede SFCs i de fleste brønde kan derfor på grund af ikke-specifik stimulation af præsentationen af Qa-1 epitoper, der er afledt af intracellulære proteiner i C1R celler af Qa-1 molekyler. Men OLPs i de 3 indrammede brønde i figur 3 c (B8, D12, og E9), som matchede 3 fremhævet OLPs i figur 3A (OLP68, OLP96 og OLP105), opfyldte kriterium for at definere en OLP-specifikke, Qa-1-begrænset IFN-γ svar som beskrevet i protokollen trin 5.112. Data tyder på, at de 3 OLPs indeholder Qa-1 epitope(s). Da OLP105 konsekvent produceret den højeste respons, udførte vi detaljeret analyse af OLP10512.

    Design af en afkortet peptid bibliotek til en 15-mer OLP

    En 15-mer OLP, som har været fast besluttet på at stimulere Qa-1-begrænset IFN-γ sekretionen i OLP_pool-reaktiv CD8+ T-cellelinje, skal analyseres for den optimale epitop bruger en afkortet peptid bibliotek. Sådanne afkortede peptid bibliotek er designet af gradvis beskærer 15-mer OLP af 1 aminosyre på sin N - og C-termini (figur 4). Ligner andre MHC klasse I molekyler, Qa-1 molekyler binde hovedsagelig til 8 - 10-mer peptider. Vi anbefaler derfor, at den korteste afkortet peptid er 6-mer i længden.

    Identifikation af den optimale Qa-1 epitop i en 15-mer OLP, som stimulerer Qa-1-begrænset IFN-γ sekretion i en OLP_pool-reaktiv CD8+ T-cellelinje

    De ovenfor N - og C-terminalt afkortet peptider er testet for styrke i stimulerende IFN-γ sekretion i en CD8+ T cellelinie specifikke for OLP_pool eller den 15-mer OLP ved hjælp af IFN-γ ELISPOT beskrevet ovenfor. I studiet af Qa-1 epitoper i MOG12vi genereret en CD8+ T cellelinje, som var specifikke for MOG OLP105 (figur 5A). Yderligere analyse viste, at de N-terminalt afkortet 9-mer peptid mødtes de to kriterier for en optimal epitop som beskrevet taktfast protokol 6.2 (figur 5B). Vi konkluderede derfor, at N-terminalt afkortet 9-mer peptid blev den optimale Qa-1 epitop.

    Figure 1
    Figur 1: Design af en OLP biblioteket der dækker hele længden af en protein. Begynder på N-terminus, blev peptider af 15 aminosyre (15-mer) længde identificeret.N-terminus af hver peptid, undtagen den første peptid, overlappes med C-terminus af den tidligere peptid af 11 aminosyrer.

    Figure 2
    Figur 2: MOG_pool-stimuleret CD8+ T celler blev delvist MOG_pool specifikke og Qa-1-begrænset12. In vitro CD8+ T celler stimuleret af MOG OLP_pool (MOG_pool) blev undersøgt for svar til MOG_pool enten C1R eller C1R. QA-1b -celler som antigen præsentere celler ved hjælp af en IFN-γ ELISPOT assay. Repræsentant ELISPOT billeder er vist. Antallet af spot-dannende celler (SFCs) er vist på den øverste venstre hjørner af hver brønd. CD8+ T celler: 50.000 celler/brønd. C1r eller C1R. QA-1b -celler: 200.000 celler/brønd.

    Figure 3
    Figur 3: analyse af OLPs i MOG_pool, som var ansvarlige for Qa-1 begrænset svar. (A) Layout af V-bund 96-brønd plade, der indeholdt 10 mg/mL individuelle MOG OLPs. Numre i brøndene repræsenteret OLP id'er. Fremhævet 3 brøndene indeholdt de OLPs, der opfyldte kriterium for en OLP-specifikke, Qa-1-begrænset IFN-γ reaktion som beskrevet i protokollen trin 5.112. (B) repræsentant SFCs i hver brønd, der indeholdt en OLP (slutkoncentration = 4,2 μg/mL, OLP ID matches, i "A"), MOG_pool-reaktiv CD8+ T celler (50.000 celler/brønd) og C1R celler (200.000 celler/brønd). (C) repræsentant SFCs i hver brønd, der indeholdt en OLP (slutkoncentration = 4,2 μg/mL, OLP ID matches, i "A"), MOG_pool-reaktiv CD8+ T celler (50.000 celler/brønd) og C1R. QA-1b -celler (200.000 celler/brønd). 3 indrammet brøndene indeholdt de OLPs, der opfyldte kriterium for en OLP-specifikke, Qa-1-begrænset IFN-γ svar12. Tallet er blevet tilpasset fra reference12Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4: Design af trunkerede peptider af en 15-mer peptid. En 15-mer peptid blev gradvis afkortet på sin N - og C-termini af 1 aminosyre til 6-mer. 15-mer og dens afkortet peptider blev derefter syntetiseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5: analyse af det optimale Qa-1 epitop i OLP105. A en OLP105-stimuleret CD8+ T-cellelinje blev undersøgt for svar til OLP68, OLP96 og OLP105 C1R eller C1R. QA-1b -celler ved hjælp af en IFN-γ ELISPOT assay. Repræsentant IFN-γ SFCs (numre på den øverste venstre hjørner) er vist. (B) OLP105-specifikke CD8+ T-cellelinje, som vist i (A), blev undersøgt for svar på de enkelte N - og C-terminalt afkortet peptider, som vist i figur 4, i overværelse af C1R. QA-1b -celler ved hjælp af IFN-γ ELISPOT assay. OLP105: en 15-mer OLP. N6-14: N-terminalt afkortet OLP105 peptider. C6-14: C-terminalt afkortet OLP105 peptider. CD8+ T celler: 50.000 celler/brønd. C1R. QA-1b -celler: 200.000 celler/brønd. Numre på øverste venstre hjørner blev SFCs pr. 50.000 CD8+ T-celler. Røde rektangel markeret i brønden, der opfyldte kriterierne for at definere den optimale Qa-1 epitop i en OLP, som beskrevet i protokollen trin 6.2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her har vi beskrevet en protokol til at analysere Qa-1 epitoper i et protein. I forbindelse med denne protokol rapporteret flere andre strategier også tidligere. Første, allogene CD8+ T cellelinjer og kloner blev anvendt til identifikation af Qdm1. For det andet blev en formodede Qa-1-bindende motiv fra analysen af Qdm brugt til identifikation af HSP60p216-224 og en TCRBV8.1 epitop9,18. Tredje, individuelle overlappende peptider fra et protein, der blev brugt til at vaccinere dyr. Efterfølgende CD8+ T celler isoleret fra de immuniseret dyr blev brugt til at identificere den TCRBV8.2 peptid p42-50, som blev senere bekræftet for binding til Qa-16,10,19. Fjerde, funktionelle CD8+ T-celle linier i kombination med cDNA display bibliotek blev anvendt til identifikation af FL9 Qa-1 epitop4.

    Forhold til de tidligere teknikker, anvendelse af allogene CD8+ T-celle linier og kloner kan ikke være egnet til at analysere Qa-1 epitoper, der er præsenteret under fysiologiske immunrespons. Derudover tyder akkumulere data på, at den tidligere beskrevne bindende motiv kun delvist kan repræsentere peptid-bindende kapacitet af Qa-1 molekyler. Derfor er den nøjagtige Qa-1-bindende motiv stadig ikke kendt4. Derudover er immunisering med individuelle peptid til identifikation af Qa-1 epitoper besværlige. Endelig, cDNA display bibliotek strategi indebærer opførelsen af mange vektorer, der bærer forskellige peptid længder til celle Transfektion. Derimod OLP bibliotek strategi beskrevet her er enkel, og de tilknyttede peptider er kendt for at stimulere Qa-1-begrænset CD8+ T celler. Vores strategi har derfor en unik fordel.

    Den strategi, der er beskrevet her bruger OLP_pool-specifikke CD8+ T celler, som er genereret af in vitro- priming og restimulering. Alternativ kilde til CD8+ T celler kan være fra dræning lymfeknuder på et kb-/-Db-/- mus, der er immuniseret med kilde protein20. Sådanne immun CD8+ T cellerne kan derefter undersøges for IFN-γ svar på OLPs og afkortet peptider til identifikation af Qa-1 epitoper. Teoretisk set, i vivo immun CD8+ T celler er tættere på de fysiologiske tilstand end in vitro- genereret CD8+ T celler. Dog fandt vi, at svaret fra immun CD8+ T celler direkte renset fra immuniserede mus var svage og ofte kræves in vitro- restimulations for en tilfredsstillende peptid screening resultat. Derudover er denne protokol udviklet til fremtidige oversættelse til menneskelige undersøgelse af HLA-E epitoper hvori i vivo immunisering ikke er praktisk.

    Teknisk set er den kritiske del af denne protokol er generation af CD8+ T-celle linier der er specifikke for OLP_pool eller en individuel OLP. Da Qa-1/peptid komplekser er ustabil i forhold til klassisk MHC-jeg/peptid komplekser21, efter antigen præsentere celler er pulserende med OLPs eller et peptid, bør de pulserende celler ikke vaskes grundigt. Vi har fundet at peptid-pulserende celler, hvis vaskes grundigt, mister eller reducere evnen til at stimulere CD8+ T celler. Vi anbefaler derfor, vask peptid-pulserende antigen præsentere celler engang umiddelbart før de er co kulturperler med CD8+ T celler.

    Også, på grund af ustabilitet af Qa-1/peptid komplekser, anbefaler vi brug af en serumfrit medium for peptid pulserende og stimulation af CD8+ T celler. Derudover vi rutinemæssigt tilføje 50 U/mL af IL-7 under CD8+ T celle kultur samt under IFN-γ-ELISPOT assay. IL-7 formål er at bevare levedygtighed og funktion af CD8+ T celler. IL-7 i sig selv ikke stimulere CD8+ T-celler til at producere IFN-γ.

    Svarende til alle strategier, Qa-1 epitoper kortlagt af denne strategi også kræver yderligere undersøgelse for biologiske betydning. For eksempel, er et vigtigt spørgsmål, om den tilknyttede epitop kan præsenteres fysiologisk. For at løse dette spørgsmål, kan DCs være transduced med en lentiviral vektor, der udtrykker epitop kilde protein (f.eks. MOG i MOG OLP undersøgelse). Senere, reaktion af epitop-specifikke CD8+ T celler til at transduced DCs er undersøgt. Et positivt svar antyder at epitop kan være fysiologisk behandles og præsenteret af DCs. Derudover har funktionelle konsekvenser som følge af epitop anerkendelse af CD8+ T celler undersøges yderligere. I denne henseende har analyser af Qdm og FL9 Qa-1 epitoper ført til den konklusion, at Qa-1 molekyler er vigtigt for immunforsvaret overvågning1,4. Desuden, undersøgelser af HSP60p216, TCRBV8.1 peptid, og p42-50 har ført til konklusionen, at Qa-1-begrænset CD8+ T celler regulere immunrespons gennem målretning patogene CD4+ T celler 6,7 ,9,19. Desuden undersøgelse af MOG196 har for første gang afsløret som Qa-1-begrænset CD8+ T celler kunne regulere immunrespons ved rettet direkte mod en væv for at forhindre beskadigelse af potentielt patogene autoimmune celler12 . Endelig, funktionel analyse af en epitop-specifikke, Qa-1-begrænset CD8+ T-celle kan bistås af tetramer. Sådanne tetramer kan fremstilles i NIH tetramer core facilitet (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) eller en virksomhed. For at anmode om generation af en tetramer, kan man sende den funktionelle data, der understøtter sammenkædning af den nyligt tilknyttede optimal Qa-1 epitop til Qa-1 protein for deres godkendelse for generation af en Qa-1 tetramer.

    Afslutningsvis, tidligere undersøgelser har vist, at Qa-1-begrænset CD8+ T celler spiller en vigtig rolle i reguleringen af lokale immunrespons12. I denne henseende kan væv skader være forårsaget af en immunrespons, der er direkte målrettet væv. Derudover kan sikkerhedsstillelse skader være forårsaget af en immunrespons, der er rettet mod en invaderende patogen. Derfor forståelse af Qa-1-begrænset CD8 rolle+ T celler i disse to forskellige væv skader er vigtig for deres kliniske applikationer.For at nå dette mål, er en grundig analyse af Qa-1 epitoper i et self-væv eller en invaderende patogen nødvendige. Denne protokol vil være egnet til disse analyser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

    Acknowledgements

    Vi takker Penelope Garcia for hendes teknisk bistand og forberedelse af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en forskning Innovation Grant (RIG) fra Institut for medicin på Loma Linda University (681205-2967) og en pilot tilskud fra National dissemineret sklerose samfundet (PP1685) til XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79, (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188, (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207, (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13, (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5, (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177, (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123, (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113, (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178, (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72, (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8, (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350, (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360, (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3, (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182, (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172, (3), 1661-1669 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics