Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

Neuroscience

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Summary

A avaliação precisa da resposta de dor em um modelo animal neuropática é crítica para investigar a fisiopatologia das doenças dor e desenvolver novos analgésicos. Apresentamos um método sensível e objetivo para determinar a função sensorial do roedor hind pata por um sistema de análise de marcha automática.

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Kang, D. W., Choi, J. G., Moon, J. Y., Kang, S. Y., Ryu, Y., Park, J. B., Kim, H. W. Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury. J. Vis. Exp. (128), e56402, doi:10.3791/56402 (2017).

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Abstract

O teste de von Frey é um método clássico que tem sido amplamente utilizado para examinar a função sensorial dos animais de dor neuropática. No entanto, tem algumas desvantagens, tais como dados subjetivos e a exigência de um experimentador hábil, experiente. Até à data, uma variedade de modificações melhoraram o método de von Frey, mas ainda tem algumas limitações. Relatórios recentes têm sugerido que a análise da marcha produz dados mais precisos e objectivos dos animais neuropáticas. Este protocolo demonstra como realizar a análise de marcha automática para determinar o grau de dor neuropática em ratos. Após vários dias de aclimatação, os ratos foram autorizados a andar livremente sobre o piso de vidro para iluminar as pegadas. Em seguida, quantificação das pegadas e da marcha foram realizadas através de clips de vídeo com análise automática de vários parâmetros ambulante, como área de pata tempo impressão, balanço, ângulo da pata, etc.

O principal objetivo deste estudo é descrever a metodologia de análise de marcha automática e brevemente compará-lo com os dados do teste sensorial clássico usando filamentos de von Frey.

Introduction

As alterações patológicas do sistema nervoso induzidos por trauma, disfunção metabólica, inflamação, infecção, isquemia, ou doença auto-imune, ocasionalmente, resultar em dor neuropática, que é definida como uma dor que surjam como consequência directa de uma lesão ou doença afetando o sistema somatossensorial1. A dor neuropática é geralmente insuportável e infelizmente, analgésicos convencionais geralmente não produzem suficiente alívio de dor2. Das principais características da dor neuropática contém espontâneas e evocado por estimulação dores (i.e., alodinia e hiperalgesia). Alodinia é uma resposta nociceptiva que ocorre a estímulos normalmente não-dolorosos, tais como o leve toque ou estimulação quente. Hiperalgesia indica uma resposta melhorada dor aos estímulos mecânicos ou térmicos nocivos3. Embora estes dois sintomas criticamente prejudicam qualidade de vida o paciente é, mecânica alodinia evocada pela estimulação tátil suave é o sintoma mais agravante porque contato macio é difícil evitar na vida cotidiana.

Para investigar o mecanismo subjacente e novos analgésicos para o tratamento da dor neuropática, a medição precisa da resposta dor é essencial. Desenvolveram-se numerosos modelos animais de dor neuropática nociceptivos respostas o Hind pata área por causa de sua alta acessibilidade4,5,6,7. Assim, a maioria das avaliações de resposta de dor foram realizadas na superfície dorsal ou plantar da pata traseira através da aplicação de estímulos mecânicos, utilizando instrumentos especiais, como filamentos de von Frey. Dentre o método mais frequentemente utilizado é a acima e para baixo método descrito por Dixon8 e mais tarde modificado versões9,10. No entanto, muito capacitados, experientes experimentadores são necessários para executar o teste de von Frey e os resultados podem ser subjetivos.

O sistema de análise de marcha automatizado pode investigar distúrbios neuromusculares e neurológicos medindo-se vários parâmetros de andar em roedores movimentando-se livremente. Em uma variedade de modelos animais de lesão de nervo, o grau de nocicepção e o efeito antinociceptiva de vários tratamentos que podem ser avaliadas sem adicionar uma dor estimulação11,12,13, 14. este sistema de análise pode detectar parâmetros de marcha estático e dinâmico, tais como: pata a área de impressão (a área da pata completa impressão que entra em contato com o chão), pata de intensidade (a intensidade média da área de contato pata), comprimento (do passo postura de distância entre sucessivas colocações da mesma pata), fase (a duração do contato do solo de uma única pata traseira), a sequência de etapas (a ordem na qual as quatro patas são colocados no chão), balanço (a duração da fase de balanço) e velocidade (calculada do balanço do comprimento do passo e duração do balanço e expressa em pixels por segundo). Este documento demonstra o uso de um sistema de análise e fornece uma breve comparação dos dados com o teste de von Frey usando ratos neuropática de constrição crônica lesão (CCI).

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Protocol

todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes éticas da Associação Internacional para o estudo da dor e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado de Animal institucional com a Universidade Nacional de Chungnam ( Daejeon, Coreia do Sul).

1. indução da ICC no nervo ciático

  1. casa ICR camundongos machos pesando 20-25 g sob um ciclo claro/escuro de 12 h à temperatura ambiente controlada (mantida a 20-25 ° C) e humidade (40-60%), com livre acesso à comida e água. Permitir um período de aclimatação para os ratos na sala de cuidados com animais de pelo menos 1 semana antes da cirurgia.
    1. Durante a habitação, observar a aparência e o comportamento dos ratos e não usar ratos mostrando atividade anormal do aparelho locomotor.
      Nota: Um dia antes da cirurgia da ICC, medir a sensibilidade mecânica da pata traseira aplicando filamentos de von Frey e realizar a análise de marcha automática para obter valores basais normais. Em seguida, atribuir ratos aleatoriamente para controle e grupos experimentais.
  2. No dia da cirurgia, anestesia ratos injetando 2, 2,2-tribromoetanol (250 mg/kg, intraperitoneal (IP)).
    Nota: Usar equipamentos de proteção individual como máscara, luvas e avental cirúrgico.
    1. Pesar 2,5 g de 2, 2,2-tribromoetanol e adicionar 2-metil-2-buthanol para o volume final de 5 mL. Manter a solução longe da luz (por exemplo, usar um recipiente escuro ou embrulhe em papel alumínio).
    2. Reagentes de permitir dissolver-se completamente por aquecimento a 40 ° C e mexendo por 10-30 min.
    3. Adicionar água destilada para o volume final de 200 mL e mexa até ficar bem misturado.
    4. Armazenar alíquotas a 4 ° C e manter no escuro. Depois de duas semanas, a anestesia deve ser substituída com novas alíquotas.
    5. Injetar um volume de 20 µ l por 1 g de massa corporal. Por exemplo, se o peso do corpo do mouse é 25g, dar 500 µ l de solução. A duração típica desta anestesia é 1 h.
      Nota: Esta solução irá tornar-se tóxico quando exposta à luz e/ou calor, portanto, tenha cuidado para evitar a exposição à luz e ao calor. Uma rota de injeção do IP é altamente recomendada.
  3. Quando o mouse se encaixa anestesia profunda, coloque-o na mesa de operação com o lado dorsal para cima (ou seja, posição prona) e esterilizar a área externa do meio da coxa do lado direito com um algodão embebido em álcool 70%.
    Nota: Confirmar anestesia profunda, verificando a falta de resposta para beliscar ou pressão estímulo sobre as patas traseiras ou cauda.
  4. Induzir o CCI no nervo ciático direito do mouse.
    1. Fazer uma incisão na pele ao redor da área do meio da coxa de 1,0-1,5 cm de comprimento, com uma lâmina de bisturi.
    2. Sem rodeios a dissecar os músculos da coxa com a pinça hemostática micro-mosquito para expor o nervo ciático.
    3. Ligate nervo ciático exposto 3 vezes com intervalos de 1,0-1,5 mm, usando uma sutura de catgut crómico 4-0.
      Nota: Fazer ligadura solta amarrando fora do nervo ciático até agitação suave aparece sobre a pata traseira ipsilateral. O grupo farsa de ratos recebeu a mesma abertura cirúrgica em condições similares, exceto sem ligadura de nervo.
  5. Fechar a abertura cirúrgica com 3-4 suturas interrompidas simples, usando seda 5-0 e esterilizar com iodopovidona para desinfecção da área externa da cirurgia.
  6. Após a cirurgia, posicione o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento. Quando os animais são recuperados da anestesia, devolvê-los para sua gaiola casa.
    Nota: Neste estudo, os antibióticos não foram usados. A gabapentina IP grupo recebida CCI + libras Esterlinas (GBP) na dose de 50 mg/kg uma vez ao dia como um controle positivo.

2. Medição de alodinia mecânica (teste de von Frey)

Nota: avaliar a frequência da resposta aos estímulos mecânicos retirada usando 1 g de filamentos de von Frey à superfície plantar da pata traseira ipsilateral.

  1. Em cada dia de teste, trazer os ratos para a sala de teste comportamental e aclimatar os ratos em sua própria gaiola em casa pelo menos 30 min antes do teste
    Nota: Usar equipamentos de proteção individual como máscara, luvas e avental cirúrgico.
  2. Coloque o mouse em uma caixa de acrílico transparente no chão do engranzamento do metal e aclimatar o mouse de 30 min.
  3. Aplicar suavemente 1G de filamentos de von Frey à superfície plantar da pata traseira, até que o filamento se curva.
  4. Aplicar estimulação de filamento para o hind ipsilateral pata 10 vezes com intervalos de pelo menos 10 s e registrar o resultado.
    Nota: Neste estudo, o número de respostas de retirada de pata de 10 ensaios é mostrado como porcentagem da frequência de retirada de pata (PWF, %). O teste de von Frey foi realizado a cada dois dias após a cirurgia da ICC.

3. Realizar análise de marcha automática

Nota: O sistema de análise de marcha visualiza cada impressão da pata, enquanto o animal está andando e analisa automaticamente vários parâmetros de marcha, tais como impressão, de pata pata, intensidade, comprimento do passo, postura fase, sequência de etapas, balanço, balanço velocidade, etc. neste estudo, mostramos que a área de impressão de pata e única postura depois de converter os dados para a porcentagem mudam entre contralateral à esquerda contra a pata direita traseira ipsilateral. Assim, um resultado de 50% indica que o tamanho de impressão da pata e a duração da área de pata em contacto com o chão, entre os lados esquerdo e direito são mesmos. Além disso, valores de dados mais baixos, quase 0% indicam que o tamanho e a duração do contato são diminuídos na pata traseira ipsilateral em comparação com o lado contralateral (ver painel B da Figura 2 e Figura 3).

  1. Para aclimatação, manter os ratos dentro do dispositivo de análise de marcha durante 10 minutos uma vez por dia começando 5 dias antes da cirurgia de ICC.
    Nota: O teste de análise da marcha, incluindo a aclimatação deve ser realizada no escuro.
  2. Trazer os ratos para a sala de teste para análise de marcha e acclimate em sua gaiola em casa pelo menos 30 min antes do teste
    1. No guia de instalação do menu do programa, defina o " comprimento de passagem " a 30 cm e conjunto o " máximo executar duração " a 5 s e o " máximo executar variação " a 50%.
    2. Selecione uma câmera registrada partir o ' configuração ' guia do ' programa ' menu.
    3. Selecionar " abrir aquisição " do ' adquirir ' guia do ' programa ' menu.
    4. Após a mensagem de status, clique o ' encaixe fundo ' o botão para tirar uma foto de plano de fundo da passarela vazio (ou seja, em branco).
  3. Clique o ' iniciar aquisição ' botão e coloque um rato no corredor; a gravação inicia-se automaticamente de acordo com o movimento do mouse.
    Nota: Quando o mouse entra claramente do outro lado da passarela, o programa automaticamente classifica os este movimento como " complacente executar " com um ícone verde. Se o software não conseguiu detectar a impressão de pé, o experimentador verá um ícone vermelho e deve repetir a gravação. Pelo menos cinco execuções compatíveis com sucesso são necessárias para a análise.
  4. Após o teste, selecione ' classificar corre ' na guia de adquirir o ' programa ' menu.
  5. Selecione as pistas para a análise e clique no ' auto classificar ' botão.
    Nota: Após a classificação, todos os parâmetros de estatística são salvas automaticamente e o experimentador pode encontrar os resultados clicando " vista executar estatísticas " no menu analyze.

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Representative Results

Nós temos realizado o teste de von Frey e automatizado de análise de marcha em camundongos CCI até 10 dias após a cirurgia da ICC. Para análise estatística, medidas repetidas de duas vias de análise de variância (ANOVA) determina os efeitos globais e análise post-hoc de Dunnett foi realizada para determinar o valor de p entre os grupos experimentais.

Os resultados mostrados na Figura 1 indicam o curso do tempo dos dados de teste de von Frey clássica. O PWF (%) de ratos ICC foi aumentados 2 dias após a cirurgia da ICC e mantido por 10 dias em comparação com o grupo Sham. No grupo de controle positivo de ICC, libras Esterlinas (50 mg/kg, IP, uma vez ao dia por 10 dias começa 1 dia após a cirurgia) significativamente aliviados PWF ICC avançada. No grupo Sham de painel A, PFW (%) foi 8,00 ± 5,83 na Commit pré-cirurgia (Pre), 6.00 ± 2,45 no dia 2, 4,00 ± 2,45 no dia 4, ± 2,00 2,00 no dia 6, 4,00 22.45 no dia 8 e 6,00 ± 2,45 no dia 10. No grupo de ICC, PWF (%) foi de 2,86 ± 1.84 no Pre, 61.43 ± 5,95 no dia 2, 68.57 ± 4,59 no dia 4, 72.86 ± 5.22 no dia 6, 75.71 6.49 no dia 8 e 75.71 ± 3,69 no dia 10. No grupo de ICC + GBP, PFW (%) era 2,50 ± 1,43 na pré, 57.50 ± 5.22 no dia 2, ± 50.00 4,04 no dia 4, 45.00 ± 4.81 no dia 6, 46.25 5.65 no dia 8 e 47.50 ± 4,88 no dia 10. No painel B, a área sob a curva (AUC) foi ± 23,00 6,00 na farsa, 317.86 ± 17,04 no ICC e 223.75 ± 17.05 no grupo ICC + libras Esterlinas.

Os resultados mostrados na Figura 2 indicam uma mudança de curso do tempo da área de impressão da pata após a cirurgia da ICC. Dados são mostrados como a variação percentual da área de impressão pata entre as patas traseiras direita e esquerdas. Se a área de impressão da pata é o mesmo para os lados esquerdo e direito em uma condição normal, os dados serão de 50%. CCI significativamente reduzido a área de impressão da pata da pata traseiras ipsilateral 2 dias após a cirurgia e foi mantido por 10 dias. GBP notavelmente recuperado a área de impressão da pata reduzida. No grupo Sham de painel B, a área de impressão de pata (%) foi 50.13 ± 2,13 no Pre, 50,30 ± 1,45 no dia 2, ± 53,24 0.80 no dia 4, 50,30 ± 1,68 no dia 6, 52.08 ± 1,79 no dia 8 e 49.66 ± 2,24 no dia 10. No grupo de ICC, área de impressão de pata (%) foi de 50.71 ± 3.17 no Pre, 0 ± 0, no dia 2, 0 ± 0 no dia 4, 8,86 ± 3.27 no dia 6, 6,6 ± 3,20 no dia 8 e 10,30 ± 5,60 no dia 10. No grupo de ICC + libras Esterlinas, a área de impressão de pata (%) foi 55.59 ± 2,01 no Pre, 4.65±4.17 no dia 2, 15.18±5.57 no dia 4, 20.20 ± 4,00 no dia 6, 26,01 ± ± 5,53 no dia 8 e 28.40 6.04 no dia 10.

Os resultados mostrados na Figura 3 indicam a mudança de curso do tempo de uma única postura após a cirurgia da ICC. Os dados foram calculados e mostrados como a variação percentual (semelhante aos dados da área de impressão de pata). CCI reduzido a única postura do lado ipsilateral e GBP significativamente foi recuperada. No grupo Sham de painel B, a única postura (%) foi de 49.31 ± 2.15 na pré, 50.71 ± 0,67 no dia 2, 50.76 ± 0,44 no dia 4, 50,60 ± 1,11 no dia 6, 51.50 ± 0,96 no dia 8 e 49,00 ± 2,35 no dia 10. No grupo de ICC, a única postura (%) foi de 50.36 ± 3.17 no Pre, 0 ± 0, no dia 2, 0 ± 0 no dia 4, 11,5 ± 3,25 no dia 6, 13.61 ± ± 5,04 no dia 8 e 12,94 6,40 no dia 10. No grupo de ICC + libras Esterlinas, a única postura (%) foi 52.35 ± 0,91 no Pre, 5,44 ± 4,87 no dia 2, ± 18.66 4.33 no dia 4, 25.48 ± 4,10 no dia 6, 30.26 2.17 no dia 8 e 32.24 ± 4,95 no dia 10.

Figure 1
Figura 1: alodinia mecânica avaliada pelo teste de von Frey em camundongos ICC. Frequência (A), a retirada da pata (PWF, %) no von Frey teste foi aumentados 2 dias após a cirurgia da ICC e mantido por 10 dias em comparação com o grupo Sham. Gabapentina (GBP, 50 mg/kg, IP) reverteu significativamente a alodinia mecânica induzida por ICC. (B) dados acumulados de PFW são mostrados como área sob a curva. * * p < 0,01 e * * * p < 0.001 contra grupo de ICC. Barras de erro indicam média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Paw área de impressão por análise de marcha automatizados em camundongos ICC. (A) capturou imagens de patas traseiras dos grupos de Sham, CCI e CCI + libras Esterlinas (gabapentina, 50 mg/kg, IP) pelo software de análise. Retângulos brancos são indicadores de pata traseira detectado pelo sistema de análise. Observe o menor tamanho da pata do CCI e essa redução foi parcialmente recuperada pelo tratamento de libras Esterlinas. (B) tempo de curso da área de impressão de pata (%). Os dados são calculados como a variação percentual da área de impressão entre a pata esquerda e direita traseira (por exemplo, 50% indica as mesmas áreas de impressão pata em lados esquerdo e direito). * p < 0,05 e * * p < 0,01 contra grupo de ICC. Barras de erro indicam média ± SD

Figure 3
Figura 3: posição única análise automatizada da marcha em camundongos ICC. (A) capturado e convertidas imagens de única postura destacados por cores diferentes para cada pata. Observe que o traço-de-rosa para a pata posterior ipsilateral é encurtado no grupo ICC e gabapentina (GBP, 50 mg/kg, IP) significativamente foi recuperada da mesma forma para o nível de Sham. (B) tempo curso de postura única (%). Dados são resumidos como um gráfico de linha após o cálculo percentual mudança de postura única entre a pata esquerda e direita traseira (por exemplo, 50% indica a mesma postura única em lados esquerdo e direito). * p < 0.05, * * p < 0,01 e * * * p < 0.001 contra grupo de ICC. Barras de erro indicam média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Atualmente, a medição de alodinia mecânica por meio de filamentos de von Frey é o mais amplamente utilizado método em modelos animais de dor para demonstrar a hipersensibilidade tátil. Como modelos animais de dor neuropática continuaram a ser desenvolvidos, a metodologia de avaliação de função sensorial tem sido também melhorou8,9,10,15. Esses relatórios, tem sido sugerido que essas modificações podem fornecer um substituto mais preciso, rápido e fácil de usar para métodos mais antigos. No entanto, dados a partir desses métodos ainda podem ser limitados pela sua subjetividade e a exigência de habilidade ou experiência para executar o método. Além disso, os animais de restrição não pode ser evitada quando realizar o teste de von Frey, e portanto stresse contenção dos animais pode afetar os resultados de resposta de dor.

O sistema de análise de marcha automática mede automaticamente vários parâmetros do animal andando (e.g., área total de contato da pata para o chão, o ângulo da cópia da pata, tempo de postura, etc.), e, portanto, o experimentador pode usar dados mais objetivos para análise de12,13,14,16,17,18. Além disso, este método pode ser realizado sem qualquer estímulo; assim, é menos invasiva e dados a partir do roedor livremente movente podem ser obtidos. Conforme os resultados deste estudo, o pé imprime tamanho e postura tempo da pata traseira ipsilateral são reduzidos pela cirurgia da ICC e recuperado pelo tratamento de libras Esterlinas; resultados semelhantes também são encontrados no von teste de Frey. Consistente com as anteriores observações14, resultados de análise de marcha em modelos animais de dor neuropática tem um alto grau de correlação positiva com que o teste von Frey, indicando que os parâmetros alterados relacionados a ICC podem refletir o grau de de alodinia mecânica, um dos sintomas mais irritantes de dor neuropática.

Aqui, nós fornecemos um método sobre como operar o sistema de análise de marcha automatizados em detalhe e uma breve comparação dos dados com o clássico teste de von Frey em camundongos neuropáticas ICC. Em conclusão, a análise de marcha automática pode ser que a mais melhor ferramenta acessível para o estudo da dor neuropática por causa disso é fácil de usar, objetiva e sensível.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Chungnam University, Coreia Instituto Nacional de Medicina Oriental (KIOM) e uma subvenção da Coreia saúde tecnologia R & D o projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & Bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI15C0007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline JW Pharmaceutical N/A Vehicle for drugs
1ml syringe BD Plastipak 300013 Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity) Sigma T48402 Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity) Sigma 152463 Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system Noldus N/A Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness) AILEE C442 Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin Sigma Y0001280 Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps F.S.T 11051-10 Surgical instrument
Heating Pad DAESHIN ELECTRONICS M-303AT Regulation of body temperature
ICR Mouse Samtaco N/A Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness) ETHICON W598H Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito F.S.T 13010-12 Surgical instrument
Micro-scissors F.S.T 14090-09 Surgical instrument
Needle holder F.S.T 12002-12 Surgical instrument
Povidone Iodine Firson N/A Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade F.S.T 10010-00 (#10) Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle F.S.T 10003-12 (#3) Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments North Coast NC12775-99 Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation

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References

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