GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

Neuroscience
 

Summary

このプロトコルは、タグ付きの観測リアルタイム緑色蛍光タンパク質 (GFP) のブドウ糖の運送者 4 (GLUT4) タンパク質インスリン刺激とインスリン-GLUT4 の CCR5 の生物学的役割の評価時に人身売買の手法を記述します。デコンボリューション顕微鏡を用いたシグナル伝達。

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Changou, C. A., Ajoy, R., Chou, S. Y. Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy. J. Vis. Exp. (130), e56409, doi:10.3791/56409 (2017).

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Abstract

2 型糖尿病 (2 型糖尿病) インスリン シグナル伝達障害と末梢組織に慢性的な炎症によって特徴付けられる世界の健康危機であります。中枢神経系 (CNS) の視床下部は、エネルギーおよびインシュリン信号応答の規則のためのコントロール センターです。末梢組織の不均衡 (CCL5、tnf α、IL-6 など) 特定のケモカインの慢性的な炎症は、糖尿病や肥満に貢献します。しかし、ケモカインと視床下部のインスリン シグナル伝達制御まだ接続機能の機構は不明します。

一次ニューロン文化モデル体外は、インスリン シグナル調節視床下部ニューロンを調査する使用ことができます便利でシンプルなモデルです。本研究では、インスリン刺激による GLUT4 膜移行を追跡するためのプライマリの視床下部ニューロン、外因 GLUT4 タンパク質 GFP (GFP GLUT4) の共役を導入しました。GFP GLUT4 タンパク質輸送のコマ撮り画像デコンボリューション顕微鏡実験を行いながらニューロンを大幅に損なうことがなく高速、高解像度の画像を生成するユーザーが記録しました。インスリン調整される GLUT4 転座 CCR5 の貢献は分離され、CCR5 欠損マウスから培養 CCR5 欠損視床下部ニューロンで観察されました。我々 の結果は、インスリン刺激後、CCR5 欠損視床下部ニューロンの GLUT4 膜転流効率が減ったことを示した。

Introduction

2 型糖尿病 (2 型糖尿病) は、世界的な健康危機です。2 型糖尿病は、インスリン シグナル伝達障害と末梢組織に慢性的な炎症によって特徴付けられます。視床下部は、体のエネルギー代謝、食欲および概日リズムを調節するコントロール センターです。最も重要なは、視床下部も全身代謝1,2,3,4,5を調節するインスリン シグナル応答を仲介します。視床下部のインスリン シグナル経路は、インスリン抵抗性6,7を誘発する可能性を中断すること。視床下部は、細胞のエネルギー状態およびインスリンなどアディポカイン (例えばレプチン) 全身糖代謝、インスリン応答性と食品の摂取量を調節する、末梢組織からのホルモンの分泌を調整します。インスリン受容体のインスリン結合活性化インスリン受容体基質 (IRS) 蛋白質は、PI3K など、下流のシグナリング分子にインスリンをアクティブ化 (ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ)、GLUT4 を誘発する AKT (タンパク質キナーゼ B (PKB/AKT))膜の転流。ニューロンはインシュリン; への応答でのグルコース取り込みのための主要なターゲットではないです。ただし、GLUT4 の発現の重要なレベルは、視床下部の弓状核 (ARC) 地域で識別されています。したがって、視床下部ニューロンの GLUT4 の規制は脳末梢の軸におけるインスリン シグナルに重要な役割を果たす可能性があります。

多くの研究は、慢性炎症と炎症性ケモカイン視床下部にも糖尿病や肥満の開発に重要な役割を果たしてし、視床下部の炎症の抑制は食餌誘導性インスリン抵抗性を逆転できることを示唆しています。8,9,10します。 さらに、ケモカイン CCL5 (C C モチーフ配位子 5、別名 RANTES Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) と 2 型糖尿病11,12の開発と相関してその CCR5 受容体レベル。インスリン機能と糖代謝における CCL5 と CCR5 の役割は不明します。1 つの研究報告 CCR5 の欠乏が肥満誘起性炎症、マクロファージ募集およびインスリン抵抗11; からマウスを保護すること対照的に、別の研究は、CCR5 不足が脂肪細胞と筋肉のインスリン シグナル12と同様、全身のグルコース耐性を損なうことを報告しました。CCL5 は T 細胞でのグルコース取り込みを増加して、視床下部13,14, しかし、アクション機構への作用を食品の摂取量を減らすために発見され、受容体の関与はまだ識別すること。

インシュリンは視床下部ニューロンの機能に及ぼす周辺組織の炎症細胞メカニズムを研究することは困難です。これは細胞の不均質性とニューロン回路のフィードバック規制のためです。この理由は、細胞の in vitro培養モデルは視床下部インシュリン信号調節に、ケモカインの影響を調査するためきれいなモデルを提供します。多くの確立された研究用不死視床下部神経細胞にありますが、これらの細胞株の別のマーカーの表現し、したがって、視床下部ニューロン15の異なる種類を表します。プライマリ視床下部文化を維持することは困難にすることができます、にもかかわらず彼らはインスリン刺激時に視床下部ニューロンの最も現実的な応答を提供することができに来る未知の影響細胞を維持するときに再生の可能性を回避することも人工増殖因子と培地の長期的です。

ここ、C57BL/6 (WT) 野生型マウスと CCR5 ノックアウト (CCR5-/-) マウスからプライマリ視床下部ニューロンを活用し、transfect GFP GLUT4 の構造と細胞の両方の種類。CCR5 のインスリンによる GLUT4 膜輸送への貢献のため、GFP GLUT4 トランスフェクション細胞はインスリンや組換え CCL5 と扱われました。我々 は、GFP GLUT4 のデコンボリューション顕微鏡による主な視床下部ニューロンの細胞膜上の動きを特徴付けます。

Protocol

すべてのプロトコルおよび動物の科目で使用される方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 台北医科大学によって承認されている (プロトコル番号: LAC-2013-0278;LAC-2015-0397)

1 一次ニューロンの文化

  1. 培養前に、の準備
    1. ポリ-D-リジン (表 1) で培養皿文化の前に 1 日のコートします。6 よく皿を各ウェルに 1.5 mL ポリ D リジン (0.05 mg/mL) を追加します。ライブ イメージング用 12 mm × 12 mm coverslip 標準コーティング 6 ウェル プレートでの細胞を培養します。
    2. 削除/ごみポリ-D-リジンと 2 mL ddH2O を 2 回で皿を洗う
    3. 手術器具の準備: 標準ストレート先端の鉗子、湾曲した先端の鉗子、マイクロ解剖はさみのペア。手術器具を滅菌、手術中に 75% エタノールでそれらを保ちます。
    4. 20 mL 洗浄媒体 (表 1) と 10 cm シャーレを記入し、氷の上を保ちます。
    5. 15 mL 洗浄媒体を 15 mL の試験管を記入し、氷の上の管を保ちます。
  2. 異なる脳の領域から脳組織分離
    1. 非換気ケージにマウスを配置し、CO2を夢中にさせる標準的な euthanization プロトコルで 16-19 日の古い妊娠したメスマウスを犠牲に。E15.5 ~ E16.5 胚に適している視床下部神経文化と E16.5 〜 E17.5 は海馬と大脳皮質神経細胞の培養に適しています。
    2. プラットフォーム、解剖顕微鏡、および汚染を避けるために 75% エタノール手術ツールを殺菌します。
    3. (図 1、1 D) それらを損なうことがなく簡単に臍帯周辺 (暗い赤い領域は、図 1 a、1 bの破線) 子犬を分離するためにカットします。
    4. はさみ (図 1E, F) とそれぞれの子犬の頭の部分を削除し、目領域 (図 1) の細いストレート鉗子を使ってその場でヘッド部分を保護します。別の細い使用は 2 つの側面から外側の皮膚と頭蓋骨を削除し背方向 (図 1 H、黒矢印方向に) に前方からそれらを剥離鉗子。脳損傷 (図 1I) せず孤立すべき。
      注: それは脳脳の異なる領域を隔離するときに精度を確保するための整合性を維持するために不可欠です。
    5. 次の手順のための冷たい洗浄媒体ときれいなペトリ皿に分離脳をしてください。
    6. 脳を反転し、腹側を追いつきます。視床下部は、(図 1 j, 視床下部領域の矢印) の脳の真ん中に丸い構造です。細いカーブタイプ鉗子で視床下部組織を分離します。(黄色がかった赤色を持っている) の髄膜を削除慎重に。
      注意: 髄膜の完全な除去は、線維芽細胞の汚染を避けるために重要なステップです。
    7. シャープの鉗子で嗅葉を押し、カーブタイプ鉗子 (図 1 K, L) に脳全体を取り巻く薄い髄膜剥離します。
    8. 海馬は大脳皮質の下の部分に埋め込まれているバナナのような形です。皮質の下側に反転し、(図 1 M、N、およびO) カーブタイプ鉗子を持つ側に引っ張ることで大脳皮質から海馬を分離します。必ずすべての残存髄膜周囲の脳組織を削除してください。
    9. 脳のすべての領域が分離されている場合、これらの組織鉗子 (ステップ 1.1.5) の助けを借りて、冷たい洗浄媒体を含んでいる 15 mL チューブにみじん切りに。
      注: 脳組織は 2-3 h の冷たい洗浄媒体に保存できます。
  3. 組織の消化、めっきと文化
    1. 組織を含む組織 15 mL チューブを 2-3 回、反転でリンスし、まっすぐチューブ (1 〜 3 分) を解決するために組織を許可します。
    2. 真空システムに接続されている上部媒体ガラス パスツール ピペットを使用して削除します。組織を洗浄するには、15 mL の氷冷洗浄媒体を追加し、2 〜 3 回チューブを反転します。次のステップの前に 3 回洗浄手順を繰り返します。
      注意: は、真空システムを使用して上のメディアを削除するときに下部組織の用心深い。
    3. 最終的な洗浄後 1 mL ピペットの助けを借りて洗浄媒体を削除します。
    4. パパイン トリプシン消化バッファー (表 1) 7-14 分振る 37 ° C の水浴中で組織のすべての組織を確保するため 2 つ毎分正しく消化バッファーにさらされているチューブを孵化させなさい。
      注: インキュベーション時間と消化バッファーのボリューム調整できます組織のサイズに基づいて。6-8 子犬から収集した視床下部組織、300 μ L パパイン トリプシン消化バッファーと 7 分インキュベーション時間をお勧めします。多くの組織より多く消化バッファーが必要になります。
    5. 牛胎児血清の 1 ボリュームを追加することによって酵素の活性を中和します。室温で 3-5 回の試験管を振る。
    6. ラックにチューブを維持し、落ち着く; するために組織を許可するように 1-2 分待つ慎重に 1 mL ピペットで上澄みを削除します。
    7. 播種培地 (表 1) 試験管やピペットで移しなさい組織の上下に 50 回 5 mL ピペットで優しく (6 ウェル プレート、ウェルあたり 1.5 mL めっき媒体を推奨) の 6 mL を追加します。ほとんどの細胞が単一セル ピペッティングを繰り返した後に分離してしまいます。
      注: この手順を行いながら泡の形成を回避しようとします。ほとんどの実験室は、組織を分離するのに炎症を起こすガラス牧草地 pipets を使用します。狭い先端で 5 mL のピペットは、このステップの良い代替をすることができます。
    8. ラックにチューブを維持し、定住する分厚い、非解離組織を許可するように 1-2 分待ちます。上部段階を含む新しい管への細胞解離し、希釈播種培地 (解離細胞の 1 x ボリュームごとのボリュームめっき中 × 5。たとえば、追加メッキ 1 mL 解離細胞用培地 5 mL)。
    9. 診断細胞密度を計算でステップ 1.1.1 のようにポリ-D-リジン コーティング培養プレートに必要な細胞数をシードします。2-4 x 6 よく皿/35 mm ディッシュ用井戸あたり 10 の5セルに推薦された神経イメージング研究をお勧めします。高密度タンパク質コレクションおよび分析のため必要になります。
      注: を追加しないでくださいあまりにも多くのめっき中 1 つ 6 よく皿に 1 〜 1.5 mL めっき媒体は添付ファイルのために十分。メディアの過剰な量は、適切な細胞接着に必要な時間が延長されます。
    10. 2-3 時間待ち、顕微鏡下でシードのニューロンをチェックします。ニューロンは、適切に接続するとき、炎を成長を開始します。
    11. めっき培地を取り除き、めっき中を洗浄する皿に温めた 2 mL 洗浄媒体 (37 ° C) を追加します。この手順を 2 回繰り返します。
    12. 6 よく皿を各ウェルに 2 mL の完全培地 (表 1) を追加します。
    13. 媒体の半分ごとに 3-4 日を変更します。毎回新鮮な完全培地を準備します。異なる形態と特性 (図 2) 別のマウス脳から培養したニューロンがあります。

2. リポソームを用いた一次ニューロンにプラスミド DNA トランスフェクション

注意: ニューロン transfection のためエンドトキシン フリーのプラスミド DNA 精製キット (材料表) は DNA の準備のためお勧めします。追加エタノール沈殿は過剰の溶媒を削除したり、DNA 濃度を高めます。

  1. 一次ニューロンにおけるリポソーム DNA トランスフェクションします。
    注: トランスフェクション時間は実験に必要な成熟状態に依存します。視床下部ニューロンは、DIV 7-10 (DIV、日体外) で導入されました。
    1. DNA: リポソーム混合物の準備: 希釈 GFP GLUT4 プラスミド DNA16 (2 μ g) 遠心機チューブ含む 300 μ L 低血清培。2 μ L 300 μ L 低血清培地、リポソームと別の遠心管を準備し、室温で 5 分間インキュベートします。
    2. 両方のチューブの内容を結合し、室温で 20-30 分間インキュベートします。
    3. 神経細胞培養培地を培養皿から削除します。各ウェルに 600 μ L の DNA リポソームの混合物を追加し、4-6 時間 37 ° C で孵化させなさい。
    4. 4-6 時間後 DNA リポソームの混合物を削除し、培地 2 mL を追加します。
    5. 18-72 時間後だけで GFP や GLUT4 タンパク質 GFP タグ (図 3および図 4) 共役などの蛍光信号を観察できます。

3. ライブ画像記録

  1. ライブの準備細胞・ イメージング
    1. 細胞の培養 WT と CCR5-/-視床下部ニューロン グルコーストランスポーター 4 (GFP GLUT4) #1.5 (または厚さ 0.17 mm) というラベルの付いた緑色蛍光蛋白を発現するポリ-D-リジン 6 ウェルの 1.1.1 手順で塗装されているガラス基板プレート。
    2. 慎重に鉗子を用いたニューロンと、coverslips を削除、注意してスライド ガラスの上に置きます。
    3. 繊細な作業のおしりふきで余分なメディア/液体を削除します。ワイプを 2 回折るし、慎重に、coverslip の上に置いてください。軽く、coverslip を移動することがなくワイパー下に押して。
      注意: は、力をこめてをガラス スライドに対して coverslip を押さないで下さい。この手順の目的は、こと、coverslip はない移動/ドリフト浮力による画像集録中にことを確認することです。
    4. 正しく coverslips とスライドを coverslip の直面して、セキュリティで保護されたとのデコンボリューション顕微鏡ステージに配置します。この手順は、ユーザーが後で標的細胞の同じセットを追跡できるように、スライドの位置が一定のまま確保するためです。
    5. WT と CCR5-/-視床下部ニューロン細胞観察 60 x/1.42 NA 油浸対物レンズ。
    6. CCL5 で選択したセルのサンプルを扱う (10 ng/mL) またはカバーガラスの端に希薄化後のインスリンの 1 つ分を追加 1.5 μ L のインスリン (10 U/mL)。
    7. 視覚化し、すぐに選択したセルのサンプルを記録します。30 分を記録するためのビデオ録画ソフトウェアをプログラムします。
  2. デコンボリューション顕微鏡および分析
    注: プロトコルのこの部分は、分析のためのデコンボリューション顕微鏡と特殊なソフトウェアを使用を必要があります。
    1. イメージング システムの電源をオンに、適切に初期化し、LED 光源をオンに顕微鏡ステージを許可します。
    2. 60 x 1.42 NA の対物レンズにイマージョン オイル (37 ° C でライブ サンプルのインデックス 1.520 屈折率) を追加します。顕微鏡の対物レンズに向かって coverslip のサンプル スライドを配置し、スライドを正しくセキュリティで保護します。
    3. 明視野または蛍光照明を標的細胞を識別するために使用します。標的細胞を明確に観察できるまでは、フォーカスを調整します。不要な傷を避けるために coverslip 圏外対物レンズを移動しないでください。
    4. 緑を識別する蛍光タンパク質 GFP シグナルによってグルコース輸送体 4 (GFP GLUT4) の共役します。画像取り込みの対象セルを識別します。選択したターゲット セル位置は、将来参照 (図 4) の記憶ことができます。
    5. 各ターゲット セル上の適切な実験的パラメーター (画素数、励起波長、透過率、露光時間、スタックの厚さ、時間間隔と、撮像時間の合計を含む) をセットアップします。この実験画像ピクセル数は GFP シグナルの 512 x 512 (解像度 1,024 × 1,024 に設定できます) に設定しました。0.025 〜 0.05 毎 5 分マイナー横 x、y、および z 調整の s が推奨されるソフトウェア (材料) によって制御できます間露光時間が設定されました。
    6. 最大ピクセル強度を達成するために約 2,000、3,000 カウントに露出パラメーターを設定します。蛍光退色を最小限に維持する露出時間未満 1, 繰り返し手順関心の各追加蛍光チャンネルと各個々 の励起光伝送の可能な限りの割合を減らします。
    7. 各ターゲット セルの Z スタックの上限と下限の制限を設定します。これは、ターゲット セルの上下が少しピン ボケ両方まで顕微鏡ステージを移動することによって実現できます。ユーザーは、(各画像間の距離を設定することによって行うことができます)、上限と下限の制限の間のイメージの数を設定することにより、z 軸の解像度を調整できます。
    8. 画像のスタックは、逆算され、後でこの場合それぞれのソフトウェア-パーキンエルマー社から速度の助けを借りて分析します。

Representative Results

培養マウス視床下部ニューロンは視床下部の特定の蛋白質 - 研究 (POMC) 抗体と神経マーカー - 微小管関連タンパク質 2 (MAP2) と免疫染色によってさらに識別された (図 2 a)。一次培養の視床下部ニューロン表現視床下部タンパク質 POMC を確認しました。視床下部ニューロンにおける CCR5 受容体と CCL5 の発現が特異抗体で識別、共同 POMC 抗体 (図 2 a、2 b) が付いた。

GFP DNA (図 3) が発現するニューロン培養 3 日後または GFP 共役 GLUT4 (図 4)。GFP 発現入手できますすべての上特定のパターン (図 3) せず、GLUT4 GFP の細胞 (図 4) 細胞質内の点状のような構造体として表現されます。本研究で使用されるトランスフェクション キットはニューロンの transfection のため最も効率的な方法ではありません。しかし、トランスフェクション後より良い生細胞イメージング/録音後に貢献するより良い細胞の生存が厳しくない法です。GFP GLUT4 の発現ニューロンの画像は、インスリン刺激または CCL5 刺激 (図 4、補助ビデオ 3) 時間経過映画 (図 4 aB、補助ビデオ 1、2) の前に撮影されました。GFP および GFP GLUT4 の信号が明確とニューロンに強いです。

視床下部ニューロン GLUT4 GFP 遺伝子導入はさらにインスリン (40 U) GFP GLUT4 が人身売買を特徴付けるために扱われました。インスリン刺激による WT と CCR5-/-視床下部ニューロン GLUT4 GFP 動きの reprehensive のビデオは、それぞれビデオ 1 とビデオ 2 として表示されます。

Figure 1
図 1: 胚のステージ (16.5 日) でマウスの脳の異なる領域からの組織分離します。(A ~ D)胎盤から子犬の分離に必要な手順。(E, F)体から子犬の頭の解剖。(G-私)頭蓋骨から脳全体の分離に関連する手順。鉗子を用いた頭蓋骨を除去しながら引っ張られる方向に黒い矢印のポインター。(J) 視床下部の分離。黒い矢印は、鉗子の間視床下部の領域を指します。(K L)マウスの脳の皮質の隔離。脳全体から、皮質の分離をマウスの脳および白い矢印の皮質領域は黒の印です。(MO)大脳皮質から海馬部分の分離。上の白い矢印は、海馬の組織をマークし、下の白い矢印マークを皮質組織。スケール バー = 1 cm (A ~ F)、(G O) 200 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 視床下部の神経細胞マーカー - POMC および CCL5 と CCR5 の共発現の特性。(A) 一次培養視床下部ニューロンは POMC (赤)、視床下部神経細胞マーカーで CCR5 (緑)、および神経細胞マーカー MAP2 の共発現 (グレー) を付けられました。POMC (赤) 肯定的な視床下部ニューロン (参照17補足データから適合) の (B) (緑) CCL5 式。ここでは、DAPI は、青い色の核をラベル付けします。スケール バーで 50 μ m = (A) と (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: マウス一次ニューロンにおける GFP 発現。GFP プラスミド DNA は後 4 日間文化 (DIV4) リポソームを初代培養神経細胞にトランスフェクトしたし、もう 3 日 (DIV7) で表現。(A B)GFP は、炎と相馬の両方で表現されます。(C ・ D)ニューロン モック トランスフェクション。DAPI はラベル (B、D) の核です。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 視床下部の神経細胞での GFP GLUT4 のスナップショット。(A、C)GFP GLUT4 タンパク質は CCR5-/-視床下部ニューロン野生型 (WT) 視床下部ニューロンと (B) で表されます。ニューロンはインスリン (A, B) や CCL5 を刺激した (C)。GFP GLUT4 (-) の前に炎で点状に矢印をポイント (+) 後インスリンまたは CCL5 刺激とアスタリスク (-) の前に表面の GLUT4 GFP をポイント (+). (C) CCL5 刺激の前後(図参照17から適応)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Borade バッファー x 5 会社 カタログ番号 ボリューム
ホウ酸 シグマ アルドリッチ B6768 1.55 g
ホウ砂 シグマ アルドリッチ 71997 2.375 g
ddH2O 100 mL
フィルター、4 ° C で維持
ポリ-D-リジン株式 x 20 会社 カタログ番号 ボリューム
ポリ-D-リジン シグマ アルドリッチ P6407 100 mg
ddH2O 100 mL
フィルター、-20 ° C で保存
1 x ポリ-D-リジン ボリューム
20 x ポリ-D-リジン 5 mL
Borade バッファー x 5 20 mL
ddH2O 75 mL
合計 100 mL
4 ° c を維持します。
洗浄媒体 会社 カタログ番号 ボリューム
DMEM 高グルコース Gibco 12800-017 495 mL
抗生物質 Antimyotic Gibco 15240-062 5 mL
合計 500 mL
4 ° c を維持します。
パパイン トリプシン消化バッファー: 会社 カタログ番号 ボリューム/最終濃度
パパイン (10 mg/mL) シグマ アルドリッチ P4762 200 μ L (2 mg/mL)
トリプシン-EDTA (0.25%) Gibco 25200-072 200 Μ L (0.05%)
洗浄媒体 600 Μ L
合計 1,000 Μ L
-20 ° C で維持します。
メッキ媒体: 会社 カタログ番号 ボリューム
Neurobasal 培地 Gibco 21103-049 176 mL
ウシ胎児血清 Gibco 10437-028 20 mL
L-グルタミン酸 (200 mM) Gibco 25030 2 mL
抗生物質 Antimyotic Gibco 15240-062 2 mL
合計 200 mL
4 ° c を維持します。
完全な培 会社 カタログ番号 ボリューム
Neurobasal 培地 Gibco 21103-049 95 mL
N2 サプリメント (100 倍) Gibco 17502-048 1 mL
B27 サプリメント (50 倍) Gibco 17504 04 2 mL
L-グルタミン酸 (200 mM) Gibco 25030 1 mL
抗生物質 Antimyotic Gibco 15240-062 1 mL
合計 100 mL
作りたて

表 1: 本研究で使われた消化バッファーとメディア作曲。

補助ビデオ 1:インスリン刺激 WT 視床下部ニューロンにおける GFP GLUT4 運動このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補助ビデオ 2:インスリン刺激 CCR5-/-視床下部ニューロンにおける GFP GLUT4 運動このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補助ビデオ 3:CCL5 刺激 WT 視床下部ニューロンにおける GFP GLUT4 運動(ビデオ参照17から適応)。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

Discussion

CCL5 またはインスリン刺激時の生きているセルを監視する機能は、GLUT4 の動きに CCL5 またはインスリンの急激な効果を研究するため極めて重要です。実際には、それは WT と CCR5 の-/-視床下部ニューロン刺激によるインスリンの重要な違いを視覚化することができます。インスリン刺激17後 WT と CCR5 の-/-視床下部ニューロン異なる時点での内因性の GLUT4 タンパク質の表面の分類を行った。セル表面蛋白質の分類低バック グラウンドと特異性の高い抗体が必要です。さらに、表面の蛍光定量は困難で時間がかかるできます。したがって、コマ撮り録画 CCL5 の効果ことを確信することができます。 またはインスリンは実験条件ではなく、統計的変動に基づく真の生理の変化。表面の内因性 GLUT4 の分類、一緒には、強力な証拠と GLUT4 転流とインスリン シグナルに CCL5 と CCR5 の参加方法を実証する実験を提供します。

現代細胞生物学と分子生物学の研究は、多くの実験は、蛍光顕微鏡の利用を必要とします。この技術に蛋白質および/または移動方向と速度、促進効果、形態学的変化および蛋白質の売買だけでなく、細胞細胞器官間の空間関係を視覚化できます。しかし、この技術はその限界: 背景の蛍光性によって標的タンパク質 (または領域) から発する信号を圧倒できます fluorophores が興奮しているとき。その結果、蛍光画像が背景信号に深く埋葬された予想される信号ぼやけて表示されます。この現象は特に膜結合タンパク質の観察です。

全内部反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) は、この困難を克服するために開発されました。バック グラウンド蛍光物質に影響を与えずに選択した表面結合 fluorophores の励起を視覚化する科学者をことができます。機能や細胞膜などの非常に薄いサーフェス領域上のイベントを選択的に特徴付けるため科学者をことができます。デコンボリューション顕微鏡は、近年の技術の進歩の助けを借りて可能です処理計算集約的なイメージです。それは、デジタルの蛍光画像の解像度を改善するために頻繁に利用されています。以前、説明したように、fluorophores が付いている照明 (レーザー、LED など) の任意の型に興奮しているときは、すべて fluorophores が付いて出力光信号に関係なくかどうか、焦点が合っている場合イメージが常にぼやけて表示されますのでします。このボケと呼ばれる「点広がり関数」(PSF)、小さな蛍光ソース (明るいスポット) から光を来るがさらに広がるし、ピンぼけ (ぼかし) になる現象が原因です。原則として、このイベントは砂時計のような形をした蛍光信号を生成、蛍光イメージは、このような多数の信号ので構成できます。デコンボリューション処理は、元の明るいスポット形式にすべての蛍光信号を再割り当てし、イメージのコントラストを改善するためにアウト フォーカスの光の大部分を排除できます。

近年、デコンボリューション アルゴリズムは、共焦点顕微鏡に匹敵する解像度を持つ画像を生成しています。さらに、観察、比較では広視野顕微鏡により、すべての光を検出する信号し、デコンボリューション処理を通じて彼らの源に戻ってそれらを再割り当て制限励起領域によって検出されるからアウト フォーカスのぼかしを防ぎます。したがって、実際は、デコンボリューション顕微鏡はより効率的な画像取得方法だけでなく、全反射型顕微鏡と比較してよりコスト効果の高い方法になっています。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

S Y C に省の科学と技術, 台湾 - たばこ製品の MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) と保健医療福祉有料 - MOHW106-TDU-B-212-144001 によって提供される助成金を感謝しております

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DeltaVision deconvolution microscope Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)  equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images
SoftWorX application software Applied Precision Inc. used to control microscope and camera
VoloCITY software PerkinElmer used to analyze the images
Insulin Actrapid, Denmark
Liposome Invitrogen 11668019 Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection
GFP control plasmid DNA provided by Professor Samuel Cushman
GFP-GLUT4 plasmid DNA provided by Professor Samuel Cushman
Anti-mouse Alex-488 Invitrogen #A-11001 Secondary anitbody
Anti-rabbit IgG -Alex-568 Invitrogen #A-11036 Secondary anitbody
CCL5/RANTES R&D Systems 478-MR-025 10ng/ml
Kimwipes Kimberly-Clark #FL42572A 0.17mm thickness
12 mm Microscope coverglass Deckglaser #41001112 used for immmunstaining study
micro-dissecting scissors Klappenecker Surgical tool
curved-tipped forceps Ideal-tek Surgical tool
standard straight-tipped forceps Ideal-tek Surgical tool
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362 Purify Endotoxin free plasmid DNA
5 ml pipette Corning costar  4487 dissociate brain tissue

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References

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