Syntese af kerne-shell Lanthanide-doped Upconversion nanokrystaller for cellulære applikationer

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En protokol, der er præsenteret for syntesen af kerne-shell lanthanide-doped upconversion nanokrystaller (UCNs) og deres cellulære ansøgninger om kanal protein forordning efter nær-infrarødt (NIR) lys belysning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ai, X., Lyu, L., Mu, J., Hu, M., Wang, Z., Xing, B. Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications. J. Vis. Exp. (129), e56416, doi:10.3791/56416 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lanthanide-doped upconversion nanokrystaller (UCNs) har tiltrukket stor opmærksomhed i de seneste år baseret på deres lovende og kontrollerbar optiske egenskaber, som giver mulighed for absorption af nær-infrarødt (NIR) lys og kan derefter konvertere det til multipleksede emissioner, der spænder over en bred vifte af områder fra UV til den synlige for NIR. Denne artikel præsenterer detaljerede eksperimentelle procedurer for høj temperatur udfældes sammen syntese af kerne-shell UCNs at inkorporere forskellige lanthanide ioner i nanokrystaller til effektivt konvertering dybe væv gennemtrængelige NIR excitation (808 nm) ind i en stærk blå emission på 480 nm. Ved at kontrollere den overflade modifikation med biokompatible polymer (polyacrylic syre, PAA), som forberedte UCNs erhverver stor Opløselighed i buffer løsninger. De hydrofile nanokrystaller er yderligere functionalized med specifikke ligander (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for lokalisering på cellemembranen. Ved NIR lys (808 nm) bestråling, upconverted blå emission kan effektivt aktivere lys-gated kanal protein på cellemembranen og specifikt regulerer kation (fx, Ca2 +) tilstrømning i cytoplasmaet. Denne protokol giver en realistisk metode til syntese af kerne-shell lanthanide-doped UCNs og efterfølgende biokompatible overflade modifikation for yderligere cellulære applikationer.

Introduction

I de seneste år, har været udbredt lanthanide-doped upconversion nanokrystaller (UCNs) som et alternativ til konventionelle organiske farvestoffer og quantum dots i biomedicinsk applikationer, som hovedsagelig er baseret på deres fremragende kemiske og optiske egenskaber, herunder stor biokompatibilitet, høj modstandsdygtighed overfor photobleaching og smal båndbredde emission1,2,3. Endnu vigtigere, kan de tjene som et lovende nanotransducer med fremragende væv penetration dybde i vivo konvertere nær-infrarødt (NIR) excitation i en bred vifte af emissioner fra Ultraviolette, synlige, og regionerne NIR gennem en multi photon upconversion proces4,5. Disse unikke egenskaber gør lanthanide-doped UCNs tjene som et særligt lovende vektor for biologiske sensing, Biomedicinsk imaging og sygdomme theranostics6,7,8.

De generelle komponenter af UCNs er hovedsagelig baseret på doteret lanthanide ioner i matrixen isolerende vært indeholdende en sensibilisator (fx, Yb3 +, Nd3 +) og en aktivator (fx, Tm3 +, Er3 +, Ho EUR 3 +) inden for krystal administrationsprocedurerne9. De forskellige optiske emission fra nanokrystaller tilskrives den lokaliserede elektronisk overgang inden for de 4f orbitaler af lanthanide energiniveauerne på grund af deres stigen-lignende arrangeret energi niveau10. Derfor er det kritisk at netop kontrol størrelse og morfologi af syntetiserede UCNs med stand lanthanide energiniveauerne. Af retten, har været veletablerede nogle lovende metoder til fremstilling af lanthanide-doped UCNs, herunder termisk nedbrydning, høj temperatur Co nedbør, hydrotermiske syntese, sol-gel behandling, etc.11 , 12 , 13 blandt disse tilgange, høj temperatur udfældes sammen metode er en af de mest populære og nem strategier for UCNs syntese, som kan kontrolleres strengt for at forberede ønskede høj kvalitet nanokrystaller med ensartet form og størrelse distribution i en forholdsvis kort reaktionstid og lavpris-14. Men de fleste nanostrukturer syntetiseret af denne metode er hovedsagelig loft med hydrofobe ligander som oliesyre og oleylamine, der normalt hindrer deres yderligere bioapplication på grund af begrænsede af hydrofobe ligand Opløselighed i vandig opløsning 15. Derfor er det nødvendigt at foretage passende overflade modifikation for at forberede biokompatible UCNs i biologiske applikationer in vitro og i vivo.

Heri, præsenterer vi en detaljeret eksperimentel procedure for syntese af kerne-shell UCNs nanostrukturer gennem høj temperatur udfældes sammen metode og en mulig ændring teknik til functionalize biokompatible polymer på UCNs overflade for yderligere trådløse applikationer. Denne UCNs nanoplatform indarbejdet nanokrystaller at erhverve stærk blå emission tre lanthanide ioner (Yb3 +, Nd3 +, og Tm3 +) (~ 480 nm) ved NIR lys excitation på 808 nm, som har større indtrængningsdybde i levende væv. Det er velkendt at Nd3 +-doteret UCNs vises minimeret vand absorption og overophedning effekter på dette spektrale vindue (808 nm) i forhold til konventionelle UCNs på 980 nm bestråling16,17, 18. Desuden, for at udnytte UCNs i biologiske systemer, de hydrofobe ligander (oliesyre) på overfladen af UCNs er for det første fjernes ved hjælp af sonikering i syreopløsning19. Derefter modificeres de ligand-fri UCNs yderligere med et biokompatibelt polymer (polyacrylic syre, PAA) at erhverve stor Opløselighed i vandige opløsninger20. Desuden, som en proof-of-concept i cellulære applikationer, de hydrofile UCNs yderligere functionalized med molekylær ligander (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for specifikke lokalisering på N3-markeret celle membran. Ved NIR lys (808 nm) bestråling, upconverted blå emission på 480 nm kan effektivt aktivere et lys-gated kanal protein, channelrhodopsins-2 (ChR2), på cellens overflade og dermed lette kation (fx, Ca2 + -ion) tilstrømning gennem en membran af levende celler.

Denne video protokol indeholder en realistisk metode til lanthanide-doped UCNs syntese, biokompatible overflade ændring og UCNs bioapplication i levende celler. Eventuelle forskelle i syntese teknikker og kemiske reagenser, der anvendes i nanocrystal vækst vil påvirke de størrelse distribution, morfologi og upconversion luminescens (UCL) spektre af endelige UCNs nanostrukturer celle forsøgsdyr. Denne detaljerede video protokol er parat til at hjælpe nye forskere på dette område at forbedre UCNs reproducerbarhed med metoden høj temperatur udfældes sammen og undgå de mest almindelige fejl i UCNs biokompatible overflade modifikation for yderligere cellulære applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

forsigtighed: Rådfør dig med alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Brug venligst alle relevante sikkerhedspraksis, når du udfører syntesen af UCNs ved en høj temperatur (~ 290 ° C), herunder anvendelse af tekniske foranstaltninger (stinkskab) og personlige værnemidler (f.eks., beskyttelsesbriller, handsker, laboratoriekittel, fuld længde bukser, og lukket tå sko).

1. syntese af NaYF 4: Tm-Yb-Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokrystaller

  1. syntese af NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) core nanostrukturer
    1. Forberedelse af RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F methanol stamopløsning
      Bemærk: den sjældne jordarter (RE) lanthanide ioner omfatter Yttrium (Y), Ytterbium (Yb), Thulium (Tm) og neodym (Nd).
      1. Opløse 500 mg Yttrium(III) acetat hydrat i 5 mL methanol (100 mg/mL), 250 mg Ytterbium (III) acetat hydrat i 5 mL methanol (50 mg/mL), 10 mg Thulium (III) acetat hydrat i 1 mL methanol (10 mg/mL), og 10 mg neodym (III) acetat hydrat i 1 mL metha Nol (10 mg/mL) i hætteglas med ultralydbad rengøring i 2 min.
      2. Kombinere 400 mg NaOH i et 50 mL centrifugeglas med 20 mL methanol med rengøring ultralydbad at forberede NaOH stamopløsning (20 mg/mL).
      3. Kombinerer 600 mg NH 4 F i et 50 mL centrifugeglas med 30 mL methanol med rengøring ultralydbad at forberede NH 4 F stamopløsning (20 mg/mL).
        Bemærk: Placer stamopløsning lanthanide komplekser, NaOH og NH 4 F i hætteglas, forsegle med parafilm og gemme dem i køleskab ved ~ 4 ° C indtil det skal bruges. Rede methanol stamopløsninger udskiftes en gang hver 2 uge.
    2. Forberedelse af NaYF 4: Tm-Yb-Nd core nanostrukturer
      1. 3 mL af oliesyre og 7 mL af 1-octadecene afpipetteres i en 50 mL tre-hals kolbe.
      2. Kombinerer 1.089 mL Y (CH 3 CO 2) 3 stamopløsning, 0.608 mL Yb (CH 3 CO 2) 3 stamopløsning, 83.6 µL af Tm (CH 3 CO 2) 3 stock løsning, og 128.5 µL Nd (CH 3 CO 2) 3 stamopløsning i kolben.
      3. Passer et termometer (0 - 360 ° C-rækken) i kolben og lader spidsen touch løsningen. Kolben anbringes i en glasbeholder med phenylmethyl silikone olie.
      4. Opvarmes opløsningen til 100 ° C med en varmeplade til at fordampe fra methanol. Kolben sættes til en Schlenk linje med en dobbelt vakuum/gas manifold til at fjerne de resterende methanol og holde reaktionsblandingen under vakuum i 2-3 min. under omrøring.
      5. Hæve temperaturen til 150 ° C og bevare denne temperatur for 60 min. vedligehold en omrøring hastighed på 700 omdrejninger i minuttet under syntesen.
        Bemærk: Sæt en moderat omrøring hastighed at undgå stænk løsningen.
      6. Stoppe varmepladen og holde kolben ved stuetemperatur til at tillade løsningen køle ned langsomt.
        Bemærk: Protokollen kan blive standset her.
      7. Kombinere 2 mL NaOH-methanol stamopløsningen og 2.965 mL af NH 4 F-methanol stamopløsning i en 15 mL-centrifugerør. Stramme tube med sin kasket og bland løsningen af kraftfulde vortexing for 5 s.
      8. Tilføj NaOH-NH 4 F blandingen langsomt i kolben med glas pipette over 5 min.
      9. Øger temperaturen af blandingen til 50 ° C og holder denne temperatur i 30 min.
        Bemærk: Indstil temperaturen på ikke mere end 50 ° C, fordi høje temperaturer vil fremme krystal Nukleering og vækst.
      10. Øge temperaturen (~ 100 ° C) til at fordampe fra methanol og kolben til en Schlenk linje med en dobbelt vakuum/gas manifold til at fjerne de resterende methanol og holde reaktionsblandingen under vakuum i 2-3 min.
      11. Skifte position af stophane udfylde kolben med nitrogen.
      12. Øget temperatur til 290 ° C ved en varme på ~ 5 ° C/min. holde reaktionsblandingen på 290 ° C for 1,5 h.
      13. Stoppe varmepladen og fjern kolben for at tillade reaktionsblandingen til at køle ned langsomt i stuetemperatur mens omrøring.
        FORSIGTIGHED: Vær forsigtig med varmeplade med høj temperatur (> 400 ° C) til at undgå alvorlige forbrændinger ved hudkontakt.
      14. Overføre blandingen i kolben i et 50 mL-centrifugerør. Skyl kolben med 30 mL ethanol og overføre løsningen til centrifugeglasset.
      15. Centrifugeres produkt ved 4000 × g i 8 min ved stuetemperatur og supernatanten.
      16. Tilføje 10 mL af hexan centrifugeglas og re sprede produktet med ultralydbehandling (60 kHz, 240 W) i 2 min.
      17. Tilsættes 30 mL ethanol til røret. Spin ned produkt ved 4000 × g i 8 min og derefter supernatanten.
      18. Re sprede de faste produkter i bunden i centrifugeglasset med 5 mL hexan. Gemme løsningen i køleskab ved ~ 4 ° C i et næste skridt.
        Bemærk: Upconversion emission af kerne-shell UCNs er testet af bestråling af løsninger med en 808 nm laser (2 W).
  2. Forberedelse af NaYF 4: Tm-Yb-Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokrystaller
    1. kombinerer 3 mL af oliesyre og 7 mL af 1-octadecene i en tre-hals kolbe på 50 mL. Tilføje 1.082 mL af stamopløsningen Y (CH 3 CO 2) 3 og 2,87 mL af stamopløsningen Nd (CH 3 CO 2) 3 i kolben.
    2. Tilføje opnåede core nanostrukturer (80 mg i 5 mL hexan fra trin 1.1.2.18) i kolben under omrøring.
    3. Passer et termometer (0 - 360 ° C-rækken) i kolben og lader spidsen røre blandingen. Kolben anbringes i en glasbeholder med phenylmethyl silikone olie.
    4. Varme blanding ved 100 ° C på toppen varmeplade til at fordampe ud af methanol og hexan. Kolben sættes til en Schlenk linje med en dobbelt vakuum/gas manifold til at fjerne de resterende opløsningsmiddel og holde reaktionsblandingen under vakuum i 2-3 min. under omrøring.
    5. Hæve temperaturen til 150 ° C og holde det for 60 min. vedligehold den omrøring hastighed på 700 rpm i syntesen.
      Bemærk: Sæt en moderat omrøring hastighed at undgå stænk løsningen.
    6. Stoppe varmepladen og fjern kolben til at tillade løsning at køle ned langsomt ved stuetemperatur.
      Bemærk: Protokollen kan blive standset her.
    7. Afpipetteres 2 mL NaOH-methanol stamopløsningen og 2.965 mL af NH 4 F-methanol stamopløsning i en 15 mL-centrifugerør. Stramme tube med sin kasket og bland løsningen af kraftfulde vortexing for 5 s.
    8. Tilføj blandingen i kolben med glas pipette langsomt over 5 min.
    9. Øger temperaturen af blandingen til 50 ° C og holde det ved 50 ° C i 30 min.
      Bemærk: Indstille temperaturen ikke højere end 50 ° C, fordi høje temperaturer vil fremme krystal Nukleering og vækst.
    10. Øge temperaturen (~ 100 ° C) til at fordampe fra methanol og kolben til en Schlenk linje med en dobbelt vakuum/gas manifold til at fjerne de resterende methanol, holde reaktionsblandingen under vakuum i 2-3 min.
    11. Skifte position af stophane udfylde kolben med nitrogen.
    12. Hæve temperaturen til 290 ° C med en varme sats på ~ 5 ° C/min. holde reaktionsmiljøet på 290 ° C for 1,5 h.
    13. Stoppe varmepladen og fjern kolben for at tillade reaktionsblandingen til at køle ned langsomt ved stuetemperatur under omrøring.
      FORSIGTIGHED: Vær forsigtig med varmeplade med høj temperatur (> 400 ° C) til at undgå alvorlige forbrændinger ved hudkontakt.
    14. Overføre blandingen i kolben i et 50 mL-centrifugerør. Skyl kolben med 30 mL ethanol og overføre løsningen til centrifugeglasset.
    15. Centrifugeres produkt ved 4000 × g i 8 min ved stuetemperatur og supernatanten.
    16. Tilføje 10 mL af hexan centrifugeglas og re sprede produktet med ultralydbehandling (60 kHz, 240 W) i 2 min.
    17. Tilsættes 30 mL ethanol til røret. Spin ned produkt ved 4000 × g i 8 min og derefter supernatanten.
    18. Re sprede de faste produkter i bunden i centrifugeglasset med 5 mL hexan. Gemme løsningen i køleskab ved ~ 4 ° C indtil behov.
      Bemærk: Upconversion emission af kerne-shell UCNs er testet af bestråling af løsninger med en 808 nm laser (2 W).

2. Syntese af biokompatible UCNs nanostrukturer

  1. forberedelse af ligand-fri UCNs nanopartikel
    1. Kombiner 30 mL ethanol med som forberedt oleat-udjævnede UCNs løsning (trin 1.2.18) i en 50 mL-centrifugerør. Centrifugeres blandingen ved 4000 × g i 8 min ved stuetemperatur og supernatanten.
    2. Kombinerer 10 mL sur vandig opløsning (pH = 4) justeret af HCl (0,1 M) med bundfaldet i 50 mL centrifugeglas, og bundfaldet opløses ved ultralydbehandling (60 kHz, 240 W) i 30 min.
    3. Overførsel løsning i et glas hætteglasset med kraftig omrøring i 2 h.
    4. Uddrag den vandige opløsning med 30 mL diethylether Gentag tre gange for at fjerne oliesyre.
    5. Tilsættes 10 mL vand i de kombinerede ether lag med blid ryster.
    6. Indsamle den vandige fase sammen (20 mL) og tilføje 20 mL acetone med vortexing for 5 s.
    7. Spin ned produkt på 35.000 × g i 10 min. og derefter supernatanten. Bundfaldet oploeses i 2 mL vand.
  2. Forberedelse af polymer modificeret UCNs (PAA-UCNs)
    1. kombinere 200 mg polyacrylic syre (PAA, Mw = 1.800) med 20 mL vand ved hjælp af sonikering (60 kHz, 240 W) i 20 min. Tilføj de førnævnte ligand-fri UCNs i opløsningen PAA med kraftig omrystning.
    2. Juster pH-værdien til 7,4 af natriumhydroxidoploesning (1 M) med ultralydbehandling (60 kHz, 240 W) for 30 min. holde blandingen i 24 timer ved stuetemperatur under omrøring.
    3. Bundfaldet ved centrifugering på 35.000 × g i 10 min. genopslæmmes produkt i 10 mL vand ved hjælp af sonikering (60 kHz, 240 W) for 5 min og centrifugeres igen ved 35.000 × g i 10 min. Gentag dette trin tre gange.
    4. Re sprede produktet i 8 mL vand ved hjælp af sonikering (60 kHz, 240 W) for 5 min. gemme løsningen i køleskab ved ~ 4 ° C indtil behov.
  3. Forberedelse af funktionelle DBCO-UCNs nanopartikel
    1. Spin ned som forberedt PAA@UCNs (1 mg) ved centrifugering på 35.000 × g i 10 min. genopslæmmes bundfaldet i 1 mL tørre DMF ved ultralydbehandling (60 kHz, 240 W) for 1 min og centrifugeres igen på 35.000 × g i 10 min. Gentag dette trin to gange.
    2. Opløses bundfaldet i 200 µL tørre DMF i et hætteglas. Tilføje HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) og DIPEA (16 µL) i hætteglas med magnetisk omrøring for 24 h.
    3. Indsamler produkt ved centrifugering på 35.000 × g i 10 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes bundfaldet i 1 mL DMSO og centrifugeres igen ved 35.000 × g i 10 min. Gentag dette trin tre gange.
    4. Sprede produktet i 0,2 mL DMSO og opbevares i køleskab ved ~ 4 ° C inden brugen.

3. Bioapplications af DBCO-UCNs i forordning af membran kanaler i levende celler

  1. kultur HEK293 celler i Dulbecco ' s ændret Eagle ' s Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, 100 enheder/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og opretholde en befugtet kuvøse med 5% CO 2 på 37 ° C. frø 1 × 10 5 celler i 1 mL DMEM/brønd i en 12-godt pladen og holde det i inkubator for 24 h.
  2. Kombinerer plasmidet (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µg) med P3000 Transfektion reagens (2 µL) i Ørnen ' s Minimum væsentlige medier (MEM) (100 µL) i microcentrifuge tube A, og tilføje Transfektion reagens (1,5 µL) i MEM (100 µL) i tube B.
  3. Inkuberes blanding af løsninger i rør A og B i 10 min ved stuetemperatur.
  4. Kombinerer løsning i rør A og B med 400 µL MEM. Cellerne vaskes med 1 mL serum-fri DMEM to gange.
  5. Tilføje 600 µL Transfektion blandingen i hver brønd med en 12-godt plade og inkuberes cellerne ved 37 ° C inkubator for 4 h. Fjern mediet og vaskes to gange med 1 mL DMEM.
  6. Tilsættes 1 mL DMEM indeholdende 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM i DMSO) i brønden og holde det i rugemaskinen i 2 dage.
  7. Fjerne medium og vaske en gang med 1 mL PBS. Der tilsættes 1 mL Trypsin-EDTA (0,25%) løsning i hvert hul i den 12-godt plade og inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne har løsrevet (~ 2 min). Re kultur celler i en Konfokal parabol på 1 × 10 5 celler/brønd i 1 mL DMEM for natten.
  8. Fjern mediet og tilsæt 1 mL frisk DMEM med 2 µL DBCO-UCNs (50 mg/mL) i fad i 2 timer ved 37 ° C. For Konfokal imaging, vaske cellerne to gange med DMEM og tilføje 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) for 30 min.
  9. For intracellulære calcium analyse, inkuberes celler med en blanding af 1 µL Rhod-3 AM (10 mM), 10 µL Probenecid (250 mM) og 10 µL loading bufferen (Pluronic overfladeaktivt stof polyols,0.1% w/v)) i 1 mL DMEM medium i 30 min. i mørke.
  10. Cellerne vaskes med serum-fri DMEM og bestråle med 808 nm NIR lys ved dosering af 0,8 W/cm 2 for 20 min (5 min pause efter 5 min belysning).
  11. Optage imaging resultater på Konfokal mikroskop (Laserkilde: 561 nm laser; detektor rækkevidde: 610/75 nm; linse: 100 x 1,4 NA olie, eksponeringstid: 100 ms). Der tilsættes 1 mL Trypsin-EDTA (0,25%) løsning i hver brønd og inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne har løsrevet (~ 2 min). Cellerne i 1 mL PBS til flowcytometri (FCM) analysen af handelsstrømmen genopslæmmes (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skematisk syntese processen med core-shell lanthanide-doped UCNs er vist i figur 1 og figur 2. Transmissions elektronmikroskopi (TEM) og høj opløsning transmissions Elektron Mikroskopi (HRTEM) billeder af core og core-shell UCNs nanostrukturer blev indsamlet henholdsvis (figur 1). Ligand-fri UCNs er udarbejdet ved at fjerne den hydrofobe oliesyre på overfladen af UCNs i syre og modificeret med hydrofile polymer (PAA). Derefter er COOH-udjævnede PAA-UCNs functionalized med DBCO-NH2 af et AMID kondensationsreaktion. TEM billeder af ligand-fri UCNs, PAA-UCNs og DBCO-UCNs er vist i figur 2. Dynamisk lysspredning (DLS), zeta potentielle resultater og upconversion luminescens (UCL) spektre af DBCO-UCNs er indsamlet henholdsvis (figur 3). Fourier transform infrarød (FTIR) spektroskopi af DBCO-NH2, PAA-UCNs og DBCO-UCNs er præsenteret i figur 4.

I celle eksperimenter bekræftes den vellykkede udtryk for ChR2 på cellemembranen af indlysende grøn fluorescerende proteiner (NGL) markør (Venus) ved hjælp af Konfokal mikroskopi (figur 5A). DBCO-UCNs er specifikt lokaliseret på overfladen af ChR2-udtrykker HEK293 celler ved klik reaktion (figur 5A). Intracellulære calcium analyse efter NIR lys stimulation er også bekræftet af Konfokal imaging og flow flowcytometri (FCM) baseret på en standard fluorescerende Ca2 + indikator, Rhod-3 AM (figur 5B, C).

Figure 1
Figur 1. Syntese af kerne-shell lanthanide-dopede UCNs. (A) skematisk illustration af syntese processen med UCNs. (B, C) TEM kerne (NaYF4: Tm-Yb-Nd (30/0,5/1 %)) og core-shell (NaYF4: Tm-Yb-Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostrukturer. Skalalinjen: 50 nm. Indsatser: HRTEM billeder af core og core-shell UCNs nanostrukturer. Skalalinjen: 5 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Syntese af funktionelle UCNs nanostrukturer. (A) skematisk illustration af den syntese ligand-fri UCNs, PAA-UCNs og DBCO-UCNs, henholdsvis. (B, C, D) TEM billeder af ligand-fri UCNs, PAA-UCNs og DBCO-UCNs. Skalalinjen: 100 nm i panelet B og 50 nm i panelet C/D. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. FTIR spektroskopi af DBCO-NH2, PAA-UCNs og DBCO-UCNs, hhv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Karakterisering af DBCO-UCNs i stødpudeopløsning. (A) DLS resultater af DBCO-UCNs. (B) Zeta potentielle resultater af PAA-UCNs og DBCO-UCNs (mener ± SD). (C) UCL spektre af core og core-shell UCNs i hexan (1 mg/mL), PAA-UCNs og DBCO-UCNs i vand (1 mg/mL) separat (Ex: 808 nm). Indsatser: luminescence fotografi af UCNs med 808 nm bestråling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Cellulære anvendelser af DBCO-UCNs ved NIR lys belysning. (A) Konfokal billeddannelse af ChR2-udtrykker N3-markeret HEK293 cellerne inkuberes med DBCO-UCNs (øverst) og PAA-UCNs (nederst) i 2 h på 100 µg/mL. Grøn: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), blå: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Skalalinjen: 20 µm. (B) cellulære Ca2 + imaging med Rhod-3 før og efter NIR-lys bestråling (0,8 W/cm2 for 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Skalalinjen: 10 µm. (C) kvantitative FCM analyse af normaliserede fluorescens-intensiteten af cellulære Ca2 + med forskellige lys doser belysning (gennemsnit ± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel har præsenteret en metode for syntesen af kerne-shell lanthanide-doped upconversion nanokrystaller (UCNs) og deres overflade modifikation med funktionelle fraspaltning for cellulære applikationer. Denne roman nanomateriale besidder enestående optiske egenskaber, som kan udsende UV og synligt lys ved NIR lys excitation gennem en multi photon upconversion proces. I denne protokol, core-shell UCNs nanostrukturer (NaYF4: Tm-Yb-Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) er udarbejdet af en høj temperatur udfældes sammen metode i en blanding af oliesyre og 1-octadecene. TEM billeder demonstrere morfologi af disse core og core-shell nanokrystaller er sfærisk form med en diameter på 20 nm og 30 nm henholdsvis antyde en vægtykkelse på omkring 5 nm (figur 1). Core-shell arkitektur er også afsløret af høj opløsning TEM billeder i indsatser af figur 1, som viser lignende gitter frynser med de centrale UCNs nanostrukturer. Desuden, en typisk d-afstand omkring 0,52 nm er enig godt med afstanden i β-NaYF4(100) plan, der angiver, alle core og core-shell UCNs nanostrukturer er yderst krystalliseret og opretholde den samme krystalstruktur. Derudover upconversion luminescence spectra demonstrere core-shell nanokrystaller udsender stærke blå emission med en meget højere intensitet på 480 nm end core partikler ved excitation med en diodelaser til at opnå en kontinuerlig bølge på 808 nm ( Figur 4 c). Øget udledning af kerne-shell UCNs tilskrives undertrykt overfladen dæmper virkningen af Yb3 +, Nd3 +og Tm3 + ioner, der er integreret i det indre lag af kerne-shell nanokrystaller21. Disse resultater bekræfter kraftigt vellykket udarbejdelse af lanthanide-doped core-shell UCNs nanomateriale i dette forslag.

Der er flere kritiske trin i høj temperatur udfældes sammen syntesen af disse nanokrystaller. Først, den ekstra volumen af lanthanide ion stamopløsning i syntese processen med core og core-shell UCNs bør kontrolleres strengt (trin 1.1.2.2). Højt niveau doping ioner vil resultere i en fusion-relaterede cross-afslapning eller dæmper effekt på grund af ion-ion interaktion i nanokrystaller21. Andet, temperaturen skal holdes på mindre end 50 ° C for at sikre komplet Nukleering efter NaOH og NH4F er tilføjet i kolben (trin 1.1.2.9 og trin 1.2.9), som er afgørende for at sikre en ensartet morfologi ved at fremme crystal vækst baseret på Ostwald modning effekter22. For det tredje, størrelse og optiske egenskaber af kerne-shell nanopartikler kan hovedsageligt styres ved at justere mængden af lanthanide ioner i forstadier til shell (Y3 + og Nd3 +) og som forberedte core partikler (trin 1.2.1). Det er også vigtigt, at morfologi af kerne-shell nanokrystaller er baseret på den anisotrope shell vækst i forskellige typer af core partikler, som er nyttige for modulerende af forskellige optiske emissionen af UCNs ved NIR lys belysning23.

Derudover er det også en stor udfordring at effektivt konvertere hydrofobe UCNs til hydrofile UCNs nanopartikler til yderligere biologisk applikationer. Selvom nogle metoder er blevet rapporteret at forbedre UCNs biokompatibilitet i stødpudeopløsning, herunder ligand exchange, silica belægning, oleat-udjævningen ligand oxidation, osv., de lider af uventede aggregering, tidskrævende, og komplekse procedurer24,25,26. Heri, vi udvikler en enkel tilgang for at få vand-spredbar ligand-fri UCNs nanostrukturer ved at fjerne oliesyre på overfladen af oleat-udjævnede UCNs i en syre vand løsning (pH = 4). PH-værdien justeres af HCl er kritisk at kontrollere frigivelsen af oleat ligand og påvirke luminescence af UCNs. Endnu vigtigere, et biokompatibelt polymer (polyacrylic syre, PAA) med et stort antal carboxyl grupper kan linke med lanthanide ioner på overfladen af UCNs ved koordinering interaktion, der vil give mere funktionelle grupper for yderligere kemiske ændring. Derfor, vi functionalize DBCO-NH2 fraspaltning på overfladen af UCNs for yderligere specifikke N3-markeret celle membran lokalisering. TEM billeder af ligand-fri UCNs, PAA-UCNs og DBCO-UCNs i figur 2 viser den store dispersity og Opløselighed af disse nanostrukturer i stødpudeopløsning efter overflade ændring. Derudover blev fourier transform infrarød (FTIR) spektroskopi udført for at karakterisere den overflade modifikation af DBCO grupper på UCNs nanoplatform. Som vist i figur 3, den stærke bånd omkring 3,430 cm-1 er H-O strækker vibrationer af carboxyl grupper, og de to bands centreret på 1550 cm-1 og 1458 cm-1 er forbundet med den asymmetriske og symmetrisk strækker vibrationsindstillinger af carboxylat anioner, der angiver den succesfulde belægning af COOH gruppe-indeholdende polymerer (PAA) på UCNP overflade. Efter reaktion med DBCO-NH2 fraspaltning er et oplagt band på 1,635 cm-1 nuværende baseret på C = C stretching vibration på den aromatiske ring i DBCO grupper, som er konsistent med FTIR spektrum af DBCO-NH2 fraspaltning på samme wavenumber. Desuden dynamisk lysspredning (DLS) resultatet angiver den øgede hydrodynamiske diameter af DBCO-UCNs i vandig opløsning (96.4±10.4 nm) (figur 4A). Zeta potentielle resultater også angive negative overfladen af PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) og DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) henholdsvis (figur 4B), viser stor opløselighed og stabilitet af disse nanostrukturer i stødpudeopløsning. Derudover UCL spektre af PAA-UCNs og DBCO-UCNs demonstrere at de kan udsende lignende upconverted emission på 480 nm ved 808 nm lys bestråling (figur 4 c), som kan udnyttes til yderligere NIR lys-medieret photoactivation i biologisk systemer.

Desuden, som en proof-of-concept, for at vise bioapplication af functionalized UCNs i levende celler, er et lys-gated kanal protein (ChR2) manipuleret på cellens overflade til at regulere de cellulære funktioner ved mægle tilstrømningen af kation ioner (fx, Ca2 +) i cytoplasmaet27,28,29. Den vellykkede udtryk for ChR2 på membranen af HEK293 cellelinje bekræftes ved tilstedeværelsen af grøn fluorescerende proteiner (NGL) markør (Venus) ved hjælp af Konfokal mikroskopi (figur 5A). Derudover lokalisering af UCNs på N3-mærket cellemembranen er naturligvis visualiseret på cellens overflade (blå) efter 2 h inkubation, som kan tilskrives, at de resterende DBCO grupper på overfladen af UCNs nanostrukturer farves med en indeholder-holdige fluorescerende farvestof (5-carboxytetramethylrhodamine-indeholder, Rhod-N3) gennem kobberfrit bioorthogonal Klik reaktion. Derudover NIR lys (808 nm) er udnyttet til at bestråle den lokaliserede UCNs nanotransducer på celleoverfladen, der kan aktivereden lys-gated ChR2 kanal proteiner og lette Ca2 + -ion tilstrømning på tværs af membranen. Som vist i figur 5B, en betydelig stigning af røde fluorescens i cytosol er observeret af en standard fluorescerende Ca2 + indikator, Rhod-3 AM, mens ingen tilsyneladende fluorescens tilvækst registreres i mangel af lys belysning. Den kvantitative analysen af flowcytometri (FCM) i figur 5 c viser også, at sådanne NIR-lys-responderende fluorescens ekstraudstyr er lys-dosis-afhængige, tyder klart på at de biokompatible DBCO-UCNs kan effektivt regulerer den kanal proteiner på cellemembranen ved NIR-lys bestråling.

I sammendrag, baseret på de ovennævnte resultater, vi forventer, at denne protokol ikke kun giver detaljerede eksperimentelle procedurer for høj temperatur udfældes sammen syntese af kerne-shell UCNs nanostrukturer, men også udvikler en enkel teknik for biokompatible overflade ændring af UCNs for yderligere NIR lys-medieret photoactivation i biologisk applikationer. Vigtigere, baseret på rationalet bag denne metode, af UCNs optiske egenskaber kan yderligere reguleres af doping forskellige slags lanthanide ioner (fxErbium (III), Holmium (III), osv.) i krystaller til udsender UV, grøn, rød, og NIR lys på 808 nm lys bestråling30. Derudover kan UCNs overflade også ændres med forskellige funktionelle grupper (f.eks.peptid, protein, lipid, målretning ligand, etc.) for yderligere biomedicinsk programmer31,32. Disse fordele gør biokompatible UCNs nanomateriale en egnet kandidat til studiet af fysiologiske processer in vitro og i vivo, og kan således fungere som personlig Nanomedicin til klinisk theranostics i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at videregive.

Acknowledgements

Dette arbejde blev delvist støttet af NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) og (RG 35/15) tildelt i Nanyang Technological University, Singapore og National Natural Science Foundation i Kina (NSFC) (nr. 51628201).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octadecene Sigma Aldrich O806 Technical grade
oleic acid Sigma Aldrich 364525 Technical grade
Methanol Fisher Scientific A412 Technical grade
Ethanol Fisher Scientific A405 Technical grade
Acetone Fisher Scientific A18 Technical grade
Hexane Sigma Aldrich H292 Technical grade
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 367702 99.9% trace metals basis
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 325805 99.9% trace metals basis
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326011 99.9% trace metals basis
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326046 99.9% trace metals basis
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 reagent grade
Ammonium fluoride (NH4F) Sigma Aldrich 338869 ACS reagent
Hydrogen chloride (HCl) Fisher Scientific A144 reagent grade
polyacrylic acid (PAA) Sigma Aldrich 323667 average Mw 1800
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma Aldrich 54802 ACS reagent
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E7750 commercial grade
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) Sigma Aldrich 761540 ACS reagent
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma Aldrich D125806 ACS reagent
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231 Technical grade
HEK293 cell line ATCC CRL-1573 human embryonic kidney
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051 ACS reagent
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 10,000 U/mL
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) Addgene 15753 Plasmid sent as bacteria in agar stab
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11965092 High glucose
opti-Modified Eagle Medium (MEM) Thermo Fisher 51985034 Reduced Serum Media
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000015 Lipid-Based Transfection
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) Sigma Aldrich A7605 ACS reagent
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher 25200056 Phenol red
Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit Thermo Fisher R10145 Fluorescence dye
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) Sigma Aldrich 760757 Azide-fluor 545
Confical dish ibidi GmbH 81158 Glass Bottom, 35 mm
50 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 Polypropylene
15 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Polypropylene
1.5 ml conical microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 Polypropylene
Phenylmethyl silicone oil Clearco Products 63148-52-7 Less than 320 degrees Celsius
Glass thermometer GH Zeal L0111/10 From -10 to 360 degrees Celsius
12-well plate Sigma Aldrich Z707775 Polystyrene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10, (12), 968-973 (2011).
  2. Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543, (7644), 229-233 (2017).
  3. Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28, (24), 3987-4011 (2016).
  4. Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
  5. Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136, (6), 2248-2251 (2014).
  6. Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53, (4), 1012-1016 (2014).
  7. Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44, (6), 1416-1448 (2015).
  8. Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3, (5), 317-330 (2013).
  9. Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51, (25), 6121-6125 (2012).
  10. Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
  11. Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6, (8), 560-564 (2012).
  12. Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22, (30), 3266-3271 (2010).
  13. Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4, (1), 129-154 (2014).
  14. Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44, (6), 1346-1378 (2015).
  15. Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25, (28), 3758-3779 (2013).
  16. Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1608-1634 (2015).
  17. Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
  18. Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54, (27), 7915-7919 (2015).
  19. Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11, (2), 835-840 (2011).
  20. Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44, (6), 1379-1415 (2015).
  21. Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44, (6), 1318-1330 (2015).
  22. Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9, (7), 1634-1644 (2014).
  23. Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1680-1713 (2015).
  24. Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51, (13), 3125-3129 (2012).
  25. Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1526-1560 (2015).
  26. Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45, (36), 14101-14108 (2016).
  27. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  28. Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56, (11), 3031-3035 (2017).
  29. Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (19), 5173-5178 (2016).
  30. Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47, (10), 3052-3060 (2014).
  31. Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9, (11), 3698-3718 (2017).
  32. Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6, (13), 2439-2457 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics