Synthèse de noyau-enveloppe dopé Lanthanide Upconversion nanocristaux pour des Applications cellulaires

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Un protocole est présenté pour la synthèse de nanocristaux coeur-écorce dopé lanthanide upconversion (UCNs) et leurs applications cellulaires pour la régulation des protéines canaux à lumière éclairage de proche infrarouge (NIR).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ai, X., Lyu, L., Mu, J., Hu, M., Wang, Z., Xing, B. Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications. J. Vis. Exp. (129), e56416, doi:10.3791/56416 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lanthanide dopé upconversion nanocristaux (UCNs) ont attiré beaucoup d’attention ces dernières années, selon leurs propriétés optiques prometteuses et contrôlables, qui permettent l’absorption de lumière de proche infrarouge (NIR) et peuvent ensuite convertir en multiplexage des émissions qui s’étendent sur un large éventail de régions de l’UV à la visible pour le RNI. Cet article présente les procédures expérimentales détaillées pour la synthèse de la coprécipitation de haute température du noyau-enveloppe UCNs qui intègrent des ions lanthanides différents dans les nanocristaux pour convertir efficacement excitation de NIR perméables aux tissus profonds (808 nm) dans une forte émission de bleue à 480 nm. En contrôlant la modification de surface avec polymère biocompatible (acide polyacrylique, AAP), l’UCNs préparés comme acquiert grande solubilité dans les solutions tampons. Les nanocristaux hydrophiles sont davantage fonctionnalisés avec des ligands spécifiques (cyclooctyne de dibenzyle, DBCO) pour la localisation sur la membrane cellulaire. À la lumière NIR (808 nm) irradiation, l’émission d’upconvertis bleu peut activer efficacement la protéine canal lumière bloquées sur la membrane cellulaire et réglementer spécifiquement l’afflux du cation (par exemple, Ca2 +) dans le cytoplasme. Ce protocole prévoit une méthode possible pour la synthèse du noyau-enveloppe dopé lanthanide UCNs et ultérieure biocompatible modification de surface pour des applications cellulaires plus.

Introduction

Ces dernières années, dopée lanthanide upconversion nanocristaux (UCNs) ont été largement utilisées comme alternative aux colorants organiques conventionnels et de points quantiques dans des applications biomédicales, qui reposent essentiellement sur leurs remarquables propriétés chimiques et optiques, y compris grande biocompatibilité, résistance élevée aux photobleaching et bande passante étroite d’émission1,2,3. Plus important encore, ils peuvent servir comme un nanotransducer prometteur avec tissu excellente pénétration profondeur in vivo pour convertir le proche infrarouge (NIR) excitation dans un large éventail d’émissions provenant de l’UV, le visible et régions NIR par un multi-photon processus de conversion ascendante4,5. Ces propriétés uniques font dopé lanthanide UCNs constituer un vecteur particulièrement prometteur pour la détection biologique, imagerie biomédicale et maladies théranostic6,7,8.

Les composantes générales de UCNs reposent essentiellement sur les ions lanthanides dopé dans la matrice hôte isolant contenant une substance sensibilisante (p. ex., Yb3 +, Nd3 +) et un activateur (p. ex., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) dans le cristal homogènement9. L’émission optique différente depuis les nanocristaux est attribuée à la transition électronique localisée dans les 4 orbitalesf des dopants lanthanide en raison de leur échelle arrangée énergie niveau10. Par conséquent, il est essentiel de contrôler avec précision la taille et la morphologie des UCNs synthétisés avec dopants multicomposants lanthanide. De plein droit, certaines méthodes prometteuses ont été bien établies pour la préparation de lanthanide dopé UCNs, y compris la décomposition thermique haute température coprécipitation, synthèse hydrothermale, traitement de sol-gel, etc.11 , 12 , 13 parmi ces approches, la méthode de coprécipitation haute température est une des stratégies les plus populaires et pratiques pour la synthèse de UCNs, qui peuvent être strictement contrôlés pour préparer des nanocristaux de qualité désiré avec forme uniforme et distribution de la taille dans un temps de réaction relativement court et faible coût,14. Toutefois, la plupart des nanostructures synthétisés par cette méthode sont principalement plafonnées avec des ligands hydrophobes tels que l’acide oléique et oleylamine, qui empêchent généralement leur bioapplication supplémentaire en raison de la limited de solubilité de ligand hydrophobe en solution aqueuse 15. par conséquent, il est nécessaire d’effectuer des techniques de modification de surface convenable pour préparer UCNs biocompatibles en applications biologiques in vitro et in vivo.

Ici, nous présentons la procédure expérimentale détaillée pour la synthèse de nanostructures UCNs noyau-enveloppe par le biais de la méthode de coprécipitation haute température et une technique de modification possible pour fonctionnaliser polymère biocompatible UCNs surface pour Outre les applications cellulaires. Cette nanoplatform UCNs incorpore trois ions lanthanides (Yb3 +, Nd3 +et Tm3 +) dans les nanocristaux d’acquérir forte émission bleue (~ 480 nm) à l’excitation lumineuse NIR à 808 nm, ce qui assure une plus grande profondeur de pénétration dans tissus vivants. Il est bien connu que Nd3 +-UCNs dopés affichent les effets d’absorption et une surchauffe eau réduite à cette fenêtre spectrale (808 nm) par rapport aux classiques UCNs à 980 nm irradiation16,17, 18. en outre, pour pouvoir utiliser les UCNs dans les systèmes biologiques, les ligands hydrophobes (acide oléique) sur la surface de UCNs sont tout d’abord enlevés par sonication dans la solution acide19. Puis les UCNs exempt de ligand sont modifiées ultérieurement avec un polymère biocompatible (acide polyacrylique, AAP) pour acquérir la grande solubilité dans les solutions aqueuses de20. En outre, comme une preuve de concept dans les applications cellulaires, les UCNs hydrophiles sont davantage fonctionnalisés avec des ligands moléculaires (cyclooctyne de dibenzyle, DBCO) pour la localisation spécifique sur la N3-membrane de la cellule contenant le tag. À la lumière NIR (808 nm) irradiation, l’émission d’upconvertis bleu à 480 nm peut efficacement activer une protéine canal de lumière-dépendants, channelrhodopsins-2 (ChR2), sur la surface de cellules et ainsi faciliter l’afflux du cation (par exemple, ions Ca2 + ) à travers la membrane des cellules vivantes.

Ce protocole vidéo fournit une méthodologie possible pour dopé lanthanide UCNs synthèse, la modification des surfaces biocompatible et UCNs bioapplication dans les cellules vivantes. Toutes les différences dans les techniques de synthèse et les réactifs chimiques utilisés dans la croissance de nanocristaux semiconducteurs influeront sur les spectres de luminescence (UCL) taille upconversion, la morphologie et la distribution des nanostructures de UCNs final utilisé dans des expériences de cellule. Ce protocole vidéo détaillé est prête à aider les nouveaux chercheurs dans ce domaine pour améliorer la reproductibilité des UCNs avec la méthode de coprécipitation haute température et éviter les erreurs les plus communes dans la modification des surfaces biocompatible UCNs pour d’autres applications cellulaires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

attention : veuillez consulter toutes les fiches signalétiques (FS) avant utilisation. Copiez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lorsque vous effectuez la synthèse de UCNs à une température élevée (~ 290 ° C), y compris l’utilisation des contrôles d’ingénierie (hotte aspirante) et des équipements de protection individuelle (par exemple, des lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pleine longueur pantalons et chaussures fermées).

1. synthèse de Chana 4 : Yb/Tm/DN (30/0.5/1%) @NaYF 4 : nanocristaux coeur-écorce Nd(20%)

  1. synthèse de Chana 4 : nanostructure core Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)
    1. Préparation des RE (CH 3 CO 2) 3, solution mère de NaOH, NH 4 F méthanol
      Remarque : les terres rares (RE) des ions lanthanides comprennent l’Yttrium (Y), Ytterbium (Yb), Thulium (Tm) et néodyme (Nd).
      1. Dissoudre 500 mg d’acétate de Yttrium(III) hydrate dans 5 mL de méthanol (100 mg/mL), 250 mg hydrate acétate Ytterbium (III) dans 5 mL de méthanol (50 mg/mL), 10 mg hydrate acétate Thulium (III) dans 1 mL de méthanol (10 mg/mL) et 10 mg hydrate d’acétate de néodyme (III) dans 1 mL metha Nol (10 mg/mL) en flacons de verre avec un bain de nettoyage à ultrasons pour 2 min.
      2. Combiner 400 mg NaOH dans un tube à centrifuger 50 mL et 20 mL de méthanol avec bain de nettoyage à ultrasons pour préparer la solution mère de NaOH (20 mg/mL).
      3. Combiner 600 mg NH 4 F dans un tube à centrifuger 50 mL et 30 mL de méthanol avec bain de nettoyage à ultrasons pour préparer la solution mère de NH 4 F (20 mg/mL).
        NOTE : Placer la solution mère de complexes de lanthanides, NaOH et NH 4 F dans des flacons de verre, sceller avec du parafilm et les stocker dans un réfrigérateur à ~ 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Les solutions mères de méthanol préparés sont remplacées une fois toutes les 2 semaines.
    2. Préparation de Chana 4 : Yb/Tm/Nd core nanostructure
      1. Pipetter, dans un ballon jaugé de 50 mL trois-cou, 3 mL d’acide oléique et 7 mL de 1-octadecene.
      2. Solution
      3. combiner 1.089 mL de la solution de stock de 3 (CH 3 CO 2) de Y, 0,608 mL de la solution de stock de 3 (CH 3 CO 2) de Yb, 83,6 µL du stock 3 Tm (CH 3 CO 2), et 128,5 µL de la solution mère de 3 ème (CH 3 CO 2) dans la fiole.
      4. Mettre en place un thermomètre (0 - 360 ° C plage) dans la fiole et laisser à son extrémité en contact la solution. Placer la fiole dans un récipient en verre avec de l’huile de silicone phenylmethyl.
      5. Chauffer la solution à 100 ° C avec une plaque chauffante pour évaporer le méthanol. Raccorder le ballon à une ligne de Schlenk une tubulure double vide/gaz pour éliminer le méthanol résiduel et garder le mélange réactionnel sous vide pendant 2-3 min tout en remuant.
      6. Augmenter la température à 150 ° C et maintenir cette température pendant 60 min. maintenir une vitesse d’agitation de 700 tr/min pendant la synthèse de
      7. .
        Remarque : Définissez un modéré en remuant la vitesse pour éviter les éclaboussures de la solution.
      8. Arrêter la plaque chauffante et maintenir le flacon à température ambiante pour permettre à la solution refroidir lentement.
        Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
      9. Solution-mère
      10. mélanger 2 mL de NaOH-méthanol et 2,965 mL de NH 4 solution mère F-méthanol dans un tube à centrifuger 15 mL. Serrer le tube avec sa casquette et mélanger la solution puissante Vortexer pendant 5 s.
      11. Ajouter le mélange de F 4 NaOH-NH lentement dans le ballon par une pipette de verre pendant 5 min
      12. Augmenter la température du mélange à 50 ° C et maintenir cette température pendant 30 min.
        Remarque : Réglez la température à pas plus de 50 ° C, car la température élevée favorisera crystal nucléation et croissance.
      13. Augmenter la température (~ 100 ° C) à évaporer le méthanol et raccorder le ballon à une ligne de Schlenk une tubulure double vide/gaz pour éliminer le méthanol résiduel et garder le mélange réactionnel sous vide pendant 2-3 min.
      14. Passer de la position du robinet pour remplir la fiole avec de l’azote.
      15. Augmentation de la température à 290 ° C, à une vitesse de chauffage de ~ 5 ° C/min. Gardez le mélange réactionnel à 290 ° C pendant 1,5 h.
      16. Arrêter la plaque chauffante et enlever le ballon pour permettre le mélange réactionnel se refroidir lentement à température ambiante en agitant.
        ATTENTION : Soyez prudent de la plaque de cuisson à température élevée (> 400 ° C) pour éviter de graves brûlures au contact de la peau.
      17. Transférer le mélange dans le flacon dans un tube à centrifuger 50 mL. Rincer le ballon avec 30 mL d’éthanol et transvaser la solution dans le tube à centrifuger.
      18. Centrifuger le produit à 4 000 × g pendant 8 min à la température ambiante et éliminer le surnageant.
      19. Ajouter 10 mL d’hexane pour le tube à centrifuger et re-disperser le produit avec la sonication (60 kHz, 240 W) pendant 2 min.
      20. Ajouter 30 mL d’éthanol dans le tube. Tournez en bas du produit à 4 000 × g pendant 8 min et ensuite éliminer le surnageant.
      21. Re-disperse les produits solides au fond du tube à centrifuger avec 5 mL d’hexane. Conserver la solution dans un réfrigérateur à 4 ° C pour une prochaine étape.
        Remarque : L’émission de conversion ascendante de noyau-enveloppe UCNs est testée en irradiant les solutions avec un laser à 808 nm (2 W).
  2. Préparation de Chana 4 : Yb/Tm/DN (30/0.5/1%) @NaYF 4 : nanocristaux coeur-écorce Nd(20%)
    1. combiner 3 mL d’acide oléique et 7 mL de 1-octadecene dans un ballon jaugé de 50 mL trois-cou. Ajouter 1,082 mL de la solution Y (CH 3 CO 2) 3 et 2,87 mL de la solution mère de 3 ème (CH 3 CO 2) dans la fiole.
    2. Ajouter la noyau obtenu nanostructure (80 mg dans 5 mL d’hexane de l’étape 1.1.2.18) dans le ballon tout en délayant.
    3. Mettre en place un thermomètre (0 - 360 ° C plage) dans la fiole et toucher la pointe du mélange. Placer la fiole dans un récipient en verre avec de l’huile de silicone phenylmethyl.
    4. Chauffer le mélange à 100 ° C sur le dessus de la plaque chauffante pour évaporer le méthanol et l’hexane. Raccorder le ballon à une ligne de Schlenk une tubulure double vide/gaz pour enlever le solvant résiduel et garder le mélange réactionnel sous vide pendant 2-3 min tout en remuant.
    5. Augmenter la température à 150 ° C et le maintenir pendant 60 min. maintenir la vitesse d’agitation à 700 tr/min dans la synthèse.
      Remarque : Définissez un modéré en remuant la vitesse pour éviter les éclaboussures de la solution.
    6. Arrêter la plaque chauffante et enlever le ballon afin de laisser la solution refroidir lentement à température ambiante.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
    7. Solution-mère
    8. pipette 2 mL de NaOH-méthanol et 2,965 mL de NH 4 solution mère F-méthanol dans un tube à centrifuger 15 mL. Serrer le tube avec sa casquette et mélanger la solution puissante Vortexer pendant 5 s.
    9. Ajouter le mélange dans le ballon par une pipette de verre lentement pendant 5 min
    10. Augmenter la température du mélange à 50 ° C et le maintenir à 50 ° C pendant 30 min.
      Remarque : Réglez la température ne dépasse pas 50 ° C, car la température élevée favorisera crystal nucléation et croissance.
    11. Augmenter la température (~ 100 ° C) à évaporer le méthanol et raccorder le ballon à une ligne de Schlenk une tubulure double vide/gaz pour éliminer le méthanol résiduel, gardant le mélange réactionnel sous vide pendant 2-3 min.
    12. Passer de la position du robinet pour remplir la fiole avec de l’azote.
    13. Augmentation de la température à 290 ° C à une vitesse de chauffage de ~ 5 ° C/min. Gardez le mélange réactionnel à 290 ° C pendant 1,5 h.
    14. Arrêter la plaque chauffante et enlever le ballon pour permettre le mélange réactionnel se refroidir lentement à température ambiante en agitant.
      ATTENTION : Soyez prudent de la plaque de cuisson à température élevée (> 400 ° C) pour éviter de graves brûlures au contact de la peau.
    15. Transférer le mélange dans le flacon dans un tube à centrifuger 50 mL. Rincer le ballon avec 30 mL d’éthanol et transvaser la solution dans le tube à centrifuger.
    16. Centrifuger le produit à 4 000 × g pendant 8 min à la température ambiante et éliminer le surnageant.
    17. Ajouter 10 mL d’hexane pour le tube à centrifuger et re-disperser le produit avec la sonication (60 kHz, 240 W) pendant 2 min.
    18. Ajouter 30 mL d’éthanol dans le tube. Tournez en bas du produit à 4 000 × g pendant 8 min et ensuite éliminer le surnageant.
    19. Re-disperse les produits solides au fond du tube à centrifuger avec 5 mL d’hexane. Conserver la solution dans un réfrigérateur à ~ 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
      Remarque : L’émission de conversion ascendante de noyau-enveloppe UCNs est testée en irradiant les solutions avec un laser à 808 nm (2 W).

2. Synthèse de Nanostructures de UCNs Biocompatible

  1. préparation de ligand-free UCNs NANOPARTICULE
    1. combiner 30 mL d’éthanol avec la préparés comme diablotin oléate UCNs solution (point 1.2.18 dans un tube à centrifuger 50 mL). Centrifuger le mélange à 4 000 × g pendant 8 min à la température ambiante et éliminer le surnageant.
    2. Combiner 10 mL de solution aqueuse acide (pH = 4) ajusté par HCl (0,1 M) avec le précipité dans le tube à centrifuger de 50 mL et dissoudre le précipité par sonication (60 kHz, 240 W) pendant 30 min.
    3. Transfert flacon de la solution dans un verre avec vigoureux en remuant pendant 2 h.
    4. Extrait de la solution aqueuse avec 30 mL d’éther diéthylique pour éliminer l’acide oléique, répétez trois fois.
    5. Ajouter 10 mL d’eau dans les couches d’éther combinée avec agitant doucement.
    6. Recueillir l’humeur aqueuse phase ensemble (20 mL) et ajouter 20 mL d’acétone avec Vortex pendant 5 s.
    7. Spin down le produit à 35 000 × g pendant 10 min et puis jeter le surnageant. Dissoudre le précipité dans 2 mL d’eau.
  2. Préparation du polymère modifié UCNs (AAP-UCNs)
    1. combiner 200 mg d’acide polyacrylique (AAP, Mw = 1 800) avec 20 mL d’eau par sonication (60 kHz, 240 W) pendant 20 min. ajouter les susmentionnés UCNs exempt de ligand dans la solution de l’AAP avec un brassage vigoureux.
    2. Ajuster le pH à 7.4 en solution de NaOH (1 M) avec sonication (60 kHz, 240 W) pour 30 min. Gardez le mélange pendant 24 h à température ambiante en agitant.
    3. Recueillir le précipité par centrifugation à 35 000 × g pour 10 min. remettre en suspension le produit dans 10 mL d’eau par sonication (60 kHz, 240 W) pendant 5 min et centrifuger à nouveau à 35 000 × g pendant 10 min. Répétez cette étape trois fois.
    4. Re-disperser le produit dans l’eau 8 mL par sonication (60 kHz, 240 W) pour 5 min. conserver la solution dans un réfrigérateur à ~ 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  3. Préparation de fonctionnelle DBCO-UCNs NANOPARTICULE
    1. Spin vers le bas de la PAA@UCNs comme préparés (1 mg) par centrifugation à 35 000 × g pour 10 min. remettre en suspension le précipité dans 1 mL séchant DMF par sonication (60 kHz, 240 W) pendant 1 min et centrifuger à nouveau à 35 000 × g pendant 10 min. répéter cette étape deux fois.
    2. Dissoudre le précipité dans 200 µL de
    3. sec DMF dans un flacon en verre. Ajouter HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) et DIPEA (16 µL) dans le flacon avec agitateur magnétique pendant 24 h.
    4. Recueillir le produit par centrifugation à 35 000 × g pour 10 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension le précipité dans 1 mL de DMSO et centrifuger à nouveau à 35 000 × g pendant 10 min. Répétez cette opération trois fois.
    5. Disperser le produit dans le DMSO 0,2 mL et stocker dans un réfrigérateur à ~ 4 ° C avant utilisation.

3. BioApplications de DBCO-UCNs dans le règlement des canaux membranaires dans les cellules vivant

cellules
  1. Culture le HEK293 Dulbecco ' s Modified Eagle ' s moyen (DMEM) additionné de 10 % FBS, 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et maintenir dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO 2 à 37 cellules ° Seed C. 1 × 10 5 dans 1 mL DMEM/puits dans une plaque de 12 puits et rangez-le dans l’incubateur pendant 24 h.
  2. Combiner le plasmide (pCAGGS-ChR2-Vénus, 1 µg) avec le réactif de transfection P3000 (2 µL) à Eagle ' s médias essentiel Minimum (MEM) (100 µL) dans microcentrifuge tube A et ajouter le réactif de transfection (1,5 µL) dans MEM (100 µL) dans le tube B.
  3. Incuber le mélange des solutions dans des tubes A et B pendant 10 min à température ambiante.
  4. Combiner la solution dans le tube A et B avec 400 µL MEM. Laver les cellules avec 1 mL sans sérum DMEM deux fois.
  5. Ajouter le mélange de transfection de 600 µL à chaque puits d’une plaque de 12 puits et incuber les cellules à l’incubateur de 37 ° C pendant 4 h. Retirer le support et laver deux fois avec 1 mL DMEM.
  6. Ajouter 1 mL DMEM contenant 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM dans le DMSO) dans le puits et le conserver dans l’incubateur pour 2jours.
  7. Enlever le milieu et laver une fois avec 1 mL de PBS. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) dans chaque puits de la plaque de 12 puits et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules ont détaché (~ 2 min). Re-culture de cellules dans un plat confocal à 1 × 10 5 cellules/puits dans 1 mL DMEM pour la nuit.
  8. Enlever le milieu et ajouter 1 mL DMEM frais avec 2 µL DBCO-UCNs (50 mg/mL) dans le plat pendant 2 h à 37 ° C. Pour l’imagerie confocale, laver deux fois avec DMEM, les cellules et ajouter 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) pour 30 min.
  9. Pour l’analyse de calcium intracellulaire, incuber les cellules avec le mélange de 1 µL Rhod-3 AM (10 mM), 10 µL probénécide (250 mM) et 10 µL de tampon de chargement (Pluronique surfactant polyols,0.1% p/v)) dans le milieu DMEM 1 mL pendant 30 min dans le noir.
  10. Laver les cellules avec DMEM sans sérum et irradier à 808 nm NIR à la dose de 0,8 W/cm 2 pour 20 min (5 min de pause après 5 min illumination).
  11. Enregistrer les résultats de l’imagerie sur microscope confocal (source laser : laser à 561 nm ; intervalle : détecteur : 610/75 nm ; objectif : 100 x 1,4 NA oil, temps d’exposition : 100 ms). Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) dans chaque puits et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules ont détaché (~ 2 min). Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS pour analyse en cytométrie en flux (FCM) flux (Ex : 561 nm, Em : 582/15 nm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le processus de synthèse schématique du noyau-enveloppe dopé lanthanide UCNs sont indiquées dans la Figure 1 et Figure 2. La microscopie électronique à transmission (TEM) et les images de microscopie électronique (HRTEM) transmission à haute résolution de nanostructures UCNs core et core-shell ont été recueillis respectivement (Figure 1). Les ligand-free UCNs sont préparés en enlevant l’acide oléique hydrophobe sur la surface du UCNs en solution acide et modifiés avec des polymères hydrophiles (AAP). Puis l’AAP-UCNs diablotin COOH sont fonctionnalisés avec DBCO-NH2 par une réaction de condensation amide. Les images TEM de ligand UCNs AAP-UCNs et sans DBCO-UCNs sont indiquées à la Figure 2. La diffusion dynamique de la lumière (DLS), les résultats potentiel zêta et les spectres de luminescence (UCL) conversion ascendante de DBCO-UCNs sont recueillis respectivement (Figure 3). La transformée de fourier (FTIR) spectroscopie infrarouge DBCO-NH2, AAP-UCNs et DBCO-UCNs sont présentés dans la Figure 4.

Dans des expériences de cellules, l’expression réussie de ChR2 sur la membrane cellulaire est confirmée par le marqueur évident protéine fluorescente verte (GFP) (Venus) à l’aide de la microscopie confocale (Figure 5 a). Les DBCO-UCNs sont spécifiquement localisées à la surface des cellules HEK293 ChR2 exprimant par clic réaction (Figure 5 a). L’analyse de calcium intracellulaire lors de la stimulation lumineuse NIR est également confirmé par confocale imagerie et écoulement cytometry (FCM) basée sur un standard Ca2 + indicateur fluorescent, Rhod-3 AM (Figure 5 b, C).

Figure 1
Figure 1. Synthèse du noyau-enveloppe dopé lanthanide UCNs. (A) illustration schématique du processus de synthèse de UCNs. (B, C) TEM du core (Chana4: Yb/Tm/Nd (30/0,5/1 %)) et coeur-écorce (Chana4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostructures. Barre d’échelle : 50 nm. En médaillon : HRTEM images de nanostructures UCNs core et core-shell. Barre d’échelle : 5 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Synthèse de nanostructures UCNs fonctionnelles. (A) illustration schématique du processus de synthèse de ligands libres UCNs, AAP-UCNs et DBCO-UCNs, respectivement. (B, C, D) Images TEM de ligand UCNs AAP-UCNs et sans DBCO-UCNs. Echelle : 100 nm dans le groupe B et 50 nm dans le panneau C/D. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. La spectroscopie FTIR DBCO-NH2, AAP-UCNs et DBCO-UCNs, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Caractérisation des DBCO-UCNs dans la solution tampon. (A) les résultats de listes de distribution de DBCO-UCNs. (B) résultats potentiels de Zeta d’AAP-UCNs et DBCO-UCNs (moyenne ± écart-type). (C) les spectres UCL de UCNs core et core-shell dans l’hexane (1 mg/mL), AAP-UCNs et DBCO-UCNs dans l’eau (1 mg/mL) séparément (Ex : 808 nm). En médaillon : luminescence photo UCNs avec l’irradiation 808 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Des applications cellulaires de DBCO-UCNs sur NIR lumière éclairage. (A) l’imagerie confocale exprimant le ChR2 N3-tag cellules HEK293 incubées avec DBCO-UCNs (en haut) et l’AAP-UCNs (en bas) pendant 2 h à 100 µg/mL. Vert : ChR2-Venus (Ex : 488 nm, Em : 530/50 nm), bleu : UCNs (Ex : 543 nm, Em : 580/50 nm). Barre d’échelle : 20 µm. (B) cellulaire Ca2 + imagerie avec Rhod-3 h avant et après irradiation NIR-légère (0,8 W/cm2 pour 20 min). Ex : 561 nm, Em : 610/75 nm. Barre d’échelle : 10 µm. (C) FCM Quantitative analyse de l’intensité de fluorescence normalisée de cellulaire Ca2 + avec illumination de différentes doses légères (moyenne ± écart-type). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cet article présente une méthode pour la synthèse de nanocristaux coeur-écorce dopé lanthanide upconversion (UCNs) et leur modification de surface avec les groupements fonctionnels pour des applications cellulaires. Ce nanomatériau roman possède des propriétés optiques remarquables, qui peuvent émettre des UV et lumière visible à excitation lumineuse NIR grâce à un processus de conversion ascendante multiphotonique. Dans le présent protocole, les noyau-enveloppe UCNs nanostructures (Chana4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) sont préparés selon une méthode de coprécipitation haute température dans un mélange d’acide oléique et 1-octadecene. Images TEM démontrent la morphologie de ces principaux et noyau-enveloppe nanocristaux est sphériques en forme avec un diamètre de 20 nm à 30 nm respectivement, ce qui implique une épaisseur d’environ 5 nm (Figure 1). L’architecture de noyau-enveloppe est aussi révélée par les images TEM de haute résolution dans l’encart de la Figure 1, qui montre des franges treillis semblable avec celle de la carotte UCNs nanostructures. En outre, un typique d-espacement autour de 0,52 nm s’accorde bien avec l’espacement de l’avion (100) de β-Chana4, indiquant que tous les nanostructures UCNs en core et core-shell sont hautement cristallisés et conserver la même structure cristalline. Par ailleurs, le spectre de luminescence upconversion démontre les nanocristaux coeur-écorce émettent forte émission bleue avec une intensité bien supérieure à 480 nm que les particules de base sur l’excitation avec un laser à diode pour obtenir une onde continue à 808 nm ( Figure 4). L’émission accrue de noyau-enveloppe UCNs est attribuée à la surface supprimée trempe effet de Yb3 +, Nd3 +et les ions Tm3 + qui sont incorporées dans la couche intérieure du coeur-écorce nanocristaux21. Ces résultats confirment le succès de la préparation de lanthanide dopé au noyau-enveloppe UCNs nanomatériau dans cette proposition.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans la synthèse de la coprécipitation de haute température de ces nanocristaux. Tout d’abord, le volume supplémentaire de solution mère d’ion lanthanide dans le processus de synthèse des UCNs core et core-shell devrait être strictement contrôlé (étape 1.1.2.2). Haut niveau dopage ions se traduira par une croix-relaxation liée à la concentration ou la trempe d’effet en raison de l’interaction ion-ion dans les nanocristaux21. En second lieu, la température doit être maintenue à moins de 50 ° C pour assurer la nucléation complète après NaOH et NH4F ont été ajoutés dans le ballon (étape 1.1.2.9 et étape 1.2.9), qui est essentiel pour assurer une morphologie uniforme en favorisant la croissance des cristaux basée sur Ostwald maturation des effets22. En troisième lieu, la taille et les propriétés optiques des nanoparticules de noyau-enveloppe peuvent être principalement contrôlées en ajustant la quantité d’ions lanthanides dans les précurseurs de la coque (Y3 + et Nd3 +) et les particules préparés comme base (étape 1.2.1) de. Il est aussi important que la morphologie des nanocristaux coeur-écorce est basée sur la croissance de la coquille anisotrope de différents types de particules du noyau, qui est utile pour moduler les émissions optiques différentes de UCNs à NIR éclairage léger23.

En outre, il est aussi un défi considérable pour convertir efficacement UCNs hydrophobes hydrophile UCNs nanoparticules pour autres applications biologiques. Bien que certaines méthodes ont été signalés afin d’améliorer la biocompatibilité des UCNs dans une solution tampon, y compris l’échange de ligand, couche de silice, oxydation de ligand oléate-capsulage, etc., ils souffrent d’agrégation inattendue, beaucoup de temps, et procédures complexes24,25,26. Dans les présentes, nous développons une approche simple pour obtenir l’eau susceptible de dispersion exempt de ligand UCNs nanostructures en enlevant l’acide oléique sur la surface du diablotin oléate UCNs dans une solution acide/eau (pH = 4). La valeur du pH ajustée par HCl est essentielle pour contrôler les rejets de ligand oléate et d’affecter la luminescence des UCNs. Plus important encore, un polymère biocompatible (acide polyacrylique, AAP) avec un grand nombre de carboxylique groupes peuvent lier avec les ions lanthanides sur la surface de UCNs par interaction de coordination, qui fournira plus de groupes fonctionnels pour produit chimique supplémentaire modification. Par conséquent, nous fonctionnaliser les fractions de2 DBCO-NH sur la surface de UCNs pour plus spécifique N3-localisation de la membrane de la cellule contenant le tag. Les images TEM de ligand UCNs, AAP-UCNs et sans DBCO-UCNs Figure 2 démontrent la grande dispersion et la solubilité de ces nanostructures dans une solution tampon après modification de surface. En outre, spectroscopie de transformée de fourier transform infrared (FTIR) a été réalisée afin de caractériser la modification de la surface des groupes DBCO sur UCNs nanoplatform. Comme illustré à la Figure 3, la bande forte autour de 3 430 cm-1 est due à la vibration d’élongation H-O des groupes carboxyle, et les deux bandes centrées à 1550 cm-1 et cm 1458-1 sont associés à l’asymétrique et modes de vibration élongation symétrique des anions carboxylate, indiquant le revêtement réussi des polymères contenant du groupe par COOH (AAP) sur la surface UCNP. Après réaction avec les moitiés de DBCO-NH2 , une bande évidente au cm 1 635-1 est présente basé sur le C = C, qui s’étend de vibration sur l’anneau aromatique de groupes DBCO, qui concorde avec le spectre FTIR des portions2 DBCO-NH en même nombre d’onde. En outre, le résultat de la diffusion de la lumière dynamique (DLS) indique le diamètre hydrodynamique de DBCO-UCNs en solution aqueuse (96.4±10.4 nm) (Figure 4 a). Les résultats de potentiel zêta indiquent également la surface négative des AAP-UCNs (-26.1±4.4 mV) et DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) respectivement (Figure 4 b), ce qui démontre la grande solubilité et la stabilité de ces nanostructures dans la solution tampon. De plus, les spectres de l’UCL d’AAP-UCNs et DBCO-UCNs démontrent qu’ils peuvent émettre similaires upconvertis emission à 480 nm à 808 nm lumière l’irradiation (Figure 4), qui peut être utilisé pour plus amples NIR induite par la lumière photoactivation biologique systèmes.

En outre, comme une preuve de concept, afin de démontrer la bioapplication de UCNs fonctionnalisés dans les cellules vivantes, une protéine canal de lumière-dépendants (ChR2) est conçue sur la surface des cellules pour réguler les fonctions cellulaires par médiation l’influx des ions cations (par exemple, Ca2 +) dans le cytoplasme27,28,29. L’expression réussie de ChR2 sur la membrane de la lignée de cellules HEK293 est confirmée par la présence du marqueur de la protéine fluorescente verte (GFP) (Venus) à l’aide de la microscopie confocale (Figure 5 a). En outre, la localisation des UCNs sur la N3-tagged membrane cellulaire est évidemment visualisée sur la surface des cellules (bleue) après 2 h d’incubation, qui peut être attribuée au fait que les groupes DBCO résiduelles sur la surface des nanostructures UCNs sont tachées un colorant fluorescent contenant de l’azide (5-carboxytetramethylrhodamine-azide, Rhod-N3) par le biais de le bioorthogonal de cuivre-libre cliquez sur réaction. De plus, lumière NIR (808 nm) est utilisé pour irradier le nanotransducer UCNs localisée sur la surface des cellules, qui peut activerle ChR2 lumière-gated channel protéines et faciliter l’influx de Ca2 + ion à travers la membrane. Comme le montre la Figure 5 b, on observe une augmentation significative de la fluorescence rouge dans le cytosol par un indicateur2 + Ca fluorescent standard, Rhod-3 m, alors qu’aucun accroissement apparent de fluorescence n’est enregistré en l’absence d’éclairement lumineux. L’analyse de cytométrie en flux (FCM) de flux quantitatifs dans la Figure 5 montre également que ce NIR-lumière-sensible augmentation de la fluorescence est dose-dépendante de la lumière, ce qui semble indiquer clairement que les DBCO-UCNs biocompatibles peuvent réglementer efficacement le protéines de canal sur la membrane cellulaire lors de l’irradiation de lumière-NIR.

En résumé, d’après les résultats précités, nous prévoyons que le présent protocole fournit non seulement des procédures expérimentales détaillées pour la synthèse de la coprécipitation de haute température du noyau-enveloppe UCNs nanostructures, mais développe également un simple technique de modification de surface biocompatible de UCNs pour outre NIR de photoactivation à induite par la lumière dans des applications biologiques. Plus important encore, fondée sur la raison d’être de cette méthode, les propriétés optiques des UCNs plus réglable par dopage différents types d’ions lanthanides (p. ex., Erbium (III), (III) d’Holmium, etc.) dans les cristaux pour émettre des UV, vert, rouge, et Lumière sur 808 nm irradiation lumineuse30NIR. En outre, la surface UCNs peut être modifiée aussi avec divers groupes fonctionnels (p. ex., peptide, protéine, lipide, ciblant le ligand, etc.) pour les autres applications biomédicales31,32. Ces avantages font biocompatible UCNs nanomatériau un candidat approprié pour l’étude des processus physiologiques in vitro et in vivoet peuvent ainsi agir comme nanomédecine personnalisé pour théranostic clinique dans l’avenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nous n’avons rien à divulguer.

Acknowledgements

Ce travail a été partiellement soutenu par NTU-ACI-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) et (RG 35/15) décerné à Université technologique de Nanyang, Singapour et National Natural Science Foundation de Chine (NSFC) (n° 51628201).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octadecene Sigma Aldrich O806 Technical grade
oleic acid Sigma Aldrich 364525 Technical grade
Methanol Fisher Scientific A412 Technical grade
Ethanol Fisher Scientific A405 Technical grade
Acetone Fisher Scientific A18 Technical grade
Hexane Sigma Aldrich H292 Technical grade
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 367702 99.9% trace metals basis
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 325805 99.9% trace metals basis
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326011 99.9% trace metals basis
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326046 99.9% trace metals basis
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 reagent grade
Ammonium fluoride (NH4F) Sigma Aldrich 338869 ACS reagent
Hydrogen chloride (HCl) Fisher Scientific A144 reagent grade
polyacrylic acid (PAA) Sigma Aldrich 323667 average Mw 1800
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma Aldrich 54802 ACS reagent
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E7750 commercial grade
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) Sigma Aldrich 761540 ACS reagent
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma Aldrich D125806 ACS reagent
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231 Technical grade
HEK293 cell line ATCC CRL-1573 human embryonic kidney
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051 ACS reagent
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 10,000 U/mL
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) Addgene 15753 Plasmid sent as bacteria in agar stab
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11965092 High glucose
opti-Modified Eagle Medium (MEM) Thermo Fisher 51985034 Reduced Serum Media
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000015 Lipid-Based Transfection
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) Sigma Aldrich A7605 ACS reagent
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher 25200056 Phenol red
Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit Thermo Fisher R10145 Fluorescence dye
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) Sigma Aldrich 760757 Azide-fluor 545
Confical dish ibidi GmbH 81158 Glass Bottom, 35 mm
50 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 Polypropylene
15 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Polypropylene
1.5 ml conical microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 Polypropylene
Phenylmethyl silicone oil Clearco Products 63148-52-7 Less than 320 degrees Celsius
Glass thermometer GH Zeal L0111/10 From -10 to 360 degrees Celsius
12-well plate Sigma Aldrich Z707775 Polystyrene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10, (12), 968-973 (2011).
  2. Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543, (7644), 229-233 (2017).
  3. Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28, (24), 3987-4011 (2016).
  4. Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
  5. Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136, (6), 2248-2251 (2014).
  6. Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53, (4), 1012-1016 (2014).
  7. Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44, (6), 1416-1448 (2015).
  8. Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3, (5), 317-330 (2013).
  9. Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51, (25), 6121-6125 (2012).
  10. Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
  11. Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6, (8), 560-564 (2012).
  12. Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22, (30), 3266-3271 (2010).
  13. Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4, (1), 129-154 (2014).
  14. Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44, (6), 1346-1378 (2015).
  15. Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25, (28), 3758-3779 (2013).
  16. Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1608-1634 (2015).
  17. Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
  18. Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54, (27), 7915-7919 (2015).
  19. Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11, (2), 835-840 (2011).
  20. Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44, (6), 1379-1415 (2015).
  21. Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44, (6), 1318-1330 (2015).
  22. Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9, (7), 1634-1644 (2014).
  23. Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1680-1713 (2015).
  24. Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51, (13), 3125-3129 (2012).
  25. Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1526-1560 (2015).
  26. Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45, (36), 14101-14108 (2016).
  27. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  28. Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56, (11), 3031-3035 (2017).
  29. Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (19), 5173-5178 (2016).
  30. Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47, (10), 3052-3060 (2014).
  31. Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9, (11), 3698-3718 (2017).
  32. Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6, (13), 2439-2457 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics