إعداد الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية بالطرد المركزي الوترياتيون

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويصف هذا البروتوكول استعمال الوترييشن الطرد المركزي لفصل الخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في مراحل مختلفة من دورة الخلية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

القدرة على مزامنة الخلايا تم المركزية لتعزيز فهمنا لتنظيم دورة الخلية. وتشمل التقنيات الشائعة المستخدمة المصل الحرمان؛ المواد الكيميائية التي تعتقل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية؛ أو استخدام الانقسامية اهتزاز-إيقاف الذي يستغل التزامهم خفض. ومع ذلك، كل هذه لها عيوب. على سبيل المثال، يعمل المصل المجاعة جيدا للخلايا الطبيعية ولكنها أقل جيدا للخلايا السرطانية مع نقاط التفتيش دورة الخلية الشبهة بسبب فقدان القامع التنشيط أو الورم السرطاني. وبالمثل، يمكن السكان خلية المعالجة كيميائيا المرفأ الأضرار الناجمة عن المخدرات وإظهار التعديلات المتصلة بالإجهاد. هو أسلوب الذي تلتف هذه المشاكل كونتيرفلوو الوترياتيون الطرد المركزي (CCE)، حيث يتعرض الخلايا إلى قوتين متعارضتين وقوة الطرد المركزي وسرعة السوائل، مما يؤدي إلى انفصال الخلايا استناداً إلى حجم وكثافة. نظراً لتوسيع نطاق الخلايا المضي قدما من خلال الدورة عادة، يمكن استخدام مركز التعليم المستمر لفصل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. هنا نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للخلايا الأولية من سرطان الدم الليمفاوي الحاد. تحت الظروف المثلى، يمكن الحصول سكان أساسا نقية من الخلايا في المرحلة G1 وعدد سكانها مخصب بدرجة عالية من الخلايا في مراحل G2/M في الغلة ممتازة. هؤلاء السكان الخلية هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة دورة الخلية تعتمد على آليات عمل المخدرات السرطان والتطبيقات الأخرى. ونحن أيضا إظهار كيف تعديلات على إجراءات قياسية يمكن أن يسفر عن أداء دون المستوى الأمثل ومناقشة أوجه قصور الأسلوب. وينبغي تيسير المنهجية التفصيلية المقدمة التطبيق واستكشاف هذه التقنية إلى أنواع أخرى من الخلايا.

Introduction

الخلايا المستزرعة عادة تنمو بشكل غير متزامن وخلايا فردية موجودة في مختلف مراحل دورة الخلية. معرض متزامن بطبيعة الحال خلية دورات بعض الكائنات الحية أو يمكن أن تكون متزامنة بالمنبهات الفسيولوجية المحددة. على سبيل المثال، تقسيم الأنوية داخل plasmodia العملاقة من الوحل العفن بوليسيفالوم فيساروم في أزياء متزامنة عالية1، وخلايا الطحالب الخضراء كوادريكودا ديسموديسموس يمكن أن تكون متزامنة بالتناوب الضوء والظلام 2من فترات. في حين تقدم مثل هذه الكائنات سمات تجريبية فريدة من نوعها، أنها نموذج غير كاف تعقيدات خلايا الثدييات. القدرة على مزامنة مصطنع السكان خلية الثدييات قد المركزية لتعزيز فهمنا لتنظيم دورة الخلية والأساس الجزيئي لنقاط التفتيش دورة الخلية. وتشمل الأساليب الشائعة الحرمان المصل أو كتلة الكيميائية والإفراج أو استغلال الخصائص الفيزيائية3،4. انسحاب مصل غالباً ما يسبب الخلايا لدخول التتابع، وإعادة إضافة المصل تشجع عودة دورة الخلية في المرحلة G15. مثبطات الكيميائية تشمل عوامل مثل هيدروكسيوريا التي كتلة الخلايا عند حدود G1/S، thymidine الزائدة أو مثبطات ميكروتوبولي الذي عادة اعتقال الخلايا في3،م المرحلة4. وتشمل النهج التي تستغل الخصائص الفيزيائية الانقسامية اهتزاز-إيقاف التشغيل التي يمكن استخدامها لإثراء للخلايا الانقسامية لأنها ملتصقة أقل من الطور البيني خلايا6. ومع ذلك، جميع هذه التقنيات على العيوب المحتملة. على سبيل المثال، ليس كل أنواع الخلايا الحفاظ على استمرارية في عدم وجود مصل أو وجود مثبطات الكيميائية، والعائد من الخلايا بعد اهتزاز الانقسامية قبالة يقتصر دون المزامنة المسبقة مع مثبطات الانقسامية.

وباستثناء دورات الخلية الجنينية المبكرة، حيث تنخفض الخلايا تدريجيا في الحجم كما أنها تقسم7، معظم خلايا المضي قدما من خلال الدورة الخضوع لمراحل النمو وتصبح أكبر. يتم استغلال هذه الخاصية في أسلوب الطرد المركزي كونتيرفلوو الوترييشن (CCE)، التي يمكن استخدامها لفصل الخلايا التي تختلف في الحجم ومن ثم في دورة الخلية المرحلة8،9. خلال مركز التعليم المستمر، الخلايا تحت تأثير قوتين متعارضتين: قوة الطرد المركزي، الذي يدفع الخلايا بعيداً عن محور الدوران، وسرعة السائل (كونتيرفلوو)، الذي يحرك الخلايا اتجاه محور الدوران (الشكل 1). الخلايا في قاعة الوترياتيون التوصل إلى وضع توازن التي تتساوى فيها هذه القوات. هي العوامل الرئيسية لإملاء موقف التوازن قطر الخلية والكثافة. هو زيادة معدل الحل المخزن المؤقت التدفق وقوة السحب كونتيرفلوو تفوق قوة الطرد المركزي، وهو إنشاء توازن جديد، تسبب تغييرا في موقف خلايا داخل الدائرة. يتم إزاحة كافة الخلايا تجاه إنهاء الدائرة، أسفر عن أصغر منها ترك الدائرة الأولى، بينما الخلايا أكبر البقاء داخل الدائرة حتى يزداد بمعدل كونتيرفلوو بما فيه الكفاية لتشجيع الخروج. الخلايا الهروب من قاعة الوترييشن مع الزيادات المتتالية في سعر كونتيرفلوو يمكن جمعها في أجزاء محددة وكل جزء يحتوي على خلايا لزيادة أحجام تسلسلياً. بدلاً من إجراء الوترياتيون مع زيادات تدريجية في سعر كونتيرفلوو، انخفاضات متتالية في قوة الطرد المركزي بتقليل سرعة الطرد المركزي سيتم تحقيق نفس النتيجة. تتطلب عملية الوترياتيون الأمثل اعتماداً على نوع من الخلايا والوترياتيون المخزن المؤقت المستخدمة والأجهزة المحددة المستخدمة. معدل ترسب خلايا في هذه الظروف هو أفضل وصف لقانون ستوكس: SV = [د2(ρ-ρفم)/18η] ص2.ω، حيث SV = سرعة الترسيب؛ d = قطر الجسيمات؛ Ρف = كثافة الجسيمات؛ Ρm = الكثافة من المخزن المؤقت؛ Η = اللزوجة المخزن المؤقت؛ Ω = السرعة الزاوية للدوار؛ و r = موقف شعاعي من الجسيمات. وهكذا، SV يتناسب مع قطر الخلية والكثافة، وحيث يتم رفع قطرها إلى السلطة الثانية، يساهم إلى حد كبير أكثر من الكثافة وثابتة عموما من خلال دورة الخلية.

ميزة هامة لمركز التعليم المستمر هو أن خلايا لا تخضع لشروط قاسية للعلاج الكيميائي أو الحرمان التغذوي ويمكن استردادها في الغلة ممتازة دونما قلاقل أساسا. شرط أن الخلايا المذكورة تخضع لزيادة كبيرة في قطر، من 30 في المائة على الأقل، كما أنهم اجتياز دورة الخلية. والعيب الرئيسي هو تكلفة المتخصصة أجهزة الطرد المركزي، والدوار، والملحقات. ومع ذلك، القدرة على إعداد الخلايا أثري مركز التعليم المستمر في مراحل دورة الخلية المحددة سهلت إلى حد كبير البحوث دورة الخلية في الكائنات الحية من الخميرة إلى خلايا الثدييات9،10. وعلاوة على ذلك، يتم توسيع التقدم الذي أحرز مؤخرا يستخدم لفصل الخلايا من صحية مقابل الأنسجة السرطانية، والفصل بين أنواع الخلايا المختلفة في مخاليط غير متجانسة، وإلى إنتاج أنواع محددة من الخلايا للعلاج المناعي9.

وكان اهتمامنا الرئيسي في فهم إليه العمل لاستهداف عملاء (MTAs) مثل قلوانيات فينكا وتاكسانيس ميكروتوبولي. ويعتقد أن هذه الأدوية للعمل حصرا في الانقسام، حجب المغزل microtubule الدالة11،12، ولكن الأدلة الأخيرة تشير إلى أنها قد تستهدف أيضا الطور البيني ميكروتوبوليس13،14. نحن ذكرت مؤخرا أن خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد الأولية (جميع) الخضوع للموت أما في المرحلة G1 أو في م المرحلة عندما تعامل مع vincristine و MTAs الأخرى في طريقة تعتمد على دورة الخلية15. القدرة على فصل كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية بمركز التعليم المستمر بدور أساسي في التوصل إلى هذا الاستنتاج. في هذا المقال، وصف التفاصيل التقنية، وتقديم النصائح العملية لتطبيق مركز التعليم المستمر في إعداد المرحلة الابتدائية كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol


ملاحظة: هذا البروتوكول وقد الأمثل الابتدائية ب-جميع الخلايا التي تتراوح في قطرها من حوالي 8 ميكرومتر (المرحلة G1) إلى 13 ميكرون (مراحل G2/M). وبالتالي، لا يجوز بسرعة محددة للطرد المركزي ومعدلات تدفق مضخة المطبقة على الخلايا التي تحتوي على نطاقات مختلفة الحجم. ومع ذلك، يمكن تقدير معلمات الوترياتيون المناسب باستخدام معادلة معدل الترسيب. تستزرع خلايا في متوسط خالية من المصل محددة ك وصف 16 في بكثافة أمثل من 1-3 × 10 6 خلايا/مل. وباستثناء مجموعة الكسور التي تجري عند 4 درجة مئوية باستخدام أنابيب تبريد الثلج وتجري جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي في 20 درجة مئوية بحد أقصى 24 درجة مئوية.

1-إعداد المخزن الوترييشن ومواد

  1. من أجل الحد من التثاقل من الخلايا، وإعداد مخزن مؤقت الوترييشن من هانك ' s متوازنة المحلول الملحي (حبس) مع الفينول الأحمر تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين ( FBS)، لحماية الخلايا من الإجهاد الميكانيكي أثناء عملية الوترييشن، و 1.6 غ/لتر من الملح ديبوتاسيوم حمض 2-نافثول-6,8-دسلفنك (التجمع الوطني الديمقراطي)، مما يجعل الخلية الخارجي اتهم سلبا ويقلل من التثاقل.
    1. إضافة 1.6 غرام من التجمع الوطني الديمقراطي إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. تحت ظروف معقمة، إضافة 35 مل حبس من زجاجة 1 لتر إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على التجمع الوطني الديمقراطي. دوامة الأنبوب حتى حل التجمع الوطني الديموقراطي-
    3. باستخدام فلتر 0.2 ميكرون، نقل التجمع المنحل في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل جديدة. ثم أضف التجمع الوطني الديموقراطي إلى 1 لتر المتبقية من حبس.
    4. وأخيراً، إضافة
    5. مل 21 FBS إلى هبس للحصول على تركيز نهائي 2% (v/v)-
      ملاحظة: المخزن المؤقت الوترياتيون يمكن إعدادها وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تاريخ انتهاء الصلاحية على هبس أو حتى يكون هناك تغيير كبير في درجة الحموضة كما أشار اصفرار صبغ مؤشر.
  2. تسمية 50 مل أنابيب مخروطية الشكل لجمع الكسور حيث لا توجد أنابيب المسمى يغسل 1 و 2 (W1 و W2)، الكسور 1-20 (F1-F20)، ووقف.
    1. قبل chill هذه الأنابيب على الجليد قبل جمع الكسور.

2. الجمعية العامة "النظام الوترييشن"

  1. أولاً، تثبيت التجميع القوية في أجهزة الطرد المركزي حيث أنه يتم تغذية التيار خارج الدائرة عن طريق المنفذ الموجود على الجانب الأيسر. تأكد من مصباح فلاش القوية في الجزء الأمامي الدائرة حيث أنها سوف يصطف مع نافذة عرض عند إغلاق النابذة.
    1. تأمين الجمعية في مكان بتشديد أول اثنين من البراغي فيليبس رئيس في اثنين من الثقوب في الجزء العلوي من كل قوس وثم تشديد الاتجار في أسفل كل شريحة.
    2. توصيل سلك الطاقة بمنفذ الطاقة القوية في الجزء الخلفي من النابذة.
  2. المقبل، مجموعة الدوار إلى أسفل على لوحة الوصل محرك أقراص جهاز الطرد المركزي وتأمين مع وجع عرافة التعامل مع تي-
    ملاحظة: إذا لم تعد ضرورية في أجهزة الطرد المركزي لأغراض غير الوترييشن، الجمعية العامة القوية والدوار يمكن أن يوضع في أجهزة الطرد المركزي بين تشغيلات.
  3. مجرد تأمين الدوار، مكان التجميع الإفراج السريع الذي يحتوي على دائرة الوترييشن، التوازن العداد، وتناوب الجمعية الختم، ولوحة تصاعد إلى الدوار.
    1. دفع أسفل بالتساوي مع يد واحدة في قاعة الوترييشن واليد الأخرى على التوازن العداد حتى البراغي في الدوار المفاجئة في الثقوب على لوحة تصاعد.
    2. وأخيراً، توصيل كبل ترسيخ وضع الدبوس على جانب واحد من الكابل في الحفرة في الجمعية ختم الدورية وتأمين إيلي على الجانب الآخر من الكابل مع أحد البراغي فيليبس رئيس (المذكورة في 2.1.1) على القوس في س الجانب الأيسر و الدائرة.
  4. بعد ذلك، تجميع النظام التدفق باستخدام مضخة متغيرة سرعة وأنابيب لضخ المخزن المؤقت إلى الوترييشن الدائرة وتجمع المخزن المؤقت كما أنها تنبع من قاعة الوترييشن.
    1. إدراج أنابيب الإدخال حجم 16 قادمة من مضخة متغيرة السرعة عن طريق الميناء في الجزء العلوي الأيسر من الدائرة أجهزة الطرد المركزي حيث أن ذلك يدخل في الدائرة-
    2. إرفاق مناسب إلى نهاية خالية من أنابيب الإدخال وإدراج المناسب في حفرة الإدخال على جانب الجمعية ختم الدورية.
    3. إدراج حجم 16 إخراج الأنابيب من خلال المنفذ وإرفاقه بأنبوب نقل أعلى التناوب ختم الجمعية.
      ملاحظة: نظام تدفق يمكن أيضا تبقى مجمعة بين تشغيلات الوترييشن.
  5. وأخيراً، تشغيل أجهزة الطرد المركزي وتعيين المواصفات اللازمة للتجربة.
    1. تغيير الدوار معرف.
    2. إذا النابذة يتطلب مدخلاً وقت، تعيين لح 2، الذي أكثر من كاف لإتمام الوترياتيون تشغيل-
    3. تعيين درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية مع درجة الحرارة الحد أقصى من 24 درجة مئوية.
    4. تعيين تسريع ماكس والتباطؤ لبطء.
    5. وأخيراً، تعيين سرعة إلى 867 س زاي

3. فتيلة "النظام الوترياتيون"

  1. أولاً من أجل تعقيم النظام الوترياتيون، ووضع أنابيب الخزان في زجاجة بلاستيكية 500 مل تحتوي على التبييض 5% ثم ضع الأنبوب الناتج في زجاجة 1 لتر نفايات بلاستيكية فارغة.
    1. تشغيل المضخة وتعيين السرعة إلى 25 مل/دقيقة والسماح للتبييض 5% إلى التدفق على طول الطريق من خلال نظام الوترييشن حتى فإنه يتم ضخ الخروج من الأنبوب الناتج في زجاجة النفايات.
    2. تشغيل أجهزة الطرد المركزي والسماح لها بالتوصل إلى الحد الأقصى لتعيين سرعة (867 س ز) بغية الإفراج عن الفقاعات وباكبريسوري-
    3. وقف
    4. الطرد المركزي. بمجرد توقف الدوار بالتناوب، فتح الغطاء وفحص الدائرة لأي تسرب.
    5. إذا كان هناك أي تسرب، اسمحوا أن الحل التبييض التدفق من خلال نظام على الأقل 5 دقيقة
  2. المقبل، طرد النظام مع يعقم ماء التبييض يمكن أن يؤدي إلى تشكيل رواسب من المخزن المؤقت الوترياتيون الذي قد يؤدي إلى التثاقل الخلايا فضلا عن التسبب في ضرر للخلايا.
    1. مكان أنابيب الخزان في زجاجة 1 لتر من يعقم المياه والسماح بتدفق من خلال لمالا يقل عن 10 دقيقة
  3. بعد التنظيف بالماء، إدخال المخزن المؤقت الوترياتيون في النظام. استخدام زجاجة زجاج 150 مل الذي كان يعقم لإنشاء خزان للمخزن المؤقت الوترياتيون والخلايا.
    1. إضافة 100 مل من الوترياتيون المخزن المؤقت إلى الزجاجة ونقل أنابيب الخزان بزجاجة حيث يكون الأنبوب في أسفل جداً.
    2. ابدأ الطرد المركزي والسماح للمخزن المؤقت لتدفق من خلال نظام لطرد الماء.
    3. بمجرد زجاجة الخزان فارغ تقريبا وهو مسح المياه تماما خارج النظام، نقل إخراج الأنابيب من زجاجة النفايات إلى الخزان حيث أن المخزن المؤقت هو يجري إعادة تدويرها من خلال النظام-
  4. وأخيراً ضبط نافذة عرض بحيث يمكن أن ينظر في دائرة الوترياتيون في السرعة الحالية. مصباح
    1. الصحافة القوية السلطة زر في الخارج من أجهزة الطرد المركزي حيث أن يضيء المصباح. تشغيل ك الوترييشننوب أيضا في الخارج من أجهزة الطرد المركزي على طول الطريق إلى اليسار-
    2. دورة
    3. بينما يبحث من خلال نافذة عرض، ببطء مقبض الباب إلى اليمين حتى يأتي دائرة الوترييشن في الرأي وعلى ضوء القوية في الوقت المناسب مع تناوب الدوار.
      ملاحظة: يمكن أن يترك النظام الوترييشن في هذه الدولة حتى يتم هيأهم الخلايا.

4. إعداد "نموذج خلية"

  1. عدد الخلايا والكوة المتوسطة 300 إلى 400 مليون في النمو في العديد من أنابيب مخروطية 50 مل. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 1210 س ز للحد الأدنى 3
  2. Aspirate إيقاف نمو الخلايا وسائط الإعلام وريسوسبيند في 25 مل من المخزن المؤقت الوترياتيون من بيبيتينج صعودا وهبوطاً بلطف.
  3. من أجل الحد من الخلية التثاقل، قياس خلايا المرور مرتين من خلال 25 إبرة.
    1. باستخدام حقنه 10 مل رسم الخلايا، ثم إرفاق إبرة قياس 25 وتمرير الخلايا عن طريق إلى الداخل جدار أنبوب مخروطي العقيمة 50 مل. كرر هذه العملية حتى مرت كل 25 مل من خلال الإبرة.
    2. الحصول على جديدة الإبر والمحاقن، وتكرار هذه العملية أعلاه مرة واحدة.
      تنبيه: يجب وضع إبر المحاقن في حاويات الأدوات الحادة-
      ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يتم الضغط الخلايا عن طريق الإبرة مباشرة قبل إدخالها إلى النظام الوترييشن للحفاظ على الخلية التثاقل إلى الحد أدنى-

5. إدخال "نموذج الخلية" في نظام الوترياتيون وجمع الكسور

  1. إدخال نموذج الخلية في النظام الوترياتيون بصب العينة الخلية في خزان الخزان الذي قد تبقى الوترياتيون المخزن المؤقت إعادة التدوير من خلال . اسمحوا
    1. الخلايا الدخول في النظام، والتوصل إلى توازن داخل قاعة الوترييشن-
      ملاحظة: سوف تستغرق هذه العملية حوالي 5 دقائق ويمكن تعقب التقدم بمشاهدة الخلايا كما أنها تدخل في الدائرة عبر نافذة عرض. للتأكد من كافة الخلايا الموجودة في الدائرة، تأخذ قطره من الوينت، وضع على شريحة زجاجية وعرض تحت مجهر. إذا كانت العينة خالية من خلايا سليمة، وهذا يؤكد الاحتفاظ بها في الدائرة-
  2. البدء في جمع الكسور حالما دخلت كافة الخلايا الموجودة في الدائرة وهناك خط حدود مميزة في الجزء أوسع من الدائرة التي الخلايا في التوازن.
    1. تبدأ بتحريك أنبوب إخراج للأنبوبة المخروطية 50 مل المسمى W1. جمع 50 مل من المخزن المؤقت الوترييشن لهذا الكسر، مع التأكد من إبقاء عين على خزان الخزان وتجديد مع المخزن المؤقت الوترييشن عند الضرورة.
      ملاحظة: للتأكد من أن كافة الخلايا إدخالها في النظام، تسمح في خزان الخزان لتصبح فارغة تقريبا قبل إعادة تعبئة الخزان في المرة الأولى. وبعد الملء الأول ليس من الضروري الانتظار للخزان لتصبح تقريبا فارغة. أيضا، لا تسمح من أي وقت مضى في خزان لتصبح فارغة كهذا سيخلق فقاعات والضغط مرة أخرى في النظام.
    2. مرة واحدة وقد تم جمع 50 مل ل W1، في نفس الوقت تغيير السرعة إلى 821 x ز وتحريك أنبوب إخراج للأنبوبة المخروطية المسمى W2 وجمع 50 مل أكثر بهذه السرعة.
    3. ما زالت
    4. المتغيرة السرعة وجمع الكسور كما هو مبين في الجدول 1. تأكد من أن هناك وسائل الإعلام في الخزان دبابة وإبقاء هذه الأنابيب المخروطية على الجليد في جميع الأوقات. وأخيراً، قم بضبط نافذة عرض بتحول مقبض الباب إلى اليمين ببطء كما يقلل من السرعة.
    5. مرة واحدة جميع الكسور 20 قد جمعت ووقف الطرد المركزي وجمع 50 مل في أنبوب مخروطي يسمى STOP.

6. فلاشينغ من "النظام الوترييشن"

  1. بعد أجهزة الطرد المركزي توقفت تماما طرد النظام عن طريق وضع أنبوب خزان في زجاجة 1 لتر من يعقم ماء وأنبوب الإنتاج مرة أخرى في زجاجة النفايات.
    1. تشغيل سرعة ضخ ما يصل إلى 50 مل/دقيقة، والسماح للتشغيل من خلال النظام حتى أنه هو استنزاف المياه-
  2. تشغيل إيقاف المضخة، إزالة خرطوم الإدخال والإخراج من الجمعية الإفراج السريع، وسحب الدبوس من كبل ترسيخ.
    1. إزالة التجميع الإفراج السريع من الدوار.
      ملاحظة: اعتماداً على ما أجهزة الطرد المركزي ستستخدم للنظام الوترياتيون يمكن الآن أن يترك كما هو. وبخلاف ذلك، الجمعية كلها يمكن أن تؤخذ الترتيب العكسي كما هو موضح أعلاه. ويمكن إزالتها من الجمعية الإفراج السريع الدائرة الوترياتيون وتنظيفها بين تشغيل استخدام حمام الماء بالموجات فوق الصوتية. يؤدي هذا إلى إزالة الحطام والملوثات من الجدار الدائرة مما قد يؤثر سلبا على تشغيل أحدث.

7. تحليل الكسور وجمع G1 أو G2/M برك.

ملاحظة: من أجل إثبات فعالية الوترييشن، ويتم تحليل كل جزء لعدد الخلايا والخلية قطرها، ومحتوى الحمض النووي، وهي إنشاء تجمعات من الخلايا في مراحل G1 أو G2/M لتحليلات إيمونوبلوت، كما هو موضح في النتائج ممثلة. هذا المقطع البروتوكول سوف تصف كيفية إنشاء هذه المجمعات، وإعدادهم للاستخدام التجريبي.

  1. تدور كل جزء في 2000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و aspirate إيقاف المخزن المؤقت الوترييشن.
  2. الكسور الجمع معا من أجل الحصول على بركة مرحلة G1 وبركة مراحل G2/M.
    1. G1 المرحلة تجمع، ريسوسبيند الكسور التي جمعت في نطاق السرعة 788 x ز إلى 661 x ز (F1--F5) في مجموعة 1 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لتجمع مراحل G2/M، الكسور التي جمعت في نطاق السرعة 387 × g و g x 333 (F17-F20) ريسوسبيند-
    2. تدور أسفل الخلايا في 2000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و aspirate قبالة PBS.
  3. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل وسائط النمو واتخاذ عدد خلية.
  4. تأخذ قاسمة من كل تجمع تحليل الحمض النووي المحتوى عن طريق تلطيخ يوديد propidium وتدفق سيتوميتريك تحليل 15-
    ملاحظة: يمكن استخدام الجزء المتبقي من كل تجمع لإجراء المزيد من التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأولية كافة الخلايا (3-4 × 108) تعرضوا للطرد المركزي الوترياتيون وجمعت في اثنين يغسل الكسور والكسور الرئيسية العشرين، كما هو موضح في البروتوكول. ويبين الجدول 1 بيانات تمثيلية حيث يتم عرض إجمالي عدد الخلايا في كل جزء، فضلا عن سرعة الدوار المقابلة. وعموما كان العائد عادة ما يزيد على 80%. قياس القطر الخلية في كسور الفردية أكدت أن قطر الخلية زادت مع تقدم الوترياتيون (الشكل 2). هذه النتائج تمثل المتوسطات لاثنين من قرارات مستقلة وتعكس درجة عالية من إمكانية تكرار نتائج البيانات. الكسور التالية تعرض لتلطيخ يوديد propidium والتدفق الخلوي لتحديد محتوى الحمض النووي (الشكل 3). الكسور المبكر (F1--F5) الواردة حصرا تقريبا من الخلايا مع محتوى الحمض النووي 2N تمثل المرحلة G1. وقد لوحظ خليط خلايا في المرحلة G1، ومرحلة ثانية في وسيطة الكسور (F6-F9) وكانت الخلايا التي تحتوي على محتوى الحمض النووي 4N لاحظ بدأت في F10. وكان الكسور لاحقاً أساسا من الخلايا مع محتوى الحمض النووي 4N تمثل مراحل G2/M. وأكدت هذه البيانات إلى جانب نتائج الشكل 2 علاقة بين حجم الخلية ومرحلة دورة الخلية.

وبناء على هذه النتائج، تم الجمع بين الكسور F1--F5 لإنشاء تجمع خلايا في المرحلة G1، وتم الجمع بين الكسور F17-F20 لإنشاء تجمع للخلايا في مرحلة G2/M. وكانت نسبة الخلايا التي تحتوي على محتوى الحمض النووي 2N في تجمع المرحلة G1 عادة 99%، ونسبة الخلايا التي تحتوي على محتوى الحمض النووي 4N في تجمع G2/M كان عادة 85%، كما يحددها تلطيخ يوديد propidium والتدفق الخلوي. تحت ظروف غير متزامنة، و 60-70% من المرحلة الابتدائية يتم كافة الخلايا في المرحلة G1 و 15-20% في G2/M مراحل15، وبالتالي القيم التي تم الحصول عليها بعد الوترياتيون تعكس مستويات عالية لتخصيب اليورانيوم. كذلك مصادقة في تجمعات اثنين فيما يتعلق بمرحلة دورة الخلية، ومقتطفات من كل تعرض ل immunoblotting مع علامات المرحلتين G1 أو G2/M. أولاً، علينا الاستفادة من جسم محددة والرمات الذي يعترف بالبروتين الشبكية (الميزانية العادية) فوسفوريلاتيد على سر-807 أو Ser-811، حيث ثبت أن يصبح متزايد فوسفوريلاتيد م ع كخلايا مقدما من خلال دورة الخلية17 . كما هو موضح في الشكل 4، كانت مستويات والرمات العادية أعلى بكثير في الخلايا في تجمع G2/M مقابل المجمع المرحلة G1، ويتسق مع التوقعات. ونحن أيضا سبر cyclin B1، الذي هو أعرب عن أشد في الخلايا المرحلة G2/M، و cyclin D1، الذي أعرب عن أشد في G1 مرحلة الخلايا18 (الشكل 4). وقد تجمع G2/M مستويات أعلى بكثير من cyclin B1 مقارنة إلى تجمع G1، متسقة مع التوقعات. Cyclin D1 أعطى فقط إشارة ضعيفة في هذه الأعمال التحضيرية، ولكن مع ذلك كان يمكن اكتشافها في تجمع G1 وغير قابلة للكشف في تجمع G2/M. جابده كان يستخدم عنصر تحكم للتأكد من تحميل البروتين متساوية.

تم إجراء تعديلات على البروتوكول القياسي لتقييم آثارها، وتهيئة الظروف لتحقيق الأداء الأمثل. أولاً، عدد الكسور جمعها كان انخفض، من العشرين القياسية لفقط ثلاثة، واستخدام سرعة تحديد من الجدول 1 تمثل النقاط الطرفية لمجموعة من الخلايا في مراحل G1, S أو G2/M، كما هو مبين في الجدول 2. ويبين الشكل 5Aتحليل محتوى الحمض النووي الكسور F1 و F3. جزء 1 يتضمن خلايا التخصيب في المرحلة G1 (95 في المائة) وهكذا نقاء مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها تحت الظروف القياسية (الشكل 3). ومع ذلك، جزء 3، الخلايا ظاهرياً عالي التخصيب في المرحلة G2/M، أعطى سكان مختلطة، مع الخلايا في مراحل G1 و S الحالي أيضا. خلايا G2/M تمثل 51 في المائة فقط من الإجمالي، مقارنة بنسبة 85 في المائة في ظل الظروف العادية. تشير هذه النتائج إلى أن محاولات لتبسيط الإجراء عن طريق تقليل عدد الكسور تنازلات نوعية العينات. المقبل، ونحن اختبار أثر تخفيض حجم الكسر، كوسيلة للحد من استهلاك كاشف. وقد أجرى الوترياتيون قياسية إلا أنه تم جمع 40 مل بدلاً من الكسور 50 مل. وجرى تحليل F1 الكسور و F20 لمحتوى الحمض النووي. كما هو موضح في الشكل 5B، كان عالي التخصيب الكسر F1 في الخلايا المرحلة G1 (98 في المائة)، مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها تحت ظروف قياسية. ومع ذلك، كسر الخلايا F20 الواردة في جميع هذه المراحل الثلاث، مع الخلايا في المرحلة G2/M فقط تمثل 64 في المائة من المجموع، مقارنة ب 85% تحت ظروف قياسية. تشير هذه النتائج إلى أن تخفيض حجم الكسر كما يعرض للخطر نوعية العينة.

Figure 1
الشكل 1 . مبدأ الطرد المركزي الوترياتيون كونتيرفلوو.
علما بأن الوترياتيون من الخلايا يمكن أن يتحقق بزيادة معدل كونتيرفلوو كما هو مبين هنا أو بتقليل سرعة الدوار. بإذن من الناشرين ماكميلان المحدودة تكييف: [الطبيعة البروتوكولات] (8 Ref.)، حقوق التأليف والنشر (2008)8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . القطر من الابتدائي جميع الخلايا الزيادات مع كسر الوترييشن.
تم تحديد قطر متوسط لكسر كل استخدام محلل خلية الذي يسجل البيانات من الخلايا الفردية 500-4,500 كل عينة. البيانات المعروضة هي يعني ± التنمية المستدامة من تجربتين مستقلة. علما بأن مجالات الخطأ للعديد من النقاط هي أصغر من الرمز وتم حذف للوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . ويؤكد تحليل محتوى الحمض النووي فصل ناجحة من المرحلة الابتدائية كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية.
تم إصلاح 10 مل من كل جزء في 70% EtOH، الملون في يوديد propidium وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي، كوصف15. كان رسم Propidium يوديد المتكاملة لكثافة (س) مقابل عدد الخلايا (محور ص) لتحديد جزء الخلايا في كل مرحلة من المراحل، حيث محتوى الحمض النووي 2N إلى المرحلة G1 ومحتوى الحمض النووي 4N تشير إلى الخلايا في مراحل G2 أو M. البيانات المعروضة من تجربة ممثل وتم الحصول على نتائج متطابقة أساسية في تكرار أربعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . تحليل إيمونوبلوت للبروتينات ذات الصلة بدوره الخلية في تجميعالكسور.
عقب الوترييشن قياسية الأولية تم دمج كافة الخلايا، الكسور F1--F5 لإنشاء تجمع مرحلة G1 والكسور F17-جمعت F20 لإنشاء تجمع مرحلة G2/M. مقتطفات من استعداد و 40 ميكروغرام/لين تخضع للتحليل إيمونوبلوت، كما هو موضح سابقا15، مع الأجسام المضادة للفوسفات العادية (Ser807/811)، cyclin B1 أو cyclin D1، كلها تستخدم في تخفيف 1:2,000. واستخدمت كعنصر تحكم تحميل جابده (01:10، 000). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . بيانات توضيحية من الوترييشنز دون الحد الأمثل.
A) أثر خفض عدد الكسور التي تم جمعها. تم جمع الكسور الرئيسية الثلاثة فقط (F1-F3)، بدلاً من المعيار العشرين، كل 100 مل،، بسرعة كما هو مبين في الجدول 2. وجرى تحليل الكسور F1 و F3 لمحتوى الحمض النووي كما في الشكل 3. ب) تأثير خفض حجم الكسر. وجمعت عشرين الكسور، بالشروط نفسها كما في الجدول 1، ولكن استخدمت فقط 40 مل من المخزن المؤقت الوترياتيون بدلاً من 50 مل القياسية لكل. وجرى تحليل F1 الكسور و F20 لمحتوى الحمض النووي كما في الشكل 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كسر السرعة (دورة في الدقيقة) جي فورس مجموع الخلايا (x 10 ^ 6)
W1 3000 867 x ز 17.75
W2 2920 821 x ز 7.00
F1 2860 788 x ز 4.60
F2 2800 755 x ز 10.75
F3 2740 723 x ز 15.25
F4 2680 692 x ز 22، 50
F5 2620 661 x ز 26.75
F6 2560 631 x ز 25.00
F7 2500 602 س ز 22.75
F8 2440 573 س ز الساعة 18.00
F9 2380 546 x ز 14.00
المفتاح F10 2320 518 x ز 10.75
F11 2260 492 x ز 7.43
F12 2200 466 x ز 8.63
F13 2140 441 x ز 6.63
F14 2100 425 x ز 4.98
F15 2060 409 x ز 3.46
إف-16 حلول عام 2020 393 x ز 3.43
F17 1980 378 x ز 2.63
F18 1940 363 x ز 3.17
F19 1900 248 x ز 2.78
F20 عام 1860 333 x ز 1.66
وقف 0 0 x ز 5.19
إجمالي العائد 245.06
نسبة العائد 81.69

الجدول 1. خلية الغلة وسرعة الدوار المقابل لكل جزء.
تم تحديد العدد الخلية استخدام عداد خلية الآلي. إجمالي العائد عازمة على مجموع كسور الفردية مقابل المدخلات (3 × 108 خلايا). البيانات في وسط تجربتين الممثل. يتم إعطاء المقابلة الدوار سرعة وقوة الطرد المركزي.

كسر السرعة (دورة في الدقيقة) جي فورس
W1 3000 867 x ز
W2 2920 821 x ز
F1 2620 661 x ز
F2 حلول عام 2020 393 x ز
F3 عام 1860 333 x ز
وقف 0 0 x ز

الجدول 2. سرعة معلمات الوترياتيون دون الحد الأمثل.
يظهر هي قوي الطرد المركزي والمقابلة بسرعة الدوار ليغسل والكسور الثلاثة التي تم جمعها في الوترياتيون الأمثل مضغوط. انظر الشكل 5A للمقابلة الحمض النووي المحتوى والنص للحصول على التفاصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد قمنا بوصف طريقة للحصول على الابتدائية كافة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية باستخدام مركز التعليم المستمر. تحت الظروف المثلى سكان أساسا نقية من الخلايا في المرحلة G1 وعدد سكانها مخصب بدرجة عالية من الخلايا في مراحل G2/M يمكن سهولة الحصول عليها في الغلة ممتازة، وخلايا التخصيب في مرحلة ثانية يمكن أيضا الحصول عليها إذا رغبت في ذلك. تم التوصل إلى النتائج المعروضة هنا استخدام الابتدائية واحد تم الحصول على جميع الثقافة (على وجه التحديد، جميع-5)، وأساساً نتائج متطابقة مع ثقافة مستقلة، جميع-215. وبالإضافة إلى ذلك، أداء سائر الابتدائية جميع الثقافات التي بحثت حتى الآن تتراوح كثافة مماثلة أثناء النمو غير متزامن، ومن المرجح وبالمثل عندما تعرض لمركز التعليم المستمر. وقد أظهرت دراساتنا السابقة أيضا أن يمكن فصل أخرى خطوط خلايا سرطان الدم، بما في ذلك HL60 و K562، في مراحل مختلفة من دورة الخلية باستخدام CCE19،20. وتشمل الخطوات الحاسمة في الإجراء ضمان أن الخلايا فرقت مونو ولا تحبب خفيف في بداية التشغيل؛ تحسين الظروف لسرعة معدل ودوار كونتيرفلوو؛ ضمان عناصر النظام نظيفة وخالية من الأنقاض؛ وتجنب الأخذ بفقاعات الهواء في خطوط تدفق. مركز التعليم المستمر يعمل بشكل أفضل مع الخلايا زيادة كبيرة في حجم الخلية كما أنها تقدم من خلال دورة الخلية. لعدد معين من سكان من الخلايا في التعليق، وهذا يمكن إقامتها في البداية وسهولة بدراسة العلاقة بين محتوى الحمض النووي والجانب مبعثر، وتعتمد هذه الأخيرة على حجم الخلية. كلا المعلمتين يمكن أن يقاس في نفس الوقت التدفق الخلوي بعد يوديد propidium تلطيخ، كما وصفناها15. علاقة خطية بين الجانب مبعثر ومحتوى الحمض النووي توفر الثقة بأن زيادة حجم الخلية مع تقدم دورة الخلية، وهكذا أن مركز التعليم المستمر لديه القدرة على فصل الخلايا استناداً إلى مرحلة دورة الخلية.

كما أظهرنا (الشكل 5)، يؤدي إلى انحرافات عن الإجراء الأمثل في نوعية العينة الشبهة، خاصة بالنسبة للخلايا في مراحل G2/M. ومع ذلك، خفض عدد الكسور أو حجم الكسر لم يؤثر ملحوظ نقاء الخلايا في المرحلة G1 (الشكل 5). وهكذا، يمكن التغاضي عنه اختصارات إلى هذا الإجراء إلا إذا كان هناك حاجة إلى تنقية الخلايا المرحلة G1. على الرغم من أن مركز التعليم المستمر سهولة قابلة لتعليق خلية الثقافات، يمكن أيضا تطبيقها للكسور سوبسيلولار. على سبيل المثال، نواة من خلايا ب قبل مورين تم بنجاح فصل استخدام CCE8-حجم. أنواع الخلايا ملتصقة تطرح مشاكل محتملة بسبب ميلها إلى دقة وإمكانية التمسك بأسطح قاعة الأنابيب والوترياتيون وهكذا ينبغي التحقيق فيها بحذر.

القيد الرئيسي لمركز التعليم المستمر هو تكلفة المعدات؛ هو أحد حلول ممكنة التعاون مع مختبر التي لديها الأجهزة اللازمة. نلاحظ مع ذلك أنه في حين أن الدوار أداة مخصصة، يمكن استخدامها في أجهزة الطرد المركزي للأغراض العامة الطرد المركزي، مما يقلل من التكلفة الاستثمار حصرا في مركز التعليم المستمر. قيد آخر أن الجدول الزمني للتجارب أكثر إشكالية مقارنة بمرونة أساليب أخرى مثل تزامن المجاعة أو كيميائية المصل. يدير الوترييشن عادة ما يستغرق 5-6 ساعات، وإذا كانت هناك حاجة الخلايا التي تم الحصول عليها في وقت لاحق لإجراء التجارب على نقطة قصيرة الأجل أو زمنية متعددة، يمكن أن ينتج هذا جدولة من المضايقات. أكبر ميزة هي أن الخلايا التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة دونما قلاقل ويمكن أن يكون مثقف لعدة أيام دون أي علامات الشدة، كما أظهرنا15. وهذا يتناقض مع خلايا متزامنة بالوسائل الكيميائية التي قد تأوي الأضرار الناجمة عن المخدرات. دراسة أجريت مؤخرا باستخدام NB4 الخلايا المستمدة من سرطان الدم النقوي الحاد الانفجارات، مباشرة مقابل مركز التعليم المستمر وغيرها من الأساليب، بما في ذلك الاعتقال مع المجاعة المصل أو هيدروكسيوريا أو العلاج مثبط كيناز cyclin تعتمد على 1، رو-330621. الوترياتيد الخلايا والخلايا التي اعتقلت في مراحل مماثلة ظهرت مماثلة فيما يتعلق بمحتوى الحمض النووي و cyclin التعبير. بيد عند فحص البروتين، التغيرات الرئيسية في وفرة البروتين، لا سيما المتصلة بالإجهاد والبروتينات الخاصة بالاعتقال، ولوحظت في الخلايا المقبوض عليهم وليس في الخلايا الوترياتيد في خلية ما يعادل حجم المواقف. هذه النتائج تسلط الضوء على الأداة المساعدة لمركز التعليم المستمر لإنتاج خلايا دونما قلاقل وأؤكد أنه ينبغي توخي الحذر عند تفسير البيانات من الخلايا متزامنة بوسائل أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

كوثري Anisha حاليا في إدارة الخلية والبيولوجيا الجزيئية في مستشفى أبحاث سانت جود للأطفال.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل CA109821 المعاهد الوطنية للصحة (إلى TCC). ونحن نشكر بيكمان كولتر لسخاء توفير الأموال اللازمة لتغطية تكاليف النشر والمساعدة التقنية في إنشاء وتشغيل نظام الوترياتيون. ونحن نشكر الدكتور فريد فالكينبورج لتوفير الابتدائية الأولى جميع الثقافات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics