केंद्रापसारक Elutriation द्वारा विभिंन कोशिका चक्र चरणों में प्राथमिक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं की तैयारी

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

इस प्रोटोकॉल विभिंन कोशिका चक्र चरणों में प्राथमिक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं अलग करने के लिए केंद्रापसारक elutriation के उपयोग का वर्णन ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने की क्षमता सेल चक्र विनियमन के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए केंद्रीय गया है । आम तकनीकों में सीरम अभाव शामिल है; रसायन जो विभिंन कोशिका चक्र चरणों में कोशिकाओं को गिरफ्तार; या mitotic शेक का उपयोग बंद जो उनके कम पालन शोषण । हालांकि, इन सभी को नुकसान है । उदाहरण के लिए, सीरम भुखमरी सामान्य कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है लेकिन oncogene सक्रियण या ट्यूमर शमन के नुकसान के कारण समझौता सेल चक्र चौकियों के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के लिए कम अच्छी तरह से. इसी तरह, रासायनिक उपचार कोशिका आबादी दवा प्रेरित नुकसान बंदरगाह और तनाव से संबंधित परिवर्तन दिखा सकते हैं । एक तकनीक है जो इन समस्याओं को दरकिनार counterflow केंद्रापसारक elutriation (CCE) है, जहां कोशिकाओं को दो विरोध बलों, केंद्रापसारक बल और द्रव वेग है, जो आकार और घनत्व के आधार पर कोशिकाओं की जुदाई में परिणाम के अधीन हैं । चक्र के माध्यम से आगे बढ़ने के बाद से कोशिकाओं को आम तौर पर विस्तार, CCE अलग सेल चक्र चरणों में अलग कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहाँ हम प्राथमिक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए इस तकनीक को लागू. इष्टतम परिस्थितियों में, G1 चरण में कोशिकाओं की एक अनिवार्य रूप से शुद्ध आबादी और G2/एम चरणों में कोशिकाओं की एक अत्यधिक समृद्ध आबादी उत्कृष्ट उपज में प्राप्त किया जा सकता है । इन सेल की आबादी आदर्श विरोधी दवाओं की कार्रवाई के सेल चक्र पर निर्भर तंत्र का अध्ययन करने के लिए और अंय अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल हैं । हम यह भी बताएंगे कि कैसे मानक प्रक्रिया में संशोधनों को इष्टतम प्रदर्शन में परिणाम और तकनीक की सीमाओं पर चर्चा कर सकते हैं । प्रस्तुत विस्तृत पद्धति को तकनीक के अन्य प्रकार के कक्षों में आवेदन और अन्वेषण की सुविधा देनी चाहिए.

Introduction

प्रसंस्कृत कोशिकाओं को आम तौर पर अतुल्यकालिक हो जाना और व्यक्तिगत कोशिकाओं को सेल चक्र के विभिंन चरणों में मौजूद हैं । कुछ जीवों स्वाभाविक रूप से तुल्यकालिक सेल चक्र प्रदर्शन या विशिष्ट शारीरिक उत्तेजनाओं से सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कीचड़ के विशाल plasmodia के भीतर नाभिक मोल्ड Physarum polycephalum एक उच्च तुल्यकालिक फैशन1में विभाजित है, और हरी शैवाल Desmodesmus quadricauda की कोशिकाओं को बारी से सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है प्रकाश और अंधेरे पीरियड्स2. जबकि ऐसे जीवों अद्वितीय प्रयोगात्मक गुण प्रदान करते हैं, वे अपर्याप्त स्तनधारी कोशिकाओं की जटिलताओं मॉडल । स्तनधारी सेल की आबादी को कृत्रिम रूप से सिंक्रनाइज़ करने की क्षमता सेल चक्र विनियमन और सेल चक्र चौकियों के आणविक आधार की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए केंद्रीय किया गया है । आम तरीकों सीरम अभाव, रासायनिक ब्लॉक और रिलीज, या शारीरिक विशेषताओं का शोषण3,4शामिल हैं । सीरम की वापसी अक्सर weak में प्रवेश करने के लिए कोशिकाओं का कारण बनता है, और सीरम के पुन: जोड़ G1 चरण5में सेल चक्र पुनः प्रवेश को बढ़ावा देता है । रासायनिक अवरोधकों ऐसे अतिरिक्त thymidine या hydroxyurea जो G1/एस सीमा, या microtubule अवरोधकों जो आम तौर पर एम चरण3,4में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने में कोशिकाओं को ब्लॉक के रूप में एजेंटों में शामिल हैं । दृष्टिकोण है कि शारीरिक विशेषताओं का शोषण शामिल mitotic शेक बंद जो mitotic कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से वे कम अनुयाई है चरण कोशिकाओं से6। हालांकि, इन सभी तकनीकों में संभावित कमियां हैं । उदाहरण के लिए, नहीं सभी कोशिका प्रकार के सीरम के अभाव में व्यवहार्यता या रासायनिक अवरोधकों की उपस्थिति बनाए रखने, और mitotic शेक के बाद कोशिकाओं की उपज mitotic अवरोधकों के साथ पूर्व तुल्यकालन के बिना सीमित है.

जल्दी भ्रूण कोशिका चक्र के अपवाद के साथ, जहां कोशिकाओं को उत्तरोत्तर आकार में कमी के रूप में वे7विभाजित, सबसे चक्र के माध्यम से आगे बढ़ कोशिकाओं विकास चरणों से गुजरना और बड़ा हो जाते हैं । इस संपत्ति counterflow केंद्रापसारक elutriation (CCE) है, जो अलग कोशिकाओं के आकार में और इसलिए सेल चक्र चरण8,9में भिंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तकनीक में शोषण किया जाता है । CCE के दौरान, कोशिकाओं को दो विरोध बलों के प्रभाव में हैं: केंद्रापसारक बल, जो कोशिकाओं रोटेशन की धुरी से दूर ड्राइव, और द्रव वेग (counterflow) है, जो रोटेशन की धुरी की ओर कोशिकाओं ड्राइव (चित्रा 1) । elutriation चैंबर में कोशिकाओं को एक संतुलन की स्थिति है जहां इन बलों बराबर है तक पहुंचने । प्रमुख संतुलन स्थिति हुक्म कारकों सेल व्यास और घनत्व हैं । के रूप में बफर समाधान के प्रवाह की दर बढ़ जाती है और counterflow खींचें बल केंद्रापसारक बल, एक नया संतुलन स्थापित है, कक्ष के अंदर कोशिकाओं की स्थिति में परिवर्तन के कारण है । सभी कोशिकाओं को चैंबर बाहर निकलने की ओर स्थानांतरित कर रहे हैं, छोटे चैंबर पहले छोड़ने वालों में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि बड़े कोशिकाओं counterflow दर तक चैंबर के भीतर रहने के लिए पर्याप्त वृद्धि हुई है उनके निकास को बढ़ावा देने के लिए । counterflow दर में लगातार वृद्धि के साथ elutriation चैंबर भागने कोशिकाओं विशिष्ट भागों में एकत्र किया जा सकता है और प्रत्येक अंश क्रमिक रूप से बढ़ते आकार की कोशिकाओं में शामिल हैं । counterflow दर में वृद्धिशील वृद्धि के साथ elutriation आयोजित करने के बजाय, अनुक्रमिक केंद्रापसारक बल में कम हो जाती है एक ही परिणाम को पूरा करेगा गति कम । elutriation की प्रक्रिया में कक्ष प्रकार, elutriation बफ़र कार्यरत, और उपयोग किए गए विशिष्ट उपकरण के आधार पर ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता होती है । इन शर्तों के तहत कोशिकाओं के अवसादन की दर सबसे अच्छा स्टोक्स कानून द्वारा वर्णित है: एसवी = [d2(दर्षायाp-दर्षायाm)/18η]. ω2आर, जहां एसवी = अवसादन वेग; d = कण का व्यास; दर्षायाp = कण का घनत्व; दर्षायाm = बफ़र का घनत्व; η = बफर की चिपचिपाहट; ω = रोटर के कोणीय वेग; और r = कण की रेडियल स्थिति । इस प्रकार, एसवी सेल व्यास और घनत्व के लिए आनुपातिक है, और के बाद से व्यास दूसरी शक्ति के लिए उठाया है, यह घनत्व से अधिक महत्वपूर्ण योगदान देता है जो आम तौर पर सेल चक्र के माध्यम से लगातार है ।

CCE का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि कोशिकाओं को रासायनिक उपचार या पोषण के अभाव के कठोर शर्तों के अधीन नहीं है और उत्कृष्ट उपज में बरामद किया जा सकता है मूलतः बेफिक्र । एक आवश्यकता यह है कि प्रश्न में कोशिकाओं व्यास में एक महत्वपूर्ण वृद्धि से गुजरना, कम से 30% की, के रूप में वे कोशिका चक्र को पार । मुख्य नुकसान विशेष केंद्रापसारक, रोटर, और सामान की लागत है । फिर भी, CCE द्वारा विशिष्ट कोशिका चक्र चरणों में समृद्ध कोशिकाओं को तैयार करने की क्षमता बहुत स्तनधारी कोशिकाओं को खमीर से जीवों में कोशिका चक्र अनुसंधान की सुविधा है9,10. इसके अलावा, हाल के अग्रिमों स्वस्थ बनाम कैंसर ऊतक से कोशिकाओं के विभाजन के लिए उपयोग करता है विस्तार कर रहे हैं, विषम मिश्रण में विभिंन प्रकार के सेल के जुदाई, और immunotherapy के लिए विशिष्ट सेल प्रकार के उत्पादन के लिए9

हमारा प्रमुख हित microtubule लक्ष्यीकरण एजेंटों (MTAs) जैसे vinca उपक्षारों और taxanes की कार्रवाई के तंत्र को समझने में किया गया है । इन दवाओं का बँटवारा में विशेष रूप से कार्य करने के लिए सोचा गया था, धुरी microtubule समारोह11,12अवरुद्ध, लेकिन हाल ही में सबूत वे भी microtubules13,14चरण का लक्ष्य हो सकता है पता चलता है. हमने हाल ही में बताया कि प्राथमिक एक्यूट लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (सभी) कोशिकाओं या तो G1 चरण में या एम चरण में मौत से गुजरना जब vincristine और अंय MTAs के साथ एक सेल चक्र पर निर्भर तरीके से इलाज किया15। CCE द्वारा विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में सभी कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता इस निष्कर्ष तक पहुँचने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. इस आलेख में, हम तकनीकी विवरण का वर्णन करते है और विभिंन कक्ष चक्र चरणों में प्राथमिक सभी कक्षों की तैयारी के लिए CCE के अनुप्रयोग के लिए व्यावहारिक युक्तियां प्रदान करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" >
नोट: यह प्रोटोकॉल प्राथमिक B-सभी कोशिकाओं के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है जो लगभग 8 & #181 से व्यास में रेंज; एम (G1 चरण) से 13 & #181; m (G2/ इस प्रकार, विशिष्ट केंद्रापसारक गति और पंप प्रवाह दर विभिंन आकार पर्वतमाला के साथ कोशिकाओं को लागू नहीं हो सकता है । फिर भी, उचित elutriation मापदंडों अवसादन दर समीकरण का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । कोशिकाओं को परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम में cultureed है के रूप में वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > 16 की एक इष्टतम घनत्व पर 1-3 x 10 6 कोशिकाओं/ अंशों के संग्रह के अपवाद के साथ जो 4 & #176 पर आयोजित किया जाता है; सी आइस कूल्ड ट्यूबों का उपयोग करते हुए, सभी कदम कमरे के तापमान पर आयोजित की जाती है और 20 & #176 पर सेट कर रहे हैं; सी अधिकतम 24 & #176; c.

< p class = "jove_title" > 1. Elutriation बफर और सामग्री की तैयारी

  1. कोशिकाओं के झुरमुट को कम करने के लिए, हांक & #39 के एक Elutriation बफर तैयार; एस संतुलित खारा समाधान (HBSS) के साथ phenol लाल पूरक के साथ 2% भ्रूण गोजातीय सीरम ( FBS), elutriation प्रक्रिया के दौरान यांत्रिक तनाव से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए, और १.६ के g/L के 2-naphthol-6, 8-disulfonic एसिड dipotassium नमक (राजग), जो सेल बाहरी नकारात्मक चार्ज renders और झुरमुट कम कर देता है ।
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए NDA के १.६ ग्राम जोड़ें.
    2. बाँझ शर्तों के तहत
    3. , एक 1 एल बोतल से ३५ एमएल HBSS की ५० एमएल शंकु ट्यूब युक्त राजग में जोड़ें । राजग भंग हो गया है जब तक ट्यूब भंवर.
    4. एक ०.२ & #181; मी फिल्टर, एक नया बाँझ ५० एमएल शंकु ट्यूब में भंग राजग हस्तांतरण का उपयोग कर. इसके बाद HBSS के बचे हुए 1 L को एनडीए से जोड़ें ।
    5. अंत में, 2% (v/v) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए HBSS में 21 मिलीलीटर FBS जोड़ें ।
      नोट: elutriation बफर तैयार किया जा सकता है और 4 & #176; C पर समय सीमा समाप्ति की तारीख तक HBSS या जब तक वहां पीएच में एक बड़ा परिवर्तन के रूप में सूचक डाई का एक तेजाब से संकेत दिया है ।
  2. लेबल ५० एमएल शंकु ट्यूबों अंशों के संग्रह के लिए ताकि धो 1 और 2 लेबल ट्यूबों (W1 और W2), भिंन 1-20 (F1 & #160;-F20), और बंद करो ।
    1. पूर्व बर्फ पर इन ट्यूबों भागों इकट्ठा करने से पहले ठंडा ।
< p class = "jove_title" > 2. Elutriation प्रणाली के विधानसभा

  1. पहले, इतना है कि सत्ता कॉर्ड चैंबर के बाईं ओर बंदरगाह के माध्यम से तंग आ गया है में स्ट्रोब विधानसभा स्थापित करें । सुनिश्चित करें कि स्ट्रोब फ़्लैश लैंप चैंबर के सामने है तो यह देखने खिड़की के साथ लाइन जब केंद्रापसारक बंद कर दिया जाएगा ।
    1. जगह में पहली बार दो फिलिप्स-प्रत्येक वर्ग के शीर्ष पर दो छेद में सिर शिकंजा कस द्वारा विधानसभा सुरक्षित और फिर प्रत्येक वर्ग के तल पर thumbscrews कस द्वारा ।
    2. बिजली कॉर्ड में स्ट्रोब शक्ति बंदरगाह के केंद्रापसारक के पीछे प्लग ।
  2. अगला, रोटर सेट सीधे नीचे केंद्रापसारक ड्राइव हब और एक टी संभाल हेक्स रिंच के साथ सुरक्षित पर ।
    नोट: यदि केंद्रापसारक गैर elutriation प्रयोजनों के लिए आवश्यक नहीं है, स्ट्रोब विधानसभा और रोटर रन के बीच केंद्रापसारक में रखा जा सकता है ।
  3. एक बार रोटर सुरक्षित है, elutriation कक्ष, काउंटर संतुलन, सील विधानसभा घूर्णन, और रोटर में एक बढ़ते प्लेट युक्त त्वरित रिहाई विधानसभा जगह है ।
    1. elutriation चैंबर पर एक हाथ से नीचे समान रूप से धक्का और काउंटर संतुलन पर दूसरे हाथ जब तक बढ़ते प्लेट पर छेद में रोटर तस्वीर में बोल्ट ।
    2. अंत में, घूर्णन सील विधानसभा में छेद में केबल के एक तरफ पिन रखने और फिलिप्स में से एक के साथ केबल के दूसरे पक्ष पर eyehole सुरक्षा सिर शिकंजा (2.1.1 में उल्लेख किया) बाईं ओर ब्रैकेट पर में लंगर केबल संलग्न ओ पर कोष्ठक के साथ च द चेंबर.
  4. अगले, प्रवाह प्रणाली इकट्ठा एक चर गति पंप और टयूबिंग का उपयोग करने के लिए elutriation चैंबर में बफर पंप और बफर इकट्ठा के रूप में यह elutriation कक्ष से बाहर बहती है ।
    1. डालें आकार 16 इनपुट ट्यूबिंग के माध्यम से चर गति पंप से आ रही ऊपर केंद्रापसारक चैंबर के बाईं ओर इतना है कि यह कक्ष में प्रवेश करती है ।
    2. इनपुट टयूबिंग के मुक्त अंत करने के लिए एक फिटिंग संलग्न और घूर्णन मुहर विधानसभा के पक्ष पर इनपुट छेद में फिटिंग डालें ।
    3. बंदरगाह के माध्यम से आकार 16 उत्पादन टयूबिंग डालें और यह घूर्णन मुहर विधानसभा के शीर्ष पर स्थानांतरण ट्यूब के लिए देते हैं ।
      नोट: फ्लो सिस्टम भी elutriation रन के बीच इकट्ठे रह सकता है.
  5. अंत में, पर केंद्रापसारक बारी और प्रयोग के लिए आवश्यक विनिर्देशों सेट ।
    1. बदल रोटर आयडी.
    2. यदि केंद्रापसारक एक समय इनपुट की आवश्यकता है, 2 ज, जो एक elutriation चलाने को पूरा करने के लिए पर्याप्त से अधिक है के लिए सेट करें ।
    3. तापमान को सेट करने के लिए 20 & #176; c के साथ एक अधिकतम temp के 24 & #176; c.
    4. के लिए त्वरण सेट मैक्स और मंदी के लिए धीमी गति से.
    5. अंत में, गति सेट करने के लिए ८६७ x g.
< p class = "jove_title" > 3. Elutriation प्रणाली के भड़काना

  1. पहले क्रम में Elutriation प्रणाली को निष्फल करने के लिए, एक ५०० मिलीलीटर प्लास्टिक की बोतल में जलाशय टयूबिंग जगह 5% ब्लीच और एक खाली 1 एल प्लास्टिक अपशिष्ट बोतल में उत्पादन ट्यूबिंग जगह है ।
    1. पर पंप बारी और 25 मिलीलीटर/मिनट के लिए गति निर्धारित और 5% ब्लीच elutriation प्रणाली के माध्यम से सभी तरह प्रवाह करने के लिए जब तक यह उत्पादन ट्यूब से बाहर अपशिष्ट बोतल में पंप है अनुमति देते हैं ।
    2. पर केंद्रापसारक बारी और यह अधिकतम निर्दिष्ट गति (८६७ x g) के लिए आने के क्रम में बुलबुले और backpressure.
    3. जारी करने की अनुमति
    4. रोकने के केंद्रापसारक । एक बार रोटर घूर्णन बंद कर दिया है, ढक्कन खोलने के लिए और किसी भी लीक के लिए चैंबर का निरीक्षण किया ।
    5. अगर कोई लीक नहीं कर रहे हैं, इस प्रणाली के माध्यम से ंयूनतम 5 मिनट के लिए ब्लीच समाधान प्रवाह करते हैं ।
  2. अगले, autoclaved पानी के साथ प्रणाली फ्लश ब्लीच के रूप में elutriation बफर जो कोशिकाओं के झुरमुट के लिए नेतृत्व कर सकते है से हाला के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं को नुकसान का कारण ।
    1. autoclaved पानी की एक 1 एल बोतल में जलाशय ट्यूबिंग जगह है और यह के माध्यम से फ्लश करने के लिए अनुमति देने के लिए ंयूनतम 10 min.
  3. पानी के साथ निस्तब्धता के बाद, प्रणाली में elutriation बफर परिचय । एक १५० मिलीलीटर कांच की बोतल का उपयोग करें जो elutriation बफर और कोशिकाओं के लिए एक जलाशय बनाने के लिए autoclaved किया गया है ।
    1. बोतल करने के लिए elutriation बफर के १०० मिलीलीटर जोड़ें और कांच की बोतल के लिए जलाशय टयूबिंग कदम इतना है कि ट्यूब बहुत नीचे है ।
    2. शुरू केंद्रापसारक और बफर प्रणाली के माध्यम से प्रवाह के लिए पानी से बाहर निकलवाने की अनुमति ।
    3. एक बार जलाशय की बोतल लगभग खाली है और पानी पूरी तरह से प्रणाली से बाहर निकाली गई है, कचरे की बोतल से जलाशय के लिए उत्पादन टयूबिंग कदम है कि बफर प्रणाली के माध्यम से पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है ।
  4. अंत में, देखने खिड़की समायोजित करें ताकि elutriation चैंबर वर्तमान गति पर देखा जा सकता है ।
    1. प्रेस के बाहर पर स्ट्रोब लैंप सत्ता बटन इतना है कि दीपक पर बदल जाता है । elutriation k को चालू करेंमस्तक भी छोड़ के लिए सभी तरह के केंद्रापसारक के बाहर पर ।
    2. देखने की खिड़की के माध्यम से देख रहे हैं, जबकि धीरे elutriation चैंबर देखने में आता है जब तक सही करने के लिए घुंडी बारी और स्ट्रोब प्रकाश रोटर के रोटेशन के साथ समय में है.
      नोट: इस स्थिति में elutriation सिस्टम को तब तक छोड़ा जा सकता है जब तक कि कोशिकाएं prepped न हों.
< p class = "jove_title" > 4. सेल के नमूने की तैयारी

  1. गणना कोशिकाओं और aliquot ३०० करने के लिए विकास मध्यम में कई ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में ४००,०००,००० । 3 min.
  2. के लिए १२१० x g पर कक्षों को नीचे स्पिन
  3. महाप्राण बंद विकास मीडिया और elutriation बफर के 25 मिलीलीटर में कोशिकाओं को reसस्पेंड ऊपर और धीरे नीचे pipetting द्वारा ।
  4. कक्ष का झुरमुट कम करने के लिए, एक 25 गेज सुई के माध्यम से दो बार कोशिकाओं को पारित.
    1. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर कोशिकाओं को आकर्षित और फिर 25 गेज सुई संलग्न और एक बाँझ ५० एमएल शंकु ट्यूब के अंदर की दीवार पर के माध्यम से कोशिकाओं को पारित. यह दोहराएं जब तक सभी 25 मिलीलीटर सुई के माध्यम से पारित कर दिया है ।
    2. एक नई सुई और सिरिंज प्राप्त करने और एक बार ऊपर की प्रक्रिया को दोहराने.
      चेतावनी: सिरिंज सुई sharps कंटेनरों में रखा जाना चाहिए.
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को सुई के माध्यम से तुरंत elutriation प्रणाली के लिए उंहें शुरू करने से पहले धकेल रहे है एक ंयूनतम करने के लिए सेल का झुरमुट रखने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 5. Elutriation प्रणाली और अंशों के संग्रह में सेल नमूना का परिचय

  1. Elutriation प्रणाली में सेल नमूने जलाशय टैंक जो शेष Elutriation बफर रीसाइक्लिंग के माध्यम से है में डालने के द्वारा कक्ष नमूना परिचय .
    1. चलो कोशिकाओं प्रणाली में प्रवेश और elutriation कक्ष के भीतर संतुलन तक पहुंचने ।
      नोट: इस प्रक्रिया के बारे में 5 मिनट लग जाएगा और प्रगति के रूप में वे देखने खिड़की के माध्यम से कक्ष में प्रवेश कोशिकाओं को देख कर ट्रैक किया जा सकता है । सभी कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए कक्ष में हैं, eluent की एक बूंद ले लो, एक गिलास स्लाइड पर जगह है, और एक खुर्दबीन के नीचे देखें । यदि नमूना बरकरार कोशिकाओं से मुक्त है, यह उनकी अवधारण चैंबर में पुष्टि करता है ।
  2. भागों का संग्रह शुरू एक बार सभी कोशिकाओं को कक्ष में प्रवेश किया है और वहां कक्ष में संतुलन में है जो चैंबर के व्यापक भाग में एक अलग सीमा है ।
    1. उत्पादन ट्यूब को ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब लेबल W1 पर ले जाकर शुरू करते हैं । इस अंश के लिए elutriation बफर के ५० मिलीलीटर इकट्ठा, जलाशय टैंक पर नजर रखने के लिए और जब आवश्यक elutriation बफर के साथ भरने के लिए सुनिश्चित कर रहे हैं ।
      नोट: आदेश में सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को प्रणाली में प्रवेश किया है बनाने के लिए, जलाशय टैंक को पहली बार फिर से भरना पहले लगभग खाली हो जाने की अनुमति । पहली रिफिलिंग के बाद यह आवश्यक नहीं होगा कि जलाशय के लगभग खाली हो जाने का इंतजार किया जाए. इसके अलावा, कभी नहीं टैंक के रूप में इस बुलबुले और वापस प्रणाली में दबाव पैदा करेगा खाली बनने के लिए अनुमति नहीं है ।
    2. एक बार ५० मिलीलीटर W1 के लिए एकत्र किया गया है, एक साथ ८२१ x g करने के लिए गति में परिवर्तन और W2 लेबल शंकु ट्यूब के लिए उत्पादन ट्यूब चाल और इस गति से ५० मिलीलीटर अधिक इकट्ठा ।
    3. तालिका 1 में संकेत के रूप में गति और इकट्ठा भागों को बदलने जारी है । सुनिश्चित करें कि जलाशय के टैंक में मीडिया है और हर समय शंकु ट्यूबों को बर्फ पर रखें । अंत में, धीरे गति घटने के रूप में सही करने के लिए घुंडी मोड़ से देखने खिड़की को समायोजित करें.
    4. एक बार सभी 20 भागों एकत्र किया गया है रोकने के लिए और शंकु ट्यूब में ५० मिलीलीटर इकट्ठा बंद करो लेबल ।
< p class = "jove_title" > 6. Elutriation प्रणाली के फ्लशिंग

  1. के बाद केंद्रापसारक पूरी तरह से बंद कर दिया है autoclaved पानी की 1 एल बोतल में जलाशय ट्यूब डाल द्वारा प्रणाली फ्लश और उत्पादन बेकार बोतल में वापस ट्यूब ।
    1. पंप गति बारी करने के लिए ५० एमएल/मिनट और पानी प्रणाली के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति जब तक यह समाप्त हो गया है ।
  2. पंप बंद, जल्दी रिलीज विधानसभा से इनपुट और आउटपुट नली को हटा दें, और लंगर केबल से पिन बाहर खींचो ।
    1. त्वरित-रिलीज़ असेंबली रोटर से निकालें ।
      नोट: क्या के लिए इस्तेमाल किया जाएगा केंद्रापसारक पर निर्भर करता है, elutriation प्रणाली अब के रूप में छोड़ा जा सकता है । अन्यथा ऊपर बताए अनुसार विपरीत क्रम में पूरे विधानसभा को नीचे उतारा जा सकता है । elutriation चैंबर जल्दी रिलीज विधानसभा से हटाया जा सकता है और एक अल्ट्रासोनिक जल स्नान का उपयोग रन के बीच साफ । यह मलबा और संदूषणों को चैंबर की दीवार से निकालता है जो बाद में रन नकारात्मक को प्रभावित कर सकता है ।
< p class = "jove_title" > 7. भिन्न और G1 या G2 के संग्रह का विश्लेषण/

< p class = "jove_content" > नोट: elutriation की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, प्रत्येक भिन्न कक्ष गणना, कक्ष व्यास और डीएनए सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया है, और पूल G1 या G2 में कोशिकाओं के बनाए जाते हैं/immunoblot विश्लेषण के लिए चरणों में वर्णित के रूप में प्रतिनिधि परिणाम । इस प्रोटोकॉल खंड का वर्णन कैसे इन पूल बनाने के लिए और उंहें प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार करेंगे ।

  1. स्पिन पर प्रत्येक अंश 5 मिनट के लिए २००० x g पर 4 & #176; C और महाप्राण ऑफ़ elutriation बफ़र.
  2. दोनों एक G1 चरण पूल और एक G2/एम चरणों पूल प्राप्त करने के क्रम में एक साथ भागों गठबंधन । G1 चरण पूल के लिए
    1. , जो अंश reसस्पेंड ७८८ x g की गति सीमा में ६६१ x g (F1-F5) फॉस्फेट बफर खारा समाधान (पंजाब) के कुल 1 मिलीलीटर में एकत्र किए गए और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण । G2/M चरणों पूल के लिए, ३८७ x g और ३३३ x g (F17-F20) की गति सीमा में एकत्र किए गए थे जो भिन्न reसस्पेंड ।
    2. 5 मिनट के लिए २००० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन 4 & #176; सी और महाप्राण बंद पंजाबियों.
  3. वृद्धि मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और एक सेल गिनती ले ।
  4. प्रत्येक पूल से एक aliquot ले डीएनए सामग्री के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए के माध्यम से propidium आयोडाइड धुंधला और प्रवाह cytometric विश्लेषण < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
    नोट: प्रत्येक पूल के शेष आगे प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्राथमिक सभी कोशिकाओं (3-4 x108) केंद्रापसारक elutriation के अधीन थे और दो धो भागों और बीस मुख्य भागों में एकत्र, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है । तालिका 1 प्रतिनिधि डेटा दिखाता है जहां प्रत्येक अंश में कक्षों की कुल संख्या और साथ ही साथ संबंधित रोटर गति प्रस्तुत की जाती है । कुल मिलाकर उपज ८०% से अधिक आम तौर पर था । व्यक्तिगत अंशों में कोशिका व्यास के माप की पुष्टि की है कि सेल व्यास elutriation (चित्रा 2) आगे बढ़ने के साथ वृद्धि हुई है । ये परिणाम दो स्वतंत्र निर्धारणों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं और उच्च डिग्री के डेटा reproducibility को प्रतिबिंबित करते हैं । भागों अगले propidium आयोडाइड धुंधला और प्रवाह cytometry के अधीन थे डीएनए सामग्री (चित्रा 3) निर्धारित करने के लिए । जल्दी अंश (F1-F5) 2N डीएनए G1 चरण का प्रतिनिधित्व सामग्री के साथ लगभग अनंय रूप से कोशिकाओं को समाहित । G1 चरण और एस चरण में कोशिकाओं का मिश्रण मध्यवर्ती भागों में मनाया गया था (F6-F9) और 4N डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं F10 में शुरू मनाया गया । बाद में अंशों 4N डीएनए G2 का प्रतिनिधित्व सामग्री के साथ मुख्य रूप से कोशिकाओं/ आरेख 2 के परिणामों के साथ इन डेटा ने कक्ष आकार और कक्ष चक्र चरण के बीच संबंध की पुष्टि की ।

इन परिणामों के आधार पर, भिन्न F1-F5 G1 चरण में कक्षों का एक पूल बनाने के लिए संयुक्त थे, और भिन्न F17-F20 G2/M चरण में कक्षों का एक पूल बनाने के लिए संयोजित किए गए थे । G1 चरण पूल में 2N डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं का अनुपात आम तौर पर ९९% था, और G2/एम पूल में 4N डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं के अनुपात आम तौर पर ८५% था, के रूप में propidium आयोडाइड धुंधला और प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित । एसिंक्रोनस शर्तों के तहत, ६०-७०% प्राथमिक सभी कोशिकाओं G1 चरण में है और 15-20% G2/एम चरणों मेंहैं15, इस प्रकार elutriation के बाद प्राप्त मूल्यों संवर्धन के उच्च स्तर को प्रतिबिंबित । आगे कोशिका चक्र चरण के संबंध में दो पूल को प्रमाणित करने के लिए, प्रत्येक से अर्क या तो G1 या G2 के मार्करों के साथ immunoblotting के अधीन थे/ सबसे पहले, हम एक phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी जो retinoblastoma (आरबी) या तो Ser-८०७ या Ser-८११ पर प्रोटीन phosphorylated पहचानता उपयोग किया है, क्योंकि यह अच्छी तरह से स्थापित है कि आरबी तेजी से कोशिकाओं के रूप में phosphorylated हो जाता है सेल चक्र 17 के माध्यम से अग्रिम . के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, phospho के स्तर आरबी बहुत अधिक थे में कोशिकाओं में G2/एम पूल बनाम G1 चरण पूल, अपेक्षाओं के अनुरूप । हम भी cyclin B1 के लिए जांच की है, जो सबसे अधिक G2 में व्यक्त की है/एम चरण कोशिकाओं, और cyclin D1 के लिए, जो सबसे G1 चरण कोशिकाओं18 (चित्रा 4) में व्यक्त की है । G2/M पूल G1 पूल की तुलना में cyclin B1 के बहुत उच्च स्तर था, अपेक्षाओं के अनुरूप । Cyclin D1 इन तैयारियों में केवल एक कमजोर संकेत दिया है, लेकिन फिर भी G1 पूल में और G2 में detectable/ GAPDH एक नियंत्रण का इस्तेमाल किया गया था बराबर प्रोटीन लदान की पुष्टि ।

मानक प्रोटोकॉल में संशोधन उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए और इष्टतम प्रदर्शन के लिए शर्तों को स्थापित करने के लिए प्रदर्शन किया गया । सबसे पहले, एकत्र किए गए अंशों की संख्या कम हो गई थी, मानक बीस से केवल तीन में, तालिका 1 से निर्धारित गति का उपयोग करके G1, S या G2 में कक्षों के संग्रह के लिए टर्मिनल बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए, तालिका 2 में दर्शाए अनुसार । अंश F1 और F3 के डीएनए की सामग्री का विश्लेषण चित्र 5में दिखाया गया है । 1 अंश उच्च G1 चरण (९५%) में समृद्ध कोशिकाओं को समाहित और मानक शर्तों के तहत प्राप्त की है कि इसी तरह की पवित्रता के इस प्रकार था (चित्र 3) । हालांकि, 3 अंश, जाहिरा तौर पर अत्यधिक G2/एम चरण में समृद्ध कोशिकाओं, एक मिश्रित जनसंख्या दिया G1 और एस चरणों में कोशिकाओं के साथ भी मौजूद है । G2/M कोशिकाओं मानक शर्तों के तहत ८५% की तुलना में कुल का केवल ५१% का प्रतिनिधित्व किया । ये परिणाम इंगित करता है कि नमूना गुणवत्ता compromises अंशों की संख्या को कम करने के द्वारा प्रक्रिया को सरल करने के लिए प्रयास । अगले, हम अंश मात्रा को कम करने के प्रभाव का परीक्षण, के रूप में एक एजेंट की खपत को कम करने का मतलब है । एक मानक elutriation को छोड़कर प्रदर्शन किया गया था कि ४० एमएल के बजाय ५० एमएल अंश एकत्र किए गए । भिंन F1 और F20 डीएनए सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया । के रूप में चित्रा 5Bमें दिखाया गया है, भिंन F1 अत्यधिक G1 चरण कोशिकाओं (९८%), कि मानक शर्तों के तहत प्राप्त करने के लिए समान में समृद्ध था । हालांकि, भिन्न F20 सभी तीन चरणों में कक्ष, G2/M चरण में कक्षों के साथ केवल ६४% की कुल का प्रतिनिधित्व करता है, मानक शर्तों के तहत ८५% की तुलना में. ये परिणाम इंगित करता है कि भिन्न खंड को कम करने भी नमूना गुणवत्ता compromises ।

Figure 1
चित्र 1 . counterflow केंद्रापसारक elutriation के सिद्धांत ।
ध्यान रखें कि कोशिकाओं की elutriation को या तो यहां संकेत के रूप में counterflow की दर में वृद्धि से या रोटर गति कम करके हासिल किया जा सकता है । मैकमिलन प्रकाशकों लिमिटेड से अनुमति द्वारा अनुकूलित: [नेचर प्रोटोकॉल] (रेफरी 8.), कॉपीराइट (२००८)8कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . प्राथमिक सभी कोशिकाओं के व्यास elutriation अंश के साथ बढ़ जाती है ।
औसत व्यास प्रत्येक नमूना प्रति ५००-४,५०० व्यक्तिगत कोशिकाओं से डेटा रिकॉर्ड जो एक सेल विश्लेषक का उपयोग कर एक अंश के लिए निर्धारित किया गया था । आंकड़ों से पता चला दो स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब ± S.D. हैं । ध्यान दें कि कई बिंदुओं के लिए त्रुटि पट्टियां प्रतीक से छोटी होती है और स्पष्टता के लिए छोड़ दी गई थीं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . डीएनए सामग्री का विश्लेषण विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में प्राथमिक सभी कोशिकाओं की सफल जुदाई की पुष्टि करता है.
प्रत्येक अंश की 10 मिलीलीटर ७०% ेतोः, propidium आयोडाइड में दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण में तय किया गया था, जैसा कि15बताया गया है । Propidium आयोडाइड एकीकृत तीव्रता (x-अक्ष) बनाम सेल काउंट (y-अक्ष) को प्रत्येक चरण में कक्षों के उस भाग का निर्धारण करने के लिए प्लॉट किया गया था, जहां 2N डीएनए सामग्री G1 चरण और 4N डीएनए सामग्री को इंगित करती है या तो G2 या M चरणों में कक्षों को इंगित करती है. दिखाया डेटा एक प्रतिनिधि प्रयोग से हैं और आवश्यक समान परिणाम चार दोहराने में प्राप्त किया गया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . कोशिका चक्र के Immunoblot विश्लेषण-परित में प्रोटीन संबंधीअंशों.
प्राथमिक सभी कोशिकाओं के एक मानक elutriation के बाद, भिन्न F1-F5 G1 चरण पूल बनाने के लिए संयुक्त थे और भिन्न F17-F20 एक G2/एम चरण पूल बनाने के लिए संयुक्त थे. अर्क तैयार किया गया और ४० µ जी/लेन immunoblot विश्लेषण के अधीन, के रूप में वर्णित पहले15, phospho के लिए एंटीबॉडी के साथ-आरबी (Ser807/811), cyclin B1, या cyclin D1, सभी 1 पर इस्तेमाल किया: 2000 कमजोर पड़ने । GAPDH (1:10000) एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . उपयुक्त elutriations से डेटा गाये ।
A) एकत्र किए गए अंशों की संख्या को घटाने का प्रभाव । केवल तीन मुख्य अंश (F1-F3), के बजाय मानक बीस, १०० मिलीलीटर के प्रत्येक, गति पर एकत्र किए गए के रूप में तालिका 2 में संकेत दिया । भिंन F1 और F3 चित्रा 3के रूप में डीएनए सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया । ख) अंश मात्रा को कम करने का प्रभाव । बीस अंश, 1 तालिका में के रूप में एक ही शर्तों के तहत एकत्र किए गए थे, लेकिन elutriation बफ़र के बजाय मानक ५० मिलीलीटर की केवल ४० मिलीलीटर प्रत्येक के लिए उपयोग किया गया था । भिंन F1 और F20 चित्रा 3के रूप में डीएनए सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अंश गति (rpm) जी बल कुल कक्ष (x 10 ^ 6)
w1 ३००० ८६७ एक्स जी १७.७५
w2 २९२० ८२१ एक्स जी ७.००
f1 २८६० ७८८ एक्स जी ४.६०
f2 २८०० ७५५ एक्स जी १०.७५
f3 २७४० ७२३ एक्स जी १५.२५
f4 २६८० ६९२ एक्स जी २२.५०
f5 २६२० ६६१ एक्स जी २६.७५
f6 २५६० ६३१ एक्स जी २५.००
f7 २५०० ६०२ एक्स जी २२.७५
f8 २४४० ५७३ एक्स जी १८.००
f9 २३८० ५४६ एक्स जी १४.००
f10 २३२० ५१८ एक्स जी १०.७५
f11 २२६० ४९२ एक्स जी ७.४३
f12 २२०० ४६६ एक्स जी ८.६३
f13 २१४० ४४१ एक्स जी ६.६३
f14 २१०० ४२५ एक्स जी ४.९८
f15 २०६० ४०९ एक्स जी ३.४६
f16 २०२० ३९३ एक्स जी ३.४३
f17 १९८० ३७८ एक्स जी २.६३
f18 १९४० ३६३ एक्स जी ३.१७
बुन १९०० २४८ एक्स जी २.७८
f20 १८६० ३३३ एक्स जी १.६६
रुको 0 0 एक्स जी ५.१९
कुल यील्ड २४५.०६
प्रतिशत उपज ८१.६९

तालिका 1. सेल यील्ड और प्रत्येक अंश के लिए इसी रोटर गति ।
सेल गणना एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । कुल उपज (3 एक्स 108 कोशिकाओं) इनपुट बनाम व्यक्तिगत अंशों के योग से निर्धारित किया गया था । डेटा दो प्रतिनिधि प्रयोगों का एक औसत है । केंद्रापसारक बल और इसी रोटर गति दिया जाता है ।

अंश गति (rpm) जी बल
w1 ३००० ८६७ एक्स जी
w2 २९२० ८२१ एक्स जी
f1 २६२० ६६१ एक्स जी
f2 २०२० ३९३ एक्स जी
f3 १८६० ३३३ एक्स जी
रुको 0 0 एक्स जी

तालिका 2. इष्टतम elutriation के लिए गति मापदंडों ।
दिखाया गया है केंद्रापसारक बलों और बहाकर और तीन एक संपीड़ित इष्टतम elutriation में एकत्र भागों के लिए इसी रोटर गति । विवरण के लिए इसी डीएनए सामग्री और पाठ के लिए चित्रा 5 देखो ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम CCE का उपयोग कर सेल चक्र के विभिंन चरणों में प्राथमिक सभी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है । इष्टतम शर्तों के तहत G1 चरण में कोशिकाओं की एक अनिवार्य रूप से शुद्ध आबादी और G2/एम चरणों में कोशिकाओं की एक उच्च समृद्ध जनसंख्या आसानी से उत्कृष्ट उपज में प्राप्त किया जा सकता है, और उच्च एस चरण में समृद्ध कोशिकाओं को भी अगर वांछित प्राप्त किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत परिणाम एक प्राथमिक सभी संस्कृति का उपयोग कर प्राप्त किया गया (विशेष रूप से, सभी-5), और मूलतः समान परिणाम एक स्वतंत्र संस्कृति के साथ प्राप्त किया गया है, सब-215। इसके अलावा, अंय सभी प्राथमिक तिथि करने के लिए जांच की संस्कृतियों अतुल्यकालिक विकास के दौरान समान घनत्व पर्वतमाला है, और संभावना इसी तरह जब CCE के अधीन प्रदर्शन करेंगे । हमारी पूर्व अध्ययनों से यह भी पता चला है कि अन्य ल्यूकेमिया सेल लाइनों, HL60 और K562 सहित, CCE19,20का उपयोग कर विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में अलग किया जा सकता है. प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं मोनो बिखरे हुए हैं और चलाने के शुरू में नहीं झुरमुट में शामिल हैं; counterflow दर और रोटर गति की शर्तों का अनुकूलन; प्रणाली के घटकों को सुनिश्चित करने के लिए स्वच्छ और मलबे से मुक्त कर रहे हैं; और प्रवाह लाइनों में हवा के बुलबुले की शुरूआत से परहेज । CCE कोशिकाओं है कि कोशिका के आकार में काफी वृद्धि के रूप में वे सेल चक्र के माध्यम से अग्रिम के साथ सबसे अच्छा काम करता है । निलंबन में कोशिकाओं की एक दी जनसंख्या के लिए, यह प्रारंभिक और आसानी से डीएनए सामग्री और पक्ष तितर बितर, कोशिका के आकार पर निर्भर बाद के बीच संबंध का परीक्षण करके स्थापित किया जा सकता है । दोनों मापदंडों propidium आयोडाइड धुंधला के बाद प्रवाह cytometry द्वारा एक साथ मापा जा सकता है, जैसा कि हम15वर्णित है । पक्ष तितर बितर और डीएनए सामग्री के बीच एक रैखिक संबंध विश्वास है कि कोशिका चक्र अग्रिम के साथ सेल आकार बढ़ जाती है और इस तरह है कि CCE सेल चक्र चरण के आधार पर कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है प्रदान करता है ।

जैसा कि हम (चित्रा 5) दिखाया है, अनुकूलित प्रक्रिया से विचलन, विशेष रूप से G2 में कोशिकाओं के लिए नमूना गुणवत्ता, और एम चरणों में परिणाम. हालांकि, भिन्न या भिन्न वॉल्यूम की संख्या में कमी G1 चरण (चित्र 5) में कक्षों की शुद्धता को प्रभावित नहीं appreciably. इस प्रकार, प्रक्रिया के शॉर्टकट अगर केवल शुद्ध G1 चरण कोशिकाओं की जरूरत है बर्दाश्त किया जा सकता है । हालांकि CCE आसानी से निलंबन सेल संस्कृतियों के लिए उत्तरदाई है, यह भी उपसेलुलर भागों के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, murine pre-B कक्षों से नाभिक सफलतापूर्वक आकार-CCE8का उपयोग कर अलग किया गया है । अनुयाई सेल प्रकार क्षमता के झुरमुट के लिए उनकी प्रवृत्ति और संभव पालन के लिए टयूबिंग और elutriation चैंबर की सतहों के कारण संभावित समस्याओं मुद्रा और इस प्रकार सावधानी के साथ जांच की जानी चाहिए ।

CCE की मुख्य सीमा उपकरणों की लागत है; एक संभव समाधान के लिए एक प्रयोगशाला है जो आवश्यक उपकरण के साथ सहयोग है । नोट हालांकि कि रोटर एक समर्पित साधन है, केंद्रापसारक सामांय केंद्रापसारक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार CCE में पूरी तरह से निवेश लागत को कम करने । एक और सीमा है कि प्रयोगों का निर्धारण अधिक समस्याग्रस्त है जैसे कि सीरम भुखमरी या रासायनिक तुल्यकालन के रूप में अंय तरीकों के लचीलेपन की तुलना में । Elutriation रन आमतौर पर 5-6 घंटे ले, और यदि प्राप्त कक्ष बाद में अल्पकालिक या बहु-समय बिंदु प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं, यह परिणाम शेड्यूलिंग में असुविधाएं हो सकते हैं । इसका सबसे बड़ा फायदा यह है कि इस पद्धति द्वारा प्राप्त कोशिकाएँ बेफिक्र हैं और कई दिनों तक बिना किसी कष्ट के किसी भी लक्षण के कल्चर की जा सकती हैं, जैसा कि हमने१५दिखाया है. यह रासायनिक द्वारा सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं के साथ विरोधाभासों का मतलब है जो दवा प्रेरित नुकसान बंदरगाह हो सकता है । एक ताजा अध्ययन, NB4 गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया विस्फोटों से व्युत्पंन कोशिकाओं का उपयोग, सीधे CCE और सीरम भुखमरी, hydroxyurea, या एक cyclin-निर्भर कळेनासे 1 अवरोध करनेवाला, RO-३३०६21के साथ उपचार के साथ गिरफ्तारी सहित अन्य तरीकों, की तुलना में. Elutriated कोशिकाओं और कोशिकाओं तुलनीय चरणों में गिरफ्तार डीएनए सामग्री और cyclin अभिव्यक्ति के संबंध में इसी तरह दिखाई दिया । हालांकि, जब proteome की जांच की थी, प्रोटीन बहुतायत में बड़े बदलाव, विशेष रूप से तनाव से संबंधित और गिरफ्तारी विशिष्ट प्रोटीन, गिरफ्तार कोशिकाओं में और नहीं समकक्ष कक्ष आकार पदों पर elutriated कोशिकाओं में मनाया गया । इन परिणामों को बेफिक्र कोशिकाओं के उत्पादन के लिए CCE की उपयोगिता पर प्रकाश डाला और जोर है कि सावधानी जब अंय साधनों से सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं से डेटा की व्याख्या इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

अनिशा कोठारी इस समय सेंट झड चिल्ड्रन रिसर्च अस्पताल में सेल और आणविक जीवविज्ञान विभाग में हैं.

Acknowledgments

इस काम को NIH CA109821 (to टीसीसी) ने सपोर्ट किया था । हम Beckman-कल्टर को उदारता से धन उपलब्ध कराने के लिए प्रकाशन लागत को कवर करने और elutriation प्रणाली के सेट अप और प्रचालन में तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । हम प्रारंभिक प्राथमिक सभी संस्कृतियों प्रदान करने के लिए डॉ फ्रेड Falkenburg धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics