원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

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Cancer Research

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Summary

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

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Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

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Abstract

셀을 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해를 발전의 중심이 되었습니다. 일반적인 기술이 포함 혈 부족; 화학 물질 세포에서 다른 세포 주기 단계; 체포 또는 mitotic 쉐이크-오프는 그들의 감소 된 준수 악용의 사용. 그러나, 이러한 모든 단점이 있다. 예를 들어 혈 청 기아 잘 정상 세포에 대 한 하지만 덜 oncogene 활성화 나 종양 억제기 손실로 인해 손상 된 세포 주기 검문소와 종양 세포에 대 한 잘 작동합니다. 마찬가지로, 화학적 치료 세포 인구는 약물 유발 손상 항구 하 고 스트레스 관련 변경 표시 수 있습니다. 이러한 문제를 circumvents는 기술 셀 2 개의 반대 힘, 원심력과 유체 속도, 크기 및 밀도 기준으로 셀의 분리에 어떤 결과를 받게 됩니다 특히 원심 elutriation (CCE) 이다. 때문에 세포 주기를 통해 일반적으로 발전 확대, CCE 다른 세포 주기 단계에 셀을 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포에이 기술을 적용. 최적의 조건에서 우수한 수익률에 g 1 단계 셀의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 세포 인구를 항 암 제 약물의 행동의 공부 세포 주기-종속 메커니즘 및 다른 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다. 우리는 또한 어떻게 표준 절차 수 있습니다 수정 최적이 아닌 성능 결과 보여 하 고 기술의 한계를 논의. 응용 프로그램 및 다른 종류의 세포에 기술 탐구 상세한 방법론 제시 용이 해야.

Introduction

배양된 세포는 일반적으로 비동기적으로 성장 하 고 개별 세포는 세포 주기의 다른 단계에 존재. 일부 생물 자연스럽 게 동기 세포 주기 전시 또는 특정 생리 적인 자극에 의해 동기화 할 수 있습니다. 예를 들면 점액 형 Physarum polycephalum 의 거 대 한 plasmodia 내 핵 매우 동기 패션1Desmodesmus quadricauda 는 빛과 어둠을 번갈아 하 여 동기화 할 수 있습니다 녹색 조류의 세포 분 기간2. 이러한 생물 독특한 실험 특성을 제공, 그들은 부적당 하 게 포유류 세포의 복잡 한 모델. 포유류 세포 인구를 인위적으로 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해 및 세포 주기 검문소의 분자 기준 발전 중심 되었습니다. 일반적인 방법에는 혈 청 부족, 화학 블록 및 릴리스 또는 물리적 특성3,4악용 포함 됩니다. 혈 청의 철수 자주 세포 정지, 입력 하 고 g 1 단계5에 세포 주기 재입국을 촉진 하는 혈 청의 다시 추가 합니다. 화학 억제제 초과 티 미 딘 또는 G1/S 경계에서 세포를 차단 hydroxyurea microtubule 억제제는 일반적으로 M 단계3,4에 셀을 체포 대리인을 포함 합니다. Mitotic 쉐이크-오프 이후 그들은 덜 interphase 셀6보다 부착에 mitotic 세포에 대 한 풍부 하 게 사용할 수 있는 물리적 특성을 악용 하는 방법이 포함 합니다. 그러나, 이러한 모든 기술 잠재적인 단점이 있다. 예를 들어 모든 셀 형식 mitotic 억제제와 사전 동기화 없이 제한 mitotic 쉐이크-오프 후 혈 청 또는 화학 억제제의 존재의 부재와 셀의 수익률에서 생존을 유지 합니다.

어디 셀 점차적으로 감소 크기에 그들은7분할 초기 배아 세포 주기를 제외 하 고 대부분의 세포 주기를 통해 발전 성장 단계를 받아야 더 큰 되 고. 이 속성은 특히 원심 elutriation (CCE) 크기에 서로 다른 세포를 분리 하는 데 사용할 수 있으며 따라서 세포 주기에서8,9단계 기법에 악용 됩니다. CCE, 동안 세포는 2 개의 반대 세력의 영향 아래: 회전의 축에서 셀 드라이브, 원심력과 유체 속도 (특히), 회전 (그림 1)의 축으로 셀 드라이브. Elutriation 챔버에 셀이이 힘 같은지는 평형 위치에 도달 합니다. 평형 위치를 지시 하는 핵심 요소는 셀 직경 및 밀도 있습니다. 버퍼 솔루션의 속도 증가 흐름으로 원심력을 능가 하는 특히 끌기 힘, 새로운 균형을 설립, 챔버 내부 셀의 위치에 변화를 일으키는. 모든 세포는 특히 속도 충분히 증가 하 여 그들의 출구를 홍보를 때까지 더 큰 셀 챔버 내에 유지 하는 반면 먼저 챔버를 떠나 작은 것 들의 결과로 챔버 출구 쪽으로 이동 했다. 특히 속도 연속 증가와 elutriation 챔버 탈출 셀 특정 분수에 수집 될 수 있습니다 고 각 분수 순차적으로 증가 하는 크기의 셀을 포함 합니다. 특히 속도 증분 증가와 elutriation 실시, 대신 원심 분리 속도 감소 하 여 원심력에 순차 감소 동일한 결과 달성할 것 이다. Elutriation 과정 세포 유형과 elutriation 버퍼, 사용 하는 특정 장치에 따라 최적화를 있어야 합니다. 이러한 조건에서 셀의 침전 속도 최고의 Stokes 법칙에 의해 설명: SV = [d2pm) / 18η].ω2r, 어디 SV = 침전 속도; d =; 입자의 직경 Ρp =; 입자의 밀도 Ρm = 버퍼;의 밀도 Η =; 버퍼의 점성 Ω; 회전자의 각 속도 = 그리고 r = 입자의 방사형 위치. 따라서, SV는 셀 직경 및 밀도에 비례 하 고 직경 두 번째 전력 발생, 이후 그것은 일반적으로 세포 주기를 통해 상수는 밀도 보다 더 크게 기여.

CCE의 중요 한 장점은 셀 화학 치료 또는 영양 부족의 가혹한 조건에 적용 되지 않습니다 우수한 수익률 본질적으로 교란된에 복구할 수 있습니다. 요구는 문제의 세포 직경, 적어도 30%의 상당한 증가 받게 세포 주기 통과. 주요 단점은 특수 원심 분리기, 회전자, 및 액세서리의 비용입니다. 그럼에도 불구 하 고, 셀 CCE에 의해 특정 세포 주기 단계에서 풍성 하 게 준비 하는 능력은 크게 포유류 세포9,10에서 효 모 유기 체에서 세포 주기 연구를 촉진 했다. 또한, 최근 발전 암 조직, 이질적인 혼합물에서 특정 종류의 세포 immunotherapy9에 대 한 생산을 다른 세포 유형의 분리 대 건강 한에서 세포의 분리에 사용을 확산 되고있다.

우리의 주요 관심 vinca 알 카 로이드, taxanes 등 에이전트 (Mta)를 대상으로 하는 microtubule의 행동의 메커니즘을 이해 하고있다. 이 약은 유사 분열, 스핀 들 microtubule 함수11,12, 차단에 독점적으로 행동 생각 했다 하지만 최근 증거 그들은 또한 interphase microtubules13,14을 대상 수 있습니다 나왔다. 우리는 최근 주 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) 셀 받 다 죽음에 g 1 단계 또는 m에서 vincristine, 세포 주기 의존적인 방식으로15에서 다른 Mta로 치료 하면 단계를 했다. CCE에 의해 다른 세포 주기 단계에 모든 세포를 분리 하는 기능은이 결론에 도달에서 쓸모 있었다. 이 문서에서는, 우리는 기술적인 세부 사항을 설명 하 고 다른 세포 주기 단계에서 모든 셀 기본 준비에 CCE의 응용 프로그램에 대 한 실용적인 팁을 제공.

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Protocol


참고:이 프로토콜 기본 B-모든 세포 직경 약 8 µ m (G1 단계)에서 13 µ m (G2/M 단계)에서 범위에 대 한 최적화 되었습니다. 따라서, 특정 원심 분리기 속도 펌프 유량 수 없습니다 다른 크기 범위에 있는 셀에 적용. 그럼에도 불구 하 고, 적절 한 elutriation 매개 변수 침전 비율 방정식을 사용 하 여 추정 될 수 있습니다. 셀 설명된 16 10 6 셀/mL x 1-3의 최적의 밀도 정의 된 혈 청 자유로운 매체에 교양. 분수의 얼음 냉각 튜브를 사용 하 여 4 ° C에서 실시 하는 컬렉션, 제외한 모든 단계 실내 온도 및 24의 최대 20 ° C에서 원심 분리기에서 실시 하는 ° C.

1. Elutriation 버퍼의 준비 및 자료

  1. 세포의 응집을 감소, 행 크의 elutriation 버퍼를 준비 하기 위해 ' s 균형 소금물 (HBSS) 페 놀 레드 2% 소 태아 혈 청 (보충 FBS), elutriation 프로세스, 부정 청구 셀 외관을 렌더링 하 고 응집 감소 2-naphthol-6,8-disulfonic 산 dipotassium 소금 (NDA)의 1.6 g/L 중 기계적 스트레스 로부터 세포를 보호 하.
    1. NDA의 1.6 g을 50 mL 원뿔 튜브 추가할.
    2. 살 균 조건 추가 HBSS의 35 mL 1 L 병에서 NDA를 포함 50 mL 원뿔 튜브. 튜브는 NDA 해산 했다 때까지 소용돌이.
    3. 새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 녹아 NDA를 전송 0.2 µ m 필터를 사용 하 여. HBSS 나머지 1 리터에 기밀 엄수 계약서 추가.
    4. 마지막으로 2% (v/v)의 최종 농도를 HBSS 21 mL FBS 추가.
      참고: elutriation 버퍼 수 준비 되며 만료 날짜는 HBSS 또는 지시자 염료의 황으로 pH에 큰 변화가 있을 때까지 때까지 4 ° C에 저장.
  2. 표시 튜브 1과 2 (W1, W2) 분수 1-20 (F1 ~ F20), 세척 하 고 중지 되도록 50 mL 원뿔 튜브 분수의 컬렉션에 대 한 라벨.
    1. 분수를 수집 하기 전에 미리 얼음이이 튜브를 진정.

2. Elutriation 시스템의 조립

  1. 첫째, 스트로보 어셈블리는 원심 분리기에 있도록 설치 전원 코드 왼쪽에 있는 포트를 통해 상공에서 먹이. 원심 분리기를 닫을 때 그것은 보기 창 줄 것입니다 그래서 스트로브 플래시 램프는 챔버의 앞에 인지 확인 합니다.
    1. 먼저 각 브라켓의 상단에 두 개의 구멍에 두 개의 십자 머리 나사를 강화 하 고 다음으로 각 브래킷의 하단에 나사를 강화 하 여 장소에 어셈블리 보안.
    2. 스트로브 전원 포트는 원심 분리기의 뒷면에 전원 코드를 꽂습니다.
  2. 다음, 원심 분리기 드라이브 허브에 곧장 회전자를 설정 하 고 T-핸들 육각 렌치로 고정.
    참고: 경우에 원심 분리기 비 elutriation 목적을 위해 필요 하지 않습니다, 스트로보 어셈블리와 회전자 지켜질 수 있다 실행 사이의 원심 분리기에.
  3. 회전자 확보 되 면 인감 어셈블리와 장착 플레이트를 회전로 터에 elutriation 챔버, 카운터 밸런스, 포함 된 빠른 릴리스 어셈블리를 놓습니다.
    1. 밀어 균등 하 게 한 손으로 elutriation 챔버와 카운터 밸런스에 다른 한편에는 터 볼트 장착 플레이트에 구멍에 스냅 될 때까지.
    2. 는 마지막으로, 회전 씰 어셈블리에 있는 구멍에 케이블의 1 개의 측에 핀을 배치 하 고 왼쪽 o에 브라켓 십자 머리 나사 (2.1.1에 언급 된) 중 하나 케이블의 다른 쪽에 eyehole를 확보 하 여 고정 케이블을 연결 f 챔버.
  4. 다음, 가변 속도 펌프를 사용 하 여 흐름 시스템을 조립 하 고는 elutriation에 펌프 버퍼 튜브 챔버 elutriation 챔버의 흐름으로 버퍼를 수집.
    1. 삽입 크기 16 입력된 튜브 상단에 포트를 통해 변속 펌프에서 오는 왼쪽 원심 분리기 약 실 챔버에 들어가 있도록.
    2. 입력된 튜브의 무료 끝에 피팅을 부착 하 고 회전 씰 어셈블리 측면 입력된 구멍에 피팅을 삽입.
    3. 삽입 크기 16 출력 포트를 통해 튜브와 회전의 상단에 전송 관에 봉인 어셈블리.
      참고: 흐름 시스템 또한 남아 있을 수 있습니다 elutriation 실행 사이의 조립.
  5. 마지막으로,는 원심 분리기를 설정 하 고 실험에 필요한 사양 설정.
    1. 변경 회전자 id입니다.
    2. 는 원심 분리기 시간 입력 하는 경우, 설정 된 elutriation 실행을 완료 하는 데 충분 한 더 보다는 2 h.
    3. 설정 온도 20 ° c 24의 최대 온도 ° c.
    4. 맥스 가속과 감속을 위해 느리게 설정.
    5. 마지막으로, 867 x g.를 속도 설정

3. Elutriation 시스템의 못쓰게

  1. elutriation 시스템 소독, 5% 표 백제를 포함 하는 500 mL 플라스틱 병에 저수지 튜브를 놓고 출력 튜브는 빈 1 L 플라스틱 폐기물 병에 배치 하려면 먼저.
    1. 펌프를 켜고 25 mL/min로 속도 설정 하 고 5% 표 백제 폐기물 병으로 출력 튜브 펌핑은 때까지 줄곧 elutriation 시스템을 통해 흐름을 허용.
    2. 는 원심 분리기를 켜고 거품 및 배 압 순서 속도 (867 x g)를 지정 하는 최대와 서 허용.
    3. 는 원심 분리기를 중지합니다. 로 터 회전 중지, 일단 뚜껑 열고 어떤 누출에 대 한 챔버 검사.
    4. 아무 누출 경우 게 표 백제 솔루션 최소한 5 분에 대 한 시스템을 통해 흐름
  2. 로 표 백제는 수는 세포의 응집으로 이어질 뿐 아니라 세포에 해를 입힐 elutriation 버퍼에서 침전의 형성으로 이어질 수 있습니다 다음, 압력가 마로 소독 물 시스템을 플러시.
    1. 장소 압력가 마로 소독의 1 리터 병으로 저수지 튜브 물 하 고를 통해 적어도 10 분에 대 한
  3. 물으로 홍 조, 후 elutriation 버퍼 시스템에 도입. Elutriation 버퍼 및 셀에 대 한 저수지를 만들 압력가 되었습니다 150 mL 유리병을 사용 합니다.
    1. Elutriation 버퍼의 100 mL 병에 추가 하 고 튜브 맨 아래에 되도록 유리 병 저수지 튜브 이동.
    2. 는 원심 분리기를 시작 하 고 물 밖으로 플러시 시스템을 통해 흐름에 버퍼가.
    3. 저수지 병 거의 비어 일단 물 시스템에서 완전히 붉 어 지는 출력 튜브 폐기물 병에서 저수지에는 버퍼 시스템을 통해 재활용 되 고 있도록 이동.
  4. 마지막으로 조정 보기 창을 elutriation 챔버 현재 속도로 볼 수 있습니다.
    1. 보도 스트로보 램프 램프 켜 하는 원심 분리기의 외부에 버튼 전원. Elutriation k를 설정노브를 왼쪽 원심 분리기의 외부에도.
    2. 천천히 보기 창을 통해 보고 차례 elutriation 챔버 보기 및 스트로브 빛에 올 때까지 오른쪽 노브는로 터의 회전 시간.
      참고: elutriation 시스템 남아 있을 수 있습니다이 상태에서 셀 준비 될 때까지.

4. 셀 샘플의 준비

  1. 수 전지와 여러 50 mL 원뿔 튜브에 aliquot 300 400 백만 성장 매체. 3 분 위한 1210 x g에서 셀 아래로 회전
  2. 25 ml를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 elutriation 버퍼의 성장 매체 및 resuspend 세포 aspirate.
  3. 줄이기 위해 세포 응집, 패스는 25 통해 두 번 셀 게이지 바늘.
    1. 10 mL 주사기를 사용 하 여 셀을 그릴 25 게이지 바늘을 연결 하 고 내부에는 셀을 통과 살 균 50 mL 원뿔 튜브의 벽. 이 모든 25 mL 바늘 통과 될 때까지 반복.
    2. 새 바늘과 주사기를 한 번 위의 과정을 반복.
      주의: 주사기 바늘은 sharps 용기에 배치 되어야 합니다.
      참고:이 중요 그 셀 올려집니다 바늘을 통해 elutriation 시스템에 그들을 소개 하기 전에 즉시 세포 응집을 최소한 유지.

5. Elutriation 시스템 및 분수의 컬렉션에 셀 샘플의 소개

  1. 소개 통해 재활용 나머지 elutriation 버퍼는 저수지 탱크에 셀 샘플을 붓는 의해 elutriation 시스템으로 셀 샘플 .
    1. 셀 시스템에 입력 하 고 elutriation 챔버 내에서 평형에 도달 하자.
      참고:이 과정은 약 5 분 소요 됩니다 그리고 그들이 보기 창을 통해 챔버를 입력으로 셀을 보면서 진행을 추적할 수 있습니다. 모든 셀에에서 있도록 챔버, 걸릴 드롭 eluent의 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 볼. 이 챔버에 그들의 보존을 확인 하는 샘플 그대로 셀의 무료 이면.
  2. 일단 모든 셀 챔버에 입력 한 있는 셀 균형 있는 챔버의 가장 넓은 부분에 뚜렷한 경계가 분수를 수집 하기 시작.
      출력 관 50 mL 원뿔 관으로 이동 하 여
    1. 시작 레이블이 W1. 이 분수, 저수지 탱크에 고 elutriation 버퍼 필요한 경우 보충를 위한 elutriation 버퍼의 50 mL 수집.
      참고: 모든 셀 시스템에 입력 했습니다 있는지 확인 하기 위해 저수지 탱크를 처음으로 저수지를 채우는 전에 거의 빈 될 수 있습니다. 첫 번째 리필 후 그것 거의 비어 될 저수지에 대 한 기다릴 필요가 되지 않습니다. 또한, 하지 마십시오 있도록 허용 될 빈이 시스템에 거품과 백 프레셔를 만들 것입니다 탱크.
    2. 일단 50 mL가 w 1에 대 한 수집, 동시에 821 x g 속도 변경 표시 W2 원뿔 튜브에 출력 관 고 이동 50 mL이이 속도에서 더 많은 수집.
    3. 계속 속도 변경 하 고 표 1에 표시 된 대로 분수를 수집 합니다. 저수지에서 미디어 탱크와 모든 시간에 얼음에 원뿔 관을 유지 있는지 확인 합니다. 마지막으로, 천천히 속도 감소로 오른쪽 노브를 설정 하 여 보기 창 조정.
    4. 일단 모든 20 분수 수집 되어, 있는 원심 분리기를 중지 및 정지를 표시 하는 원뿔 튜브에 50 mL 수집.

6. Elutriation 시스템의 플러싱

  1. 는 원심 분리기 멈춘 후 완전히 플러시 시스템 저수지 튜브 압력가 물과 폐기물 병에서 다시 출력 관의 1 리터 병에 넣어.
    1. 50 mL/min까지 펌프 속도 설정 하 고 있도록 그것 고갈 될 때까지 시스템을 통해 실행 물.
  2. 설정 펌프, 빠른 릴리스 어셈블리에서 입력 및 출력 호스를 제거 하 고 고정 케이블에서 핀을 꺼내.
  3. 제거로 터에서 빠른 릴리스 어셈블리
      .
      참고: 무엇는 원심 분리기 사용 됩니다, 따라서 elutriation 시스템 수 지금 남아 있을 이다. 그렇지 않으면, 전체 어셈블리 수 내려올 반대 순서에 따라 위에서 설명한 대로. Elutriation 챔버 빠른 릴리스 어셈블리에서 제거 하 고 초음파 물 목욕을 사용 하 여 실행 사이의 청소 수 있습니다. 이 이후 실행에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 챔버 벽에서 파편과 오염 물질을 제거.

7. 분수와 G1 또는 G2/M 풀의 컬렉션의 분석.

참고: elutriation의 효과 설명 하기 위하여 각 분수 세포 수, 세포 직경, 및 DNA 콘텐츠 분석 및 풀 셀에 만들어집니다 immunoblot 분석에 대 한 G1 또는 G2/M 단계에 설명 된 대로 대표 결과입니다. 이 프로토콜 섹션 이러한 풀을 만들 및 실험적인 사용을 위해 그들을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

  1. 2000 x g 4 ° C와 elutriation 버퍼에서 aspirate에서 5 분 동안에 각 분수를 스핀.
  2. G 1 단계 풀와 G2/M 단계 풀을 얻기 위하여 함께 결합 분수.
    1. G 1에 대 한 수영장 단계, 총 1 mL의 인산 염 버퍼 염 (PBS) 및 15 mL 원뿔 튜브에 661 x g (f 1-f 5) 788 x g의 속도 범위에서 수집 된 분수를 resuspend. G2/M 단계 풀 resuspend g x 333 x g (F17-F20) 387의 속도 범위에서 수집 된 분수.
    2. 2000 x g 4 ° C와 PBS에서 aspirate에서 5 분에 셀 아래로 회전.
  3. 셀 성장 매체의 10 mL에 resuspend 하 고 세포 수.
  4. Propidium 요오드 화물 얼룩 통해 콘텐츠 dna 분석 각 풀에서 한 약 수를 받아 고 cytometric 분석 15.
    참고: 각 풀의 나머지는 추가 실험을 위해 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

기본 모든 셀 (3-4 × 108) 원심 elutriation 대상이 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 두 세척 분수와 20 메인 분수, 수집. 표 1 각 분수 해당 회전자 속도 있는 셀의 총 수 제시는 대표 데이터를 보여 줍니다. 전반적인 항복이 했다 일반적으로 80% 이상. 개별 분수에 셀 직경의 측정 확인 해당 셀 직경 elutriation (그림 2) 진출 증가. 이러한 결과 두 개의 독립적인 결정의 평균을 대표 하 고 데이터 재현성의 높은 학위를 반영. 분수 다음 propidium 요오드 화물 얼룩을 복종 되었다과 cytometry DNA 콘텐츠 (그림 3)를 결정 합니다. 초기 분수 (F1-f 5) G1 단계를 대표 하는 2N DNA 콘텐츠로 거의 독점적으로 셀을 포함. G 1 단계에서 S 단계 세포의 혼합물 중간 분수 (F6-F9)에서 관찰 되었다 그리고 4N DNA 콘텐츠로 셀 f 10에서 시작 관찰. 나중 분수 주로 셀 4N DNA 콘텐츠 G2/M 단계를 대표 했다. 그림 2 의 결과 함께이 데이터 셀 크기와 세포 주기 단계 사이의 관계를 확인 했다.

이러한 결과 바탕으로, 분수 f 1-f 5 g 1 단계에서 셀의 수영장을 만들 결합 했다 그리고 분수 F17-F20 G2/M 단계에서 셀의 수영장을 만들 결합 했다. 2N DNA 콘텐츠 g 1 단계 풀에 포함 된 셀의 비율 일반적으로 99% 이었고 4N DNA 콘텐츠 G2/M 수영장에서 포함 된 셀의 비율 일반적으로 85%, propidium 요오드 화물 얼룩에 의해 결정 되 고 cytometry 흐름. 비동기 조건 하에서 모든 셀 g 1 단계에 15-20%는 기본의 60-70%는 G2/M 단계15, 따라서 elutriation 농축의 높은 수준을 반영 후 얻은 값에에서 있습니다. 세포 주기 단계에 대해 두 개의 풀을 더 인증 하려면 각에서 추출 G1 또는 G2/M 단계의 마커와 immunoblotting를 받게 했다. 첫째, 우리 인식 (Rb) retinoblastoma 단백질 phosphorylated Ser-807 또는 Ser-811, 이후 그것은 잘 설립 Rb phosphorylated 점점 된다 세포 주기17 통해 셀 사전으로는 인 특정 항 체를 활용 . 그림 4에 나와 인 Rb의 레벨 셀 g 1 단계 풀, 기대와 일치 대 G2/M 수영장에 훨씬 더 높은 했다. 우리는 또한  B1, G2/M 단계 셀에 가장 높은 표현 및  D1, 가장 높은 g 1 단계 세포18 (그림 4)에 표현에 대 한 조사. G2/M 수영장  B1 G1 수영장, 기대와 일치에 비해 훨씬 높은 수준의 했다.  D1 이러한 준비에만 약한 신호를 준 하지만 그럼에도 불구 하 고 g 1 수영장에서 감지 및 G2/M 수영장에서 탐지 되었다. GAPDH 사용 되었다 동등한 단백질 로드를 확인 하는 컨트롤.

그들의 효과 평가 하 고 최적의 성능에 대 한 조건을 설정 하는 표준 프로토콜에 대 한 수정 수행 되었습니다. 첫째, 분수 수집된의 수 감소 했다에 표준 20에서 표 2와 같이 3에서 결정 하는 속도 사용 하 여 표, G1 또는 G2/M 단계에 있는 셀의 컬렉션에 대 한 터미널 포인트를 표현 하기 위해 1만. F1 및 F3 분수의 DNA 콘텐츠 분석 그림 5A에 표시 됩니다. 분수 1 셀 g 1 단계 (95%)에서 매우 풍부 하 게 포함 하 고 표준 조건 (그림 3)에서 얻은 것을 이와 유사한 순도의 이렇게 이었다. 그러나, 분수 3, 표면적으로 세포가 매우 G2/M 단계에서 농축도 존재 하는 g 1과 S 단계에서 세포와 혼합된 인구를 주었다. G2/M 세포 전체의 51%만 표현 표준 조건 하에서 85%에 비해. 이러한 결과 분수 타협 샘플 품질의 수를 줄여 절차를 단순화 하기 위해 시도 나타냅니다. 다음, 우리 시 약 소비를 줄이기 위해 수단으로 분수 볼륨 감소의 효과 테스트 합니다. 표준 elutriation 40 mL 50 mL 분수 대신 수집을 제외 하 고 수행 되었다. 분수 F1 및 F20 DNA 콘텐츠에 대 한 분석 했다. 그림 5B같이 분수 F1 g 1 단계 셀 (98%), 표준 조건 하에서 얻어진 저것과 유사한 높은 농축 했다. 그러나, 셀만 전체의 64%를 대표 하는 G2/M 단계에와 모든 3 개의 단계에서 분수 F20 포함 된 셀 표준 조건 하에서 85%에 비해. 이 결과 샘플 품질을 타협도 분수 볼륨 감소를 나타냅니다.

Figure 1
그림 1 . 특히 원심 elutriation의 원리입니다.
참고 여기에 표시 된 대로 특히의 속도 증가 하거나 감소 하는 회전자 속도 셀의 그 elutriation 달성 될 수 있다. 맥 밀란 발행인 주식 회사에서 허가 의해 적응: [자연 프로토콜] (Ref 8.), 저작권 (2008)8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 기본 모든 직경 세포 elutriation 분수와 함께 증가.
평균 직경 샘플 당 500-4500 개별 셀에서 데이터를 기록 하는 세포 분석기를 사용 하 여 각 부분에 대 한 결정 했다. 표시 된 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 평균 ± 사 우 스 다코타. 참고 많은 포인트에 대 한 오차 막대 기호 보다 작은 그리고 명확성을 위해 생략 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . DNA 콘텐츠 분석 다른 세포 주기 단계에서 모든 셀 기본의 성공적인 분리 확인합니다.
10 mL 각 분수의 70%에 고정 되었다 EtOH, propidium 요오드 화물에 얼룩이 지 고으로, cytometry에 의해 분석 설명15. Propidium 통합 요오드 화 강도 (x 축) 어디 2N DNA 콘텐츠 G1 단계 나타내고 4N DNA 콘텐츠 나타냅니다 셀 g 2 M 단계에서 각 단계에 세포의 부분을 결정 하는 세포 수 (y 축) 대 구성 했다. 표시 된 데이터는 대표적인 실험에서 고 필수적인 동일한 결과 4 개의 반복에서 얻은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 에 세포 주기 관련 단백질의 Immunoblot 분석 풀링된분수입니다.
다음 주 모든 셀, 분수 f 1-f 5 G1 단계 수영장과 분수 F17-만드는 결합 했다의 표준 elutriation F20 G2/M 단계 풀을 만들기 위해 결합 했다. 추출 물 준비 및 40 µ g/레인 이전15, 인 Rb (Ser807/811), 항 체와 함께 설명한 대로 immunoblot 분석 대상이  B1, 또는  D1, 1:2,000 희석에서 사용 된 모든 했다. GAPDH (1:10, 000) 로드 제어로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 설명 데이터 차선 elutriations에서.
A) 분수 수집의 수를 감소의 효과. 3 주 분수 (F1-f 3), 표준 20, 100 mL의 각 대신 수집 했다, 속도에 표 2에 표시 된 대로. 분수 f 1와 f 3 그림3 DNA 콘텐츠에 대 한 분석 했다. B) 분수 볼륨 감소의 효과입니다. 20 분수, 표 1에서와 같이 동일한 조건 하에서 수집 하지만 40 mL 표준 50 mL 대신 elutriation 버퍼의 각각을 위해 사용 되었다. 분수 F1 및 F20 그림3 DNA 콘텐츠에 대 한 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

분수 속도 (rpm) G 조-포스 총 셀 (x 10 ^6)
W1 3000 867 x g 17.75
W2 2920 821 x g 7.00
F1 2860 788 x g 4.60
F2 2800 755 x g 10.75
F3 2740 723 x g 15.25
F4 2680 692 x g 22.50
F5 2620 661 x g 26.75
F6 2560 631 x g 25.00
F7 2500 602 x g 22.75
F8 키 2440 573 x g 18.00
F 9 2380 546 x g 14.00
F10 2320 518 x g 10.75
F11 2260 492 x g 7.43
F12 키 2200 466 x g 8.63
F13 2140 441 x g 6.63
F14 2100 425 x g 4.98
F15 2060 409 x g 3.46
F16 2020 393 x g 3.43
F17 1980 378 x g 2.63
F18 1940 363 x g 3.17
F19 1900 248 x g 2.78
F20 1860 333 x g 1.66
중지 0 0 x g 5.19
총 수익률 245.06
백분율 수확량 81.69

표 1입니다. 셀 생산량 및 해당 회전자 각 분수에 대 한 속도.
세포 수 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 결정 했다. 총 수익률은 입력 (3 x 108 셀) 대 개별 분수의 합으로 결정 했다. 데이터는 두 개의 대표적인 실험의 평균. 원심력과 해당 회전자 속도 제공 됩니다.

분수 속도 (rpm) G 포스
W1 3000 867 x g
W2 2920 821 x g
F1 2620 661 x g
F2 2020 393 x g
F3 1860 333 x g
중지 0 0 x g

표 2입니다. 차선의 elutriation 속도 매개 변수입니다.
원심력과는 세척에 대 한 해당 회전자 속도 압축된 차선 elutriation에 수집 된 3 개의 분수는입니다. 그림 5A 해당 DNA 콘텐츠 및 자세한 내용은 텍스트를 참조 하십시오.

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Discussion

우리 CCE를 사용 하 여 세포 주기의 다른 단계에 기본을 얻기위한 방법 모든 셀을 설명 했습니다. 최적의 조건에서 셀 g 1 단계에의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구 쉽게 얻어질 수 우수한 수율, 그리고 셀 S 단계에서 매우 풍성 하 게 얻어질 수 있다 또한 원하는 경우. 여기에 제시 된 결과 독립적인 문화, 모든-215주 모든 문화 (특히, 모든-5), 그리고 본질적으로 동일한 결과 얻은 사용 하 여 얻은 했다. 또한, 다른 모든 기본 날짜를 검사 하는 모든 문화 비슷한 밀도 범위 동안 비동기 성장, 그리고 가능성이 CCE를 때 유사 하 게 수행 합니다. 우리의 이전 연구 또한 나타났습니다 HL60, K562, 등 다른 백혈병 세포 라인 CCE19,20를 사용 하 여 다른 세포 주기 단계로 분리 될 수 있다. 절차의 중요 한 단계를 확인 셀 모노 분산 및 하지 이멀전의 실행;의 시작에 포함 특히과로 터의 속도;의 조건의 최적화 깨끗 하 고 파편;의 자유는 보장 시스템의 구성 요소 그리고 흐름 라인에 공기 방울의 도입을 피하고. CCE 그들은 세포 주기를 통해 미리 셀 크기에 크게 증가 하는 셀에 가장 적합 합니다. 에 셀의 주어진된 인구에 대 한이 설정할 수 있습니다 쉽고 처음 DNA 콘텐츠 및 사이드 분산형, 셀 크기에 후자의 의존 관계를 검사 하 여. 두 매개 변수를 측정할 수 있습니다 동시에 cytometry에 의해 propidium 요오드 화물 얼룩, 후15를 설명한 우리. 측면-분산형 및 DNA 콘텐츠 간의 선형 관계 셀 크기 세포 주기 사전 증가 하 고 따라서 세포 주기 단계에 따라 CCE는 세포를 분리 하는 자신감을 제공 합니다.

같이 우리는 (그림 5), 손상 된 샘플 품질, 특히 셀 G2/M 단계에 대 한 최적화 절차에서 편차 발생. 그러나, 분수 또는 분수 볼륨의 수에 있는 감소 분명 미치지 않았다 셀의 순도에 g 1 단계 (그림 5). 따라서, 순화 g 1 단계 셀 필요 하는 경우에 프로시저에 바로 가기 용납 수 있습니다. CCE는 쉽게 의무가 정지 세포 배양, 그것 또한 subcellular 분수에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 murine 사전-B 세포에서 핵 되었습니다 성공적으로 크기-CCE8를 사용 하 여 분리. 부착 세포 유형 관과 elutriation 챔버의 표면에 응집 하 고 가능한 준수에 대 한 그들의 성향 때문에 잠재적인 문제를 제기 하 고 따라서 신중 하 게 조사 해야 합니다.

CCE의 주요 한계는 장비;의 비용 필요한 기구는 연구소와 협력 하 여 가능한 솔루션이입니다. 그러나 회전자는 전용된 악기는, 일반적인 원심 분리 목적는 원심 분리기를 사용할 수 있습니다, 그리고 CCE에 전적으로 투자 비용 감소. 또 다른 한계가 이다 실험의 일정 문제 혈 청 기아 또는 화학 동기화 같은 다른 방법의 유연성에 비해. Elutriation 실행 일반적으로 5-6 시간, 고 얻은 셀 이후에 단기 또는 다중 시간 실험에 필요한,이 불편을 일정 발생할 수 있습니다. 가장 큰 장점은이 방법에 의해 얻은 세포 교란은15를 같이 우리 조 난의 어떤 표시 없이 많은 일에 대 한 교양 수입니다. 이 약물 유발 손상 항구 수는 화학 방법으로 동기화 하는 세포와 대조 됩니다. 최근 연구 결과, 폭발 NB4 세포 급성 골수성 백혈병에서 파생 된을 사용 하 여, 직접 CCE와 혈 청 기아, hydroxyurea, 또는 치료  종속 키 1 억제제로-330621체포를 포함 한 다른 방법에 비해. Elutriated 세포와 세포 DNA 콘텐츠 및  식 비슷한 등장 하는 비교 단계에서 체포. 그러나,는 프로테옴 시험 되었다 때 주요 단백질 풍부, 특히 스트레스 관련 변경 하 고 체포 관련 단백질, 체포 셀에 해당 셀 크기 위치에서 elutriated 셀 안에 관찰 되었다. 이 결과 교란된 세포의 생산을 위한 CCE의 유틸리티를 강조 표시 하 고 강조 하는 다른 방법으로 동기화 셀에서 데이터를 해석 하는 때 주의 사용 해야 합니다.

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Disclosures

Anisha Kothari 전지와 세인트 주드 어린이 연구 병원 분자 생물학의 부에 현재 있다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH CA109821 (TCC)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 베크 Coulter 아낌없이 간행물 비용을 충당 하기 위해 자금을 제공 하 고 설정 및 elutriation 시스템의 운영 기술 지원. 우리는 제공 하는 초기 기본 모든 문화에 대 한 박사 프레드 Falkenburg 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

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References

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