遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

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Summary

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。

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Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

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Abstract

セルを同期する機能を細胞周期の規則の私達の理解を進める中心となっています。一般的な技法は、血清遮断;化学物質の細胞を別の細胞周期段階で逮捕または分裂振り払い減少への遵守を悪用するの使用します。しかし、これらすべての欠点を持ちます。たとえば、血清飢餓動作も正常な細胞が、腫瘍細胞が癌遺伝子の活性化や腫瘍サプレッサーの損失のための危険にさらされた細胞周期チェックポイントのあまり。同様に、化学的に扱われる細胞集団は薬害被害を抱くし、ストレス関連の変更を表示できます。これらの問題を回避する手法が対向流遠心浄化 (CCE) つの反対勢力、遠心力と流体の速度、サイズおよび密度に基づいて細胞の分離の結果をセルを受けます。通常サイクルを進める細胞が拡大するので、細胞を別の細胞周期の段階に分割する CCE を使用できます。ここで我々 は急性リンパ性白血病の主にこの手法を適用します。最適な条件下で、優れた収率で、G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で高濃縮細胞集団が取得できます。これらの細胞は、抗がん剤の作用の勉強の細胞周期依存性のメカニズムおよび他のアプリケーションには最適です。またどのように標準的な手順に変更の最適なパフォーマンスの結果を表示し、技術の制限について説明。紹介する詳細な方法は、アプリケーションや他の種類の細胞に手法の探査を促進するべき。

Introduction

培養細胞は通常非同期的に成長し、個々 の細胞が細胞周期の異なった段階の存在。いくつかの生物は当然のことながら同期の細胞周期を展示または特定の生理学的な刺激によって同期することができます。たとえば、粘粘菌変形体の巨大なでん内核分割高同期ファッション1, と指数養魚は光と闇を交互に同期できる緑の藻の細胞期間2。このような生物は、ユニークな実験的属性を提供する間不十分な哺乳類細胞の複雑さをモデルします。人工的に哺乳類セル人口の同期機能細胞周期チェックポイントの分子基盤と細胞周期制御の理解を推進する中心となっています。血清剥奪、化学ブロック、リリース、または物理的特性3,4を利用する一般的な方法があります。血清の撤退、静穏化を入力するセルが生じる、再血清添加 G1 フェーズ5細胞周期再突入に昇格させます。阻害剤には、余分なチミジンやヒドロキシウレア G1/S 境界で細胞をブロック、M フェーズ3,4のセルを通常逮捕微小管阻害剤などのエージェントが含まれます。分裂振り払い間期細胞6より少ない付着しているので、分裂期細胞の豊かにするために使用できる物理特性を悪用する手法が含まれます。ただし、すべてのこれらの技術の潜在的な欠点があります。たとえば、すべてのセル型は分裂振り払いは有糸分裂阻害薬の事前同期せず限られた後血清や化学剤の存在の有無と細胞の収量で生存率を維持します。

初期胚細胞周期、場所細胞は分類7サイズが徐々 に減少を除いてほとんどの細胞周期を進める成長段階を経るし、サイズが大きくなります。このプロパティは、対向流遠心浄化 (CCE)、サイズの異なる細胞を分離する使用ことができますし、それゆえ細胞周期段階8,9の手法で利用されます。CCE、中に細胞が 2 つの反対勢力の影響の下で: 回転の軸から細胞を運転する遠心力と流体の速度 (対向)、回転 (図 1) の軸に向かってセルを駆動します。これらの力が等しい平衡位置を飛びだしチャンバーで細胞に到達します。平衡位置を指示、重要な要因は細胞径および密度です。緩衝液の率の増加の流れとして、対向ドラッグ力が遠心力を上回る新しい均衡を確立すると、商工会議所の内部のセルの位置が変更されています。すべてのセルが対向流率はその出口を促進するために十分に増加するまで商工会議所内より大きい細胞にとどまるに対し小さいものは最初、商工会議所のままで、その結果、チャンバー出口に向かってシフトされます。特定分数で対向速度の連続増加と飛びだし室をエスケープ細胞を集めることができるし、各分画に順番にサイズの増加のセルが含まれています。対向流率の増加と飛び出しを行う必要がなく遠心分離速度を減少させることによって遠心力の連続の減少は、同じ結果を達成するでしょう。浄化のプロセスには、セル型、採用、飛びだしバッファーおよび使用される特定の装置によって最適化が必要です。これらの条件下で細胞の堆積速度はストークスの法則によって最もよく述べ: SV = [d2p- ρm)/18η] .ω2r、SV = 沈降速度;d = 粒子の直径Ρp = 粒子の密度Ρm = バッファーの密度Η = バッファーの粘度Ω =; ローターの角速度r = 粒子の半径方向の位置。したがって、SV は細胞径および密度に比例して、細胞周期を通って一般に定数である密度より大きく寄与直径が 2 番目の電源に発生するので。

CCE の重要な利点は、細胞が化学治療や栄養欠乏の過酷な条件にさらされないと本質的に動じない優れた収率で回収することができます。要件は、細胞周期にトラバース、問題の細胞が直径の少なくとも 30% の大幅な増加を受けることです。主な欠点は、特殊な遠心分離機、ローター、アクセサリーのコストです。それにもかかわらず、CCE によって豊かに細胞周期の特定の段階で細胞を準備する機能は、酵母から哺乳類セル9,10の生物で細胞周期研究を促進しています。また、最近の進歩で、細胞の分離の使用を拡大して癌組織、異なる種類の細胞、異種混合物でし免疫療法9の特定の細胞型の生産分離対健康からいます。

我々 の主要な関心のビンカ アルカロイドやタキサン系薬剤などのエージェント (Mta) 微小管作用のメカニズムを理解されています。これらの薬は、有糸分裂、スピンドル微小管機能11,12のブロックにのみ行動すると考えられていたが、最近の証拠は、彼らが間期の微小管13,14の対象にも示唆しています。我々 は最近、プライマリ急性リンパ芽球性白血病 (ALL) セル G1 期のいずれかの死を受けるまたは M 相ビンクリスチンと細胞周期依存的15の他の Mta で処理することを報告しました。CCE によって異なった細胞周期の段階にすべてのセルを分ける機能はこの結論に達するに尽力しました。この記事では、技術的な詳細を説明して、異なった細胞周期の段階ですべてのセルの CCE のプライマリの調製への応用のための実用的なヒントを提供します。

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Protocol


注: このプロトコルは、B-すべての主要な細胞の直径は約 8 μ m (G1 期)、13 μ m (G2/M フェーズ) に範囲の最適化されています。したがって、特定の遠心速度とポンプ流量は異なるサイズの範囲のセルには適用できません。それにもかかわらず、沈降速度式を使用して適切な飛び出しパラメーターを推定できます。セル 1-3 10 6 セル/mL の x の最適密度で説明した 16 として無血清培地で培養されます。部屋の温度と最大 24 までの 20 ° C で設定遠心分離機で行われていますすべてのステップ 4 ° c の氷冷却管を使用して行われる分数のコレクションを除いて ° C

1 飛びだしバッファーの準備と材料

細胞の凝集を低減、ハンクの飛びだしバッファーを準備するために
  1. ' s バランス 2% 牛胎児血清 (補足フェノールレッド食塩 (HBSS)。FBS) を使用して、浄化プロセス、および負荷電のセルの外観をレンダリングし、凝集を減らす 2-ナフトール-6, 8-ジスルホン酸二カリウム塩 (NDA)、1.6 g/L の間に機械的ストレスから細胞を保護するためにも。
    1. 50 mL の円錐管に NDA の 1.6 グラムを追加します
    2. 無菌条件下で HBSS の 35 mL を 1 L ボトルから NDA を含む 50 mL の円錐管に追加。NDA が溶けるまでチューブを旋回します
    3. 新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに溶存 NDA 0.2 μ m フィルターを使用して転送します。HBSS の残り 1 L に NDA を追加します
    4. では、最後に、21 mL FBS を最終濃度 2% (v/v) を取得する HBSS に追加します
      。 注: 飛びだしバッファーを作成し、HBSS またはインジケーター染料の黄変によって示されるように pH に大きな変化があるまで有効期限まで 4 ° C で保存します
  2. ラベル 50 mL を分画のコレクションのための円錐管でチューブ ラベル 1、2 (W1 と W2) 分数 1-20 (F1 - F20) を洗浄し、停止があります。
    1. 中古分数を収集する前に氷の上にこれらの管を寒さ

2。浄化システムのアセンブリ

    左側のポートを通ってチャンバから電源を供給できるように、
  1. まず、遠心分離機にストロボ アセンブリをインストールします。ストロボ フラッシュ ランプは商工会議所の前面は遠心分離機が閉じられたときそれが表示ウィンドウで整列されるのでを確認します。
    1. で各ブラケットの下部に蝶ネジを締めて、最初各ブラケットの上部に 2 つの穴に 2 つのプラス頭ネジを締めによって場所にアセンブリをセキュリティで保護します
    2. 遠心分離機の背面にあるストロボの電源ポートに電源コードを差し込みます
  2. 次に、遠心分離機ドライブハブにまっすぐにローターをセットし、T ハンドル六角レンチで固定します
    。 注: 場合非飛び出し用遠心分離機が必要でないストロボ アセンブリとローターに保存できます実行の間遠心分離機で
  3. ローターを固定すると、一度は、ロータにシールの組立・取付板を回転飛び出し室、カウンター バランスを含むクイック リリース アセンブリを配置します。
    1. を均等に押す片手で飛びだし室とカウンター バランスの一方のローター ボルト取付板の穴にカチッとはまるまで
    2. 最後に、回転シール アセンブリの穴にケーブルの 1 つの側面のピンを配置すると左側に o のブラケット (2.1.1 に記載) + ネジの 1 つとケーブルの反対側アイホール固定アンカー ケーブルを添付します。f 商工会議所します
  4. 次に、変数の速度のポンプを使用してフロー システムを構築して、商工会議所飛びだしにチューブ ポンプ バッファーへと飛び出し室から移動するときに、バッファーを収集します。
    1. サイズ 16 入力管上部のポートを介して変速ポンプから来るまま遠心室内の商工会議所に入るので、挿入
    2. 入力管の自由端に継ぎ手を接続し、回転シール アセンブリ横の穴に入力に継手を挿入します
    3. インサート サイズ 16 出力ポートを介してチューブ、回転の上部に転送管に取り付けますシールアセンブリします
      。 メモ: フロー システムの飛びだし実行の間組み立てられたままもできます
  5. 最後に、遠心分離機をオンにして、実験に必要な仕様を設定。
    1. ローターの ID の変更
    2. 水簸分級実行を完了するよりも十分です 2 時間の遠心分離機は、時間の入力を必要とする場合を設定します
    3. 24 の最大温度 20 ° C に温度を設定 ° C
    4. 最大の加速と減速のために遅く設定します
    5. 最後に、867 x g に速度を設定

3。浄化システムのプライミング

殺菌浄化システム、5% の漂白剤を含む 500 mL ペットボトルに貯留管を置き、空 1 L の廃プラスチック ボトルに出力管を配置するために最初の
    1. それ廃液ボトルに出力管からポンプでくまれるまで飛び出しシステムをフローする 5% の漂白剤のポンプをオンにして速度を 25 mL/min に設定でき
    2. 遠心分離機をオンにして、泡と背圧を解放するために (867 x g) の速度を指定された最大値を出すことができます
    3. は、遠心分離機を停止します。ローターの回転が停止すると、一度蓋を開き、室内楽、任意の漏れを検査します
    4. リークがない場合させて漂白剤溶液で少なくとも 5 分間システムのフロー
  1. 次に、漂白剤は、細胞に害をもたらすだけでなく、細胞の凝集につながる可能性があります飛びだしバッファーから析出物の形成につながる可能性としてオートクレーブ水システムをフラッシュします。
    1. 場所オートクレーブの 1 L ボトルに貯留管水し、少なくとも 10 分をフラッシュするそれを許可
  2. 水でフラッシュした後、システムに飛びだしバッファーを紹介します。飛びだしバッファーおよび細胞のための貯蔵を作成するオートクレーブ養生されている 150 mL 瓶を使用します。
    1. ボトルに 100 mL の水簸分級バッファーを追加し、チューブが一番下にくるように、貯水池のチューブ ガラスのボトルに移動します
    2. 遠心分離機を開始でき、流れる水を洗い流すシステムにバッファーします
    3. リザーバー ボトルはほとんど空と水は完全にシステムから消去、移動、出力管廃液ボトルから貯蔵所に、バッファーがシステムでリサイクルされている
  3. 飛び出し商工会議所は、現在の速度で見ることができるので、さらに、表示ウィンドウを調整します。
    1. プレス、ストロボ ランプ電源ランプが点灯するので、遠心分離機の外側のボタンであります。飛び出し k を有効に左端に遠心分離機の外側にもノブ
    2. 。 飛びだし室表示とストロボの光に来るまで右にノブは、ローターの回転と時間表示窓からゆっくりと探している間
    3. ターン
      。 注: 水簸分級システムことができます状態のままにこのセルを準備するまで.

4。細胞試料調製

  1. カウント細胞といくつかの 50 mL の円錐管に分注 300 に 4 億で培。1210 x g で 3 分間で細胞をスピン
  2. 25 mL の上下に軽くピペッティングによる飛び出しバッファーで成長のメディアと再懸濁します細胞を吸引します
  3. を減らすために細胞を凝集、パス細胞 2 回、25 ゲージの針。
    1. 10 mL の注射器を使用してセルを描く 25 ゲージの針を添付し、内側にからのセルを渡す滅菌 50 mL の円錐管の壁。この手順を繰り返してすべての 25 mL は、針を通過している
    2. 新しい針と注射器を入手し、一度上記の手順を繰り返します
      。 注意: 注射針はディスポに配置する必要があります
      。 注: セルを針を介してプッシュ水簸分級システムにそれらを導入する前にすぐを細胞凝集を最小限の維持が重要です

5。導入細胞サンプルの水簸分級システムと分数コレクション

  1. を通じてリサイクル飛びだしバッファーの残りのあるリザーバ タンクにセルのサンプルを注ぐことによって浄化システムにセルのサンプルをご紹介.
    1. システムに入力し、飛び出しチャンバ内で平衡に達する細胞ができます
      。 注: このプロセスは約 5 分かかります、表示ウィンドウを介してチャンバを入力するとセルを見ることによって進捗状況を追跡ことができます。ドロップを取るようにすべてのセルは、商工会議所、溶離液のガラス スライド上に配置し、顕微鏡下で表示。これは商工会議所での保持を確認するサンプルがそのままなセルのフリーの場合
  2. 室にすべてのセルを入力し、セルが均衡商工会議所の最も広い部分で明確な境界がある分数を収集を開始します。
    1. 開始 50 mL の円錐管に出力管を移動しては、W1 をラベル付けします。50 mL のリザーバ タンクに目を離さないし、飛び出しバッファー必要があるときに補充するようにして、この分数の飛びだしバッファーを収集します
      。 注: システムにすべてのセルが入力されていることを確認、するためにリザーバ タンク初めて貯水池を充填する前にほぼ空になることができます。最初の詰め替え後貯水池ほぼ空になるを待つ必要があります。また、これまで泡と背圧を作成するシステムで、これが空になるためにタンクを許可するしないで
    2. W1 の 50 mL が収集されて、一度同時に 821 x g に速度を変更 W2 というラベルの付いた円錐管の出力管を移動し、50 mL この速度でより多くを収集します
    3. は、速度を変更して、表 1 に示されているように、分数を収集を続けます。貯留層におけるメディア タンクし、常に氷の上の円錐管があることを確認します。さらに、速度が減少、徐々 つまみを右に回して、表示ウィンドウを調整します
    4. 20 のすべての分数は収集されているし、遠心分離機を停止、停止というラベルの付いた円錐形の管の 50 mL を収集します

6。飛び出し系フラッシング

  1. 遠心分離機が停止した後完全にフラッシュ システム オートクレーブ水と廃棄物のボトルに戻る出力管の 1 L ボトルで貯留管を置くことによって。
    1. 50 mL/min までポンプの速度を切り、水がなくなるまで、システムを介して実行するを許可します
  2. 電源、ポンプをオフ クイック リリース アセンブリから入力と出力のホースを取り外し、アンカー ケーブルからピンを抜きます。
    1. ローターからクイック リリース アセンブリを削除します
      。 注: 遠心分離機が使用されるか、によって飛び出しシステム今をそのままです。それ以外の場合、アセンブリ全体が前述を逆の順序で閉鎖することができます。飛びだしチャンバーをクイック リリース アセンブリから削除し、清掃超音波水浴を使用して実行できます。これは後の実行に悪影響を及ぼす室壁から瓦礫や汚染物質を削除します

7。分数と G1 または G2/M プールのコレクションの分析

注: 浄化の有効性を示すために各分画、細胞数、細胞径および DNA 量を分析し、に従って、イムノブロット解析の G1 または G2/M の段階で細胞のプールが作成されます代表の結果。このプロトコルのセクションは、これらのプールを作成し、実験用のためにそれらを準備する方法を説明します

  1. 4 ° C と飛びだしバッファーを吸引で 5 分間 2000 x g で各分画をスピンします
  2. G1 相プールと G2/M 段階プールの両方を取得するために一緒に結合分画。
    1. のための G1 相プール、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) 1 mL、15 mL の円錐管への転送の合計で 661 × g (F1 - f5 キーを押して) 788 × g の速度範囲で収集した画分を再懸濁します。G2/M 段階プール × g と 333 x グラム (F17 - F20) 387 の速度範囲で集められた分数を再懸濁します。
    2. 細胞 4 ° C と PBS を吸引で 5 分間 2000 x g でスピンダウンします
  3. 細胞数をとり成長媒体の 10 mL の細胞を再懸濁します
  4. Propidium ヨウ化染色を介してコンテンツの DNA を分析するのに各プールから、因数を取るし、フローサイトメトリー解析 15 をフローします
    。 注: 各プールの残りの部分は、さらに実験のため使用できます

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Representative Results

プライマリのすべてのセル (10 x 3 48) 遠心浄化を受けるし、プロトコルで説明されているように 2 つの洗浄分数と 20 の主な分数に収集されました。対応するローターの速度と同様、各画分のセルの合計数が表示されます代表的なデータを表 1 に示します。全体収率は通常 80% では以上。留分の細胞径の測定は、そのセル径に伴って飛び出し (図 2) を確認しました。これらの結果は、2 つの独立した測定の平均値を表し、データ再現性の高度を反映します。分数は、propidium ヨウ化染色が施された次におよびフローサイトメトリー DNA 量 (図 3) を決定します。初期分数 (F1 - f5 キー) は、G1 期を表す 2N DNA 量とほとんど専ら細胞を含まれています。G1 期と S 期の細胞の混合物は中間留分 (F6 - f9 キー) で観察されたと 4 n の DNA 量と細胞観察 [f10] キーで開始。後の分数は、G2/M のフェーズを表す 4 n DNA 量と主として細胞を持っていた。これらのデータと、図 2の結果は、セル サイズと細胞周期との関係を確認しました。

これらの結果に基づき、分数 F1 f5 キーは、G1 期で細胞のプールを作成する結合され、分数 F17 - F20 を G2/m 期で細胞のプールを作成する結合されました。G1 相プールで 2 n の DNA 量と細胞の割合は通常 99% してフローサイトメトリー G2/M プール 4 n DNA 量と細胞の割合 propidium ヨウ化染色により通常は 85% であった。非同期条件下でプライマリのすべての細胞は、G1 期と 15-20% の 60-70% は、G2/M 段階15、こうして飛びだし濃縮の高レベルが反映後に得られる値。細胞周期の段階に関して 2 つのプールをさらに認証には、G1 か G2/M 段階のマーカーと免疫ブロットにそれぞれからの抽出物を受けた。まず、我々 は細胞周期17 を通って細胞事前として Rb なるますますリン酸化されることはよく設立それ以来 Ser 807 に Ser-811、rb タンパク質のリン酸化を認識するリン酸化型特異抗体を利用.図 4に示すとおり、リン Rb のレベルはるかに高かった G1 相プール、期待と一貫した対 G2/M プール内のセルにします。我々 も G2/M 期の細胞で最も高い表現されるサイクリン B1、G1 相細胞18 (図 4) で最も高い表現されるサイクリン D1 がプローブされます。G2/M のプールは、サイクリン b1 の期待と一致して、G1 のプールと比較して非常に高いレベルを持っていた。サイクリン D1 はこれらの準備に弱い信号のみを与えたが、それにもかかわらず、G1 プールで検出および G2/M プールで検出限界以下でした。GAPDH が使用された同じ蛋白質のローディングを確認するコントロール。

標準プロトコルへの変更は、その効果を評価するために、最適なパフォーマンスを得るための条件を確立する行った。まず、収集した分数の数減少したに標準的な 20 から表 2 に示すように、G1、S、G2/M の段階で細胞のコレクションのターミナルのポイントを表す 1 を表から決定速度を使用して、3 つだけ。F1 と F3 の分数の DNA 量の解析は、図 5 aに表示されます。分数 1 G1 期 (95%) の高い濃縮細胞し、標準条件 (図 3) の下で取得するような純度のためだった。ただし、分数 3 は表向きは G2/m 期で高濃縮細胞 G1、S 相も存在で細胞との混合された人口を与えた。G2/M 細胞は、全体の 51% だけ表される標準的な条件の下で 85% と比較されました。これらの結果を示す分数妥協サンプル質の数を減らし、手順を簡素化しようとしています。次に、我々 は試薬の消費量を削減する手段として分数ボリュームの削減の効果をテストしました。標準的な飛び出しは、50 mL の一部分ではなく 40 mL を採取したことを除いて行った。分数 F1 及び/もしくは F20 は、DNA 量の解析しました。図 5 bのように、割合 F1 だった G1 期の細胞 (98%)、標準的な条件の下で得られるような高濃縮。ただし、のみ、全体の 64% を表す G2/m 期で細胞とすべての 3 つのフェーズに含まれる F20 細胞に比べて標準的な条件の下で 85%。これらの結果を示す、サンプル品質が低下割合のボリュームを減らすことも。

Figure 1
図 1.対向流遠心浄化の原理。
メモここで示したように対向流率を増やすことによって、ローターの回転速度を減少させることによって、細胞が水簸分級を実現できます。マクミラン出版業者株式会社からの許可によって適応: [自然のプロトコル] (Ref 8.)、著作権 (2008)8この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.主なすべての直径細胞飛びだし分数増加します
平均粒径は、各分画サンプルあたり 500 4,500 個々 のセルからデータを記録するセル アナライザーを使用して決定されました。表示されるデータは、2 つの独立した実験から平均 ± 標準偏差です。多くのポイントの誤差範囲記号より小さい、明快のために省略されたことに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.DNA 量の解析は、異なる細胞周期段階でプライマリの正常な分離のすべてのセルを確認します。
各画分の 10 mL は 70% で修正されたエタノール、ヨウ化 propidium で染色し、として、フローサイトメトリーで分析した説明15。Propidium ヨウ化統合強度 (x 軸) は、2 n DNA 量 G1 期を表し 4N DNA 量セル G2 または M のいずれかの段階で、各段階で細胞の部分を決定するセル数 (y 軸) とプロットしました。表示されるデータは、代表的な実験から、4 つの繰り返しで不可欠と同じ結果が得られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.細胞周期関連蛋白のイムノブロット解析プール分数。
次の一次分数 F1 f5 キーのすべてのセルが G1 相プールと分数 F17 - を作成する結合された標準的な飛び出し F20 に G2/M 相プールを作成する結合されました。抽出物は準備ができて、40 μ g/車線前述以前15、リン Rb (Ser807/811) に対する抗体とイムノブロット解析を受けるサイクリン B1、サイクリン D1 1:2,000 希釈で使用されているすべて.GAPDH (1:10, 000) は、ローディング コントロールとして使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5.最適な elutriations から例示データ。
A) 収集した分数の数を減少させる効果。20、それぞれ 100 mL の標準ではなく 3 つしか主な分数 (F1 ・ F3) は、表 2 に示されるように速度で収集されました。図 3のように DNA 量の分数 F1 と F3 を行った。B) 一部のボリュームを減らすことの効果。20 画分を集め、表 1 のように同じ条件の下で、各 40 mL のみの標準的な 50 mL の代わりに飛びだしバッファーが使用されました。分数 F1 及び/もしくは F20 は図 3のように DNA の内容を分析しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

分数 速度 (rpm) G フォース セルを合計 (x 10 ^6)
W1 3000 867 × g 17.75
W2 2920 821 x g 7.00
F1 2860 788 x g 4.60
F2 2800 755 x g 10.75
F3 2740 723 x g 15.25
F4 2680 692 x g 22.50
F5 キー 2620 661 × g 26.75
F6 キー 2560 631 x g 25.00
F7 キー 2500 602 × g 22.75
F8 キー 2440 573 x g 18.00
F9 キー 2380 546 × g 14.00
F10 キー 2320 518 x g 10.75
F11 キー 2260 492 x g 7.43
F12 キー 2200 466 x g 8.63
F13 2140 441 x g 6.63
F14 キー 2100 425 x g 4.98
F15 2060 409 x g 3.46
F16 2020 393 x g 3.43
F17 1980 378 x g 2.63
F18 1940 363 x g 3.17
F19 1900 248 x g 2.78
F20 1860 333 x g 1.66
停止 0 0 x g 5.19
総収量 245.06
パーセントの利回り 81.69

表 1。収量と各分画の対応するローターの回転速度をセルします。
自動化された細胞カウンターを使用してセル数を求めた。総収量は、入力 (3 x 10 の8セル) 対個々 の分数の合計によって決定されました。2 つの代表的な実験の平均値。遠心力と対応するローターの回転速度が与えられています。

分数 速度 (rpm) G フォース
W1 3000 867 × g
W2 2920 821 x g
F1 2620 661 × g
F2 2020 393 x g
F3 1860 333 x g
停止 0 0 x g

表 2。最適な飛び出しの速度パラメーター。
遠心力と洗浄の対応するローターの速度と圧縮の最適な飛び出しで収集された 3 つの分数が表示されます。対応する DNA の内容の詳細は本文図 5 aを参照してください。

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Discussion

CCE を使用して細胞周期の異なった段階でプライマリを取得するためのメソッドのすべてのセルを説明しました。最適な条件で G1 期の細胞の本質的に純粋な人口と G2/M の段階で細胞の高濃縮人口に容易に得ることができた優れた収率で、必要な場合、S 期で高濃縮のセルを取得することも。ここで示された結果は、独立した文化、すべて 215ですべての文化 (具体的には、すべての-5) と本質的に同一の結果が得られている 1 つのプライマリを使用して得られました。さらに、他のすべてのプライマリ日付を調べてすべての文化非同期成長中に同じような密度の範囲があるし、可能性が高い実行同様に CCE を受けるとき。私たちの先行研究も CCE19,20を使用して異なる細胞周期段階分け他白血病細胞株 HL60 と K562 などを含むことができますを示しました。重要なステップの手順では、実行の開始時、セルの単分散とない周辺固定支持が確実対向速度と回転速度の条件の最適化汚れや破片; がないは、システムのコンポーネントを確保流線に気泡の発生を回避します。CCE は細胞が細胞周期を通って進むにつれてセル サイズの大幅増加に最適です。懸濁液中の細胞の特定の人口のためこれを確立できます最初、簡単に DNA 量と側方散乱、セル サイズに後者の依存関係を調べることによって。両方のパラメーターが同時測定可能フローサイトメトリーによる染色、propidium ヨウ化後15に述べたようです。側方散乱と核 DNA 量の線形関係は、細胞周期事前にセルのサイズを増加させるし、このように細胞周期に基づく CCE に細胞を分離する可能性があることに自信を提供します。

(図 5) を示したように最適化された手順からの逸脱は G2/M の段階で細胞の特に危険にさらされたサンプル品質の結果します。ただし、分数または分数ボリューム数の削減では細胞の純度をかなり G1 期 (図 5) に影響しなかった。したがって、のみ精製 G1 期の細胞が必要な場合は、プロシージャへのショートカットを許容できます。CCE は培養細胞に簡単に従わないが、内分にも適用できます。たとえば、マウスのプレ B 細胞から核されている正常にサイズ - CCE8を使用して区切られます。付着性のセル型はチューブと飛びだしチャンバーの表面に凝集および可能な遵守のための傾向のための潜在的な問題を提起、したがって、慎重に調べる必要があります。

CCE の主な制限は、機器等の費用可能な解決策は、必要な装置を持っているラボとの共同作業することです。ただし、ローターは専用計測器が、一般的なの遠心分離用遠心分離機を使用ことができます、CCE にのみ投資コストを削減します。別の制限は実験のスケジュールがより問題となる血清飢餓や化学の同期などの他の方法の柔軟性と比較してます。飛び出しの実行は通常 5-6 時間を取るし、得られる細胞はその後短期またはマルチ時間ポイント実験に必要な場合これは不便をスケジュールに生じる。最大の利点は、このメソッドによって得られる細胞が摂動15示したように苦痛の徴候もなく何日も培養することができます。これは薬害被害を抱くことができる化学的手段によって同期セルと対照的します。最近の研究では、急性骨髄性白血病由来 NB4 細胞を使用して爆発、CCE と血清飢餓、ヒドロキシウレア、RO 330621サイクリン依存性キナーゼ 1 阻害剤による治療と逮捕を含む他の方法を直接比較します。細胞と細胞の DNA 量およびサイクリン式に関して同じような出現の匹敵する段階で逮捕を elutriated しました。しかし、プロテオームを調べた、タンパク質豊富な特にストレス関連の主要な変更、逮捕特定蛋白質は逮捕されたセルに、対応するセル サイズ位置 elutriated 細胞では観察されました。これらの結果は CCE の摂動の細胞の生産のためのユーティリティを強調表示し、強調する他の手段によって同期セルからのデータを解釈するときに注意を使用する必要があります。

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Disclosures

アニシャ Kothari は現在聖ジュード小児研究病院学講座細胞分子学です。

Acknowledgments

この作品は、NIH (TCC) に CA109821 によって支えられました。気前よく文書のコストをカバーするための資金を提供するためとセットアップと飛びだしシステムの運用に関する技術援助ベックマン ・ コールターに感謝します我々 は博士フレッド ・ ファルケンバーグが初期プライマリのすべての文化を提供することをありがちましょう。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

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