Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

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Cancer Research

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Summary

Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.

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Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

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Abstract

A capacidade de sincronizar as células tem sido fundamental para fazer avançar a nossa compreensão da regulação do ciclo celular. Técnicas comuns empregadas incluem privação de soro; produtos químicos que prendam células em fases diferentes de ciclo celular; ou o uso de mitótica shake off-que explora sua aderência reduzida. No entanto, todos estes têm desvantagens. Por exemplo, a fome de soro funciona bem para as células normais, mas menos bem para células tumorais, com pontos de verificação ciclo de celular comprometida devido à perda de supressor de ativação ou tumor do oncogene. Da mesma forma, populações de células quimicamente tratada podem abrigar dano induzido e mostrar alterações relacionadas ao estresse. Uma técnica que contorna esses problemas é elutriation centrífuga de contracorrente (CCE), onde as células estão sujeitos a duas forças opostas, a força centrífuga e a velocidade do fluido, que resulta na separação de células com base no tamanho e densidade. Desde células avançando através do ciclo normalmente ampliar, CCE pode ser usado para separar as células em fases diferentes de ciclo celular. Aqui podemos aplicar esta técnica para as células de leucemia linfoblástica aguda primária. Sob condições ideais, uma população essencialmente pura de células na fase G1 e uma população altamente enriquecida de células em G2/M fases podem ser obtidas em excelente rendimento. Estas populações de células são ideais para estudar mecanismos de ciclo celular dependente da ação de drogas anticâncer e para outras aplicações. Podemos também mostrar como modificações para o procedimento padrão pode resultam em desempenho suboptimal e discutir as limitações da técnica. A metodologia detalhada apresentada deve facilitar a aplicação e exploração da técnica para outros tipos de células.

Introduction

Células cultivadas geralmente crescem de forma assíncrona e células individuais estão presentes em diferentes fases do ciclo celular. Alguns organismos apresentam ciclos de célula naturalmente síncronos ou podem ser sincronizados por estímulos fisiológicos específicos. Por exemplo, núcleos dentro plasmódios gigantes do slime molde Physarum polycephalum dividem em uma forma altamente síncrona1e as células das algas verdes que desmodesmus quadricauda podem ser sincronizados por alternadas claras e escuras períodos2. Embora esses organismos oferecem atributos únicos experimentais, são modelos inadequadamente as complexidades de células de mamíferos. A capacidade de sincronizar artificialmente as populações de células de mamíferos tem sido fundamental para fazer avançar a nossa compreensão da regulação do ciclo celular e a base molecular dos postos de controlo do ciclo celular. Métodos comuns incluem privação de soro, bloco de químico e liberação ou explorando características físicas3,4. Retirada do soro, muitas vezes, faz com que células entrar quiescência, e a re-adição de soro promove ciclo celular reentrada para o G1 fase5. Inibidores químicos incluem agentes como timidina excesso hidroxiureia que bloqueiam as células no limite do G1/S ou inibidores de microtúbulos que tipicamente prendam células na fase M3,4. Abordagens que exploram características físicas incluem mitótica shake off-que pode ser usado para enriquecer para células mitóticas desde que eles são menos aderentes que interfase células6. No entanto, todas essas técnicas têm desvantagens potenciais. Por exemplo, nem todos os tipos de célula mantêm viabilidade na ausência de soro ou a presença de inibidores químicos e o rendimento das células após agitar-off mitótica é limitado sem prévia sincronização com inibidores mitóticos.

Com excepção dos primeiros ciclos de celular embrionários, onde células progressivamente diminuem de tamanho, como eles dividem7, a maioria das células, avançando através do ciclo passam por fases de crescimento e se tornam maiores. Esta propriedade é explorada na técnica de elutriation centrífuga contrafluxo (CCE), que pode ser usado para separar as células diferindo em tamanho e, portanto, no ciclo celular fase8,9. Durante CCE, as células estão sob a influência de duas forças opostas: a força centrífuga, que leva as células longe do eixo de rotação e a velocidade do fluido (contrafluxo), que leva as células para o eixo de rotação (Figura 1). Células na câmara elutriation alcançar uma posição de equilíbrio onde estas forças são iguais. Os principais fatores que ditam a posição de equilíbrio são a densidade e diâmetro da célula. Como o fluxo taxa da solução-tampão é aumentada e a força de arrasto de contrafluxo supera a força centrífuga, é estabelecido um novo equilíbrio, causando uma mudança na posição de células dentro da câmara. Todas as células são deslocadas na direção de saída da câmara, resultando em menores deixando a câmara, em primeiro lugar, Considerando que as maiores células permanecer dentro da câmara até que a taxa de contrafluxo é aumentada suficientemente para promover sua saída. As células escapar da câmara de elutriation com aumentos consecutivos na taxa de contrafluxo podem ser coletadas em frações específicas e cada fração contém células de tamanhos que aumentam sequencialmente. Em vez de realizar elutriation com aumentos incrementais em taxa de contrafluxo, sequencial diminui em força centrífuga, diminuindo a velocidade de centrifugação irá realizar o mesmo resultado. O processo de elutriation exige otimização dependendo do tipo de célula, buffer de elutriation empregado e o aparelho específico utilizado. A taxa de sedimentação de células nestas condições é melhor descrita pela lei de Stokes: SV = [d2p- ρm) / 18η] .ω2r, onde SV = velocidade de sedimentação; d = diâmetro da partícula; Ρ,p = densidade da partícula; Ρm = densidade do buffer; Η = viscosidade do buffer; Ω = velocidade angular do rotor; e r = posição radial da partícula. Assim, o SV é proporcional à densidade e diâmetro da célula, e desde que o diâmetro é elevado à segunda potência, contribui mais significativamente do que a densidade que é geralmente constante ao longo do ciclo celular.

Uma vantagem importante da CCE é que as células não estão sujeitos a condições adversas de tratamento químico ou privação nutricional e podem ser recuperadas em excelente rendimento essencialmente imperturbável. Um requisito é que as células em questão se submeter a um aumento significativo de diâmetro, pelo menos 30%, como eles atravessam o ciclo celular. A principal desvantagem é o custo do centrifugador especializado, rotor e acessórios. No entanto, a capacidade de preparar células enriquecidas nas fases do ciclo celular específico por CCE tem facilitada pesquisa do ciclo celular em organismos do fermento para células de mamíferos9,10. Além disso, os avanços recentes estão expandindo usos para a separação das células de saudável contra o tecido canceroso, a separação dos diferentes tipos de células em misturas heterogêneas e a produção de tipos de células específicas para imunoterapia9.

Nosso interesse principal tem sido na compreensão do mecanismo de ação do microtubule direcionamento MTAs (agentes) tais como alcaloides da vinca e taxanos. Estas drogas foram pensadas para atuar exclusivamente na mitose, bloqueando os microtúbulos do fuso função11,12, mas a evidência recente sugere que eles também podem direcionar interfase microtúbulos13,14. Recentemente, informou que as células de leucemia linfoblástica aguda primária (todos) sofrem a morte em qualquer fase G1 ou no M fase quando tratados com vincristina e outros MTAs em uma maneira dependente do ciclo celular15. A habilidade de separar todas as células em fases diferentes de ciclo celular por CCE foi fundamental para chegar a esta conclusão. Neste artigo, descrevemos os detalhes técnicos e oferecer dicas práticas para a aplicação da CCE para a preparação da escola primária de todas as células nas fases do ciclo celular diferente.

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Protocol


Nota: Este protocolo foi otimizado para primário B-todas as células que variam em diâmetro de aproximadamente 8 µm (fase G1) a 13 µm (fases G2/M). Assim, as velocidades de centrifugação específicos e taxas de fluxo da bomba podem não ser aplicáveis às pilhas com intervalos de tamanho diferente. Não obstante, parâmetros de elutriation apropriado podem ser estimados usando a equação de taxa de sedimentação. As células são cultivadas em meio livre de soro definido como descrito 16 em uma densidade ideal de 1-3 x 10 6 células/mL. Com exceção da coleção de frações que é conduzida a 4 ° C, utilizando tubos de resfriado, todas as etapas são conduzidas a temperatura e o centrifugador definido a 20 ° C, com um máximo de 24 ° C.

1. preparação de Buffer Elutriation e materiais

  1. , a fim de reduzir a aglutinação de células, preparar um buffer elutriation de Hank ' s equilibrada solução salina (HBSS) com vermelho de fenol, suplementado com 2% de soro fetal bovino ( FBS), para proteger as células do estresse mecânico durante o processo de elutriation e 1,6 g/L de sal de 2-naftol-6,8-disulfonic acid dipotassium (NDA), que torna o exterior da célula carregado negativamente e reduz a aglutinação.
    1. Adicionar 1,6 g de NDA para um tubo cónico de 50 mL.
    2. Sob condições estéreis, adicionar 35 mL de HBSS de uma garrafa de 1 L para o tubo cónico de 50 mL contendo NDA. Agite o tubo até dissolver a NDA.
    3. Usando um filtro de 0,2 µm, transferir a NDA dissolvida em um novo tubo cônico estéril 50 mL. Em seguida, adicione o restante 1L de HBSS NDA.
    4. Finalmente, adicione 21 mL FBS o HBSS para obter uma concentração final de 2% (v/v).
      Nota: O buffer de elutriation pode ser preparado e armazenado a 4 ° C até a data de validade sobre o HBSS, ou até que haja uma grande mudança de pH, conforme indicado por um amarelinho do corante indicador.
  2. Etiqueta 50ml cónicos tubos para coleta de frações que existem tubos rotulados lavagem 1 e 2 (W1 e W2), frações (F1 - F20) 1-20 e parem.
    1. Pre-chill esses tubos no gelo antes de coletar frações.

2. Montagem do sistema Elutriation

  1. em primeiro lugar, instalar o conjunto de strobe para a centrífuga para que o cabo de alimentação é alimentado fora da câmara através da porta do lado esquerdo. Certifique-se que a lâmpada de flash estroboscópio na frente da câmara vai alinhar com a janela de visualização quando o centrifugador é fechado.
    1. Fixar o conjunto no lugar primeiro apertando dois parafusos Phillips nos dois furos na parte superior de cada suporte e depois de apertar os parafusos na parte inferior de cada suporte.
    2. Conecte o cabo de porta de alimentação do estroboscópio na parte de trás da centrifuga.
  2. Em seguida, defina o rotor direto para baixo para o hub de unidade centrífuga e seguro com uma chave hexagonal de T-handle.
    Nota: Se a centrífuga não é necessário para fins de não-elutriation, a montagem do estroboscópio e do rotor podem ser mantidos na centrífuga entre execuções.
  3. , Uma vez que o rotor é fixado, coloque o conjunto de liberação rápida que contém a câmara de elutriation, balanço de contador, montagem de selo e uma placa de montagem de giro no rotor.
    1. Pressione uniformemente com uma mão a câmara de elutriation e a outra mão sobre o equilíbrio do contador até os parafusos no rotor encaixem nos orifícios da placa de montagem.
    2. Finalmente, conecte o cabo de ancoragem colocando o pino em um lado do cabo no orifício na Assembleia de vedação rotativa e fixando o olho do outro lado do cabo com um dos parafusos Phillips-cabeça (mencionados em 2.1.1) do suporte sobre o lado esquerdo o f a câmara de.
  4. Em seguida, montar o sistema de fluxo usando uma bomba de velocidade variável e tubo para buffer de bomba para o elutriation câmara e recolher o tampão que flui fora da câmara de elutriation.
    1. Inserir o tubo de entrada de tamanho 16 proveniente da bomba de velocidade variável através da porta na parte superior saiu da câmara de centrifugação para que ele entra na câmara de.
    2. Anexar um encaixe a extremidade livre do tubo de entrada e insira o encaixe no orifício entrado na lateral da Assembleia de vedação rotativa.
    3. Inserir o tamanho 16 tubos através da porta de saída e anexá-lo para o tubo de transferência no topo o rotativo de vedação montagem.
      Nota: O sistema de fluxo pode permanecer montado entre as execuções de elutriation.
  5. Por último, ligue o centrifugador e definir as especificações necessárias para o experimento.
    1. Alterar o rotor ID.
    2. Se o centrifugador requer uma entrada de tempo, definido por 2 h, que é mais do que suficiente para completar um elutriation executar.
    3. Definir a temperatura a 20 ° C, com uma temperatura máxima de 24 ° C.
    4. Definir a aceleração para o max e a desaceleração para lento.
    5. Finalmente, definir a velocidade de 867 g. x

3. Preparação do sistema Elutriation

  1. primeiro a fim de esterilizar o sistema elutriation, coloque o tubo de reservatório em um frasco plástico de 500 mL, contendo 5% de alvejante e coloque o tubo de saída em um frasco de resíduos plásticos de vazio 1 L.
    1. Ligar a bomba e definir a velocidade de 25 mL/min e permitir que a lixívia de 5% a correr todo o caminho através do sistema de elutriation até é bombeada fora do tubo de saída para o frasco de resíduos.
    2. Ligar o centrifugador e permitir que chegasse ao máximo designado velocidade (867 x g) para soltar as bolhas e contrapressão.
    3. Parar o centrifugador. Uma vez que o rotor parou de girar, abra a tampa e inspecionar a câmara para qualquer vazamento.
    4. Se não existem fugas, deixe a solução de lixívia fluxo através do sistema de pelo menos 5 min.
  2. Em seguida, limpe o sistema com água esterilizada como lixívia pode levar à formação de precipitados de buffer de elutriation, que pode levar a aglutinação das células, bem como causar danos às células.
    1. Lugar da tubulação do reservatório dentro de uma garrafa de 1L de autoclavado de água e deixe-o liberar através de pelo menos 10 min.
  3. Após o enxaguamento com água, introduzir o tampão elutriation no sistema. Use um frasco de vidro de 150 mL que tem sido esterilizado para criar um reservatório para o buffer de elutriation e células.
    1. Adicionar 100 mL de tampão de elutriation para a garrafa e mover o tubo de reservatório para o frasco de vidro para que o tubo está na parte inferior.
    2. Começar o centrifugador e permitir que o buffer para o fluxo através do sistema de expulsar a água.
    3. Uma vez que o frasco reservatório está quase vazio e a água é liberada completamente fora do sistema, mova a saída tubo do frasco resíduos para o reservatório para que o buffer está sendo reciclado através do sistema.
  4. Finalmente, ajustar a janela de visualização para que a câmara de elutriation pode ser vista na velocidade atual. Lâmpada
    1. imprensa strobe o botão do lado de fora do centrifugador de energia para que a lâmpada acende. Vire o k elutriationNob, também do lado de fora do centrifugador todo o caminho para a esquerda.
    2. Curva de
    3. enquanto olhando através da janela de visualização, lentamente o botão para a direita até a câmara de elutriation entra em modo de exibição e a luz estroboscópica é no tempo com a rotação do rotor.
      Observação: O sistema elutriation pode ficar neste estado até que as células estão preparadas.

4. Preparação da amostra celular

  1. contagem de células e a alíquota média de 300 a 400 milhões em crescimento em vários tubos de 50ml cónico. Gire para baixo as células a 1210 x g, durante 3 min.
  2. Aspirado de células de mídia e ressuspender crescimento em 25 mL de tampão de elutriation pipetando para cima e para baixo suavemente.
  3. Aglutinação de células
  4. para reduzir, células passe duas vezes a um 25 medidor de agulha.
    1. Utilizando uma seringa de 10 mL elaborar as células e, em seguida, conecte a agulha de calibre 25 e passe as células através no interior parede de um tubo cônico estéril 50 mL. Repita isto até que todos os 25 mL tenham passado através da agulha.
    2. Obter uma nova agulha e seringa e repita o processo acima quando.
      Atenção: As agulhas de seringa devem ser colocadas em recipientes para objectos cortantes.
      Nota: É fundamental que as células são empurradas através da agulha, imediatamente antes de apresentá-los ao sistema elutriation para manter a célula aglutinação ao mínimo.

5. Introdução da amostra de célula no sistema Elutriation e coleção de frações

  1. introduzir a amostra de células no sistema derramando a amostra de células no tanque de reservatório, que tem o buffer de elutriation restantes reciclagem através de elutriation .
    1. Deixa as células introduzir no sistema e atingir o equilíbrio dentro da câmara de elutriation.
      Nota: Este processo levará cerca de 5 min e progresso pode ser rastreado, observando as células como eles entram na câmara através da janela de visualização. Para garantir que todas as células se encontram nesta sala, pegue uma gota de eluente, coloque sobre uma lâmina de vidro e ver os sob um microscópio. Se a amostra está livre de células intactas, isto confirma sua retenção na câmara.
  2. Começar a coletar frações, uma vez que todas as células entraram na câmara e não há um limite distinto na parte mais larga da câmara na qual as células estão em equilíbrio.
    1. Begin, movendo-se o tubo de saída para o tubo cônico 50ml rotulados W1. Coletar 50 mL de tampão de elutriation para esta fração, certificando-se de manter um olho sobre o tanque de reservatório e reabasteça com buffer elutriation quando necessário.
      Nota: A fim de certificar-se de que todas as células tenham entrado no sistema, permitir que o tanque reservatório tornar-se quase vazio antes de enchimento do reservatório pela primeira vez. Após a primeira recarga não será necessário esperar o reservatório tornar-se quase vazio. Além disso, não nunca permitir que o tanque se tornar vazio como isto irá criar bolhas e contrapressão no sistema de.
    2. Depois de 50 mL foram recolhidos por W1, simultaneamente mudar a velocidade para 821 x g e mover o tubo de saída para o tubo cônico rotulado W2 e recolher mais nessa velocidade 50 mL.
    3. Continuar alterando a velocidade e coletando frações, conforme indicado na tabela 1. Verifique se há meios de comunicação no reservatório do tanque e mantenham os tubos cónicos no gelo em todos os momentos. Finalmente, ajustar a janela de visualização, lentamente girando o botão para a direita quando a velocidade diminui.
    4. Uma vez que todos os 20 fracções foram recolhidas, parar o centrifugador e recolher 50 mL no tubo cónico rotulado STOP.

6. Flushing do sistema Elutriation

  1. após a centrifugação parou completamente nivelado o sistema, colocando o tubo reservatório na garrafa 1 L de água esterilizada e o tubo de saída volta na garrafa resíduos.
    1. a velocidade da bomba até 50 mL/min e deixe a água correr através do sistema até que se esgote.
  2. Virar a bomba, retire a mangueira de entrada e saída da Assembleia de liberação rápida e retire o pino do cabo de ancoragem.
    1. Remover o conjunto de liberação rápida do rotor.
      Nota: Dependendo do que a centrífuga será usada para, o sistema elutriation pode agora ser deixado como é. Caso contrário, todo o conjunto pode ser derrubado na ordem oposta como descrito acima. Câmara de elutriation pode ser removida do conjunto da liberação rápida e limpa entre execuções usando um banho ultra-sônico. Isto remove resíduos e contaminantes da parede da câmara que pode afetar negativamente as execuções posteriores.

7. Análise de coleção do G1 ou G2/M piscinas e fracções.

Nota: a fim de demonstrar a eficácia da elutriation, cada fração é analisada para contagem de células, diâmetro de célula e conteúdo de DNA, e piscinas são criadas de células na fase G1 ou G2/M para análises de immunoblot, conforme descrito no Resultados do representante. Esta secção de protocolo irá descrever como criar esses pools e prepará-los para uso experimental.

  1. Girar cada fração a 2000 x g por 5 min a 4 ° C e aspirado de buffer de elutriation.
  2. Combinar frações juntos a fim de obter uma piscina de fase G1 e G2/M piscina fases.
    1. Para o G1 fase piscina, resuspenda fracções que foram coletadas na faixa de velocidade de 788 x g a 661 x g (F1 - F5) em um total de 1 mL de solução salina-tampão fosfato (PBS) e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Para o pool de fases G2/M, resuspenda fracções que foram coletadas na faixa de velocidade de 387 x g e 333 x g (F17 - F20).
    2. Spin para baixo as células a 2000 x g por 5 min a 4 ° C e aspirado fora PBS.
  3. Ressuspender as células em 10 mL de mídia de crescimento e tomar uma contagem de células.
  4. Tomar uma alíquota de cada grupo para ser analisado por DNA conteúdo através de coloração de iodeto de propidium e fluxo cytometric análise 15.
    Nota: O restante de cada pool pode ser usado para novas experiências.

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Representative Results

Primária todas as células (3-4 x 108) foram submetidas a elutriation centrífuga e coletadas em duas fracções de lavagem e vinte principais frações, conforme descrito no protocolo. A tabela 1 mostra dados representativos, onde o número total de células em cada fração, bem como a velocidade do rotor correspondente é apresentado. Em geral rendimento era tipicamente mais de 80%. Medição do diâmetro da célula em frações individuais confirmou esse diâmetro celular aumentou com o avançar da elutriation (Figura 2). Estes resultados representam as médias das duas determinações independentes e refletem o alto grau de reprodutibilidade de dados. Frações em seguida foram submetidas à coloração de iodeto de propidium e fluem cytometry para determinar o conteúdo de DNA (Figura 3). Primeiras fracções (F1 - F5) continham quase exclusivamente de células com 2N conteúdo de DNA que representa a fase G1. Observou-se uma mistura de células na fase G1 e fase S em fracções intermediárias (F6 - F9) e células com conteúdo de DNA 4N foram observados a partir de F10. Frações mais tarde tinham principalmente células com conteúdo de DNA 4N representando fases G2/M. Estes dados, juntamente com os resultados da Figura 2 confirmaram uma relação entre o tamanho da célula e a fase do ciclo celular.

Com base nestes resultados, fracções F1 - F5 foram combinadas para criar um pool de células na fase G1 e frações F17 - F20 foram combinadas para criar um pool de células na fase G2/M. A proporção de células com conteúdo de DNA 2N na piscina fase G1 era tipicamente 99%, e a proporção de células com conteúdo de DNA 4N na piscina G2/M era tipicamente 85%, conforme determinado pela coloração de iodeto de propidium e citometria de fluxo. Sob condições de assíncronas, 60-70% da primária são de todas as células na fase G1 e 15-20% estão em G2/M fases15, assim, os valores obtidos após elutriation refletem níveis elevados de enriquecimento. Para ainda mais autenticar as duas piscinas com relação a fase do ciclo celular, extratos de cada um foram submetidos à immunoblotting com marcadores de fases G1 ou G2/M. Em primeiro lugar, utilizamos um phospho-específico do anticorpo que reconhece a proteína do retinoblastoma (Rb) fosforilada no Ser-807 ou Ser-811, já está bem estabelecido que a Rb torna-se cada vez mais fosforilado como adiantamento de células através do ciclo celular17 . Como mostrado na Figura 4, de fosfo-Rb eram muito mais elevados nas células em G2/M piscina contra o pool de fase G1, consistente com as expectativas. Nós também sondou para ciclina B1, que é mais altamente expressa em células em fase G2/M, e de ciclina D1, que é mais altamente expresso em G1 fase células18 (Figura 4). A piscina do G2/M tinha níveis muito mais altos de ciclina B1 em comparação com o pool de G1, consistente com as expectativas. Ciclina D1 deu apenas um sinal fraco nestes preparativos, mas não obstante era detectável na piscina G1 e indetectável na piscina G2/M. GAPDH foi usado um controle para confirmar o carregamento de proteína igual.

Modificações para o protocolo padrão foram realizadas para avaliar seus efeitos e estabelecer condições para um desempenho ideal. Primeiro, o número de fracções recolhidas diminuiu, desde os vinte padrão para apenas três, com velocidades de determinada a partir da tabela 1 para representar os pontos terminais para coleta de células nas fases G1, S e G2/M, conforme mostrado na tabela 2. Análise do DNA conteúdo de frações F1 e F3 são mostrados na Figura 5A. Fração 1 continha células altamente enriquecidas na fase G1 (95%) e foi assim, de pureza similar àquele obtido sob condições normais (Figura 3). No entanto, a fração 3, ostensivamente células altamente enriquecido na fase G2/M, deu uma população misturada, com células nas fases G1 e S também presentes. G2/M células representavam apenas 51% do total, em comparação com 85% em condições normais. Estes resultados indicam que as tentativas de simplificar o procedimento, reduzindo o número de fracções compromete amostra a qualidade. Em seguida, testamos o efeito de reduzir o volume de fração, como um meio para reduzir o consumo de reagente. Realizou-se um padrão elutriation exceto que foram coletadas 40 mL em vez de frações de 50 mL. Fracções F1 e F20 foram analisados para conteúdo de DNA. Como mostrado na Figura 5B, fração F1 foi altamente enriquecida em G1 células em fase (98%), semelhantes ao Obtido em condições padrão. No entanto, as células fração F20 contidos em todas as três fases, com as células na fase G2/M apenas representando 64% do total, comparado com 85% em condições normais. Estes resultados indicam que reduzindo fração volume também compromete a qualidade da amostra.

Figure 1
Figura 1 . Princípio da elutriation centrífuga de contracorrente.
Nota que elutriation de células pode ser conseguido aumentando a taxa de contrafluxo conforme indicado aqui ou diminuindo a velocidade do rotor. Adaptado com permissão da Macmillan Publishers Ltd: [protocolos de natureza] (8 Ref.), de direitos autorais (2008)8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Diâmetro do primário todos células aumenta a fração de elutriation.
O diâmetro médio foi determinado para cada fração usando um analisador de celular que grava dados de células individuais de 500-4.500 por amostra. Os dados mostrados são média ± D.P. de dois experimentos independentes. Note que as barras de erro para muitos pontos são menores do que o símbolo e foram omitidas para maior clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Análise de conteúdo de DNA confirma separação bem sucedida da escola primária de todas as células nas fases do ciclo celular diferente.
10 mL de cada fração foi fixado em 70% EtOH, manchado em iodeto de propidium e analisadas por citometria de fluxo, como descrito a15. Intensidade de integrado de iodeto de propidium (eixo x) foi representados graficamente em função da contagem de células (eixo y) para determinar a porção de células em cada fase, onde 2N conteúdo de DNA indica a fase G1 e conteúdo de DNA 4N indica células em fases G2 ou M. Os dados mostrados são de uma experiência representativa e essenciais resultados idênticos foram obtidos em quatro repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Em pool immunoblot análise de proteínas relacionadas com o ciclo celular emfrações.
Seguindo um padrão elutriation da primária para todas as células, fracções F1 - F5 foram combinadas para criar um pool de fase G1 e frações F17 - F20 foram combinados para criar um pool de fase G2/M. Extratos foram preparado e 40 µ g/lane submetido à análise de immunoblot, conforme descrito anteriormente15, com Anticorpos fosfo-Rb (Ser807/811), cyclin B1 ou cyclin D1, todos usados na diluição do 1:2,000. GAPDH (01:10, 000) foi usado como um controle de carregamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Dados ilustrativos de elutriations de qualidade inferior.
A) efeito da diminuição do número de fracções recolhidas. Apenas três frações principais (F1 - F3), em vez do padrão de vinte, cada um de 100 mL, foram coletadas, a velocidades conforme indicado na tabela 2. Fracções F1 e F3 foram analisados para conteúdo de DNA, como na Figura 3. B) efeito de reduzir o volume de fração. Vinte fracções foram coletadas, nas mesmas condições como na tabela 1, mas apenas de 40 mL de tampão de elutriation em vez dos 50 mL padrão foi usado para cada um. Fracções F1 e F20 foram analisados para conteúdo de DNA, como na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fração Velocidade (rpm) G-Force Total de células (x 10 ^ 6)
W1 3000 867 x g 17,75
W2 2920 821 x g 7,00
F1 2860 788 x g 4.60
F2 2800 755 x g 10,75
F3 2740 723 x g 15,25
F4 2680 692 x g 22.50
F5 2620 661 x g 26.75
F6 2560 631 x g 25,00
F7 2500 602 x g 22.75
F8 2440 573 x g 18,00
F9 2380 546 x g 14,00
F10 2320 518 x g 10,75
F11 2260 492 x g 7.43
F12 2200 466 x g 8.63
F13 2140 441 x g 6.63
F14 2100 425 x g 4.98
F15 2060 409 x g 3,46
F16 2020 393 x g 3.43
F17 1980 378 x g 2,63
F18 1940 363 x g 3.17
F19 1900 248 x g 2.78
F20 1860 333 x g 1.66
PARE 0 0 x g 5.19
Rendimento total 245.06
Por cento do rendimento 81.69

Tabela 1. Rendimento de célula e rotação do rotor correspondente para cada fração.
Contagem de células foi determinada usando um contador automatizado de células. Rendimento total foi determinado pela soma de frações individuais contra entrada (3 x 108 células). Dados são uma média de dois experimentos representativos. Força centrífuga e a correspondente velocidade do rotor são dadas.

Fração Velocidade (rpm) Força G
W1 3000 867 x g
W2 2920 821 x g
F1 2620 661 x g
F2 2020 393 x g
F3 1860 333 x g
Pare 0 0 x g

Tabela 2. Parâmetros de velocidade para elutriation suboptimal.
São mostradas as forças centrífugas e correspondentes velocidades do rotor para as lavagens e três fracções recolhidas em um comprimido elutriation de qualidade inferior. Ver Figura 5A para conteúdo de DNA correspondente e texto para detalhes.

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Discussion

Descrevemos um método de obtenção primária todas as células em diferentes fases do ciclo celular usando o CCE. Sob condições ideais uma população essencialmente pura de células na fase G1 e uma população altamente enriquecida de células em G2/M fases prontamente poderiam ser obtidos em excelente rendimento, e células altamente enriquecidas em fase S também podem ser obtidas se desejado. Os resultados aqui apresentados foram obtidos usando um primário de que toda cultura (especificamente, ALL-5) e essencialmente idênticos resultados foram obtidos com uma cultura independente, ALL-215. Além disso, todos os outros primária de todas as culturas que examinou até à data têm intervalos de densidade semelhante durante o crescimento assíncrono e provavelmente faça da mesma forma, quando submetido ao CCE. Nossos estudos anteriores mostraram também que outras linhas de células de leucemia, incluindo HL60 e K562, podem ser separadas em fases diferentes de ciclo celular usando CCE19,20. Passos críticos no procedimento incluem garantindo as células mono-dispersos e não agrupados no início da execução; otimização das condições de velocidade taxa e rotor de contracorrente; garantindo os componentes do sistema são limpo e livre de detritos; e evitando a introdução de bolhas de ar nas linhas de fluxo. CCE funciona melhor com células que aumentam significativamente em tamanho da célula à medida que avançam através do ciclo celular. Para uma determinada população de células em suspensão, esta pode ser estabelecida inicialmente e facilmente examinando a relação entre o conteúdo de DNA e lado-scatter, o último dependente do tamanho da célula. Ambos os parâmetros podem ser medidos simultaneamente por citometria de fluxo após iodeto de propidium coloração, como descrevemos a15. Uma relação linear entre o lado-scatter e conteúdo de DNA proporciona confiança de que o tamanho da célula aumenta com o avanço do ciclo celular e, portanto, que a CCE tem o potencial para separar as células com base na fase do ciclo celular.

Como mostramos (Figura 5), os desvios do processo otimizado resultam em qualidade de amostra comprometidos, especialmente para as células em G2/M fases. No entanto, redução do número de fracções ou fração volume não afectem a pureza das células na fase G1 (Figura 5). Assim, os atalhos para o procedimento podem ser tolerados se apenas células em fase G1 purificadas são necessários. Apesar de CCE é facilmente passível de culturas de células de suspensão, também pode ser aplicado a frações subcelulares. Por exemplo, núcleos de células pré-b murino foram com sucesso tamanho-separadas usando CCE8. Tipos de células aderentes representam potenciais problemas devido à sua propensão para aglutinação e possível aderência sobre as superfícies da câmara de tubulação e elutriation e, portanto, devem ser investigados com cuidado.

A principal limitação da CCE é o custo do equipamento; uma possível solução é colaborar com um laboratório que tem o aparato necessário. Note no entanto que, enquanto o rotor é um instrumento específico, a centrífuga pode ser utilizada para fins de centrifugação geral, reduzindo assim o custo investido exclusivamente no CCE. Outra limitação é que o agendamento das experiências é mais problemático em comparação com a flexibilidade de outros métodos, como sincronização de fome ou química de soro. Elutriation é executado geralmente leva 5 a 6 horas, e se as células obtidas posteriormente são necessários para as experiências de curto prazo ou tempo multi ponto, isso pode resultar em agendamento inconvenientes. A maior vantagem é que as células obtidas por esse método são imperturbável e podem ser cultivadas por muitos dias sem qualquer sinal de perigo, como mostramos15. Isto contrasta com células sincronizadas por meios químicos, que podem abrigar dano induzido por drogas. Um estudo recente, utilizando células NB4 derivadas de leucemia mieloide aguda explosões, directamente comparados CCE e outros métodos, incluindo a detenção com fome de soro, Hidroxiureia ou tratamento com um inibidor cyclin-dependente de quinase 1, RO-330621. Elutriated células e células presos às fases comparáveis aparecidas semelhantes em relação ao conteúdo de DNA e expressão de ciclina. No entanto, quando o proteome foi examinado, major muda em abundância de proteína, particularmente relacionados ao estresse e proteínas específicas de detenção, foram observadas nas células presas e não nas células elutriated em posições de tamanho de célula equivalente. Estes resultados destacar a utilidade da CCE para a produção de células imperturbável e enfatizar que cautela deve ser usada quando a interpretação dos dados de células sincronizado por outros meios.

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Disclosures

Anisha Kothari está atualmente o departamento de biologia celular e Molecular no Research Hospital do St Jude Children.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH CA109821 (para o TCC). Agradecemos Beckman-Coulter, generosamente, fornecendo recursos para cobrir os custos de publicação e de assistência técnica na instalação e operação do sistema elutriation. Agradecemos o Dr. Fred Falkenburg pelo fornecimento inicial primária todas as culturas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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