التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويصف هذا البروتوكول ديسيلولاريزيشن الكامل لعضلة القلب البشري مع الحفاظ على عناصر المصفوفة خارج الخلية. الاستمرار في معالجة نتائج المصفوفة خارج الخلية في إنتاج المجهرية الدقيقة والمائية تجميع ذاتي سيتوبروتيكتيفي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الاستعدادات اللاخلوي المصفوفة خارج الخلية هي مفيدة لدراسة التفاعلات الخلية-مصفوفة وتسهيل تطبيقات العلاج خلية التجدد. تتوفر العديد من المنتجات التجارية المصفوفة خارج الخلية الهلاميات المائية أو الأغشية، ولكن هذه لا تملك أنسجة محددة النشاط البيولوجي. لأنه عادة ما ديسيلولاريزيشن التروية غير ممكن مع أنسجة قلب الإنسان، قمنا بتطوير عملية ديسيلولاريزيشن غمر الخطوة 3. شرائح احتشاء عضلة القلب البشري المشتراة خلال الجراحة أولاً تعامل مع المخزن المؤقت لتحلل الاسموليه خالية من المنظفات، تليها الحضانة مع دوديسيل كبريتات الصوديوم الأيونية المنظفات، وإتمام العملية عن طريق استغلال نشاط الدناز الجوهرية مصل الدم البقري الجنين. نتائج هذا الأسلوب في أوراق القلب المصفوفة خارج الخلية مع خلية خالية إلى حد كبير الحفاظ على تكوين النسيج الليفي العمارة وبيوبوليمير، التي عرضت تقديم منبهات بيئية محددة للسكان خلية القلب والجذعيه pluripotent الخلايا. أوراق القلب المصفوفة خارج الخلية يمكن ثم كذلك المجهزة إلى مسحوق يمثل دون تعديل المواد الكيميائية كذلك، أو، عن طريق الهضم بيبسن قصيرة الأجل، وإلى المائية مصفوفة خارج الخلية قلبية تجميع ذاتي مع الحفاظ على بيواكتيفيتي.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) يوفر ليس فقط دعم الهيكلية ولكن مهم أيضا للخلية البيولوجية والأنسجة تعمل1. في القلب، ويشارك إدارة المحتوى في المؤسسة في تنظيم استجابات باثوفيسيولوجيك مثل التليف والتهاب والأوعية، والدالة الهوس كارديوميوسيتي وبقاء ومصير الخلية السلف المقيمين. بالإضافة إلى مكوناته الأولية-glycoproteins الليفي والجليكوزامينوجليكان وبروتيوجليكانس--أنه يحتوي على مجموعة من عوامل النمو يفرز، السيتوكينات، والحويصلات الغشائية التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات2،3.

مؤخرا أصبح من الواضح أن اللاخلوي ECM الاستعدادات ليست فقط لا تقدر بثمن لدراسة التفاعلات الخلية-مصفوفة، بل أيضا للتطبيقات المستندة إلى الخلية العلاجية المحتملة. أهمية توفير بيئة ملائمة للمنتجات العلاجية الخلايا أو الأنسجة المهندسة هو الآن على نطاق واسع. وقد بذلت محاولات للجمع بين تعليق خلية أو المركبات النشطة مع المعرفة الهلاميات المائية بيوبوليميريك4،،من56 أو مع الكوكتيل بروتين يفرز من الخلايا ساركومه مورين (أي، ماتريجيل، جيلتريكس) 7-بيد السابقة محدودة بيواكتيفيتي، هذه الأخيرة إشكالية في عمليات برنامج الرصد العالمي-الصف، وكلاهما يفتقر بيواكتيفيتي الخاصة بأنسجة القلب ECM (الوزاري)8،،من910، 11،،من1213.

ديسيلولاريزيشن عضلة القلب كانت تؤديها سابقا نضح قلب كله عن طريق ال14،المفرج التاجية15. حين يكون ذلك ممكناً في قلوب الحيوان، قلوب البشر سليمة تتوفر إلا نادراً. ولذلك، كان يفضل عملية غمر الذي يسمح لمعالجة عينات الأنسجة التي تم الحصول عليها في غرفة العمليات. ويتضمن البروتوكول "3-خطوة" لدينا منفصلة 3 حضانة الخطوات هي تحلل، سولوبيليزيشن، وإزالة الحمض النووي. غلة ECM احتشاء عضلة القلب البشري إلى حد كبير الحفاظ على البروتين و glycosaminoglycan تكوين16،17. هذه الشرائح الوزاري السماح للدراسات في المختبر من تفاعلات الخلية-مصفوفة ولكن سيئة مناسبة للتطبيقات العلاجية المحتملة على الإنسان على نطاق. ثم تم تمديد عملية التصنيع لإنتاج المجهرية الدقيقة الوزاري المجففة بالتبريد أو المائية الوزاري18.

يسمح هذا البروتوكول ديسيلولاريزيشن لعضلة القلب البشري التي تم الحصول عليها من عينات جراحية، الحفاظ على المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية احتشاء عضلة القلب (ECM) ونشاطهم البيولوجية. يوصي بهذا البروتوكول عندما ECM القلب البشري مع الحفاظ على الأنسجة على حدة بيواكتيفيتي مطلوب للدراسات التجريبية من تفاعلات الخلية-مصفوفة، أو عند الحاجة إلى بيئة ملائمة لنهج يستند إلى الخلية التجديد احتشاء عضلة القلب. من حيث المبدأ، من الممكن أيضا التكيف مع هذا البروتوكول إلى شروط GMP الصف، حيث أنه ينبغي استخدام الوزاري المجهزة التطبيقات العلاجية في المستقبل ممكناً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بروتوكول الدراسة تتفق مع المبادئ الأخلاقية المبينة في "إعلان هلسنكي" ووافقت عليه لجنة المجلس والأخلاقيات استعراض المؤسسية للجامعة الطبية في مستشفى الشارتي. جميع المرضى المقدمة كتابة، المستنيرة باستخدام أنسجة القلب للدراسات التجريبية.

1. إعداد عضلة القلب البشري لتقطيع

  1. الحصول على عضلة القلب البطين الأيسر (الحجم يختلف تبعاً لنوع الجراحة) مباشرة من غرفة العمليات والنقل في برنامج تلفزيوني الباردة في حاوية معقمة.
  2. قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية مع مشرط معقم مع شفرة رقم 10 تحت ظروف معقمة.
  3. قطع في عضلة القلب في مكعبات حوالي 1 × 1 × 1 سم باستخدام مشرط.
  4. ضع المكعبات في أنابيب معقمة 50 مل.
    ملاحظة: لوقفه، نفذ الخطوة 1.5، وإلا تابع مع الخطوة 2، 2. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة لمنع تدهور البروتين وانخفاض في نوعية الأنسجة.
  5. تخزين الأنابيب التي تحتوي على المكعبات في-80 درجة مئوية. ويمكن تخزين الأنسجة لعدة أشهر.

2-تقطيع مكعبات عضلة القلب إلى شرائح

  1. أن tube(s) تتضمن المكعبات المعدة خارج الثلاجة.
  2. النقل على الجليد كريوستات.
  3. ضبط درجة حرارة الكائن والدائرة إلى-15 درجة مئوية.
    ملاحظة: درجة الحرارة المناسبة أمر حاسم لضمان تمزيقها الكمال.
  4. تشيل أنابيب فارغة 50 مل والطوابع في الدائرة أو على الثلج الجاف.
  5. قم بإضافة طبقة (حوالي 0.5-1.0 مل) من متوسطة كريوسيكشن على ختم الباردة واسمحوا أنها تجمد حتى يصبح أبيض ومتين.
  6. إضافة طبقة ثانية من كريوسيكتيون المتوسطة ووضع مكعب عضلة القلب على هذه الطبقة.
  7. تأكد من كريوسيكشن المتوسطة وعضلة القلب مجمدة تماما قبل المتابعة.
    ملاحظة: عند متوسط العينة وكريوسيكشن ليست مجمدة تقطيع ستضعف. يتحول المتوسطة كريوسيكتيون مجمدة تماما من السوائل وشفاف متين والأبيض وغير شفافة. مكعبات احتشاء عضلة القلب تحتاج إلى 30 دقيقة على الأقل حتى 1 ح تجميد تماما إذا ما تواصل مباشرة من الخطوة 1، 4. عندما يتم تجميد الأنسجة ينبغي أن لا تشوه عندما لمست/التعامل مع ملاقط.
  8. إدراج طابع مع عضلة القلب المجمدة في الحامل وتشديد جميع المسامير.
  9. تقليم سطح النسيج حتى يتم الحصول سطح حتى تقطيع.
  10. قم بتقطيع السمك إلى 300 ميكرون.
  11. قسم عضلة القلب المجمدة مع تقطيع التلقائي. وهذا يضمن أقسام قطع موحدة. يمكن شرائح حوالي 30-40 مقاطع من مكعب واحد.
  12. ضع كل شريحة بعد تقطيع فضفاضة في أنبوب 50 مل بريكوليد.
    ملاحظة: لا تضغط على شرائح أو حزمة محكم. يمكن أن تناسب شرائح تقريبا 40 في أنبوب واحد.
  13. إغلاق الأنابيب شغلها ووضع على الجليد.
    ملاحظة: لإيقاف الذهاب في الخطوة 2، 14، وإلا تابع مع الخطوة 3.2.
  14. تخزين شرائح عضلة القلب في-80 درجة مئوية. ويمكن تخزين الشرائح لعدة أشهر.

3-ديسيلولاريزيشن شرائح عضلة القلب البشري

  1. أن العدد اللازم من أنابيب 50 مل تتضمن أجزاء عضلة القلب من الثلاجة-80 درجة مئوية والنقل على الجليد.
  2. نقل الأجزاء المجمدة لكل 50 مل أنابيب من الخطوة 3.1 في كوب معقم واحد. يتم إضافة شرائح حوالي 40 للكأس الواحدة وأنبوب 50 مل. ينبغي أن يكون الكأس ثلاث مرات حجم أنابيب 50 مل؛ على سبيل المثال، على ديسيلولاريزيشن أنبوب 50 مل واحد استخدام كوب 150 مل.
  3. إضافة حل تحلل 50 مل (10 ملم تريس، 0.1% w/v يدتا، درجة الحموضة 7.4 في ح2س) في أنبوب 50 مل مع شرائح عضلة القلب.
  4. اهتزاز عضلة القلب شرائح في كوب معقم 100-150 لفة في الدقيقة بشكل مستمر ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  5. ضغط السائل مع شرائح الأنسجة من خلال مصفاة خشنة. نقل شرائح الأنسجة مع الملاقط كليلة لكوب عقيمة جديدة. إضافة 50 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% في برنامج تلفزيوني لكل أنبوب الأولية 50 مل من شرائح عضلة القلب (مثلاً، استخدام 100 مل مخزونات النشر الاستراتيجي الحل عندما يتم يجري ديسيلولاريزيد أنبوبين 50 مل من أقسام احتشاء عضلة القلب).
  6. اهتز بشكل مستمر ح 6 لفة في الدقيقة 100-150 في درجة حرارة الغرفة.
  7. ضغط السائل مع شرائح الأنسجة من خلال مصفاة خشنة. نقل شرائح الأنسجة مع الملاقط كليلة لكوب عقيمة جديدة ويغسل 3 مرات مع 50 مل برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في كل حين تهز 150 لفة في الدقيقة. يغسل بعد ذلك، بين عشية وضحاها في برنامج تلفزيوني مع 1% البنسلين/ستربتوميسين و 1% النيستاتين (برنامج تلفزيوني-P/S-N) في 100-150 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية في حين تهتز.
    ملاحظة: الغسيل شامل أمر حاسم لإزالة أي بقايا الحزب الديمقراطي الصربي. بقايا من الحزب الديمقراطي الصربي مواد سامة عندما يستخدم في تركيبة مع الخلايا إدارة المحتوى في المؤسسة.
  8. إزالة الحل الغسيل وإضافة 25 مل يسخن FBS (37 درجة مئوية) مع 1% البنسلين/ستربتوميسين و 1% النيستاتين لشرائح ديسيلولاريزيد كل أنبوب الأولية 50 مل من شرائح عضلة القلب.
  9. احتضانها ح 3 في 37 درجة مئوية. في هذه الخطوة، يتم إزالة أي الحمض النووي الباقية من المصفوفة بسبب نشاط الدناز الجوهرية FBS.
  10. نقل الشرائح إلى كوب عقيمة جديدة ويغسل 3 مرات مع 50 مل برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في كل حين تهز 150 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: شرائح المحتوى يمكن تخزين في برنامج تلفزيوني-P/S-N عند 4 درجة مئوية لعدة أيام. ومع ذلك، من المستحسن المضي فورا.

4-تجهيز الوزاري ديسيلولاريزيد إلى مسحوق

  1. وضع شرائح ECM فضفاضة في صفيحة 6-بئر جديدة عقيمة. تجميد ECM في-80 درجة مئوية وليوفيليزي لمدة يومين في ليوفيليزير.
    ملاحظة: يمكن وضع شريحة واحدة أو أكثر في البئر. ترتيب الشرائح تغطي كامل سطح البئر. الشرائح متداخلة لا تؤثر على نجاح نضح اللاحقة.
  2. لنضح الشريحة إدارة المحتوى في المؤسسة، أنابيب استخدام المسارات المحددة (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على 1.4 مم حبات السيراميك. ملء الأنابيب فضفاضة مع ECM المجففة بالتبريد باستخدام الملقط حادة معقمة. لتحقيق أفضل النتائج، ينصح وزن إجمالي لإدارة المحتوى في المؤسسة بين 10-20 ملغ.
    ملاحظة: إذا كانت معبأة إدارة المحتوى في المؤسسة مسرف في أنابيب الطحن عملية نضح سوف تتأثر سلبا.
  3. الأداة الإضافية-تجميد الأنابيب في نيتروجين سائل.
    تحذير: النتروجين السائل درجة الحرارة منخفضة للغاية، وملابس الحماية الشخصية المناسبة.
  4. إدراج أنابيب المجمدة في آلة طحن ويطحنون في إدارة المحتوى في المؤسسة.
    1. تعيين مدة 30 ق وبحد أقصى سرعة وبدء تشغيل الجهاز.
    2. بعد الانتهاء، إخراج الأنابيب وتجميد الأداة مرة أخرى في نيتروجين سائل.
    3. كرر خمس مرات.
  5. أغسل المجهرية الدقيقة من الأنابيب بإضافة 1 مل ddH2س كل أنبوب ويهز أو دوامة لإكمال سولوبيليزينج. تصفية الحل غير متجانسة من خلال شبكة 200 ميكرومتر في أنبوب 50 مل.
  6. تجميد الأنبوبة في النيتروجين السائل أو-80 درجة مئوية.
  7. استبدال غطاء الأنبوب القياسية مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. غطاء عامل التصفية هذا يمنع المتدفقة من الأنبوب المسحوق ولكن يسمح دوران الهواء لتبخر الماء.
  8. إدراج هذه الأنابيب في ليوفيليزير وليوفيليزي مرة أخرى لإزالة الماء من الخطوة (الخطوة 4، 5)
    ملاحظة: ليوفيليزيشن في هذه الخطوة يمكن أن يستغرق مدة تصل إلى 3 أيام.
  9. تخزين مسحوق في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة أو الاستمرار في الخطوة 5، 1.

5-إنزيم استناداً إلى هوموجينيزينج من الوزاري الجسيمات الدقيقة

  1. حل بيبسن الخنزير في 0.01 M HCl (pH 2.0) بتركيز 1 ملغ/مل. ضع على شاكر روتاري في درجة حرارة الغرفة حتى أنه يذوب تماما.
  2. حل مسحوق ECM البشرية المجففة بالتبريد (الخطوة 4، 8) في حل بيبسن بتركيز نهائي 10 ملغ/مل. مزيج دقيق من خلال بيبيتينج. إجمالي الحجم يعتمد على مقدار الحاجة إلى حل إدارة المحتوى في المؤسسة. على سبيل المثال، يحل 10 ملغ مسحوق ECM في 1 مل بيبسن الحل.
    ملاحظة: حل جسيمات يمكن دعم عن طريق فورتيكسينج لطيف (1,000-1,500 لفة في الدقيقة). تبقى الكتل المجهرية الدقيقة سوف تؤثر سلبا على الهضم.
  3. نقل الحل إلى أنابيب 2 مل بحجم 1 مل كل أنبوب.
  4. ضع الأنابيب في شاكر أنبوب ح 48 27 درجة مئوية و 1,200 في الدقيقة.
  5. إخراج الأنابيب من شاكر ومكان على الجليد أو حامل أنبوب تبريد مسبقاً.
  6. مزيج 1/9 حجم الحل ECM الباردة x 10 برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) مع 1/10 حجم الحل ECM الباردة 0.1M هيدروكسيد الصوديوم في الأنبوب بريكوليد والمكان على الجليد. هذا الخليط سوف تحييد الحل ECM هضمها ولا رجعة فيه إلغاء تنشيط في محيط.
  7. إضافة حل إدارة المحتوى في المؤسسة إلى تحييد خليط ومزيج دقيق من خلال بيبيتينج أو فورتيكسينج.
  8. تعيين في إدارة المحتوى في المؤسسة إلى التركيز المطلوب مع برنامج تلفزيوني 1 x (درجة الحموضة 7.4). يمكن التحقق من الرقم الهيدروجيني للحل مع ورقة الأس الهيدروجيني.
    ملاحظة: حساب مثال لمل 10 يهضم حل إدارة المحتوى في المؤسسة:
    إضافة 10 ملغ بيبسن الخنزير إلى 10 مل من HCl (pH 2.0).
    إضافة مسحوق 100 مغ ECM لحل بيبسن.
    ملاحظة: حساب مثال لتحييد 10 مل يهضم حل إدارة المحتوى في المؤسسة، وتعيين التركيز إلى 8 ملغ/مل:
    المجلدالنهائي = x Vol جابدأ ابدأالنهائي = 10 ملغ/مل × 10 مل/8 ملغ/مل = 12.5 مل
    المجلد10xPBS = المجلدبدء تشغيل /9 = 1/9 من 10 مل = 1.11 مل 10 x برنامج تلفزيوني
    المجلدهيدروكسيد الصوديوم = المجلدبدء تشغيل /10 = 1/10 من 10 مل = 1 مل
    المجلد1xPBS = المجلد المجلدالنهائي -المجلدبدء تشغيل -10xPBS -المجلدهيدروكسيد الصوديوم = 12.5 مل-10 مل-مل.11-1 مل = 0.39 مل

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عرض البروتوكول 3-خطوة ديسيلولاريزيشن لعضلة القلب البشري هنا النتائج في إزالة شبه الكامل للمواد الخلوية، مع الحفاظ على عناصر المحتوى الرئيسية وبنية فيبريلار لإدارة المحتوى في المؤسسة. بعد ديسيلولاريزيشن، يتضح الإجمالي إزالة الخلايا من الأنسجة بتغيير اللون (الشكل 1A). وكشف التحليل النسيجي مع بقع ح & ه وماسون تريتشرومي الغياب الكامل للخلايا المتبقية سليمة (الشكل 1B). وكشفت فحوصات الكمي لمكونات فردية في إدارة المحتوى في المؤسسة إزالة الحمض النووي أكثر اكتمالا والحفاظ على أفضل من مجموع الكولاجين والايلاستين الجليكوزامينوجليكان مقارنة مع ديسيلولاريزيشن من الحزب الديمقراطي الصربي وحدها (الشكل 2A). ويبين الشكل 2الأدلة الفنية لنشاط بيولوجي الوزاري. هنا، استخدم RT-PCR للتحديد الكمي للتعبير عن البروتينات الهيكلية كارديوميوسيتي (Myh6، Tnnt2)، أوائل (Mef2c، Nkx2.5) أواخر عوامل النسخ في كارديوميوجينيك (Gata4)، والخلايا البطانية ماركر السطحية الجينات (فون ويليبراند عامل (فوف)، فيكاديرين) في مورين ESC تمر التمايز عفوية. بالمقارنة مع سطح الطبق الثقافة غير المصقول وطلاء ماتريجيل-إدارة المحتوى في المؤسسة، فمن الواضح أن الاتصال مع الوزاري يدفع الخلايا الجذعية pluripotent يفضل نحو النمط الظاهري مثل كارديوميوسيتي.

يمكن معالجة المجففة بالتبريد ECM شرائح أخرى إلى المجهرية الدقيقة دون استخدام الكواشف الكيميائية أو الانزيمية. الميكانيكية طحن أو الذر استخدام مجموعات مناسبة سمحت لإنتاج المجهرية الدقيقة بحجم موحد (الشكل 3A). الكتلي يوفر لمحة عامة عن جميع البروتينات المعروفة في الوزاري. وكشف تحليل علم الوجود الجينات مع التركيز على المكونات الخلوية أن غالبية بروتينات ECM مستمدة في الواقع من الفضاء خارج الخلية، مع عدد قليل من بقايا الهيموغلوبين وعدد من البروتينات داخل الخلايا غالباً (الشكل 4). هذا النمط يمكن تحديد وظيفة الوزاري البيولوجية الخاصة بالانسجة، ولكن هذا الافتراض يحتاج إلى مزيد من البحث. ويرد موجز لتكوين البروتين الوزاري في الجدول 1- التجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة إلى المجهرية الدقيقة يحافظ على النشاط البيولوجي. عرض الخلايا HL-1 تتعرض لظروف محاكاة "الدماغية" (الحرمان نقص، والسكر، والمصل) زيادة في استقلاب الخلية (الشكل 3B) وانخفاضا في موت الخلية عند مثقف في الوزاري (الشكل 3).

ويؤدي الهضم محدودة على أساس بيبسن مسحوق الوزاري، استناداً إلى بروتوكول تعديل وضعها ل تنقية الكولاجين19، حلاً ECM المتجانس. مرحلة التباين الخفيفة الميكروسكوب الصور (الشكل 5A) تثبت عملية الهضم بعد ح 0 وح 48. وتسهل هذه الخطوة المتجانس تطبيقات في الطب التجديدي10. ويبين الشكل 5Bالوزاري المجهزة الناجمة عن ذلك. تحت درجة حرارة الغرفة ويبقى السائل (الشكل 5B، اليسار) ولكن عند 37 درجة مئوية من أشكال المائية تجميع ذاتي مع الاستقرار مناسبة لتراكب مع تعليق خلية السماح للثقافة 3D (صورة تمثيلية، حق الشكل 5B ، المائية الطبقات مع الثقافة المتوسطة). يعيش الميت تلطيخ الخلايا الليفية القلب البشري كما يبين الآثار المفيدة لاستزراع في الوزاري (الشكل 5). الوزاري المجهرية الدقيقة والمائية الوزاري يعزز النشاط الأيضي للخلايا HL1 الهوس في ظروف الدماغية مقارنة بالخلايا في الثقافة القياسية (الشكل 5، اللوحة اليسرى السفلي).

Figure 1
رقم 1: ديسيلولاريزيشن لعضلة القلب القلب البشري. (أ) يكشف تحليل العيانية الوزاري بالفحص المجهري ستيريو إزالة المواد الخلوية مع بروتوكول ديسيلولاريزيشن الخطوة 3. وهذا واضح من زيادة الشفافية. (ب) الأنسجة تلطيخ شرائح احتشاء عضلة القلب من قبل وبعد ديسيلولاريزيشن مع أنه-(يسار; شريط المقياس = 50 ميكرومتر) و Trichrome ماسون تلطيخ (الحق؛ شريط المقياس = 200 ميكرومتر) يظهر نجاح إزالة الخلايا من الأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: المحتوى والأثر لشرائح الوزاري. (أ) تحليل الكيمياء الحيوية الكمية المحددة مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة والحمض النووي، ومقارنة البروتوكول ديسيلولاريزيشن 3-خطوة إلى 0.5% ديسيلولاريزيشن الحزب الديمقراطي الصربي وحدها. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من المحتوى في عضلة القلب الأصلي. مع البروتوكول خطوة 3، محتوى الحمض النووي المتبقية وكان ما يقرب من الصفر وأقل بكثير من أن بعد احتضان ح 9 مع معيار الجمع بين 0.5% الحزب الديمقراطي الصربي/تحلل المخزن المؤقت تركيبة و FBS (الحزب الديمقراطي الصربي 9 h + FBS). أظهرت فحوصات الكيمياء الحيوية الخاصة بكل منها شبه الكامل الحفاظ على الكولاجين، حوالي 20% الحفاظ على المحتوى جليكوسامينوجليكان مقارنة بالانسجة الأصلية، وصون 30% تقريبا من محتوى الايلاستين، أعلى كثيرا من الحزب الديمقراطي الصربي مرجعية بروتوكول قياسي (تمثل الأشرطة يعني ± ووزارة شؤون المرأة). (باء) مرناً التعبير المحدد الجينات في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent التفريق في الوزاري، بالمقارنة مع أطباق الثقافة غير المصقول وسطح المغلفة ماتريجيل. يتم تطبيع البيانات الوزاري لتلك التي تم الحصول عليها في المواد التي تحكم كل منهما (التحكم = 1، خط متقطع). إلى حد كبير يعبر عن غالبية الجينات القلب أكثر شدة عندما مثقف في الوزاري (تمثل الأشرطة يعني ± ووزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: المظهر والنشاط البيولوجي الوزاري المجهرية الدقيقة. (أ) الوزاري يمثل مسحوق بعد ليوفيليزيشن. (ب) "التمثيل الغذائي" (MTS) وخلية (ج) الموت (رابطة حقوق الإنسان الإفراج) تحليل HL-1 الخلايا المستزرعة مع الوزاري أو الجيلاتين. الوزاري إلى حد كبير يقلل من موت الخلايا ويزيد من الأيض. تمثل الأشرطة يعني ± ووزارة شؤون المرأة، دلالة إحصائية اختبار أحادي الاتجاه ANOVA وبونفيروني. الشكل 3B ج- وقد عدلت من كابلر et al. 18 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تكوين البروتين الوزاري المجهرية الدقيقة. وعقب الكتلي، يصور DB سلسلة تحليل المكونات الرئيسية الوزاري، التي ترتبط أساسا بالفضاء خارج الخلية (الذهاب: 0005615; p مجالات حمراء > 0.05). تشير الخطوط إلى تفاعلات البروتين استناداً إلى البيانات التجريبية البيوكيميائية (الأرجواني)، على تعبير المشارك البيانات (أسود)، على قاعدة بيانات التفاعلات (الأزرق)، وعلى التعبير المشارك (الأخضر). مطلوب DB سلسلة الثقة: نقاط > 0.4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تجهيز الوزاري إلى المائية الحفاظ على الفعالية البيولوجية. مرحلة التباين الخفيفة الميكروسكوب صور تثبت أن الهضم الأنزيمي الوزاري لنتائج ح 48 في حل ECM المتجانس أكثر؛ شريط المقياس = 500 ميكرومتر. ECM (أ) الحل يبقى السائل يصل إلى درجة حرارة الغرفة (ب، اليسار) ويتضمن القدرة على تجميع ذاتي نحو المائية عند المحتضنة في 37 درجة مئوية (ب، حق). يعيش الميت وصمة عار للقلب الليفية البشرية مثقف مع أو بدون الوزاري يكشف كالسين أعلى من تلطيخ كثافة الخلايا الحية؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر (ج). هيدروجيل الوزاري يزيد من نشاط الخلايا HL1 في ظروف الدماغية الأيضية بنفس الطريقة كالجسيمات الدقيقة (ج، اللوحة اليمنى السفلي، تعديل من كابلر et al. تمثل الأشرطة 18) يعني ± ووزارة شؤون المرأة، دلالة إحصائية اختبار أحادي الاتجاه ANOVA وبونفيروني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وصف البروتين
مستقبلات 5-هيدروكسيتريبتاميني 7 OS = الإنسان العاقل GN = HTR7 PE = 1 س = 2
أكتين-مثل البروتين 6B OS = الإنسان العاقل GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
أكتين، والعضلات الملساء الابهري OS = الإنسان العاقل GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
ألبومين المصل OS = الإنسان العاقل GN = ALB PE = 1 SV = 2
نظام التشغيل أنتيثرومبين-الثالث = الإنسان العاقل GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
الابوليبوبروتين ج-ثالثا "نظام التشغيل" = الإنسان العاقل GN = APOC3 PE = 1 س = 1
الابوليبوبروتين ه نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = الذين PE = 1 SV = 1
البروتين التي تحتوي على المجال لفائف ملفوف 47 OS = الإنسان العاقل GN = CCDC47 PE = 1 س = 1
عضو الأسرة 11 المجال يكتين ج-نوع نظام التشغيل A = الإنسان العاقل GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
كلوريد قناة داخل الخلايا بروتين 1 نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
الكولاجين alpha-2(I) سلسلة نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = COL1A2 PE = 1 س = 7
استكمال نظام التشغيل C3 = الإنسان العاقل GN = C3 PE = 1 SV = 2
الكولاجين alpha-2(IV) سلسلة نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = COL4A2 PE = 1 س = 4
البروتين عنصر ملزم المراعية لامبير سيكليك 3-مثل البروتين 4 OS = الإنسان العاقل GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
نظام التشغيل ديرماتوبونتين = الإنسان العاقل GN = DPT PE = 2 س = 2
نظام التشغيل فيبرونيكتين = الإنسان العاقل GN = FN1 PE = 1 SV = 4
الجلوتاثيون البيروكسيديز 3 OS = الإنسان العاقل GN = GPX3 PE = 1 س = 2
الهيموغلوبين ألفا فرعية لنظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
الهيموغلوبين الوحيدات بيتا نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = PE سداسي البروم ثنائي الفينيل = 1 SV = 2
Ig كابا سلسلة ج المنطقة OS = الإنسان العاقل GN = PE إيجكك = 1 س = 1
نظام التشغيل لوميكان = الإنسان العاقل GN = PE لوم = 1 SV = 2
نظام التشغيل ميميكان = الإنسان العاقل GN = OGN PE = 1 SV = 1
نظام التشغيل نيدوجين-1 = الإنسان العاقل GN = NID1 PE = 1 س = 3
أثري بسيودوبوديوم كيناز شاذة 1 نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
الصباغ المستمدة من ظهارة عامل التشغيل = الإنسان العاقل GN = SERPINF1 PE = 1 س = 4
الناقل المتقدرية إنزيم A SLC25A42 نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = SLC25A42 PE = 2 س = 2
اميلويد المصل ف مكون نظام التشغيل = الإنسان العاقل GN = PE ناقلات الجنود المدرعة = 1 SV = 2
فرعية تفييد عامل لبدء النسخ 5 OS = الإنسان العاقل GN = TAF5 PE = 1 س = 3
تيودور البروتين التي تحتوي على المجال 3 OS = الإنسان العاقل GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
زنك إصبع ماترين من نوع البروتين 4 OS = الإنسان العاقل GN = ZMAT4 PE = 2 س = 1
زنك إصبع البروتين 101 OS = الإنسان العاقل GN = ZNF101 PE = 2 س = 1

الجدول 1: تكوين البروتين من مسحوق الوزاري حسبما يقرره الكتلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند إعداد المحتوى احتشاء عضلة القلب البشري، ويهدف إلى تحقيق ما يلي: إزالة المواد الخلوية مكسبه ذات الصلة، والحفاظ على سلامة إدارة المحتوى في المؤسسة وبيواكتيفيتي، العقم، غير سمية للناتج النهائي، برنامج الرصد العالمي-عملية التوافق، و مدى ملاءمة المنتج لتطبيق محدد من حيث التعامل. عن طريق الجمع بين لدينا بروتوكول ديسيلولاريزيشن الخطوة 3 مع مواصلة تجهيزها إلى المجهرية الدقيقة أو المائية تجميع ذاتي، هو الحصول على المواد ECM القلب البشري الذي يمتلك النشاط البيولوجي محددة، من السهل التعامل معها، ولديها الإمكانات عدة تطبيقات في المختبر و في فيفو، مماثلة لما أظهر لمنتجات إدارة المحتوى في المؤسسة من عدة الحيوانات الأنواع11،13،،من2021.

أثناء المعالجة الأولية لانسجة عضلة القلب، من المهم لمقطع شرائح احتشاء عضلة القلب من سمك متطابقة، نظراً لأن مدة الاعتقال ومعاملة المركب قد تم معاير 300 ميكرون الشرائح. شرائح أكثر سمكا سيكون غير كامل ديسيلولاريزيد وسوف تعاني شرائح أرق توزيعاً غير المرغوب فيها من مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة مع فقدان بيواكتيفيتي. وهذا أهمية خاصة فيما يتعلق بالعلاج، والحزب الديمقراطي الصربي حيث السمية يمكن أن يؤثر سلبا على خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة والتحاليل الخلوية16. وعلاوة على ذلك، طويلة الحزب الديمقراطي الصربي العلاج يمكن أن يؤدي إلى إكمال غياب فيبرونيكتين كما رأينا في الدراسة بغدير-فورنيمينت et al. 22، في حين أنه يتم الاحتفاظ ب أسلوب لدينا17. أقسام الوزاري مناسبة للاستخدام في التجارب دون الاستمرار في معالجة (أي، في نماذج الثقافة 3D تحليل تمايز الخلية أو تفاعلات الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة، أو لنهج إعادة تعمير الخلوية "هندسة الأنسجة"). استخدام FBS لإزالة الحمض النووي ذات كفاءة عالية، ولكن يمكن أن يؤدي إلى بعض البروتينات FBS المتبقية في أقسام إدارة المحتوى في المؤسسة. وهذا يمكن أن يؤثر أي فحوصات FBS الحساسة. ينبغي أن يكون الترجمة لبروتوكول الصف سريرية GMP ممكن مع استخدام الأمصال المعتمدة، لكن قد يكون لتكيف اللازمة وفقا للوائح. وهذا يمكن أما تؤكد عدم وجود بقايا FBS في إدارة المحتوى في المؤسسة أو تغيير في البروتوكول سيكون ضروريا لتحل محل FBS مع العلاج الدناز. وأخيراً، دورات تجميد أذاب المتكررة من الأنسجة وأقسام إدارة المحتوى في المؤسسة التي ينبغي تجنبها لمنع تدهور المصفوفة.

عند إنتاج هيدروجيل الوزاري، الهضم بيبسن هو الخطوة الأكثر أهمية في هذه العملية. في تجاربنا الأولية، الهضم بيبسن في الرقم الهيدروجيني 1 عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية أدت إلى فقدان بيواكتيفيتي، التي يمكن الوقاية منها عن طريق تعديل في الحضانة على درجة الحموضة 2 ح 48 في 27 ياجيم أيضا، نضع في اعتبارنا أن المائية تنتج من تعليق يمثل الوزاري المجففة بالتبريد، لا من الشرائح الطازجة ديسيلولاريزيد الوزاري الرطب. بالإضافة إلى تحسين معالجة عامة المائية مقارنة بشرائح الوزاري، قد المائية ميزة أنها يمكن أن تضعف للاستخدام في تركيزات مختلفة، على سبيل المثال عند أعلى تركيز في تركيبة مع مواد أخرى أو 3D الثقافة، أو بتركيز أقل لطلاء أطباق الثقافة الخلية أو كمادة مضافة إلى الثقافة المتوسطة.

تم إنشاء هذا البروتوكول سوب الصف مختبر لإعداد الوزاري البشرية للمساعدة في سد الثغرات في الطب التجديدي متعدية الجنسيات التي وصفت مؤخرا سالدين et al. 10 وفي حين يمكن تطبيق شرائح ديسيلولاريزيد الوزاري كأوراق على سطح ابيكارديال من قلب المريضة، كما وصفت ذلك مؤخرا سرج et al.، مع الوزاري الخنزير في نموذج الفئران من23من احتشاء عضلة القلب، معالجة إلى المائية يسمح لأكثر في فيفو تطبيقات متنوعة، مثل حقن الوزاري في عضلة القلب كما هو مبين من سينجيلين et al. 13 , 24 من أجل المضي قدما نحو الأنشطة المتعدية السريرية، سيكون البروتوكول الحالي لتحويلها إلى إجراءات برنامج الرصد العالمي-الصف. من حيث المبدأ، جميع المواد المستخدمة أيضا جزء من عمليات إنتاج الأجهزة الطبية المعتمدة/ATMP (أي، ديسيلولاريزيد صمامات القلب أو الأوعية الدموية) ولا توجد عقبات رئيسية من المتوقع. ومع ذلك، معلومات عن مدة التخزين المأمون وعدم وجود مسببات الأمراض سيكون التأكيد المطلوب. في نهاية المطاف، هناك حاجة إلى مصدر موثوق لكميات أكبر من أنسجة القلب الطازجة والعقيمة من المانحين دون مرض القلب. هنا، هي قلوب من الجهات المانحة الجهاز المتوفى ليست مناسبة لزرع السيناريو الأكثر احتمالاً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

بروتوكول الدراسة تتفق مع المبادئ الأخلاقية المبينة في "إعلان هلسنكي". المرضى المقدمة المستنيرة لاستخدام الأنسجة لأغراض البحث، وأقر عملية جمع النسيج "المؤسسي استعراض المجلس" ولجنة الأخلاقيات في مستشفى الشارتي-برلين Universitätsmedizin (EA4/028/12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52, (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114, (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119, (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21, (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32, (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22, (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5, (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59, (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16, (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102, (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70, (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12, (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2, (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, (29), 5409-5416 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics