ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

Developmental Biology

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Summary

このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization について説明します。さらに微粒子と胃酸の自己組織化ハイドロゲルの生産における細胞外マトリックスの結果の処理。

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Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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Abstract

無細胞性細胞外マトリックス製剤は細胞マトリックスの相互作用を研究するために役立ち、再生細胞療法の適用を容易にします。ゲルまたは膜として商業細胞外マトリックスのいくつかの製品がありますが、これらは組織固有の生物学的活性を持っていません。灌流 decellularization は通常は人間の心臓組織で可能でないために、浸漬 3 段 decellularization プロセスを開発しました。手術中に調達した人間の心筋スライスは最初イオン洗剤、ドデシル硫酸と孵化によって続いて洗剤無料高浸透圧換散バッファーと扱われ、固有の DNase 活性を利用することで完了です。ウシ胎児血清。この手法による心臓の細胞外マトリックスの細胞シートで残されて線維組織のアーキテクチャと生体高分子の組成を示した心臓細胞と多能性幹に特定の環境手がかりを提供するにはセルです。心臓の細胞外マトリックス シート、さらにさらに化学修飾することがなく微粒子粉末に加工したり、短期のペプシン消化経由で自己組織化心臓細胞外マトリックス ハイドロゲルに保存生体活性。

Introduction

細胞外マトリックス (ECM) だけでなく構造サポートが、生物の細胞にとっても重要ですし、組織機能1を提供します。中心部に線維化、炎症、血管新生、心筋収縮機能、生存率、および居住者の前駆細胞の運命などの病態生理学的応答の調節における ECM が参加しています。その主要なコンポーネント - 線維性糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン - に加えて分泌された成長因子、サイトカイン、および核酸, 蛋白質の2,3を含む膜小胞のホストが含まれます。

最近、無細胞性 ECM 準備がだけ潜在的な治療上のセル ベースのアプリケーションにとっても、細胞マトリックスの相互作用を研究するため非常に貴重ではないこと明確ななっています。治療細胞製品、エンジニア リング組織に適切な環境を提供することの重要性が広く認められています。定義された biopolymeric ゲル4,5,6またはマウス肉腫細胞 (すなわちマトリゲル、Geltrex) から分泌されるタンパク質カクテル細胞懸濁液または活性化合物を結合する試みがなされました。7しますただし、元の生物活性を限られている、後者は GMP グレード プロセスで問題が発生、心臓 ECM (cECM)8,9,10,の組織固有活性の両方に欠ける。11,12,13

心筋の decellularization は以前冠血管14,15を介して心臓全体の灌流によって行われています。これは動物の心で可能ですが、そのまま人間の心はほとんどあります。したがって、手術で得られた組織のサンプルを処理することができます浸漬プロセスが支持されました。私たちの「3 ステップ」プロトコルは、別の 3 を含んでいるインキュベーション手順すなわち溶解、可溶化、および DNA 除去。それは主に保存されタンパク質とグリコサミノグリカンの構成16,17ヒト心筋 ECM を得られます。これらの cECM スライス体外細胞マトリックスの相互作用の研究を可能にするが、悪い潜在的な人間のスケールの治療への応用に適しています。製造工程、凍結乾燥 cECM 微粒子または cECM ハイドロゲル18生成に延長されました。

このプロトコルは、心筋細胞外マトリックス (ECM) とその生物学的活性の主要なコンポーネントを維持、手術標本から得られるひと心筋の decellularization を使用できます。保存された組織固有の生物活性を持つヒトの心臓 ECM が細胞マトリックスの相互作用に関する実験的研究に必要な場合、または細胞を用いた心筋再生のアプローチに適した環境が必要な場合は、このプロトコルをお勧めします。原則として、処理された cECM の使用は、実現可能な将来の治療への応用をする必要がありますにも GMP グレードの条件このプロトコルに適応する可能です。

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Protocol

研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に適合し、シャリテ医科大学施設内審査委員会および倫理委員会で承認されました。提供されるすべての患者は、実験的研究のための中心のティッシュの使用のためのインフォームド・コンセント書かれて。

1. ひと心筋の区分のための準備

  1. 左室心筋を取得 (サイズは、手術の種類によって異なります) 手術室と冷 PBS 滅菌コンテナー輸送から直接。
  2. 無菌条件下で第 10 刃で生殖不能のメスのすべての脂肪組織を削除します。
  3. 約 1 × 1 × 1 cm のメスを使用してキューブに心筋をカットします。
  4. 50 mL の滅菌チューブにキューブを配置します。
    メモ: 一時停止、実行ステップ 1.5、それ以外の場合、2.2 の手順に進みます。蛋白質の分解と組織の品質の低下を防ぐために繰り返し凍結融解は避けてください。
  5. -80 ° C でキューブを含むチューブを格納します。組織は、数ヶ月間保存できます。

2. 心筋キューブのスライスの断面

  1. 冷凍庫から準備されたキューブを含む尿管を取る。
  2. クリオスタットに氷の上を転送します。
  3. -15 ° C にオブジェクトとチャンバーの温度を設定します。
    注: 適切な温度は完璧な区分を保証することが重要です。
  4. チル空 50 mL チューブ、商工会議所またはドライアイスのスタンプ。
  5. レイヤーを追加 (約 0.5 - 1.0 mL) コールド スタンプ、聞かせに cryosection 媒体のそれはそれが白と固体になるまで凍結します。
  6. Cryosection 中の 2 番目の層を追加し、この層に心筋キューブを配置します。
  7. Cryosection 培地を確認し、続行する前に、心筋が完全に冷凍します。
    注: サンプルと cryosection 中もフリーズしていないとき、断面損なわれます。完全に凍結 cryosection 媒体は流体と透明から固体、白い、および非透明に変わります。心筋のキューブでは、1 h 1.4 の手順からの続き場合を完全に凍結するまで、少なくとも 30 分を必要があります。組織の冷凍ピンセットで触れた/処理するときは変形する必要があります。
  8. ホルダーに冷凍心筋とスタンプを挿入してすべてのネジを締めます。
  9. でも断面の表面が得られるまでは、組織の表面をトリミングします。
  10. 300 μ m の厚さの切片を設定します。
  11. 冷凍の心筋のセクション自動断面を。これは均一断面を保証します。約 30-40 のセクションは、1 つのキューブからスライスすることができます。
  12. 50 mL の冷却管に緩くセクショニング後各スライスを配置します。
    注: を押さないでください、スライスまたはパックしっかりと。約 40 のスライスは、1 つの管に合うことができます。
  13. 満たされた管を閉じて、氷の上に配置します。
    注: 2.14 のステップの移動を一時停止、それ以外の場合に 3.2 の手順に進みます。
  14. 心筋スライス-80 ° C で保存します。スライスは、数ヶ月間保存できます。

3. ひと心筋の decellularization スライスします。

  1. -80 ° C のフリーザーと氷上輸送から心筋セクションを含む 50 mL チューブの必要な数を取る。
  2. ステップ 3.1 から 1 つの滅菌ビーカーにすべての 50 の mL の管の凍結切片を転送します。約 40 のスライスは、50 mL のチューブごとビーカーに追加されます。ビーカー 50 mL チューブ; 量の 3 倍をする必要があります。例えば 1 つの 50 mL チューブの decellularization 150 mL ビーカーを使用します。
  3. 心筋スライスを 50 mL チューブあたり 50 mL 溶解ソリューション (10 mM トリス、0.1 %w/v EDTA、pH 7.4 H2O) を追加します。
  4. 室温で 2 時間の連続 100 150 rpm で滅菌ビーカーに心筋スライスを振る。
  5. 粗いこし器を通って組織のスライスと液体をひずみ。鈍ピンセットを持つ組織スライスを新しい滅菌ビーカーに転送します。PBS で心筋スライス (例えば、使用 100 mL SDS ソリューション心筋のセクションの 2 つの 50 mL チューブを脱がされている場合) の最初の 50 mL チューブあたり 0.5 %sds の 50 mL を追加します。
  6. 室温で 100-150 rpm で 6 時間継続的に横に振る。
  7. 粗いこし器を通って組織のスライスと液体をひずみ。新しい滅菌ビーカーに鈍ピンセットを持つ組織スライスを転送し、150 rpm で揺れながら 10 分を 50 mL の PBS で 3 回洗います。次に、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 1% で PBS で一晩洗ってナイスタチン (PBS-P/S ・ N) で 100-150 rpm と揺れながら 4 ° C。
    注: 徹底的に洗浄、残留の SDS を完全に削除することが重要です。SDS の残りのトレースは、ECM が細胞との組み合わせで使用される有毒です。
  8. 洗濯ソリューションを削除し、25 mL を追加 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 1 %fbs (37 ° C) を予熱した心筋のスライスの最初の 50 mL チューブあたり decellularized スライスにナイスタチンです。
  9. 37 ° C で 3 時間インキュベートします。この手順ですべての残りの DNA は、FBS の固有の DNase 活性によるマトリックスから削除されます。
  10. 新しい滅菌ビーカーにスライスを転送し、150 rpm で揺れながら 10 分を 50 mL の PBS で 3 回洗います。
    注: ECM スライスに格納できる PBS P S N 4 ° C で数日間。しかし、すぐに続行することをお勧めします。

4. 粉に Decellularized cECM の処理

  1. 新しい滅菌 6 ウェル プレートに緩く ECM のスライスを配置します。-80 ° C で ECM を凍結し、エアカーテンで 2 日間の凍結乾燥します。
    注: 1 つ以上のスライスは、ウェルあたり配置できます。井戸の表面を完全にカバーするスライスを配置します。スライスを重複しても、その後粉砕の成功には影響しません。
  2. ECM スライスの粉砕に使用特定加工チューブ (参照材料表) 含む 1.4 mm セラミック ビーズです。滅菌鈍ピンセットを使用して凍結乾燥の ECM で緩く管を埋めます。最適な結果を得るには、10-20 mg の間 ECM の総重量をお勧めします。
    注:、ECM は詰めすぎて加工管の場合粉砕プロセスは否定的影響します。
  3. スナップ-凍結チューブ液体窒素。
    警告:液体窒素は超低温、適切な個人用保護具を着用します。
  4. フライス盤に冷凍のチューブを挿入し、ECM を粉砕します。
    1. 30 の期間設定 s、最大速度、デバイスを起動します。
    2. 終えた後、チューブを取り出し、再度に凍結液体窒素で。
    3. 5 回繰り返します。
  5. 1 mL ddH2O あたりチューブと手ふれや完全な可の渦を追加することによって、チューブから微粒子を洗います。50 mL のチューブに 200 μ m メッシュで異種のソリューションをフィルター処理します。
  6. -80 ° C または液体窒素でチューブを固定します。
  7. 管の標準蓋を 0.22 μ m のフィルターに置き換えます。このフィルターのふたは粉がチューブから流れ出るを防ぐ水の蒸発の空気の循環をことができます。
  8. エアカーテンでチューブを挿入、ステップ (ステップ 4.5) から水を除去するもう一度凍乾
    メモ: この手順で凍結乾燥は 3 日前までにかかります。
  9. さらに処理まで-80 ° c の粉を保存または 5.1 の手順に進みます。

5. cECM 微粒子の酵素による均質化

  1. 1 Mg/ml の濃度を 0.01 M 塩酸 (pH 2.0) 豚ペプシンを溶解します。それを完全に溶解するまで室温でシェーカーに配置します。
  2. 最終濃度 10 mg/mL にペプシン溶液中凍結乾燥人間 ECM 粉末 (ステップ 4.8) で溶解します。ピペッティングを徹底的にミックスします。総容積は必要な ECM ソリューションの量に依存します。たとえば、ECM 粉末 1 mL ペプシン溶液の 10 mg を溶解します。
    注: 粒子の溶解は、穏やかなボルテックス (1,000-1,500 RPM) をサポートできます。残りの微粒子の塊すると、消化に悪影響を及ぼす可能性があります。
  3. チューブあたり 1 mL の量 2 mL チューブにソリューションを転送します。
  4. 48 時間は、27 ° C、1,200 rpm 管シェーカーにチューブを置きます。
  5. チューブを取り出してシェーカーと氷や予冷チューブ ホルダーの上に配置。
  6. ミックス 1/9 寒い 10 x PBS (pH 7.4) 冷たい 0.1 M の ECM ソリューションの体積の 1/10 の ECM ソリューションの量の水酸化ナトリウム冷却管と氷の上の場所。この混合物は消化の ECM ソリューションを中和し、ペプシンを不可逆的に不活化します。
  7. ECM ソリューションを追加すると、中和の混合物、ピペッティングまたはボルテックスを徹底的にミックスします。
  8. ECM を 1x PBS (pH 7.4) と目的の濃度に設定します。解決の pH は、ph 試験紙でチェックできます。
    注: 10 mL で計算の例は消化 ECM ソリューションです。
    HCl (pH 2.0) 10 mL に 10 mg 豚ペプシンを追加します。
    100 mg ECM 粉末をペプシン ソリューションに追加します。
    注: 10 mL を中和するための計算例消化 ECM ソリューションと 8 mg/mL の濃度に設定。
    最終開始c x Vol開始=/c最終10/mL x 10 mL/8 mg/mL を = = 12.5 mL
    10xPBS開始=/9 = 1/9 10 mL = 1.11 ミリリットル 10 x PBS から
    NaOH開始=/10 = 1/10 10 mL = 1 mL から
    1xPBS最終- 巻開始- 巻10xPBS - 集NaOHを = = 12.5 mL ・ 10 mL ・.11 mL-1 mL = 0.39 mL

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Representative Results

ひと心筋の decellularization の 3 ステップのプロトコルは、ECM のキーコンポーネントと ECM の高次構造を維持しながら細胞材料のほぼ完全な除去の結果を掲載します。Decellularization 後、組織からの細胞の総除去 (図 1 a) の色の変化によって明白であります。H & E とマッソン Trichrome 汚れと組織学的分析では、そのまま残留細胞 (図 1 b) の完全な欠如を明らかにしました。ECM の個々 のコンポーネントの定量的アッセイ SDS だけで (図 2 a) によって decellularization と比較してより完全な DNA 除去と総コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンのより良い保全を明らかにしました。機能性 cECM の生物学的活性に関するエビデンスは図 2 bに示すように。早く構造心筋細胞蛋白質 (Myh6、Tnnt2) の発現を定量化する RT-PCR がここでは、使用された (Mef2c、Nkx2.5)、後期 (Gata4) の cardiomyogenic 転写因子と血管内皮細胞表面マーカー遺伝子 (・ フォン ・ Willibrand 因子 (vWF)VE-cadherin) への分化誘導を受けているマウス esc キーで。コーティングされていない培養皿表面、マトリゲル ECM コーティングと比較して、心筋細胞のような表現の方に好ましく多能性幹細胞を cECM との接触にドライブは明白です。

酵素または化学の試薬を使用せず、微粒子に凍結乾燥の ECM スライスをさらに処理できます。機械的研削または制服のサイズ (図 3 a) と微粒子の生産に使用できる適切なキットを使用して粉砕します。質量分析法は、cECM で現在すべての認識可能な蛋白質の概要を示します。遺伝子オントロジー解析細胞成分に集中して ECM 蛋白質の大部分はいくつかのヘモグロビンの残基と主に細胞内タンパク質 (図 4) の数の細胞外スペースから派生確かに明らかにしました。このパターンは、cECM の組織固有の生物学的機能を定めることができるが、この仮説は、さらなる研究を必要があります。CECM タンパク質組成の概要は、「テーブル 1.微粒子に ECM の処理と、その生物学的活性が保持されます。模擬「虚血性」条件 (低酸素血症、血糖値、血清剥奪) HL 1 細胞では、細胞の代謝 (図 3 b) や cECM (図 3) で培養したときの細胞死の減少に増加が表示されます。

コラーゲン精製19のために開発されたプロトコルに基づいて、cECM パウダーの限定ペプシンによる消化は、均質化の ECM ソリューションの結果します。位相コントラスト顕微鏡写真 (図 5 a) は、0 h と 48 時間後消化プロセスをデモンストレーションします。この均質化ステップ再生医療10のアプリケーションが容易になります。結果として得られる加工 cECM を図 5Bに示します。それは液体のまま室温以下 (図 5 b、左) が、37 ° C でそれは 3次元培養 (代表的な画像、図 5 b右、ハイドロゲルを許可する細胞懸濁液をオーバーレイに適した安定性と自己組織化ハイドロゲルを形成培で階層化)。ライブ/デッド心臓線維芽細胞の染色も cECM (図 5) の養殖の有益な効果を示しています。CECM 微粒子と cECM ハイドロゲルは、標準的な文化 (図 5、右下のパネル) の細胞と比較して虚血条件下での収縮の HL1 細胞の代謝活動を強化しました。

Figure 1
図 1: ひと心筋心筋の Decellularization。(A)ステレオ顕微鏡による cECM の巨視的分析 3 段 decellularization プロトコル細胞材料の除去を明らかにします。これは透明性の増加によって明白であります。(B)組織の染色心筋スライスと彼 - (左; decellularization 前後スケールバー = 50 μ m) とマッソン Trichrome 染色 (右;スケール バー = 200 μ m) 細胞組織からの成功の削除を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: コンテンツと cECM スライスの効果(A)選択した ECM コンポーネントおよび 0.5 %sds だけで decellularization に 3 段 decellularization プロトコルを比較する DNA の定量的生化学的解析。データは、ネイティブの心筋内コンテンツのパーセンテージとして表されます。3 段階のプロトコルで残留の DNA 量はほぼゼロだったし、SDS/換散バッファーの組み合わせと FBS (SDS 9 h + FBS) 標準の 9 h の孵化が 0.5% を結合後より有意に減少します。それぞれ生化学的アッセイを示した完全に近い保全コラーゲン、グリコサミノグリカン コンテンツの保存で約 20% のネイティブの組織とで有意に高く、エラスチンのコンテンツのほぼ 30% の保全と比較して(バーを表す平均 ± SEM) 標準 SDS 参照プロトコルです。(B) cECM、上の差別化誘導多能性幹細胞における遺伝子の発現を比較し、マトリゲル コーティング表面にコーティングされていない培養皿に。cECM データがそれぞれ制御材料得られるものに正規化された (制御 = 1、破線)。心臓遺伝子の大半は、大幅 cECM (バーを表す平均 ± SEM) 上で培養したときより強く表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 外観と cECM 微粒子の生物活性します。凍結乾燥後(A) cECM 微粒子パウダー。(B)代謝 (MTS)、 (C)細胞死 (LDH リリース) の解析 cECM またはゼラチン細胞 HL 1。cECM は大きく細胞死を削減し、代謝を高めます。バーは、平均 ± SEM は、一方向の分散分析とボンフェローニによってテスト統計的有意性を表しています。図 3B-Cは、Kapplerから変更されています。18この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: cECM 微粒子のタンパク成分と。質量分析法、次文字列 DB 分析は主に細胞外の空間に関連付けられている cECM の主要なコンポーネントを示しています (行く: 0005615; 赤球 p > 0.05)。線は、共発現データ (黒)、(青)、データベースの相互作用と共発現 (緑) (紫)、生化学実験データに基づいて蛋白質の相互作用を示します。文字列 DB 必要な信頼: スコア > 0.4。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ハイドロゲルに cECM の処理は生物学的有効性を保持します。位相コントラストの光学顕微鏡写真を示すより均質化の ECM ソリューションの 48 h の結果の cECM の酵素の消化力スケール バー = 500 μ m の範囲(A)の ECM ソリューションまま液常温 (B左) まで、37 ° C (B, 右) で培養したときのハイドロゲルに向かって自己を組み立てる可能性を秘めています。心臓線維芽細胞培養 cECM とのライブ/デッド染色染色生活細胞の高いカルセインを明らかにします。スケールバー = 50 μ m (C)。CECM ハイドロゲル微粒子 (C、Kapplerから変更、右下のパネルと同じ方法で阻血状態で HL1 細胞の代謝活性を増加させる18) バーは、平均 ± SEM は、一方向の分散分析とボンフェローニによってテスト統計的有意性を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

タンパク質の説明
5-ヒドロキシトリプタミン受容体 7 OS = ホモ ・ サピエンス GN HTR7 PE を = = 1 SV = 2
アクチン様蛋白質 6B OS = ホモ ・ サピエンス GN ACTL6B PE を = = 1 SV = 1
アクチン、大動脈平滑筋 OS = ホモ ・ サピエンス GN ACTA2 PE を = = 1 SV = 1
血清アルブミン OS = ホモ ・ サピエンス GN ALB PE を = = 1 SV = 2
アンチトロンビン III OS = ホモ ・ サピエンス GN SERPINC1 PE を = = 1 SV = 1
アポリポタンパク質 C-III OS = ホモ ・ サピエンス GN APOC3 PE を = = 1 SV = 1
アポリポ蛋白 E OS = ホモ ・ サピエンス GN アポ PE を = = 1 SV = 1
コイルド コイル ドメインを含むタンパク質 47 OS = ホモ ・ サピエンス GN CCDC47 PE を = = 1 SV = 1
C 型レクチン ドメイン家族 11 メンバー A OS = ホモ ・ サピエンス GN CLEC11A PE を = = 1 SV = 1
塩化物チャネルの細胞内タンパク質 1 OS = ホモ ・ サピエンス GN CLIC1 PE を = = 1 SV = 4
コラーゲン alpha-2(I) チェーン OS = ホモ ・ サピエンス GN COL1A2 PE を = = 1 SV = 7
C3 OS を補完するホモ ・ サピエンス GN = C3 PE を = = 1 SV = 2
コラーゲン alpha-2(IV) チェーン OS = ホモ ・ サピエンス GN COL4A2 PE を = = 1 SV = 4
サイクリック AMP 応答要素結合蛋白質 3 のような蛋白質 4 OS = ホモ ・ サピエンス GN CREB3L4 PE を = = 1 SV = 1
デルマトポンチン OS = ホモ ・ サピエンス GN = DPT PE 2 SV を = = 2
フィブロネクチン OS = ホモ ・ サピエンス GN FN1 PE を = = 1 SV = 4
グルタチオンペルオキシダーゼ 3 OS = ホモ ・ サピエンス GN GPX3 PE を = = 1 SV = 2
ヘモグロビンのサブユニットのアルファ OS = ホモ ・ サピエンス GN HBA1 PE を = = 1 SV = 2
ヘモグロビンのサブユニット β OS = ホモ ・ サピエンス GN = HBB PE 1 SV = = 2
Ig カッパ チェーン C 地域 OS = ホモ ・ サピエンス GN IGKC PE を = = 1 SV = 1
Lumican OS = ホモ ・ サピエンス GN = ラム PE 1 SV = = 2
Mimecan OS = ホモ ・ サピエンス GN OGN PE を = = 1 SV = 1
Nidogen 1 OS = ホモ ・ サピエンス GN NID1 PE を = = 1 SV = 3
偽足濃縮非定型キナーゼ 1 OS = ホモ ・ サピエンス GN PEAK1 PE を = = 1 SV = 4
色素上皮由来因子 OS = ホモ ・ サピエンス GN SERPINF1 PE を = = 1 SV = 4
ミトコンドリアのコエンザイム A トランスポーター SLC25A42 OS = ホモ ・ サピエンス GN SLC25A42 PE を = = の 2 SV = 2
血清アミロイド P 成分 OS = ホモ ・ サピエンス GN = APC PE 1 SV = = 2
転写開始因子 (ディスインテグリン) サブユニット 5 OS = ホモ ・ サピエンス GN TAF5 PE を = = 1 SV = 3
Tudor ドメインを含むタンパク質 3 OS = ホモ ・ サピエンス GN TDRD3 PE を = = 1 SV = 1
亜鉛指蛋白質 matrin 型 4 OS = ホモ ・ サピエンス GN = ZMAT4 PE 2 SV を = = 1
亜鉛指蛋白質 101 OS = ホモ ・ サピエンス GN = ZNF101 PE 2 SV を = = 1

表 1: 蛋白質サブユニット組成の cECM 粉末質量分析法によって決定されます。

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Discussion

目標は次を達成するために、ヒトの心筋 ECM を準備するとき: 免疫細胞の関連資料、ECM の整合性と生理、不妊、最終製品、GMP プロセス互換性の非毒性の保全の除去と処理の面で特定のアプリケーションのための製品の適合性。微粒子や自己組織化ハイドロゲルにさらなる処理と私たち 3 段 decellularization プロトコルを組み合わせて、人間の心臓の ECM 材料が得られ、特定の生物学的作用を有している、簡単な操作で可能性を秘めていると複数アプリケーション体外体内の、何がいくつかの動物種11,13,20,21から ECM 製品に示されているよう。

心筋組織の初期処理中に、化合物の濃度と治療期間が 300 μ m のスライスの滴定されているため断面と同一の厚さのスライスを心筋に重要です。厚いスライスは不完全 decellularized になり、薄くスライスが不要な生物活性の損失の内訳 ECM コンポーネントを被るでしょう。これは毒性が低下の ECM プロパティと携帯電話の解析16SDS の処置に関して特に重要です。さらに、長期にわたる SDS の処置は Godier Fournementによる研究に見られるように、フィブロネクチンの不在を完了につながる22, それは私たちの方法17で保存されている間。CECM セクションは、さらなる処理 (すなわち、 3次元培養モデル細胞分化や細胞外マトリクス相互作用の分析や「ティッシュ エンジニア リング」細胞再アプローチ) なしの実験で使用に適しています。DNA 除去のため FBS の使用は非常に効率的ですが、ECM のセクションでいくつかの残留の FBS の蛋白質を招く可能性があります。任意の FBS の敏感な試金に影響を与える可能性があります。適応規制に応じて必要がありますしかし、臨床グレード GMP プロトコルへの変換は認定された血清の使用できるはずです。これは、どちらかの ECM の国債残基の不在を確認可能性があります。 またはプロトコルに変質が DNase 処理、FBS を交換する必要があります。最後に、組織および ECM のセクション繰り返し凍結融解は、行列の劣化を防ぐために避けるべきです。

CECM ゲルを生成、するときペプシン消化はプロセスの最も重要なステップです。初期の実験では、ph 1 37 ° C で 48 時間ペプシン消化は、生物活性、ph 2 27 oc 以上、48 時間培養を変更することによって防ぐことができるの損失をもたらしたまた、ヒドロゲルはたてからではなく、凍結乾燥 cECM 微粒子懸濁液から生産される覚えておいて脱湿式 cECM スライスです。CECM スライスに比べてハイドロゲルの改良の一般的な処理に加えて、ハイドロゲルが異なる濃度、例えば他の材料との組み合わせで高濃度で使用するため、または 3 D の希釈することがでく利点文化、または培養液への添加剤、細胞培養皿のコーティングのための低濃度で。

このプロトコルは、最近 Saldinによって記載された並進再生医療のギャップを埋めるための人間 cECM 準備のための研究室グレード SOP として確立されています。10最近 Sarig23、心筋梗塞ラットモデルにおけるブタの cECM とで定義されている、疾患のある心臓の心外膜面のシートとして脱 cECM スライスを適用可能性があります一方、ハイドロゲルに処理Singelynによって示すようより多様な生体内などのアプリケーション、cECM の心筋への注入は、します。13,24臨床の橋渡し活動を進めるために、現在プロトコルが GMP グレードの手続きに変換します。原則として、使用されるすべての材料、また承認された医療デバイス/ATMP 生産プロセス (すなわち、脱心臓弁や血管) の部分、予想される主要な障害物がないです。ただし、安全な貯蔵の期間および病原体の有無に関する情報は確かに必要となります。最終的には、心疾患のないドナーからの新鮮で無菌の中心のティッシュの量が大きく信頼できる情報源が必要です。ここでは、心移植に適さない死体臓器ドナーから、最も可能性の高いシナリオです。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に準拠しています。患者組織の研究目的のための使用のためのインフォームド コンセントの提供し、組織を収集するプロセスは、制度検討委員会とシャリテ ・ ベルリン Universitätsmedizin (EA4/028/12) の倫理委員会によって承認されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

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References

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