기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

Developmental Biology

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Summary

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

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Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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Abstract

Acellular 기질 준비 세포-매트릭스 상호 작용을 공부 하는 데 유용 하 고 재생 세포 치료 응용 프로그램을 용이 하 게. 여러 상업 기질 제품 hydrogels 또는 막, 사용할 수 있지만 이러한 조직 관련 생물 활성을가지고 있지 않습니다. 불가능 하기 때문에 관류 decellularization 일반적으로 인간의 심장 조직으로, 우리는 3 단계 집중 decellularization 프로세스를 개발 했다. 인간의 심근 조각 수술 중 조달 먼저 세제 무료 hyperosmolar 세포의 용 해 버퍼, 이온 세제, 나트륨 라우릴 황산 염와 부 화 다음으로 취급 되 고 과정의 본질적인 DNase 활동을 이용 하 여 완료 되 면 태아 둔감 한 혈 청입니다. 이 기술은 결과 심장 세포 외 매트릭스의 셀 무료 시트에 주로 섬유 조직 아키텍처 biopolymer 구성 유지는 심장 세포 인구를 pluripotent 줄기 특정 환경 단서를 제공 하기 위해 표시 했다 셀입니다. 심장 세포 외 기질 시트 다음 추가 추가 화학 수정 없이 microparticle 분말으로 처리 하거나 수, 단기 펩 신 소화를 통해와 자가 조립 심장 세포 외 기질 히드로로 보존 bioactivity입니다.

Introduction

세포 외 기질 (ECM) 뿐만 아니라 구조 지원 하지만 생물 학적 세포에 대 한 중요 및 조직 기능1을 제공 합니다. 에, ECM 등 섬유 증, 염증, 신생, cardiomyocyte 수축 기능 및 생존 능력, 주민 조상 세포 운명 pathophysiologic 응답의 규칙에 참여합니다. 그것의 기본 구성 요소-섬유 glycoproteins, 있다, proteoglycans-분 비 성장 인자, cytokines, 및 포함 하는 핵 산 및 단백질2,3막 소포를 포함 합니다.

그것은 최근에 분명 acellular ECM 준비 하지만 공부 뿐만 아니라 잠재적인 치료 셀 기반 응용 프로그램에 대 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 귀중 한 되고있다. 치료 셀 제품 또는 설계 조직에 적절 한 환경을 제공의 중요성은 이제 널리 인정 했다. 정의 된 biopolymeric hydrogels4,,56 또는 단백질 칵테일 murine 육 종 세포 (즉, Matrigel, Geltrex)에 의해 분 비 세포 현 탁 액 또는 활성 화합물을 결합 하려는 시도가 되었습니다. 그러나 7., 전 bioactivity 제한, 후자는 GMP 급 프로세스에 문제가 및 둘 다 부족 심장 ECM (cECM)8,,910, 의 조직-특정 bioactivity 11,,1213.

심근의 decellularization 이전 관상 맥 관 구조14,15통해 전체 심장의 관류에 의해 수행 되었습니다. 그러나이 동물 마음에 가능한, 그대로 인간 심 혼 거의 사용할 수 있습니다. 따라서, 수술 실에서 얻은 조직 샘플 처리에 대 한 허용 하는 집중 과정 선호 했다. 우리의 "3 단계" 프로토콜 포함 되어 있습니다 3 별도 인큐베이션 단계 즉 세포, 가용 화, 및 DNA 제거. 그것은 크게 보존된 단백질과 glycosaminoglycan 구성16,17와 인간 심근 ECM을 생성합니다. 이러한 cECM 슬라이스 체 외에서 세포-매트릭스 상호 작용의 연구에 대 한 허용 하지만 제대로 잠재적인 인간 규모 치료 응용 프로그램에 적합. 제조 프로세스는 동결 건조 된 cECM 미 또는 cECM 하이드로 겔18다음 확장 되었다.

이 프로토콜은 심근 세포 외 기질 (ECM) 및 그들의 생물 학적 활동의 주요 구성 요소를 보존 하는 수술 샘플에서 얻은 인간 심근의 decellularization에 대 한 수 있습니다. 보존된 조직-특정 bioactivity와 인간의 심장 ECM는 세포-매트릭스 상호 작용의 실험 연구에 필요한 또는 심근 재생 세포 기반 접근 방법에 대 한 적합 한 환경이 필요한 경우,이 프로토콜에 것이 좋습니다. 원칙적으로, 그것은 또한이 프로토콜 GMP 급 조건에 적응할 수 있도록 처리 된 cECM의 사용 가능한 미래에 치료 응용 해야.

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Protocol

연구 프로토콜은 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 하 고 Charité 의과대학의 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 제공 하는 모든 환자, 실험 연구에 대 한 심 혼 직물의 사용에 대 한 동의 작성.

1입니다. 단면에 대 한 인간의 심근의 준비

  1. 왼쪽된 심 실 심근을 얻기 (크기는 수술의 종류에 따라 다릅니다) 수술 실 무 균 용기에 차가운 PBS의 교통에서 직접.
  2. 무 균 조건 하에서 10 번 블레이드와 살 균 메스와 모든 지방 조직을 제거 합니다.
  3. 약 1 x 1 x 1 cm의 메스를 사용 하 여 큐브에서 심근을 잘라.
  4. 살 균 50 mL 튜브에 큐브를 놓습니다.
    참고: 일시 중지, 수행 단계 1.5, 그렇지 않으면 계속 단계 2.2. 단백질 저하와 조직 품질 저하를 방지 하기 위해 반복된 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.
  5. -80 ° c.에 큐브를 포함 하는 튜브를 저장 조직 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

2. 조각으로 심근 큐브의 단면

  1. 냉동 실에서 준비 큐브를 포함 하는 tube(s)를 가져가 라.
  2. cryostat 얼음에 전송 합니다.
  3. 개체와 챔버 온도-15 ° c.를 설정
    참고: 적당 한 온도 완벽 한 단면을 보장 하기 위해 중요 한.
  4. 진정 빈 50 mL 튜브와 우표 챔버 또는 드라이 아이스.
  5. 레이어를 추가 (약 0.5-1.0 mL) 차가운 스탬프 및 하자에 cryosection 매체의 그것 백색 이며 단단한 때까지 동결.
  6. Cryosection 매체의 두 번째 레이어를 추가 하 고이 계층에 심근 큐브를 놓습니다.
  7. Cryosection 매체와 심근 계속 하기 전에 완전 하 게 고정 되어 있는지 확인 합니다.
    참고: 샘플 및 cryosection 매체 동결 되지는 구분 될 것입니다 장애인. 완전히 언된 cryosection 매체에서으로 바뀝니다 유연 하 고 투명 한 고체, 백색, 그리고 불투명. 심근 큐브 완전히 동결 단계 1.4에서에서 즉시 계속 하는 경우 h 1까지 적어도 30 분 필요 합니다. 조직 고정 면 핀셋으로 감동/처리 하지 변형 한다.
  8. 홀더에 냉동된 심근으로 스탬프를 삽입 하 고 모든 나사를 조입니다.
  9. 심지어 단면 표면 얻을 때까지 조직의 표면 손질.
  10. 300 µ m 두께 단면 설정 합니다.
  11. 자동 구분 된 섹션 냉동된 심근입니다. 이 유니폼 컷된 섹션을 보장합니다. 약 30-40 섹션 한 큐브의 슬라이스 수 있다.
  12. Precooled 50 mL 튜브에 느슨하게 단면 후 각 슬라이스를 놓습니다.
    참고: 누르지 마십시오 조각 또는 팩 단단히. 약 40 조각 1 개의 관에 들어갈 수 있습니다.
  13. 채워진된 튜브를 닫고 얼음에.
    참고: 단계에 서 일시 중지 단계 3.2 계속 2.14, 그렇지 않으면.
  14. -80 ° c.에 게 심근 조각 슬라이스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

3입니다. 인간의 심근 조각 decellularization

  1. -80 ° C 냉장고와 얼음에 전송 심근 섹션을 포함 하는 50 mL 튜브의 필요한 수를 가져가 라.
  2. 한 메 마른 비 커에 단계 3.1에서에서 모든 50 mL 튜브의 냉동된 섹션을 전송. 약 40 조각은 비 커 50ml 튜브 당에 추가 됩니다. 비 커 세 번 50 mL 튜브;의 볼륨 해야 합니다. 예를 들어, decellularization 한 50 mL 튜브에 대 한 150 mL 비 커를 사용 합니다.
  3. 50 mL 50 mL 튜브 심근 조각 당 세포 솔루션 (10 mM Tris, 0.1 w/v %EDTA, pH 7.4 H2O)를 추가 합니다.
  4. 실 온에서 2 h에 대 한 지속적으로 100-150 rpm에서 메 마른 비 커에 흔들어 심근 조각.
  5. 거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 합니다. PBS에서 심근 조각 (예를 들어, 사용 100 mL SDS 솔루션 두 50 mL 튜브 심근 섹션의 decellularized 되는 때)의 초기 50 mL 튜브 당 0.5 %SDS 50 mL를 추가 합니다.
  6. 실 온에서 100-150 rpm에서 6 h에 대 한 지속적으로 흔들.
  7. 거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척. 다음, 1% 페니실린/스와 1 %PBS 하룻밤 씻어 Nystatin (PBS-P/S-N) 100-150 rpm, 4 ° C 동요 하는 동안에.
    참고: 철저 한 세척은 완전히 제거 하는 어떤 잔여 SDS 중요 합니다. SDS의 남은 흔적 ECM 셀과 함께에서 사용 될 때 독성이 있다.
  8. 세척 솔루션 제거 및 추가 25 mL 1% 페니실린/스와 1 %FBS (37 ° C)를 미리 데워 Nystatin 심근 조각의 초기 50 mL 튜브 당 decellularized 조각에.
  9. 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어 이 단계에서는 모든 나머지 DNA는 FBS의 본질적인 DNase 활동으로 인해 매트릭스에서 제거 됩니다.
  10. 새로운 살 균 비 커에 슬라이스를 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척.
    참고: ECM 조각은 저장할 수 있습니다 PBS-P/S-n에서 4 ° C에서 몇 일 동안. 그러나, 즉시 진행 하는 것이 좋습니다.

4. 처리 한 분말 Decellularized cECM

  1. 새로운 살 균 6 잘 플레이트에 느슨하게 ECM 슬라이스를 놓습니다. -80 ° C에 ECM을 고정 하 고는 lyophilizer에서 2 일 동안 lyophilize.
    참고: 둘 이상의 슬라이스는 잘 당 놓일 수 있다. 우물의 표면 표지에 분할 영역을 정렬 합니다. 겹치는 슬라이스 후속 분쇄 성공에는 영향이 없습니다.
  2. ECM 조각 분쇄에 대 한 사용 하 여 특정 밀링 ( 재료의 표참조) 포함 1.4 m m 세라믹 구슬 튜브합니다. 무딘 멸 균 핀셋을 사용 하 여 동결 건조 된 ECM으로 느슨하게 튜브를 채우십시오. 최적의 결과 대 한 10-20 밀리 그램 사이 ECM의 총 무게는 것이 좋습니다.
    참고: ECM 밀링 튜브에 너무 밀접 하 게 포장 하는 경우 분쇄 과정은 부정적인 영향을.
  3. 스냅-동결 튜브에 액체 질소.
    주의:: 액체 질소는 매우 낮은 온도, 적절 한 개인 보호를 착용.
  4. 밀링 기계에 냉동된 튜브를 삽입 하 고 ECM을 격파.
    1. 30의 기간 설정 s와 최대 속도 장치 시작.
    2. 마친 후, 튜브를 꺼내와 스냅-동결 다시 액체 질소.
    3. 5 회 반복 한다.
  5. 1 mL ddH2O 당 관 및 쉐이크 또는 완전 한 solubilizing 대 한 소용돌이 추가 하 여 튜브에서 미를 씻어. 50 mL 튜브에 200 µ m 메쉬를 통해 이기종 솔루션을 필터링 합니다.
  6. -80 ° C 또는 액체 질소에 튜브를 고정 합니다.
  7. 튜브의 표준 뚜껑을 0.22 μ m 필터 바꿉니다. 이 필터 뚜껑 튜브에서 흐르는 분말을 방지 하지만 물 증발에 대 한 공기 순환을 허용 한다.
  8. lyophilizer에 튜브를 삽입 하 고 다시 단계 (단계 4.5)에서 물을 제거 하 lyophilize
    참고:이 단계에서 동결은 최대 3 일 걸릴 수 있습니다.
  9. 추가 처리까지-80 ° C에서 분말을 저장 하거나 단계 5.1 계속.

5. 효소 기반 Homogenizing cECM 마이크로 입자의

  1. 1 mg/mL의 농도를 0.01 M HCl (pH 2.0)에 돼지 펩 신을 디졸브. 완전히 용 해 될 때까지 실 온에서 회전 통에 놓습니다.
  2. 10 mg/mL의 최종 농도에 펩 신 솔루션에서 동결 건조 된 인간의 ECM 분말 (단계 4.8)을 분해. Pipetting 통해 철저 하 게 혼합. 총 볼륨 필요한 ECM 솔루션의 금액에 따라 달라 집니다. 예를 들어 10mg 1 mL 펩 신 솔루션에서 ECM 분말의 분해.
    참고: 입자를 녹이는 부드러운 vortexing (1000-1500 RPM)를 통해 지원 수 있습니다. 미의 덩어리를 나머지 소화에 부정적인 영향을 줍니다.
  3. 솔루션 2 mL 튜브 튜브 당 1 mL의 볼륨을 전송.
  4. 48 h 27 ° C에서와 1200 rpm에 대 한 튜브 통에 튜브를 놓습니다.
  5. 뿌리에서 튜브를가지고 고 얼음 또는 사전 냉각된 튜브 홀더에 놓습니다.
  6. 믹스 1/9 ECM 솔루션의 볼륨의 콜드 10 x PBS (pH 7.4) 감기 0.1 m M의 ECM 솔루션의 볼륨의 1/10의 NaOH는 precooled와 얼음에 장소. 이 혼합 소화 ECM 솔루션을 무력화 하 고 irreversibly는 펩 신을 비활성화 합니다.
  7. 중립화 혼합물 및 pipetting 또는 vortexing를 통해 철저 하 게 혼합에 ECM 솔루션을 추가 합니다.
  8. 1 x PBS (pH 7.4)와 원하는 농도에 ECM을 설정 합니다. 솔루션의 산도 pH 종이 함께 확인할 수 있습니다.
    참고: 10 mL에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션:
    10 ml HCl (pH 2.0) 10mg 돼지 펩 신을 추가 합니다.
    펩 신 솔루션 100 mg ECM 파우더를 추가 합니다.
    참고: 10 mL를 중화에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션 및 8 mg/ml 농도 설정:
    최종 c시작 x Vol시작 = / c최종 10 mg/mL x 10 mL/8 mg/mL = = 12.5 mL
    10xPBS시작 = / 9 = 1/9 10 mL = 1.11 10 x PBS에서
    NaOH = 집시작 / 10 = 1/10 10 mL = 1 mL에서
    1xPBS최종 -집시작 -집10xPBS -집NaOH = = 12.5 mL-10 mL-.11 1 mL = 0.39 mL

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Representative Results

인간의 심근의 decellularization에 대 한 3 단계 프로토콜 여기 키 ECM 구성 요소와 ECM의 원 구조를 유지 하면서 세포 소재의 가까운 완전 한 제거 결과 제시. Decellularization, 후 조직에서 세포의 총 제거 색깔 (그림 1A)에 있는 변화에 의해 분명 하다. H & E와 Masson Trichrome 얼룩으로 조직학 분석 잔여 그대로 셀 (그림 1B)의 완전 한 부재를 공개 했다. ECM의 개별 구성 요소에 대 한 양적 분석 SDS 혼자 (그림 2A)에 의해 decellularization에 비해 서 더 완전 한 DNA 제거 및 총 콜라겐, 엘라 스 틴, 및 있다의 더 나은 보존을 공개 했다. CECM의 생물 학적 활동의 기능 증거는 그림 2B에 표시 됩니다. 여기, RT-PCR 구조 cardiomyocyte 단백질 (Myh6, Tnnt2)의 식을 일찍 계량 하는 데 사용 되었다 (Mef2c, Nkx2.5)과 후반 (Gata4) cardiomyogenic 녹음 방송 요인, 그리고 내 피 세포 표면 마커 유전자 (폰 Willibrand 인자 (vWF), VE-cadherin) 자발적인 차별화를 겪고 murine ESC에. Uncoated 문화 요리 표면 및 Matrigel ECM 코팅에 비해, 그것은 분명 cECM와 접촉 pluripotent 줄기 세포 cardiomyocyte 같은 표현 형으로 선호 드라이브.

동결 건조 된 ECM 조각 효소 또는 화학 시 약을 사용 하지 않고 미에 추가 처리 수 있습니다. 기계 연 삭 또는 균일 한 크기 (그림 3A)와 미의 생산을 위해 허용 하는 적합 한 키트를 사용 하 여 분쇄. 질량 분석 cECM에 모든 인식할 수 있는 단백질에 대 한 개요를 제공합니다. 세포질 구성 요소에 집중 하는 유전자 온톨로지 분석 ECM 단백질의 대부분은 실제로 몇 헤모글로빈 잔류물 및 주로 세포내 단백질 (그림 4)의 수와 세포 외 공간에서 파생 된 밝혔다. 이 패턴의 cECM, 조직의 특정 생물 학적 기능을 결정할 수 있지만이 가설 추가 연구 필요. CECM 단백질 구성의 요약에 표시 됩니다 표 1. 미에 ECM을 처리의 생물 학적 활동을 유지 합니다. HL-1 셀 시뮬레이션된 "허 혈 성" 조건 (산소, 포도 당 및 혈 청 부족)에 노출 셀 신진 대사 (그림 3B)와 cECM (그림 3C)에 배양 할 때 세포 죽음에 있는 감소에 있는 증가 표시.

CECM 분말, 콜라겐 정화19, 개발 하는 수정 된 프로토콜에 따라 제한 된 펩 신-기반 소화 무 균된 ECM 솔루션에 발생 합니다. 단계 대조 조명 현미경 사진 (그림 5A)와 48 h 후 소화 과정을 보여 줍니다. 이 균질 화 단계 재생 의학10응용 프로그램을 지원합니다. 결과 처리 된 cECM는 그림 5B에서 표시 됩니다. 실내 온도 아래 남아 있다 액체 (그림 5B, 왼쪽) 37 ° C에서 그것 형성 자가 조립 히드로 오버레이 대 한 적당 한 안정성과 세포 정지 수 있도록 3D 문화 (대표 그림, 그림 5B 오른쪽, 히드로와 하지만 문화 매체와 계층). 라이브/죽은 인간의 심장 섬유 아 세포의 얼룩 또한 cECM (그림 5C)에 경작의 유익한 효과 보여줍니다. CECM 미와 cECM 히드로 셀 표준 문화 (그림 5C, 하단 오른쪽 패널)에 비해 허 혈 성 조건에서 수축 HL1 세포의 대사 활동을 강화.

Figure 1
그림 1: 인간의 심장 심근의 Decellularization. (A) cECM 스테레오 현미경 검사 법에 의해의 거시적인 분석 결과 3 단계 decellularization 프로토콜 세포질 물자의 제거. 이것은 투명도 증가 의해 분명 하다입니다. (B) 조직학 얼룩이 지 심근 조각의 그-(왼쪽; decellularization 전후 눈금 막대 = 50 µ m)과 Masson Trichrome 얼룩 (오른쪽; 눈금 막대 = 200 µ m)는 조직에서 세포의 성공적인 제거를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 콘텐츠 및 cECM 조각의 효과. (A) 선택한 ECM 구성 요소와 0.5 %SDS 혼자 decellularization 3 단계 decellularization 프로토콜을 비교 하는 DNA의 양적 생 화 확 적인 분석. 데이터는 네이티브 심근에 콘텐츠의 백분율로 표현 됩니다. 3 단계 프로토콜 잔여 DNA 콘텐츠 거의 제로 고는 SDS/세포의 용 해 버퍼 조합과 FBS (SDS 9 h + FBS) 후 표준 9 h 인큐베이션 결합 0.5% 보다 크게 낮은. 각 생 화 확 적인 분석 실험 시연는 가까운 완전 한 보존 콜라겐, glycosaminoglycan 콘텐츠의 약 20% 보존의 기본 조직, 그리고 엘라 스 틴 콘텐츠, 모두 현저 하 게 더 높은 보다 거의 30% 보존에 비해 표준 SDS 참조 프로토콜 (바 대표 평균 ± SEM). (B) cECM에서 분화 유도 만능 줄기 세포에서 선택 된 유전자의 mRNA 표현 uncoated 문화 요리와 Matrigel 코팅 표면에 비교 했다. cECM 데이터는 각각 제어 자료에서 얻은 그 정규화 (제어 = 1, 점선 라인). 심장 유전자의 대다수는 cECM (바 대표 평균 ± SEM)에 경작 하는 때 더 높게 표현 크게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 모양 및 cECM 미의 생물 학적 활동. (A) cECM microparticle 분말 동결은 후. (B) 대사 (MTS)와 (C) 세포 죽음 (LDH 자료) 분석 cECM 또는 젤라틴 교양된 HL-1 셀의. cECM는 크게 세포 죽음을 감소 시키고 신진 대사를 증가. 바 평균 ±를 SEM, 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 통계 중요성을 나타냅니다. 그림 3B -C Kappler 에서 수정 된 18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: cECM 미의 단백질 구성. 질량 분석, 다음 문자열 DB 분석 묘사 주로 세포 외 공간에 연관 된 cECM의 주요 구성 요소 (이동: 0005615; 빨간 분야 p > 0.05). 줄에 공동 식 데이터 (검정), 공동 식 (녹색) 및 데이터베이스 상호 작용 (파란색)에 (보라색), 생화학 실험 데이터를 기반으로 하는 단백질 상호 작용을 나타냅니다. 문자열 DB 필요한 자신감: 점수 > 0.4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 처리는 히드로에 cECM의 보존 생물 학적 유효성. 단계 대조 조명 현미경 사진을 보여 더 무 균 ECM 솔루션; 48 h 결과 대 한 cECM의 효소는 소화 눈금 막대 = 500 µ m. (A)는 ECM 솔루션 남아 액체 실내 온도 (B, 왼쪽)까지 하 고 37 ° C (B, 오른쪽)에서 알을 품을 때 히드로 향해 각자 소집을 포함. 라이브/죽은 심장 인간의 섬유 아 세포와 cECM 없이 경작의 얼룩 얼룩 살아있는 세포;의 강도 높은 calcein 보여 눈금 막대 50 µ m (C)=. CECM 히드로 (C, Kappler 에서 수정 하단 오른쪽 패널, 마이크로 입자와 같은 방식으로 허 혈 성 조건에서 HL1 세포의 대사 활동 증가 18) 바 평균 ±를 SEM, 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 통계 중요성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단백질 설명
5-hydroxytryptamine 수용 체 7 OS 호모 사피엔스 GN = HTR7 PE = 1 SV = = 2
말라와 같은 단백질 6B OS 호모 사피엔스 GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 =
말라, 대동맥 평활 근 OS 호모 사피엔스 GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 =
혈 청 알 부 민 OS 호모 사피엔스 GN = ALB PE = 1 SV = = 2
Antithrombin III OS 호모 사피엔스 GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 =
Apolipoprotein C-III에 운영 체제로 호모 사피엔스 GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 =
Apolipoprotein E OS 호모 사피엔스 GN = APOE PE = 1 SV = 1 =
코일 코일 도메인에 포함 된 단백질 47 OS 호모 사피엔스 GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 =
C 형 lectin 도메인 11 가족 A OS 호모 사피엔스 GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 =
염화 물 채널 세포내 단백질 1 OS 호모 사피엔스 GN = CLIC1 PE = 1 SV = = 4
콜라겐 alpha-2(I) 체인 운영 체제 = 호모 사피엔스 GN COL1A2 PE = 1 SV = = 7
C3 OS 보완 호모 사피엔스 GN = C3 PE = 1 SV = = 2
콜라겐 alpha-2(IV) 체인 운영 체제 호모 사피엔스 GN = COL4A2 PE = 1 SV = = 4
순환 암페어 응답 요소 바인딩 단백질 3-같은 단백질 4 OS 호모 사피엔스 GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 =
Dermatopontin OS 호모 사피엔스 GN = = DPT PE 2 SV = = 2
Fibronectin OS 호모 사피엔스 GN = FN1 PE = 1 SV = = 4
티 과산화 효소 3 OS 호모 사피엔스 GN = GPX3 PE = 1 SV = = 2
헤모글로빈 소 단위 알파 OS 호모 사피엔스 GN = HBA1 PE = 1 SV = = 2
헤모글로빈 소 단위 베타 OS 호모 사피엔스 GN = HBB PE = 1 SV = = 2
Ig 카파 체인 C 지역 OS 호모 사피엔스 GN = IGKC PE = 1 SV = 1 =
Lumican OS 호모 사피엔스 GN = LUM PE = 1 SV = = 2
Mimecan OS 호모 사피엔스 GN = OGN PE = 1 SV = 1 =
Nidogen-1 OS 호모 사피엔스 GN = NID1 PE = 1 SV = = 3
Pseudopodium 농축 비정형 키 1 OS 호모 사피엔스 GN = PEAK1 PE = 1 SV = = 4
안료 상피 파생 요소 OS 호모 사피엔스 GN = SERPINF1 PE = 1 SV = = 4
미토 콘 드 리아 보 효소 A 운송업 자 SLC25A42 OS 호모 사피엔스 GN = = SLC25A42 PE 2 SV = = 2
혈 청 아 밀 로이드 P 구성 요소 운영 체제 = 호모 사피엔스 GN APCS PE = 1 SV = = 2
녹음 방송 개시 인자 TFIID 소 단위 5 OS 호모 사피엔스 GN = TAF5 PE = 1 SV = = 3
튜더 도메인에 포함 된 단백질 3 OS 호모 사피엔스 GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 =
아연 손가락 matrin 형 단백질 4 OS 호모 사피엔스 GN = = ZMAT4 PE 2 SV = 1 =
아연 손가락 단백질 101 OS 호모 사피엔스 GN = = ZNF101 PE 2 SV = 1 =

표 1: 질량 분석에 의해 결정 된 cECM 분말의 단백질 구성.

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Discussion

다음을 달성 하는 목표는 인간의 심근 ECM를 준비할 때: 관련 된 면역성 세포 소재, ECM 무결성 및 bioactivity, 불 임, GMP 공정 호환성, 최종 제품의 비 독성의 보존의 제거 및 처리 측면에서 특정된 응용 프로그램에 대 한 제품의 적합성. 미 또는 자가 조립 히드로 처리 된 우리의 3 단계 decellularization 프로토콜을 결합 하 여 인간의 심장 ECM 소재 얻은 특정 생물 학적 활동을 보유 하 고, 처리 하 고, 쉽게에 대 한 가능성이 있다 여러 응용 프로그램에서 체 외에서 vivo에서, 무슨 보였다 ECM 제품에 대 한 여러 동물 종11,13,,2021에서 비슷합니다.

심근 직물의 초기 처리 중 화합물 농도 치료 기간 300 µ m 조각에 대 한 적정 되는 때문에 동일한 두께의 섹션 심근 조각에 중요 하다. 두꺼운 조각 decellularized 불완전 하 게 되며 얇은 조각 bioactivity의 손실 ECM 구성 요소의 원치 않는 붕괴를 겪게 될 것 이다. 이것은 어디 독성 수 있습니다 부정적인 영향을 미칠 ECM 속성 및 세포 분석16SDS 처리에 관하여 특히 중요 하다. 또한, 장기간된 SDS 처리 Godier Fournement 외에 의해 연구에서 보듯이 fibronectin의 부재를 완료 하는 데 발생할 수 있습니다. 22, 우리의 방법17에 보존 하는 동안. CECM 단면도 추가 처리 (즉, 3D 문화 모델 분석 세포 분화 하거나 세포-ECM 상호 작용, 또는 "조직 공학" 셀룰러 repopulation 접근에 대 한) 없이 실험에 사용 하기 적합 이다. DNA 제거 FBS 사용 하 여 매우 효율적 이지만 ECM 섹션에 일부 잔여 FBS 단백질 유도. 이 모든 FBS 민감한 분석 실험에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 적응 규정에 따라 필요할 수 있습니다 임상 등급 GMP 프로토콜을 번역 인증된 세라 사용 가능 해야 합니다. 이 중 하나는 ECM에서 FBS 잔류물의 부재를 확인 수 또는 프로토콜 변경 DNase 치료는 FBS를 대체할 필요가 있을 것입니다. 마지막으로, 조직 및 ECM 섹션의 반복된 freeze-thaw 주기는 매트릭스의 저하를 방지 하기 위해 피할 수 있습니다.

CECM 히드로 생산 때 펩 신 소화 과정에서 가장 중요 한 단계입니다. 우리의 초기 실험에서 pH 1 37 ° C에서 48 h에 펩 신 소화 이끌어 냈다 bioactivity, pH 2 27 oc.에서 48 h에 부 화를 수정 하 여 막힐 수의 손실 또한, 곰 염두에 두고는 히드로 갓 decellularized 젖은 cECM 조각에서 동결 건조 된 cECM microparticle 정지에서 생산 됩니다. CECM 조각에 비해 하이드로 겔의 향상 된 일반적인 처리 이외에 히드로 장점이 다른 농도에서 예를 들어 다른 재료와 함께에서 높은 농도에 사용 하기 위해 또는 3D에 대 한 그것은 희석 될 수 있습니다. 문화, 또는 세포 문화 요리 또는 문화 매체에 첨가물으로 코팅에 대 한 더 낮은 농도에서.

이 프로토콜 Saldin 그 외 여러분 에 의해 최근에 설명 했다 변환 재생 의료에서 격차를 채우기 위해 인간 cECM 준비를 위해 실험실 급 SOP로 설립 되었습니다. 10 는 하이드로 겔으로 처리 하는 동안 decellularized cECM 조각 시트 Sarig 외.,23, 심근 경색 쥐 모델에서 돼지 cECM와에 의해 설명된대로 최근 병 마음의 epicardial 표면에 적용 될 수 있습니다. 더 다양 한 비보에 응용 프로그램을 가능, 심근에 cECM의 주입 등 Singelyn 그 외 여러분 에 의해 표시 된 대로 13 , 24 임상 변환 활동으로 진행 하기 위해서는 현재 프로토콜이 해야한다 GMP 급 절차로 변환할. 원칙적으로, 이용 된 모든 물자는 또한 승인 된 의료 장치/ATMP 생산 프로세스 (즉, decellularized 심장 밸브 또는 혈관)의 일부 하 고 아무 주요 장애물은 예상 될 것 이다. 그러나, 안전한 저장 기간 및 병원 체의 부재에 대 한 정보 확실히 하셔야 합니다. 궁극적으로, 더 큰 양의 심장 질환 없이 기증자 로부터 신선 하 고 메 마른 심장 조직의 신뢰할 수 있는 원본 필요 합니다. 여기, 마음 고 인된 장기 기증자 이식에 적합 하지 않은에서 가능성이 가장 높은 시나리오입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

연구 프로토콜 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 합니다. 환자는 연구 목적, 조직의 사용에 대 한 동의 제공 하 고 조직의 컬렉션 과정 기관 검토 위원회의 Charité-Universitätsmedizin 베를린 (EA4/028/12)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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