Bearbetning av mänskliga hjärtvävnad mot extracellulära Matrix självmonterande Hydrogel för In Vitro och In Vivo applikationer

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det här protokollet beskriver den kompletta decellularization av mänskliga hjärtmuskeln samtidigt bevara dess extracellulär matrix komponenter. Vidare bearbetning av extracellulärmatrix resulterar i produktion av mikropartiklar och en cytoprotektiva själv montering hydrogel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Acellulärt extracellulärmatrix preparat är användbara för att studera cell-matrix interaktioner och underlätta regenerativ cell terapi program. Flera kommersiella extracellulär matrix produkter finns som hydrogels eller membran, men dessa äger inte vävnadsspecifika biologisk aktivitet. Eftersom perfusion decellularization inte är oftast möjligt med mänskliga hjärtat vävnad, utvecklade vi en 3-stegs nedsänkning decellularization process. Mänskliga hjärtinfarkt skivor upphandlas under operation behandlas först med tvättmedel-fri hyperosmolär lyseringsbuffert, följt av inkubation med den joniska tvättmedel, sodium dodecyl sulfaten, och processen är klar genom att utnyttja den inneboende DNAS aktiviteten av fetalt bovint serum. Denna teknik resulterar i cellfria ark hjärt extracellulärmatrix med till stor del bevarade fibrös vävnad arkitektur och biopolymer sammansättning, som visades att tillhandahålla särskilda miljömässiga ledtrådar till hjärt cellpopulationer och pluripotenta stamceller celler. Hjärt extracellulärmatrix ark kan sedan ytterligare bearbetas till ett microparticle pulver utan ytterligare kemisk modifiering, eller, via kortsiktiga pepsin matsmältningen, in i en egen montering hjärt extracellulärmatrix hydrogel med bevarade bioaktivitet.

Introduction

Den extracellulära matrixen (ECM) ger inte bara strukturella stöd men är också viktigt för biologiska celler och vävnad fungerar1. I hjärtat deltar ECM i regleringen av patofysiologiska svaren som fibros, inflammation, angiogenes, hjärtmuskelcellen kontraktila funktion och lönsamhet och bosatt progenitor cell öde. Förutom dess primära komponenter - fibrösa glykoproteiner, glykosaminoglykaner och proteoglykaner - innehåller den en mängd utsöndras tillväxtfaktorer och cytokiner membranös blåsor som innehåller nukleinsyror och proteiner2,3.

Nyligen har det blivit klart att acellulära ECM preparat inte bara ovärderlig för att studera cell-matrix interaktioner, men också för potentiella terapeutiska cell-baserat program. Vikten av att tillhandahålla en adekvat miljö till terapeutisk cell produkter eller manipulerade vävnader är nu allmänt erkänt. Försök har gjorts att kombinera cellsuspensioner eller aktiva föreningar med definierade biopolymeric hydrogels4,5,6 eller med protein drinkar utsöndras av murina sarkom celler (dvs. Matrigel, Geltrex) 7. dock den tidigare har begränsat bioaktivitet, den senare är problematiska i GMP-grade processer och både saknar den vävnadsspecifika bioaktiviteten av hjärt ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization hjärtmuskeln har tidigare utförts av perfusionen i hela hjärtat via hjärt kärlsystemet14,15. Även detta är möjligt i djurens hjärtan, finns sällan intakt människors hjärtan. Därför gynnades en nedsänkning process som möjliggör hantering av vävnadsprover som erhållits i operationssalen. Vår ”3-steg”-protokollet innehåller 3 separata inkubation steg nämligen lysis, lösbarhet och DNA borttagning. Det ger mänskliga hjärtinfarkt ECM med till stor del bevarade protein och glykosaminoglykan sammansättning16,17. Dessa cECM skivor tillåta för in vitro- studier av cell-matrix interaktioner men lämpar sig dåligt för potentiell mänsklig skala terapeutiska tillämpningar. Tillverkningsprocessen utökades sedan till att producera antingen frystorkade cECM mikropartiklar eller en cECM hydrogel18.

Detta protokoll möjliggör decellularization av mänskliga hjärtmuskeln erhållits från kirurgiska prover, bevara de viktigaste komponenterna i hjärtinfarkt extracellulär matrix (ECM) och deras biologiska aktiviteten. Detta protokoll rekommenderas när mänskliga hjärt ECM med bevarade vävnadsspecifika bioaktivitet krävs för experimentella studier av cell-matrix interaktioner, eller när en lämplig miljö behövs för cellbaserade hjärtinfarkt förnyelse metoder. I princip är det också möjligt att anpassa detta protokoll till GMP-grade villkor, så att användning av bearbetade cECM bör vara möjligt i framtiden terapeutiska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studieprotokollet uppfyller de etiska principerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av den institutionella styrelsen och etik granskningskommittén Charité Medical University. Alla patienter som skrivit, informerat samtycke för användning av hjärtat vävnad för experimentella studier.

1. beredning av mänskliga hjärtmuskeln för snittning

  1. Erhålla vänster ventrikulära hjärtmuskeln (storlek varierar beroende på typ av operation) direkt från operationssalen och transport i kalla PBS i en steril behållare.
  2. Ta bort alla fettvävnad med en steril skalpell med ett nr 10 blad under sterila förhållanden.
  3. Skär myokardiet i kuber ca 1 x 1 x 1 cm med en skalpell.
  4. Lägg kuberna i sterila 50 mL rör.
    Obs: Om du vill pausa, utför steg 1,5, annars fortsätter du med steg 2.2. Undvik upprepad frysning-tining cykler för att förhindra proteinnedbrytning och en minskning av vävnad kvalitet.
  5. Förvara rören som innehåller kuberna vid-80 ° C. Vävnaden kan lagras i flera månader.

2. snittning av myokardiet kuber i skivor

  1. Ta den rör som innehåller beredda kuber ur frysen.
  2. Transport på is till kryostaten.
  3. Ställ in objekt och kammaren temperaturen till-15 ° C.
    Obs: Rätt temperatur är avgörande för att garantera perfekt snittning.
  4. Chill tom 50 mL rör och stämplar i kammaren eller på torris.
  5. Lägg ett lager (ca 0,5 - 1,0 mL) av cryosection medium på kall stämpel och låt det frysa tills den är vit och fast.
  6. Lägga ett andra lager av cryosection medium och placera en myokardiet kub på detta lager.
  7. Kontrollera att det cryosection mediet och hjärtmuskeln är helt frysta innan du fortsätter.
    Obs: När provet och cryosection mediet inte är frysta i snittning kommer att försämras. Helt fryst cryosection medium vänder från vätska och transparent fasta, vita och ogenomskinliga. Hjärtinfarkt kuberna behöver minst 30 min upp till 1 h att fullständigt frysa om fortsätter omedelbart från steg 1.4. När vävnaden är frusen bör det inte deformeras när de rörde/hanteras med pincett.
  8. Sätt stämpel med frysta myokardiet i hållaren och dra åt alla skruvar.
  9. Putsa ytan av vävnaden tills en även snittningen yta erhålls.
  10. Ange snittning tjocklek 300 µm.
  11. Avsnitt frysta hjärtmuskeln med automatisk snittning. Detta garanterar enhetlig skära sektioner. Cirka 30-40 sektioner kan vara skivad från en kub.
  12. Placera varje segment efter snittning löst i en förhandskyld 50 mL tub.
    Obs: Tryck inte på skivor eller pack tätt. Cirka 40 skivor ryms i en tub.
  13. Stäng fyllda rören och placera på is.
    Obs: Om du vill pausa gå på med steg 2.14, annars fortsätter du med steg 3,2.
  14. Lagra myokardiet skivor vid-80 ° C. Skivor kan lagras i flera månader.

3. decellularization av mänskliga hjärtmuskeln skivor

  1. Ta det nödvändiga antalet 50 mL rör som innehåller myokardiet avsnitt ur-80 ° C frys och transport på is.
  2. Över de frusna delarna av alla 50 mL rör från steg 3.1 till en steril bägare. Cirka 40 skivor läggs till bägaren per 50 mL tub. Bägaren bör vara tre gånger volymen av 50 mL tuberna; till exempel, för decellularization av en 50 mL tub Använd en 150 mL-bägare.
  3. Tillsätt 50 mL lysis lösning (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7,4 i H2O) per 50 mL tub med hjärtmuskeln skivor.
  4. Skaka myokardiet skivor i en steril bägare på 100-150 rpm kontinuerligt för 2 h i rumstemperatur.
  5. Sila vätskan med vävnad skivor genom en grov SIL. Överföra vävnad skivor med en trubbig pincett till en ny steril bägare. Tillsätt 50 mL 0,5% SDS i PBS per inledande 50 mL tub av myokardiet skivor (t.ex. 100 mL SDS lösning när två 50 mL rör av hjärtinfarkt sektioner är att cell-lösa).
  6. Skaka hela tiden i 6 h vid 100-150 rpm vid rumstemperatur.
  7. Sila vätskan med vävnad skivor genom en grov SIL. Överföra vävnad skivor med en trubbig pincett till en ny steril bägare och tvätta 3 gånger med 50 mL PBS för 10 min varje under omskakning vid 150 rpm. Nästa, tvätta över natten i PBS med 1% Penicillin/Streptomycin och 1% Nystatin (PBS-P/S-N) på 100-150 rpm och 4 ° C under omskakning.
    Obs: Grundlig tvättning är avgörande för att helt ta bort eventuella kvarvarande SDS. Spår av SDS är giftiga när ECM används i kombination med celler.
  8. Avlägsna tvättlösningen och tillsätt 25 mL förvärmd FBS (37 ° C) med 1% Penicillin/Streptomycin och 1% Nystatin till cell-lösa skivor per inledande 50 mL tub av myokardiet skivor.
  9. Inkubera under 3 h vid 37 ° C. I det här steget avlägsnas eventuella återstående DNA från matris på den inneboende DNAS aktiviteten av FBS.
  10. Överföra skivor till en ny steril bägare och tvätta 3 gånger med 50 mL PBS för 10 min varje under omskakning vid 150 rpm.
    Obs: ECM skivor kan lagras i PBS-P/S-N vid 4 ° C i flera dagar. Det rekommenderas dock att omedelbart gå vidare.

4. bearbeta den Decellularized cECM till ett pulver

  1. Placera ECM skivor löst i en ny steril 6-bra platta. Frysa ECM vid-80 ° C och lyophilize för 2 dagar i en lyophilizer.
    Obs: mer än ett segment kan placeras per brunn. Ordna skivor för att helt täcka ytan av brunnen. Överlappande skivor påverkar inte efterföljande pulvrisering framgång.
  2. För pulvrisering av ECM slice rör användning specifika fräsning (se Tabell för material) som innehåller 1,4 mm keramiska pärlor. Fyll rören löst med frystorkade ECM använder sterila trubbig pincett. För optimalt resultat rekommenderas en total vikt på ECM mellan 10-20 mg.
    Obs: Om ECM är för hårt packad i fräsning rören pulvrisering processen kommer att påverkas negativt.
  3. Snapin-frysa rören i flytande kväve.
    Varning: flytande kväve är extremt låg temperatur, bära lämplig personlig skyddsutrustning.
  4. Infoga de frysta rören i fräsmaskin och pulverisera ECM.
    1. Ange en varaktighet på 30 s och max hastighet och start av enheten.
    2. Efter avslutad, ta ut rören och snapin-frysa igen i flytande kväve.
    3. Upprepa fem gånger.
  5. Tvätta mikropartiklar från rören genom att tillsätta 1 mL ddH2O per tub och skaka eller virvel för komplett solubilizing. Filtrera den heterogena lösningen genom ett 200 µm nät till en 50 mL tub.
  6. Frysa röret i-80 ° C eller flytande kväve.
  7. Ersätta standard locket på röret med 0,22 µm filter. Detta filterlocket förhindrar pulvret rinner ut ur röret men tillåter luftcirkulation för vattenavdunstning.
  8. Sätt in rören i lyophilizer och lyophilize igen för att ta bort vattnet från steg (steg 4,5)
    Obs: Frystorka den i detta steg kan ta upp till 3 dagar.
  9. Förvara pulvret vid-80 ° C tills vidare bearbetning eller fortsätter du med steg 5.1.

5. enzymet baserat Homogenizing av cECM mikro-partiklar

  1. Lös upp svin pepsin i 0,01 M HCl (pH 2,0) till en koncentration av 1 mg/mL. Placera på en roterande skakapparat i rumstemperatur tills det är helt upplöst.
  2. Lös upp det frystorkade pulvret för mänskliga ECM (steg 4,8) i pepsinlösning till en slutlig koncentration på 10 mg/mL. Blanda noggrant genom pipettering. Den totala volymen beror på mängden av ECM-lösning behövs. Till exempel lös 10 mg ECM pulver i 1 mL pepsinlösning.
    Obs: Upplösa partiklar kan stödjas genom skonsam vortexa (1.000-1.500 RPM). Återstående klumpar av mikropartiklar kommer att negativt påverka matsmältningen.
  3. Överför lösningen till 2 mL rör med en volym om 1 mL per rör.
  4. Placera rören i en tube shaker för 48 h vid 27 ° C och 1200 rpm.
  5. Ta rören ur shakern och placera på isen eller nedkylda tube innehavare.
  6. Blandning 1/9 av volymen av ECM-lösning av kallt 10 x PBS (pH 7,4) med 1/10 av volymen av ECM-lösning av kalla 0,1 M NaOH i en förhandskyld tube och plats på is. Denna blandning kommer att neutralisera den smält ECM-lösningen och oåterkalleligt inaktivera pepsin.
  7. Lägga till ECM lösningen neutralisering blandningen och blanda grundligt genom pipettering eller vortexa.
  8. Ställ in ECM på önskad koncentration med 1 x PBS (pH 7,4). PH i lösningen kan kontrolleras med pH-papper.
    Obs: Räkneexempel för 10 mL rötas ECM-lösning:
    Lägga till 10 mg svin pepsin 10 mL HCl (pH 2,0).
    Lägga till 100 mg ECM pulver pepsinlösning.
    Obs: Räkneexempel för att neutralisera 10 mL rötas ECM-lösning och ange koncentrationen till 8 mg/mL:
    Volslutliga = cStarta x VolStarta / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol10xPBS = VolStarta / 9 = 1/9 från 10 mL = 1,11 mL 10 x PBS
    VolNaOH = VolStarta / 10 = 1/10 från 10 mL = 1 mL
    Vol1xPBS = VolFinal - VolStarta - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3-steg protokollet för decellularization av mänskliga hjärtmuskeln presenteras här resultaten i nästan fullständig borttagning av cellulära material, samtidigt som viktiga ECM komponenter och ECM fibrillar struktur. Efter decellularization är brutto borttagning av celler från vävnaden uppenbart av förändringen i färg (figur 1A). Histologisk analys med H & E och Masson Trichrome fläckar avslöjade den fullständiga frånvaron av kvarvarande intakta celler (figur 1B). Kvantitativa analyser för enskilda ECM komponenter avslöjade en mer komplett DNA borttagning och bättre bevarande av totala kollagen, elastin och glykosaminoglykaner jämfört med decellularization av SDS ensam (figur 2A). Funktionella bevis för den biologiska aktiviteten av cECM visas i figur 2B. Här, RT-PCR användes för att kvantifiera uttrycket av strukturella hjärtmuskelcellen proteiner (Myh6, Tnnt2), tidigt (Mef2c, Nkx2.5) och sena (Gata4) cardiomyogenic transkriptionsfaktorer och endotelceller ytan markörgener (von Willibrand faktor (vWF), VE-cadherin) i murina ESC som genomgår spontan differentiering. Jämfört med både obestruket kultur maträtt yta och Matrigel-ECM beläggning, är det uppenbart att kontakt med cECM driver pluripotenta stamceller helst mot en hjärtmuskelcellen-liknande fenotyp.

Frystorkade ECM skivor kan bearbetas ytterligare till mikropartiklar utan att använda enzymatiska eller kemiska reagenser. Mekanisk slipning eller pulverisering med lämplig kits tillåtet för produktion av mikropartiklar med en enhetlig storlek (figur 3A). Masspektrometri ger en översikt av alla kända proteiner närvarande i cECM. Gen ontologi analysen koncentrerar sig på cellulära komponenter visade att majoriteten av ECM proteiner faktiskt härrör från extracellulära, med några hemoglobin rester och ett antal huvudsakligen intracellulära proteiner (figur 4). Detta mönster kan avgöra vävnadsspecifika biologiska funktionen av cECM, men denna hypotes måste ytterligare forskning. Visas en sammanfattning av cECM protein sammansättningen i tabell 1. Bearbetning av ECM till mikropartiklar bevarar dess biologiska aktivitet. HL-1 celler utsätts för simulerad ”ischemisk” villkor (hypoxi, glukos och serum frihetsberövande) visas en ökning i cellmetabolism (figur 3B) och en minskning av celldöd när odlade på cECM (figur 3 c).

Begränsade pepsin-baserade matsmältningen av cECM pulvret, baserat på ett modifierat protokoll som utvecklats för kollagen rening19, resulterar i en homogeniserad ECM-lösning. Fas kontrast ljusmikroskopi bilder (figur 5A) visar rötningsprocessen efter 0 och 48 h. Detta homogeniserande steg underlättar tillämpningar inom regenerativ medicin10. Den resulterande bearbetade cECM visas i figur 5B. Under rumstemperatur det förblir flytande (figur 5B, vänster) men vid 37 ° C det bildar en egen montering hydrogel med stabilitet som är lämplig för ett överlägg med cellsuspensioner möjliggör 3D kultur (representativ bild, figur 5B höger, hydrogel skiktad med odlingsmedium). Live/dead färgning av mänskliga hjärt fibroblaster visar också de positiva effekterna av odling på cECM (bild 5 c). Både cECM mikropartiklar och cECM hydrogel förbättrats den metaboliska aktiviteten av kontraktila HL1 celler i ischemisk villkor jämfört med celler i standard kultur (figur 5 c, nedre högra panelen).

Figure 1
Figur 1: Decellularization av mänskliga hjärt hjärtmuskeln. (A) makroskopisk analys av cECM av stereo mikroskopi avslöjar avlägsnande av cellulära material med protokollet 3-steg decellularization. Detta framgår av ökningen av öppenhet. (B) histologi färgning av hjärtinfarkt skivor före och efter decellularization med HE-(vänster; Skalstapeln = 50 µm) och Masson Trichrome färgning (rätt; Skalstapeln = 200 µm) visar framgångsrika borttagning av celler från vävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: innehåll och effekt av cECM skivor. (A) kvantitativa biokemisk analys av valda ECM komponenter och DNA, jämföra 3-steg decellularization protokollet till 0,5% SDS-ensam decellularization. Data är uttryckt i procent av innehållet i native myokardiet. Med 3-stegs-protokollet resthalten DNA var nästan noll och betydligt lägre än att efter en 9 h inkubation med en standard kombinerade 0,5% SDS/Lys buffert kombination och FBS (SDS 9 h + FBS). Respektive biokemiska analyser visade en nästan komplett bevarande av kollagen, cirka 20% bevarandet av glykosaminoglykan innehåll jämfört med infödda vävnad och en nästan 30% bevarandet av elastin innehåll, alla betydligt högre än med SDS referens standardprotokollet (staplarna representerar medelvärde ± SEM). (B) mRNA uttryck av valda gener i inducerade pluripotenta stamceller att skilja på cECM, jämfört med obelagda kultur rätter och till Matrigel-belagd yta. cECM data är normaliserade som erhålls på de respektive kontrollmaterial (kontroll = 1, streckad linje). Majoriteten av hjärt gener uttrycks betydligt mer högt när odlade på cECM (staplarna representerar medelvärde ± SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: utseende och biologisk aktivitet av cECM mikropartiklar. (A) cECM microparticle pulver efter frystorka den. (B) Metabolism (MTS) och (C) Cell death (LDH release) analys av HL-1 celler odlade med cECM eller gelatin. cECM avsevärt minskar celldöd och ökar ämnesomsättningen. Staplarna representerar medelvärde ± SEM, statistisk signifikans testats av envägs ANOVA och Bonferroni. Figur 3B -C har ändrats från Kappler o.a. 18 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Protein sammansättningen av cECM mikropartiklar. Efter masspektrometri, sträng DB analys skildrar de viktigaste komponenterna i cECM, som främst förknippas med extracellulära (gå: 0005615; röd sfärer p > 0,05). Linjerna visar proteininteraktioner baserad på experimentell-biokemiska data (lila), på samtidig uttrycket data (svart), databas interaktioner (blå) och samtidig uttryck (grön). Sträng DB krävs förtroende: Poäng > 0,4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: behandling av cECM till en hydrogel bevara biologisk effektivitet. Fas kontrast ljusmikroskopi bilder visar att enzymatisk nedbrytning av cECM för 48 h resulterar i en mer homogeniserad ECM-lösning. Skalstapeln = 500 µm. (A) The ECM lösningen förblir vätska upp till rumstemperatur (B, vänster) och innehåller potential att själv montera mot en hydrogel när inkuberas vid 37 ° C (B, höger). Live/dead fläcken av hjärt mänskliga fibroblaster odlade med och utan cECM avslöjar en högre calcein färgning intensiteten i levande celler; Skalstapeln = 50 µm (C). Den cECM hydrogel ökar den metaboliska aktiviteten av HL1 celler i ischemisk villkor på samma sätt som mikropartiklar (C, nedre högra panelen, modifierad från Kappler o.a. 18) staplarna representerar medelvärde ± SEM, statistisk signifikans testats av envägs ANOVA och Bonferroni. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protein Beskrivning
5-hydroxytryptamin receptor 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2
Aktin-liknande protein 6B OS = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
Aktin, aorta muskulatur OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
Serumalbumin OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2
Antitrombin-III OS = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein CIII OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1
Dubbeltvinnade domän-innehållande protein 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1
C-typen lektin domänmedlem familj 11 A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
Klorid intracellulära kanal protein 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
Kollagen alpha-2(I) kedja OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7
Komplement C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2
Kollagen alpha-2(IV) kedja OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4
Cykliskt AMP-responsive element-bindande protein 3-liknande protein 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2
Fibronektin OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4
Glutationperoxidas 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2
Hemoglobin-subenheten alpha OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
Hemoglobin-subenheten beta OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2
IG kappa kedjan C region OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1
Lumican OS = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2
Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1
Nidogen-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3
Pseudopodium-berikad atypiska kinase 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
Pigment epitel-derived faktor OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4
Mitokondriell coenzym A transportör SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2
Serum amyloid P-komponent OS = Homo sapiens GN = Trupptransportfordon PE = 1 SV = 2
Transkription inledande faktor TFIID subenhet 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3
Tudor domän-innehållande protein 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
Zink finger matrin-typ protein 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1
Zink finger protein 101 OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1

Tabell 1: Protein sammansättningen av cECM pulver som bestäms av masspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

När du förbereder mänskliga hjärtinfarkt ECM, målet är att uppnå följande: avlägsnande av relevanta immunogent cellulära material, bevarande av ECM integritet och bioaktivitet, sterilitet, icke-toxicitet av slutprodukten, GMP-processen kompatibilitet, och lämplighet för ett visst program när det gäller hantering. Genom att kombinera vår 3-stegs decellularization protokoll med ytterligare bearbetning till mikropartiklar eller egen montering hydrogel, humant hjärt ECM material erhålls som äger viss biologisk aktivitet, är lätt att hantera, och har potential för flera ansökningar in vitro- och in-vivo, liknar vad har visats för ECM-produkter från flera djur arter11,13,20,21.

Under den inledande behandlingen av hjärtinfarkt vävnad är det viktigt att avsnitt hjärtinfarkt skivor av identiska tjocklek, eftersom sammansatta varaktighet för koncentration och behandling har varit titreras för 300 µm skivor. Tjockare skivor blir ofullständigt cell-lösa och tunnare skivor kommer att drabbas av oönskade uppdelning av ECM komponenter med förlust av bioaktivitet. Detta är särskilt viktigt när det gäller SDS behandling, där toxicitet kan negativt påverka ECM boenden och cellulära analyser16. Dessutom kan SDS långtidsbehandling leda till fullständig avsaknad av Fibronektin som ses i studien av Godier-Fournement et al. 22, medan den är bevarad med vår metod17. Avsnitten cECM är lämpliga för användning i experiment utan ytterligare bearbetning (dvs. i 3D kultur modeller analyserar celldifferentiering eller cell-ECM interaktioner, eller för ”tissue engineering” cellulära återinsättning metoder). Användning av FBS för DNA borttagning är mycket effektiv, men kan potentiellt leda till vissa kvarstående FBS proteiner i avsnitten ECM. Detta skulle kunna påverka eventuella FBS känsliga analyser. Översättningen till en klinisk grade GMP-protokollet bör vara möjligt med användning av certifierade sera, men en anpassning kan vara nödvändigt beroende på föreskrifter. Detta kan antingen bekräftar avsaknaden av FBS rester i ECM eller en ändring av protokollet kommer att vara nödvändigt att ersätta FBS med DNAS behandling. Slutligen, upprepad frysning-tining cykler av vävnad och ECM sektioner är undvikas för att förhindra nedbrytning av matrisen.

Vid framställning av de cECM hydrogel, är pepsin matsmältningen det mest kritiska steget i processen. I vårt första experiment ledde pepsin matsmältningen vid pH 1 för 48 h vid 37 ° C till en förlust av bioaktivitet, som skulle kunna förebyggas genom att ändra ruvning till pH 2 för 48 h på 27 oC. Också, Tänk på att hydrogel framställs av frystorkad cECM microparticle fjädring, inte från färska cell-lösa våta cECM skivor. Utöver förbättrad allmän hantering av hydrogel jämfört med cECM skivor har hydrogel fördelen att det kan spädas för användning i olika koncentrationer, till exempel vid en högre koncentration i kombination med andra material eller för 3D kultur, eller vid en lägre koncentration för beläggning av cell kultur rätter eller som tillsats till odlingsmedium.

Detta protokoll har etablerats som ett laboratorium-grade SOP för mänskliga cECM förberedelser för att fylla luckorna i translationell regenerativ medicin som beskrevs nyligen av Saldin o.a. 10 medan cell-lösa cECM skivor kan tillämpas som ark på epikardiell ytan av det sjuka hjärtat, som nyligen beskrivs av Sarig et al., med svin cECM i en råtta modell av hjärtinfarkt23, bearbetning till en hydrogel möjliggör mångsidigare i vivo program, till exempel en injektion av cECM i myokardiet som framgår av Singelyn et al. 13 , 24 för att fortsätta mot klinisk translationell verksamhet, det nuvarande protokollet måste konverteras till GMP-grade förfaranden. I princip alla material som används är också del av godkända medicinska enheten/ATMP produktionsprocesser (dvs. cell-lösa hjärtklaffar eller blodkärl) och några större hinder kan förväntas. Information om säker lagring varaktighet och inte innehåller några patogener kommer dock säkerligen krävas. Slutligen behövs en pålitlig källa av större mängder färska och sterila hjärta vävnad från givare utan hjärtsjukdom. Här är hjärtan från avlidna organdonatorer som inte är lämplig för transplantation det mest troliga scenariot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Studieprotokollet uppfyller de etiska principerna i Helsingforsdeklarationen. Patienter föreskrivs användning av vävnad för forskningsändamål informerat samtycke, och processen för vävnad samling godkändes av institutionella Review Board och etikkommitté Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52, (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114, (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119, (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21, (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32, (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22, (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5, (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59, (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16, (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102, (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70, (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12, (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2, (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, (29), 5409-5416 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics