Behandling af menneskelige hjerte væv mod ekstracellulære Matrix selv samle Hydrogel for In Vitro og In Vivo applikationer

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver den komplette decellularization af menneskelige myokardiet samtidig bevare sin ekstracellulære matrix komponenter. Videreforarbejdning af ekstracellulære matrix resulterer i produktionen af mikropartikler og en cytoprotective selvsamlende hydrogel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Acellulær ekstracellulære matrix præparater er nyttige til at studere celle-matrix interaktioner og lette regenerativ celle terapi programmer. Flere kommercielle ekstracellulære matrix produkter fås som hydrogels eller membraner, men disse er ikke i besidelse væv-specifikke biologiske aktivitet. Fordi perfusion decellularization ikke er normalt muligt med menneskelige hjerte væv, udviklede vi en 3-trins fordybelse decellularization proces. Menneskelige Myokardie skiver indkøbt under operationen behandles først med vaskemiddel-fri hyperosmolær lysisbuffer, efterfulgt af inkubation med Ioniske vaskemiddel, sodium dodecyl sulfat, og processen er færdig ved at udnytte den iboende DNase aktivitet af føtal bovint serum. Denne teknik resulterer i celle-gratis plader af cardiac ekstracellulære matrix med stort set bevaret fibrøst væv arkitektur og polymer sammensætning, som blev vist til at give specifikke miljømæssige stikord til hjerte cellepopulationer og pluripotente stamceller celler. Hjerte ekstracellulære matrix ark kan derefter yderligere forarbejdes til et microparticle pulver uden yderligere kemiske ændringer, eller, via kortsigtede pepsin fordøjelse, ind i en selvsamlende hjerte ekstracellulære matrix hydrogel med bevaret bioactivity.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) giver ikke kun strukturfondene støtter men er også vigtig for biologiske celle og væv funktion1. I hjertet deltager ECM i reguleringen af patofysiologiske svar som fibrose, betændelse, angiogenese, cardiomyocyte kontraktile funktion og levedygtighed og bosiddende stamfader celle skæbne. Ud over sin primære komponenter - fiber glykoproteiner, glycosaminoglycans og proteoglycaner - indeholder den et væld af udskilles vækstfaktorer, cytokiner og hindeagtige vesikler indeholdende nukleinsyrer og proteiner2,3.

Det er for nylig blevet klart, at acellulær ECM præparater ikke er kun uvurderlig for at studere celle-matrix interaktioner, men også for potentielle terapeutiske celle-baserede programmer. Betydningen af at skabe et passende miljø til terapeutiske celle produkter eller manipuleret væv er nu bredt anerkendt. Man har forsøgt at kombinere celle suspensioner eller aktive forbindelser med definerede biopolymeric hydrogels4,5,6 eller protein cocktails udskilles af murine sarkom celler (dvs., Matrigel, Geltrex) 7. men førstnævnte har begrænset bioactivity, sidstnævnte er problematisk i GMP-grade processer, og begge mangler væv-specifikke bioactivity i hjertets ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization af myokardiet er tidligere blevet udført af perfusion af hele hjertet via koronar Vaskulaturen14,15. Mens dette er muligt i dyrenes hjerter, er intakt menneskers hjerter sjældent tilgængelige. Derfor, en nedsænkning proces, der giver mulighed for håndtering af vævsprøver i operationsstuen var begunstiget. Vores "3-trins" protokol indeholder 3 separate inkubation skridt nemlig lysis, oploesning og DNA fjernelse. Det giver menneskers Myokardie ECM med stort set bevarede protein og glykosaminoglykan sammensætning16,17. Disse cECM skiver mulighed for in vitro- undersøgelser af celle-matrix interaktioner men er dårligt egnet til potentielle menneskelige skala terapeutiske anvendelsesmuligheder. Fremstillingsprocessen var derefter udvidet til at producere enten frysetørret cECM mikropartikler eller en cECM hydrogel18.

Denne protokol giver mulighed for decellularization af menneskelige myokardiet fremstillet af kirurgisk prøver, bevare de væsentligste komponenter i Myokardie ekstracellulære matrix (ECM) og deres biologiske aktivitet. Denne protokol kan anbefales når menneskelige hjerte ECM med bevaret væv-specifikke bioactivity er nødvendig for eksperimentelle undersøgelser af celle-matrix interaktioner, eller når et passende miljø er nødvendige for cellebaserede Myokardie regenerering tilgange. I princippet er det også muligt at tilpasse denne protokol til GMP-grade betingelser, således at brugen af forarbejdede cECM skal være muligt i fremtiden terapeutiske anvendelsesmuligheder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelse-protokollen er i overensstemmelse med de etiske principper, der er skitseret i Helsinki-erklæringen og blev godkendt af den institutionelle review board og etik af Charité medicinske universitet. Alle patienter der skrevet, informeret samtykke til brug af hjerte væv i eksperimentelle undersøgelser.

1. forberedelse af menneskelige myokardiet for skæring

  1. Få venstre ventrikulære myokardiet (størrelse varierer afhængigt af typen kirurgi) direkte fra operationsstuen og transport i koldt PBS i en steril beholder.
  2. Fjerne alle fedtvæv med en steril skalpel med en no. 10 blade under sterile forhold.
  3. Skære myokardiet i terninger på ca 1 x 1 x 1 cm ved hjælp af en skalpel.
  4. Placer kuberne i sterile 50 mL rør.
    Bemærk: For at pause, udføre trin 1,5, ellers vil fortsætte med trin 2.2. Undgå gentagne fryse-tø cykler for at forhindre protein nedbrydning og et fald i væv kvalitet.
  5. Gemme de rør, der indeholder kuberne ved-80 ° C. Vævet kan opbevares i flere måneder.

2. skæring af myokardiet kuber i skiver

  1. Tage røret indeholdende de forberedte kuber ud af fryseren.
  2. Transport på isen for kryostaterne.
  3. Angiv objekt og kammer temperatur til-15 ° C.
    Bemærk: Den rette temperatur er afgørende for at sikre perfekt skæring.
  4. Chill Tom 50 mL rør og stempler i mødesalen eller på tøris.
  5. Tilføje et lag (ca 0,5 - 1,0 mL) af cryosection medium på kolde stemplet og lad det fryse indtil den er hvid og fast.
  6. Tilføje et andet lag af cryosection medium og placere en myokardiet kube på dette lag.
  7. Sørg for, at cryosection medium og myokardiet er helt frosset før du fortsætter.
    Bemærk: Hvornår af prøven og cryosection medium ikke er frosset til skæring vil blive forringet. Helt frossen cryosection medium vender sig fra flydende og gennemsigtig til solid, hvide og uigennemsigtige. Myokardial kuberne behøver mindst 30 min. op til 1 h til fuldstændig fryse hvis fortsætter straks fra trin 1.4. Når vævet er frosset bør det ikke deformeres når rørt/håndteres med pincet.
  8. Stempel med frosne myokardiet i holderen, og spænd alle skruer.
  9. Trim overfladen af vævet, indtil en selv skære overflade er opnået.
  10. Indstille skære tykkelse til 300 µm.
  11. Afsnit frosne myokardiet med automatisk skæring. Dette sikrer ensartet cut sektioner. Ca 30-40 sektioner kan være skåret fra en kube.
  12. Læg hver skive efter skæring løst i en forkølede 50 mL tube.
    Bemærk: Tryk ikke skiver eller pack stramt. Cirka 40 skiver kan passe ind i et rør.
  13. Luk de fyldt rør og Anbring på is.
    Bemærk: For at pause gå på med trin 2.14, ellers fortsætte med trin 3.2.
  14. Butik myokardiet skiver ved-80 ° C. Skiver kan opbevares i flere måneder.

3. decellularization af menneskelige myokardiet skiver

  1. Tage det nødvendige antal 50 mL rør indeholdende myokardiet sektioner af-80 ° C fryser og transport på is.
  2. Overføre de frosne dele af alle 50 mL rør fra trin 3.1 i et sterilt bæger. Cirka 40 skiver føjes til bæger pr. 50 mL tube. Bægerglasset bør være tre gange mængden af 50 mL rør; for eksempel, for decellularization af en 50 mL tube brug et 150 mL bægerglas.
  3. Tilsæt 50 mL lysis løsning (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7,4 i H2O) per 50 mL tube med myokardiet skiver.
  4. Ryst myokardiet skiver i et sterilt bæger på 100-150 rpm uafbrudt i 2 timer ved stuetemperatur.
  5. Stamme væske med væv skiver gennem en grov si. Overføre væv skiver med en stump pincet til en ny steril bægerglas. Tilsættes 50 mL 0,5% SDS i PBS pr indledende 50 mL tube af myokardiet skiver (fx bruge 100 mL SDS løsning når to 50 mL rør af Myokardie afsnit er der decellularized).
  6. Ryst uafbrudt i 6 timer ved 100-150 omdr. / min. ved stuetemperatur.
  7. Stamme væske med væv skiver gennem en grov si. Overføre væv skiver med en stump pincet til en ny steril bægerglas og vask 3 gange med 50 mL PBS i 10 min. mens ryste på 150 rpm. Næste, vaske natten over i PBS med 1% Penicillin/Streptomycin og 1% Nystatin (PBS-P/S-N) på 100-150 rpm og 4 ° C under omrystning.
    Bemærk: Grundig vask er afgørende for helt at fjerne enhver resterende SDS. Resterende spor af SDS er giftige, når ECM bruges i kombination med celler.
  8. Vask-opløsning og der tilsættes 25 mL forvarmes FBS (37 ° C) med 1% Penicillin/Streptomycin og 1% Nystatin til decellularized skiver pr. første 50 mL tube myokardiet skiver.
  9. Inkuber i 3 timer ved 37 ° C. I dette trin fjernes enhver resterende DNA fra matrix på grund af den iboende DNase aktivitet af FBS.
  10. Overføre skiver til en ny steril bægerglas og vask 3 gange med 50 mL PBS i 10 min. mens ryste på 150 rpm.
    Bemærk: ECM skiver kan være gemt i PBS-P/S-N ved 4 ° C i flere dage. Det anbefales dog at fortsætte straks.

4. behandling af Decellularized cECM til et pulver

  1. Placer ECM skiver løst i en ny steril 6-godt plade. Fryse ECM ved-80 ° C og lyophilize i 2 dage i et lyophilizer.
    Bemærk: mere end én skive kan placeres pr. brønd. Arranger skiver for at helt dække overfladen af brønden. Overlappende skiver påvirker ikke den efterfølgende pulverisering succes.
  2. For ECM skive pulverisering rør brug specifikke fræsning (Se Tabel af materialer) indeholdende 1,4 mm keramik perler. Fylde rørene løst med frysetørret ECM bruger sterile sløve pincetter. For optimale resultater anbefales en samlet vægt på ECM mellem 10-20 mg.
    Bemærk: Hvis ECM er pakket for stramt i fræsning rør pulverisering proces vil blive negativt påvirket.
  3. Snap-freeze rørene i flydende kvælstof.
    Advarsel: flydende nitrogen er ekstremt lav temperatur, bære passende personlige beskyttelse.
  4. Indsæt de frosne rør i fræsning maskine og pulverisere ECM.
    1. Angive en varighed af 30 s og en maksimal hastighed og starte enheden.
    2. Efter endt, tag rør og snap-fryse igen i flydende kvælstof.
    3. Gentag fem gange.
  5. Vask mikropartikler fra rørene ved at tilføje 1 mL ddH2O pr. tube og ryste eller vortex for komplet solubilizing. Filtrere de heterogene løsning gennem en 200 µm mesh i en 50 mL tube.
  6. Fryse rør i-80 ° C eller flydende kvælstof.
  7. Erstatte standard låget af glasset med et 0,22 µm filter. Dette filter låg forhindrer pulveret fra flyder ud af røret, men giver mulighed for luftcirkulation til vand fordampning.
  8. Indsæt rør i lyophilizer og lyophilize igen for at fjerne vandet fra trin (trin 4.5)
    Bemærk: Ingot på dette trin kan tage op til 3 dage.
  9. Gemme pulver ved-80 ° C indtil videre forarbejdning eller fortsætte med trin 5.1.

5. enzym baseret Homogenizing af cECM mikro-partikler

  1. Opløse svin pepsin i 0,01 M HCl (pH 2.0) til en koncentration på 1 mg/mL. Sted på en orbitalryster ved stuetemperatur indtil det er helt opløst.
  2. Frysetørret human ECM pulveret (trin 4.8) opløses i pepsinopløsning til en slutkoncentration på 10 mg/mL. Blandes grundigt gennem pipettering. Den samlede mængde afhænger af mængden af ECM-løsningen behov. For eksempel, opløse 10 mg af ECM pulver i 1 mL pepsinopløsning.
    Bemærk: Opløse partikler kan støttes gennem blid vortexing (1.000-1.500 RPM). Resterende klumper af mikropartikler påvirker negativt fordøjelsen.
  3. Opløsningen overføres til 2 mL rør med et volumen på 1 mL pr tube.
  4. Sted rør i en tube shaker i 48 timer ved 27 ° C og 1.200 rpm.
  5. Tag rør ud af shaker og Anbring på is eller en pre afkølede tube holder.
  6. Mix 1/9 af omfanget af ECM-løsningen af kolde 10 x PBS (pH 7,4) med 1/10 af mængden af ECM-løsningen af kolde 0,1 M NaOH i en forkølede rør og sted på is. Denne blanding vil neutralisere den fordøjede ECM-løsningen og uigenkaldeligt inaktivere pepsinet.
  7. Tilføje ECM-løsningen til neutralisering blanding og bland grundigt gennem pipettering eller vortexing.
  8. Indstil ECM til den ønskede koncentration med 1 x PBS (pH 7,4). PH af løsningen kan kontrolleres med pH papir.
    Bemærk: Eksempel beregning for 10 mL fordøjet ECM-løsningen:
    Tilføje 10 mg svin pepsin til 10 mL HCl (pH 2.0).
    Tilsæt 100 mg ECM pulver til pepsinopløsning.
    Bemærk: Eksempel beregning til neutralisering af 10 mL fordøjet ECM-løsningen og at koncentrationen til 8 mg/mL:
    Volendelige = cstarter x Volstart / cendelige = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol10xPBS = Volstart / 9 = 1/9 fra 10 mL = 1.11 mL 10 x PBS
    VolNaOH = Volstart / 10 = 1/10 fra 10 mL = 1 mL
    Vol1xPBS = Volendelige - Volstart - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-11Almindeligt mL-1 mL = 0,39 mL

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3-trins protokol til decellularization af menneskelige myokardiet præsenteres her resultaterne i næsten fuldstændig fjernelse af cellulære materiale, samtidig bevare ECM nøglekomponenter og den fibrillar struktur af ECM. Efter decellularization fremgår grov fjernelse af celler fra vævet af ændringen i farve (figur 1A). Histologiske analyse med H & E og Masson Trichrome pletter afslørede den fuldstændige mangel på resterende intakt celler (figur 1B). Kvantitative assays for ECM enkeltkomponenter afslørede en mere komplet DNA fjernelse og bedre bevarelse af samlede kollagen, elastin og glycosaminoglycans sammenlignet med decellularization af SDS alene (figur 2A). Funktionelle dokumentation for den biologiske aktivitet af cECM er vist i figur 2B. Her, RT-PCR blev brugt til at kvantificere udtryk for strukturelle cardiomyocyte proteiner (Myh6, Tnnt2), tidligt (Mef2c, Nkx2.5) og slutningen (Gata4) cardiomyogenic transkriptionsfaktorer og endotel celle overflade markørgener (von Willibrand faktor (vWF), VE-cadherin) i murine ESC gennemgår spontan differentiering. I forhold til både ubestrøget kultur parabol overflade og Matrigel-ECM belægning, er det indlysende, at kontakt med cECM drev pluripotente stamceller helst mod en cardiomyocyte-lignende fænotype.

Frysetørret ECM skiver kan forarbejdes yderligere til mikropartikler uden hjælp af enzymatiske eller kemiske reagenser. Mekanisk slibning eller pulverisering ved hjælp af egnede kits tilladt for produktion af mikropartikler med en ensartet størrelse (figur 3A). Massespektrometri indeholder en oversigt over alle genkendelige proteiner til stede i cECM. Gen ontologi analyse fokuserer på cellulære komponenter viste, at størstedelen af ECM proteiner faktisk stammer fra det ekstracellulære rum, med få hæmoglobin restkoncentrationer og en række af overvejende intracellulære proteiner (figur 4). Dette mønster kan bestemme væv-specifikke biologiske funktion af cECM, men denne hypotese har brug for yderligere forskning. Et resumé af cECM protein sammensætning er vist i tabel 1. Forarbejdning ECM til mikropartikler bevarer dens biologiske aktivitet. HL-1 celler udsat for simuleret "iskæmisk" betingelser (hypoxi, glukose og serum afsavn) vises en stigning i cell metabolisme (figur 3B) og et fald i celledød når kulturperler på cECM (figur 3 c).

Begrænset pepsin-baserede fordøjelsen af cECM pulver, baseret på en modificeret protokol udviklet til kollagen rensning19, resulterer i en homogeniseret ECM-løsningen. Fase kontrast lysmikroskopi billeder (figur 5A) demonstrere fordøjelsesprocessen efter 0 h og 48 h. Trinnet homogenisering letter applikationer i regenerativ medicin10. Den resulterende forarbejdede cECM er vist i figur 5B. Under stuetemperatur bliver det flydende (figur 5B, venstre) men ved 37 ° C det danner en selvsamlende hydrogel med stabilitet passende for en overlejring med celle suspensioner tillade 3D kultur (repræsentativt billede, figur 5B ret, hydrogel lag med næringssubstratet). Live/døde farvning af menneskelige hjerte fibroblaster viser også de gunstige virkninger af dyrkning på cECM (figur 5 c). Både cECM mikropartikler og cECM hydrogel forbedret den metaboliske aktivitet af kontraktile HL1 celler i iskæmisk betingelser i forhold til cellerne i standard kultur (figur 5 c, nederste højre panel).

Figure 1
Figur 1: Decellularization af menneskelige hjerte myokardiet. (A) makroskopisk analyse af cECM af stereo mikroskopi afslører fjernelse af cellulære materiale med 3-trins decellularization protokol. Det fremgår af forøgelsen af gennemsigtighed. (B) histologi farvning af Myokardie skiver før og efter decellularization med han-(venstre; Skalalinjen = 50 µm) og Masson Trichrome farvning (højre; Skalalinjen = 200 µm) viser vellykket fjernelse af celler fra vævet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: indhold og virkning af cECM skiver. (A) kvantitative biokemiske analyser af udvalgte ECM komponenter og DNA, sammenligne 3-trins decellularization protokol til 0,5% SDS-alene decellularization. Data er udtrykt som procentdel af indhold i native myokardiet. Med 3-trins protokol, den resterende DNA indhold var næsten nul og betydeligt lavere end at efter en 9 h inkubation med en standard kombineret 0,5% SDS/lysis buffer kombination og FBS (SDS 9 h + FBS). Respektive biokemiske analyser påvist en næsten fuldstændig bevarelsen af kollagen, ca 20% bevarelse af glykosaminoglykan indhold i forhold til native væv, og en næsten 30% bevarelse af elastin indhold, alle betydeligt højere end med den standard SDS reference protokol (søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM). (B) mRNA udtryk for valgte gener i inducerede pluripotente stamceller differentiere på cECM, i forhold til ubestrøget kultur retter og Matrigel-belagt overflade. cECM data er normaliseret til dem, der opnås på de respektive kontrolmaterialer (kontrol = 1, stiplede linje). Størstedelen af cardiac gener er betydeligt mere stærkt udtryk når kulturperler på cECM (søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: udseende og biologisk aktivitet af cECM mikropartikler. (A) cECM microparticle pulver efter ingot. (B) stofskifte (MTS) og (C) celle død (LDH release) analyse af HL-1 celler kulturperler med cECM eller gelatine. cECM betydeligt reducerer celledød og øger stofskiftet. Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM, Statistisk signifikans testet af en-vejs ANOVA og Bonferroni. Figur 3B -C er blevet ændret fra Kappler et al. 18 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Protein sammensætning af cECM mikropartikler. Efter massespektrometri, streng DB analyse skildrer de centrale komponenter i cECM, som er primært tilknyttet det ekstracellulære rum (GO: 0005615, røde kugler p > 0,05). Linjer angiver protein interaktioner baseret på eksperimentel-biokemiske data (lilla), om det fælles udtryk (sort), database interaktioner (blå) og co udtryk (grøn). Streng DB kræves tillid: score > 0,4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: forarbejdning af cECM til en hydrogel bevare den biologiske effektivisering. Fase kontrast lysmikroskopi billeder demonstrere at Enzymatisk nedbrydning af cECM for 48 h resultater i en mere homogeniseret ECM-løsningen; Skalalinjen = 500 µm. (A) den ECM løsning forbliver flydende op til stuetemperatur (B, venstre) og indeholder potentialet til selvstændig samle mod en hydrogel når inkuberes ved 37 ° C (B, højre). Live/døde pletter af cardiac humane fibroblaster kulturperler med og uden cECM afslører en højere calcein farvning intensiteten af levende celler; Skalalinjen = 50 µm (C). CECM hydrogel øger den metaboliske aktivitet af HL1 celler i iskæmisk betingelser på samme måde som de mikro partikler (C, nederste højre panel, ændret fra Kappler et al. 18) søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM, Statistisk signifikans testet af en-vejs ANOVA og Bonferroni. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protein beskrivelse
5-hydroxytryptamin receptor 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2
Aktin-lignende protein 6B OS = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
Aktin, aorta glatte muskulatur OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
Serum albumin OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2
Antithrombin-III OS = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1
Oprullet-coil domæne indeholdende protein 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1
C-type lektin Domænemedlem familie 11 A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
Chlorid intracellulære kanal protein 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
Kollagen alpha-2(I) kæde OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7
Supplere C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2
Kollagen alpha-2(IV) kæde OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4
Cykliske AMP-responderende element-bindende protein 3-lignende protein 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2
Fibronektin OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4
Glutathion peroxidase 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2
Hæmoglobin subunit alpha OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
Hæmoglobin subunit beta OS = Homo sapiens GN = Ulla PE = 1 SV = 2
IG kappa kæde C region OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1
Lumican OS = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2
Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1
Nidogen-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3
Pseudopodium-beriget atypiske kinase 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
Pigment epitel-afledt faktor OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4
Mitokondrie coenzym A transportvirksomheden SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2
Serum amyloid P-komponenten OS = Homo sapiens GN = PMV'ER PE = 1 SV = 2
Transskription indledningen faktor TFIID subunit 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3
Tudor domæne indeholdende protein 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
Zink finger matrin-type protein 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1
Zink finger protein 101 OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1

Tabel 1: Protein sammensætning af cECM pulver som fastsat af massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når du forbereder menneskelige Myokardie ECM, målet er at opnå følgende: fjernelse af relevante immunogen cellular materiale, bevarelse af ECM integritet og bioactivity, sterilitet, ikke-giftighed af slutproduktet, GMP-processen kompatibilitet, og egnethed af produktet til en given anvendelse med hensyn til håndtering. Ved at kombinere vores 3-trins decellularization protokol med yderligere forarbejdning til mikropartikler eller selvsamlende hydrogel, menneskelige hjerte ECM materiale er fremstillet som besidder særlige biologiske aktivitet, er let at håndtere, og har potentiale til flere programmer i in vitro og i vivo, svarende til hvad har vist for ECM produkter fra flere dyr arter11,13,20,21.

Under den indledende behandling af Myokardie væv er det vigtigt at afsnit Myokardie skiver af samme tykkelse, fordi sammensatte koncentration og behandling varighed har været titreres for 300 µm skiver. Tykkere skiver vil være ufuldstændigt decellularized og tyndere skiver vil lide uønskede opdeling af ECM komponenter med tab af bioactivity. Dette er særlig vigtigt med hensyn til SDS behandling, hvor toksicitet kan indvirke negativt på ECM egenskaber og cellulære analyser16. Desuden kan langvarig SDS behandling føre til komplet fravær af fibronektin, som set i undersøgelsen af Godier-Fournement et al. 22, mens det er bevaret med vores metode17. Afsnittene cECM er egnet til brug i eksperimenter uden yderligere behandling (dvs. i 3D kultur modeller analysere Celledifferentiering eller celle-ECM interaktioner eller til "tissue engineering" cellulære genindsættelse tilgange). Brug af FBS for DNA fjernelse er meget effektive, men kunne potentielt føre til nogle resterende FBS proteiner i afsnittene ECM. Dette kunne påvirke nogen FBS følsomme assays. Oversættelse til en klinisk grade GMP protokol skal være muligt med brug af certificerede sera, men en tilpasning kan være nødvendige afhængigt af forordninger. Dette kunne enten bekræfter manglen FBS restkoncentrationer i ECM eller en ændring til protokollen vil være nødvendigt at erstatte FBS med DNase behandling. Endelig, gentagne fryse-tø cykler af væv og ECM sektioner skal undgås for at forhindre forringelse af matrixen.

Når producerer cECM hydrogel, er pepsin fordøjelse den mest kritiske trin i processen. I vores første eksperimenter førte pepsin fordøjelsen ved pH 1 i 48 timer ved 37 ° C til tab af bioactivity, som kan forebygges ved at ændre inkubation til pH 2 i 48 timer ved 27 oC. Også, huske på, at hydrogel er fremstillet af frysetørret cECM microparticle suspension, ikke fra frisk decellularized våde cECM skiver. Ud over den forbedrede generelle håndtering af hydrogel i forhold til cECM skiver har hydrogel den fordel, at det kan fortyndes til brug i forskellige koncentrationer, for eksempel ved en højere koncentration i kombination med andre materialer eller 3D kultur, eller ved en lavere koncentration for belægning af celle kultur retter eller som tilsætningsstof til næringssubstratet.

Denne protokol er blevet etableret som et laboratorium-grade SOP for menneskelige cECM forberedelse til at udfylde hullerne i translationel regenerativ medicin, blev for nylig beskrevet af Saldin et al. 10 decellularized cECM skiver kan anvendes som plader på epikardielle overfladen af det syge hjerte, som for nylig beskrevet af Sarig et al., med svin cECM i en rotte model af myokardieinfarkt23, forarbejdning til et hydrogel giver mulighed for mere forskelligartede i vivo applikationer, såsom injektion af cECM i myokardiet som vist af Singelyn et al. 13 , 24 for at fortsætte mod kliniske translationel aktiviteter, den nuværende protokol bliver nødt til at blive konverteret til GMP-grade procedurer. I princippet alle materialer er også en del af godkendt medicinsk enhed/LTAT produktionsprocesser (dvs. decellularized hjerteklapper eller blodkar) og ingen store hindringer der kan forventes. Dog vil oplysninger om sikker oplagring varighed og fravær af patogener helt sikkert være påkrævet. I sidste ende, er der behov for en pålidelig kilde til større mængder af frisk og sterile hjerte væv fra donorer uden hjertesygdom. Her, er hjerter fra afdøde organdonorer, der ikke er egnede til transplantation den mest sandsynlige scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelse-protokollen i overensstemmelse med de etiske principper, der er skitseret i Helsinki-erklæringen. Patienter informeret samtykke til brug af væv i forskningsøjemed, og processen med væv samling blev godkendt af institutionelle Review Board og etiske komité i Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52, (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114, (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119, (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21, (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32, (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22, (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5, (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59, (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16, (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102, (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70, (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12, (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2, (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, (29), 5409-5416 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics