Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

Developmental Biology

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Summary

Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.

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Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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Abstract

Preparación de la matriz extracelular acelular es útiles para estudiar las interacciones célula-matriz y facilitar las aplicaciones de la terapia celular regenerativa. Varios productos comerciales matriz extracelular están disponibles como hidrogeles o membranas, pero estas no poseen actividad biológica específica de tejido. Porque descelularización de perfusión no es generalmente posible con tejido cardíaco humano, desarrollamos un proceso de descelularización de inmersión de 3 pasos. Rebanadas miocardio humanos adquiridos durante la cirugía se tratan primero con tampón de lisis hiperosmolar libre de detergente, seguido por la incubación con lo iónicos detergente, dodecil sulfato de sodio, y el proceso se completa mediante la explotación de la actividad de la ADNasa intrínseca de suero bovino fetal. Esta técnica resulta en hojas sin células de la matriz extracelular cardiaca con conserva en gran parte tejido fibroso arquitectura y Biopolímeros composición, que fueron demostradas para proporcionar señales ambientales específicos a poblaciones de la célula cardiaca y vástago de pluripotent células. Hojas de matriz extracelular cardiaca pueden entonces más procesadas en un polvo de micropartículas sin mayor modificación química, o, mediante digestión de pepsina a corto plazo, en un hidrogel uno mismo-montaje de la matriz extracelular cardiaca con conserva bioactividad.

Introduction

La matriz extracelular (ECM) proporciona no sólo estructural de apoyo pero también es importante para la célula biológica y función de tejidos1. En el corazón, el ECM participa en la regulación de las respuestas fisiopatológicas tales como fibrosis, inflamación, angiogénesis, función contráctil del cardiomiocito y viabilidad y destino de la célula del progenitor residente. Además de sus principales componentes fibrosos glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos - contiene una serie de vesículas membranosas que contienen ácidos nucleicos y proteínas2,3, secretadas factores de crecimiento y citoquinas.

Recientemente ha quedado claro que preparados acelulares de ECM no sólo son inestimables para el estudio de las interacciones célula-matriz, sino también para posibles aplicaciones terapéuticas basadas en células. Ahora es ampliamente reconocida la importancia de proporcionar un entorno adecuado para productos celulares terapéuticos o ingeniería de tejidos. Ha habido intentos para combinar suspensiones celulares o compuestos activos con hidrogeles biopolímeros definido4,5,6 o con cócteles de proteína secretadas por las células del sarcoma murino (es decir, Matrigel, Geltrex) 7. sin embargo, los primeros son limitadas bioactividad, estos últimos son problemáticos en los procesos de calidad GMP y ambos carecen de la bioactividad específica de tejido cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Descelularización del miocardio se ha realizado previamente por la perfusión del corazón entero a través de la vasculatura coronaria14,15. Mientras que esto es posible en animales corazones, corazones humanos intactos están raramente disponibles. Por lo tanto, fue favorecido un proceso de inmersión que permite la manipulación de las muestras de tejido obtenidas en la sala de operaciones. Nuestro protocolo "3 pasos" contiene 3 separado incubación pasos a saber: lisis, solubilización y extracción de ADN. Produce la ECM miocardio humana con en gran parte conservadas proteínas y glicosaminoglicanos composición16,17. Estas rebanadas cECM permiten estudios en vitro de las interacciones célula-matriz pero están mal adaptados para posibles aplicaciones terapéuticas de la escala humana. El proceso de fabricación se amplió entonces para producir micropartículas cECM liofilizado o un hidrogel cECM del18.

Este protocolo permite la descelularización de miocardio humano Obtenido de muestras quirúrgicas, preservación de los componentes principales de la matriz extracelular miocárdica (ECM) y su actividad biológica. Este protocolo se recomienda cuando ECM cardiaca humana con bioactividad específica de tejido conservada se requiere para estudios experimentales de las interacciones célula-matriz, o cuando se necesita un ambiente adecuado para regeneración miocárdica celular enfoques. En principio, también es posible adaptar este protocolo a las condiciones GMP-grado, para que el uso del cECM procesado debería ser factibles aplicaciones terapéuticas en el futuro.

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Protocol

El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética y Junta de revisión institucional de la Charité Medical University. Todos los pacientes siempre por escrito, consentimiento informado para el uso de tejido cardíaco para estudios experimentales.

1. preparación del miocardio humano para seccionamiento

  1. Obtener el miocardio ventricular izquierdo (el tamaño varía dependiendo del tipo de cirugía) directamente desde la sala de operaciones y transporte en PBS frío en un recipiente estéril.
  2. Eliminar todo el tejido graso con un bisturí estéril con cuchilla Nº 10 bajo condiciones estériles.
  3. Corte del miocardio en cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 cm con un bisturí.
  4. Coloque los cubos en tubos estériles de 50 mL.
    Nota: Para hacer una pausa, ejecutar el paso 1.5, de lo contrario continúe con el paso 2.2. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida para evitar la degradación de las proteínas y una disminución en la calidad del tejido.
  5. Almacenar los tubos que contienen los cubos a-80 ° C. Los tejidos pueden guardarse por varios meses.

2. secciones de los cubos de miocardio en rodajas

  1. Tome los tubos que contienen los cubos preparados fuera del congelador.
  2. Transporte en hielo al criostato.
  3. Ajustar la temperatura del objeto y la cámara de-15 ° C.
    Nota: La temperatura adecuada es crucial para garantizar el seccionamiento perfecto.
  4. Tubos de vacío frío 50 mL y sellos en la cámara o en hielo seco.
  5. Añadir una capa (aproximadamente 0.5 - 1.0 mL) de criosección medio sobre el sello frío y deje que congele hasta que esté blanca y sólida.
  6. Añadir una segunda capa de criosección mediano y coloque un cubo de miocardio en esta capa.
  7. Asegúrese de que el medio de criosección y miocardio se congelan completamente antes de continuar.
    Nota: Cuando el medio muestra y criosección no se congelan el seccionamiento se deteriorará. Medio de criosección completamente congelado da vuelta de fluida y transparente sólido, blanco y no transparente. Los cubos miocardio necesitan por lo menos 30 min hasta 1 h para congelar completamente si continuar inmediatamente en el paso 1.4. Cuando se congela el tejido no debe deformarse cuando tocó/manipulado con pinzas.
  8. Insertar sello con miocardio congelado en el soporte y apriete todos los tornillos.
  9. Recorte la superficie del tejido hasta obtener una superficie incluso seccionamiento.
  10. Sistema de seccionamiento a 300 μm de espesor.
  11. Sección del miocardio congelado con el seccionamiento automático. Esto garantiza que las secciones de corte uniforme. Pueden rebanar aproximadamente 30-40 secciones de un cubo.
  12. Coloque cada rebanada después de seccionar libremente en un tubo de 50 mL preenfriada.
    Nota: No presione el rodajas o el paquete firmemente. Aproximadamente 40 rebanadas pueden caber en un tubo.
  13. Cierre los tubos de llenado y coloque en hielo.
    Nota: Para poner en pausa ir con paso 2.14, de lo contrario continúe con el paso 3.2.
  14. Segmentos de miocardio tienda a-80 ° C. Las rebanadas se pueden almacenar durante varios meses.

3. descelularización de miocardio humano rebanadas

  1. Tomar el número necesario de tubos de 50 mL que contiene secciones de miocardio en el congelador de-80 ° C y el transporte en hielo.
  2. Transferencia de las secciones congeladas de todos los tubos de 50 mL del paso 3.1 en un vaso estéril. Aproximadamente 40 rebanadas se agregan en el vaso por el tubo de 50 mL. El vaso debe ser tres veces el volumen de los tubos de 50 mL; por ejemplo, de descelularización de un tubo de 50 mL, utilizar un vaso de precipitados de 150 mL.
  3. Añadir 50 mL de solución de lisis (10 mM de Tris, 0.1% peso/volumen de EDTA, pH 7,4 en H2O) por el tubo de 50 mL con divisiones de miocardio.
  4. Sacuda las rebanadas del miocardio en un vaso estéril de 100-150 RPM continuamente por 2 h a temperatura ambiente.
  5. Colar el líquido con las rebanadas de tejido a través de un colador grueso. Transferir los trozos de tejido con una pinza Roma a un vaso de precipitados estéril nuevo. Añadir 50 mL de SDS 0,5% en PBS por el tubo de 50 mL iniciales de rebanadas del miocardio (p. ej., 100 mL SDS solución cuando son ser decellularized dos tubos de 50 mL de secciones miocardio).
  6. Agitar continuamente durante 6 h a 100-150 rpm a temperatura ambiente.
  7. Colar el líquido con las rebanadas de tejido a través de un colador grueso. Transferir los trozos de tejido con una pinza Roma un nuevo vaso de precipitados estéril y lavar 3 veces con 50 mL de PBS durante 10 minutos agitando a 150 rpm. A continuación, Lave toda la noche en PBS con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% nistatina (PBS-P/S-N) a 100-150 rpm y 4 º C agitando.
    Nota: Lavar bien es crucial para eliminar por completo cualquier SDS residual. Resto de SDS es tóxico cuando el ECM se utiliza en combinación con las células.
  8. Eliminar la solución de lavado y añadir 25 mL precalentado FBS (37 ° C) y 1% de penicilina/estreptomicina 1% nistatina a las rodajas de decellularized por el tubo de 50 mL iniciales de rebanadas de miocardio.
  9. Incubar durante 3 h a 37 ° C. En este paso, se elimina cualquier ADN restante de la matriz debido a la intrínseca actividad DNasa de la FBS.
  10. Transferir las rebanadas en un nuevo vaso estéril y lavar 3 veces con 50 mL de PBS durante 10 minutos agitando a 150 rpm.
    Nota: Las rodajas de ECM pueden guardarse en PBS-P/S-N a 4 ° C por varios días. Sin embargo, se recomienda proceder inmediatamente.

4. procesamiento del cECM Decellularized a un polvo

  1. Coloque las rebanadas de ECM libremente en una placa de 6 pozos estéril nuevo. Congelar el ECM a-80 ° C y liofilizar durante 2 días en un liofilizador.
    Nota: se puede colocar más de una rebanada por pozo. Arregle las rebanadas para cubrir totalmente la superficie del pozo. Superposición de las rebanadas no afecta el éxito de la posterior pulverización.
  2. Para la pulverización de la rebanada de ECM, fresado específicos uso tubos (véase Tabla de materiales) que contienen granos de 1,4 mm de cerámica. Llene los tubos libremente con ECM liofilizado con estériles pinzas embotadas. Para obtener resultados óptimos, se recomienda un peso total de ECM entre 10-20 mg.
    Nota: Si el ECM está lleno apretadamente en los tubos de fresado el proceso de pulverización se verán negativamente afectado.
  3. Rápido-congele los tubos en nitrógeno líquido.
    PRECAUCIÓN: nitrógeno líquido es extremadamente baja temperatura, utilice protección personal adecuada.
  4. Inserte los tubos congelados en la máquina de moler y pulverizar el ECM.
    1. Establecer una duración de 30 s y un máximo de la velocidad e iniciar el dispositivo.
    2. Después de terminar, saque los tubos y snap-congelar de nuevo en nitrógeno líquido.
    3. Repita cinco veces.
  5. Lave las micropartículas de los tubos mediante la adición de 1 mL ddH2O por el tubo y agitar o vórtice de solubilización completa. Filtrar la solución heterogénea a través de una malla de 200 μm en un tubo de 50 mL.
  6. Congelar el tubo de nitrógeno-80 ° C o líquido.
  7. Vuelva a colocar la tapa estándar del tubo con un filtro de 0,22 μm. Esta tapa de filtro evita que el polvo fluya fuera del tubo pero permite circulación de aire para la evaporación del agua.
  8. Insertar los tubos en el liofilizador y liofilizar otra vez para quitar el agua del paso (paso 4.5)
    Nota: Liofilización en este paso puede tardar hasta 3 días.
  9. Almacenar el polvo a-80 ° C hasta el procesamiento posterior o continúe con el paso 5.1.

5. enzima basado homogeneización del cECM Micro-partículas

  1. Disolver la pepsina porcina en 0.01 M HCl (pH 2.0) a una concentración de 1 mg/mL. Colocar en un agitador rotatorio a temperatura ambiente hasta que esté completamente disuelta.
  2. Disolver el polvo liofilizado de ECM humano (paso 4.8) en la solución de pepsina a una concentración final de 10 mg/mL. Mezclar bien mediante pipeteo. El volumen total depende de la cantidad de solución de ECM que necesita. Por ejemplo, disolver 10 mg de polvo de ECM en 1 mL de solución de pepsina.
    Nota: Disolución de las partículas puede apoyar a través de Vortex suave (1.000-1.500 RPM). Quedan grumos de micropartículas afectará negativamente la digestión.
  3. Transferir la solución a tubos de 2 mL con un volumen de 1 mL por tubo.
  4. Colocar los tubos en un agitador de tubos por 48 h a 27 ° C y 1.200 rpm.
  5. Sacar los tubos de la coctelera y coloque en hielo o en un soporte de tubo previamente enfriado.
  6. Mezcla 1/9 del volumen de la solución ECM de frío 10 x PBS (pH 7.4) con 1/10 del volumen de la solución ECM de frío 0,1 M NaOH en un lugar en el hielo y el tubo preenfriada. Esta mezcla se neutraliza la solución ECM digerida e inactivar irreversiblemente la pepsina.
  7. Añadir la solución de ECM a la neutralización mezcla y mezcla bien mediante pipeteo o vórtex.
  8. Establezca el ECM en la concentración deseada de 1 x PBS (pH 7.4). El pH de la solución puede comprobarse con papel pH.
    Nota: Ejemplo de cálculo para 10 mL había digerida solución ECM:
    Añadir 10 mg de pepsina porcina a 10 mL de HCl (pH 2.0).
    Añadir 100 mg ECM de polvo para solución de pepsina.
    Nota: Ejemplo de cálculo para neutralizar 10 mL había digerida solución ECM y ajustar la concentración a 8 mg/mL:
    VolFinal = cstart x Volstart / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol10xPBS = VolInicio / 9 = 1/9 de 10 mL = 1,11 mL 10 x PBS
    Vol deNaOH = VolInicio / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL
    Vol1xPBS = Vol VolFinal - Volstart -10xPBS - Vol deNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL

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Representative Results

El protocolo de 3 pasos de descelularización de miocardio humano presentamos resultados en la eliminación casi total de material celular, conservando los componentes clave del ECM y la estructura fibrilar del ECM. Después de descelularización, la extracción bruta de las células de los tejidos es evidente por el cambio de color (figura 1A). El análisis histológico con manchas de H & E y TRICROMICA de Masson reveló la ausencia completa de células intactas residual (figura 1B). Ensayos cuantitativos individuales componentes de ECM revelaron una extracción de ADN más completa y mejor preservación de colágeno total, elastina y glicosaminoglicanos en comparación con descelularización por SDS solo (figura 2A). Pruebas funcionales de la actividad biológica del cECM se muestran en la figura 2B. Aquí, se utilizó RT-PCR para cuantificar la expresión de proteínas estructurales del cardiomiocito (Myh6, Tnnt2), temprano (Mef2c, Nkx2.5) y finales (Gata4) cardiomiogenético factores de transcripción y genes marcador superficial de la célula endotelial (von Willibrand Factor (FvW), VE-cadherin) en ESC murino que experimentan diferenciación espontánea. En comparación a la superficie del plato de cultura sin recubrimiento y revestimiento de Matrigel-ECM, es evidente que contacto con cECM conduce las células de vástago pluripotent preferentemente hacia un fenotipo de cardiomiocitos-como.

Rodajas liofilizadas de ECM pueden ser procesados en micropartículas sin utilizar reactivos enzimáticos o químicos. Moler o pulverizar usando kits adecuados para producción de micropartículas con un tamaño uniforme (Figura 3A). Espectrometría de masas ofrece una visión general de todas las proteínas reconocible en cECM. El análisis del gene ontology en componentes celulares reveló que la mayoría de las proteínas de la ECM de hecho se deriva desde el espacio extracelular, con pocos residuos de hemoglobina y un número de proteínas intracelulares predominante (figura 4). Este patrón puede determinar la función biológica de tejidos específicos del cECM, pero esta hipótesis necesita investigación adicional. Se muestra un resumen de la composición de la proteína del cECM en tabla 1. Tratamiento del ECM en micropartículas conserva su actividad biológica. HL-1 células expuestas a condiciones simuladas de "isquémico" (privación de hipoxia, glucosa y suero) muestran un aumento en el metabolismo de la célula (figura 3B) y una disminución en la muerte celular cuando cultiva cECM (figura 3).

Limitada base de pepsina digestión del polvo del cECM, basado en un protocolo modificado desarrollado por colágeno purificación19, resulta en una solución de ECM homogeneizada. Imágenes de microscopía óptica de contraste de fase (figura 5A) muestran el proceso de digestión después de 0 h y 48 h. Este paso homogeneización facilita aplicaciones en medicina regenerativa10. El cECM procesada resultante se muestra en la figura 5B. Por debajo de la temperatura ambiente es líquido (figura 5B, izquierda) pero a 37 ° C se forma un hidrogel uno mismo-montaje con la estabilidad adecuada para un recubrimiento con suspensiones celulares que permite 3D cultura (cuadro representativo, la derecha de la figura 5B , hidrogel capas con medio de cultivo). Live/dead tinción de fibroblastos cardiacos humanos también demuestra los efectos beneficiosos del cultivo el cECM (figura 5). CECM micropartículas y cECM hidrogel mejoran la actividad metabólica de las células contráctiles de HL1 en condiciones isquémicas en comparación con las células en cultivo estándar (figura 5, panel inferior derecho).

Figure 1
Figura 1: descelularización de miocardio cardíaco humano. (A) Análisis macroscópico del cECM por estéreo microscopía revelan la remoción de material celular con el protocolo de la descelularización de 3 pasos. Esto es evidente por el aumento en la transparencia. (B) histología tinción miocárdica lonchas antes y después de descelularización con él-(a la izquierda; Barra de escala = 50 μm) y TRICROMICA de Masson coloración (a la derecha; Barra de escala = 200 μm) muestra la exitosa eliminación de las células de los tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: contenido y efecto del cECM rodajas. (A) cuantitativo análisis bioquímico de las componentes de la ECM y ADN, comparando el protocolo de 3 pasos descelularización descelularización SDS-sólo 0,5%. Datos se expresan como porcentaje del contenido en el miocardio nativo. Con el protocolo de 3 pasos, el contenido de ADN residual era casi cero y significativamente menor que después de una incubación 9 h con un estándar combinada 0,5% SDS/lisis buffer combinación y FBS (SDS 9 h + FBS). Respectivos análisis bioquímicos demostraron una preservación casi completa de colágeno, aproximadamente el 20% conservación de contenido glycosaminoglycan en comparación con tejido propio y una preservación casi 30% de contenido de elastina, todos significativamente mayor que con El SDS referencia protocolo estándar (barras representan la media ± SEM). (B) la expresión del mRNA de genes seleccionados en células pluripotentes inducidas, diferenciando el cECM, comparado con platos de cultura sin recubrimiento y superficie recubierta de Matrigel. cECM datos se normalizan a los obtenidos en los materiales de control respectivos (control = 1, línea de guiones). La mayoría de los genes cardiacos significativamente más altamente se expresa cuando cultiva cECM (barras representan la media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: aspecto y actividad biológica de micropartículas cECM. (A) cECM micropartículas polvo después de la liofilización. (B) metabolismo (MTS) y (C) célula muerte (liberación LDH) análisis de las células HL-1 cultivados con cECM o gelatina. cECM significativamente reduce la muerte celular y aumenta el metabolismo. Las barras representan la media ± SEM, significación estadística prueba unidireccional ANOVA y Bonferroni. Figura 3B C se han modificado de Kappler et al. 18 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: composición de micropartículas cECM. Después de espectrometría de masas, análisis de la cadena DB representa los componentes clave del cECM, que están principalmente asociados con el espacio extracelular (GO: 0005615; esferas rojas p > 0.05). Las líneas indican las interacciones proteína basan en datos experimentales bioquímicos (púrpuras), de expresión Co datos (negro), sobre las interacciones de la base de datos (azul) y en la expresión (verde). Cadena DB requiere confianza: puntuación > 0.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: procesamiento del cECM a un hidrogel preservar la efectividad biológica. Imágenes de microscopía óptica de contraste de fase muestran la digestión enzimática de la cECM de resultados 48 h en una solución de ECM más homogeneizada; Barra de escala = 500 μm. (A) el ECM solución sigue siendo líquido hasta la temperatura ambiente (B, a la izquierda) y contiene el potencial de uno mismo-montar a un hidrogel cuando se incuban a 37 ° C (B, derecha). Live/dead mancha de cardiacas fibroblastos humanos cultivados con y sin cECM revela una mayor calceína tinción intensidad de células vivas; Barra de escala = 50 μm (C). El cECM hidrogel aumenta la actividad metabólica de las células de HL1 en condiciones isquémicas de la misma manera que las partículas micro (C, panel inferior derecho, modificado de Kappler et al. 18) las barras representan la media ± SEM, significación estadística prueba unidireccional ANOVA y Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Descripción de proteína
receptores 5-hidroxitriptamina 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2
Actinia-como la proteína OS 6B = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
Actina, músculo liso aórtico OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
Albúmina sérica OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2
OS de antitrombina-III = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
Apolipoproteína C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1
Apolipoproteína E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1
En espiral-arrolle proteínas dominio-que contienen 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1
Miembros de familia 11 un dominio lectina tipo C A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
Proteína de canal intracelular cloruro 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
Cadena del colágeno alpha1 alpha-2(I) OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7
Complemento C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2
Cadena del colágeno alpha1 alpha-2(IV) OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4
AMP cíclico sensible elemento-proteína 3-como la proteína obligatoria 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = PE DPT = SV 2 = 2
OS de fibronectina = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4
Glutatión peroxidasa 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2
Alfa de la subunidad de hemoglobina OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
Beta de la subunidad de hemoglobina OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2
Región de cadena C Ig kappa OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1
Lumican OS = Homo sapiens GN = PE LUM = 1 SV = 2
OS Mimecan = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1
Nidogen-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3
Enriquecida con pseudopodium atípico quinasa 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
Factor derivado de epitelio de pigmento OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4
Transportador mitocondrial coenzima A SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = SV 2 = 2
Amiloide sérica P componente OS = Homo sapiens GN = CPA PE = 1 SV = 2
Subunidad de transcripción iniciación factor TFIID 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3
Proteína que contiene el dominio Tudor 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
Cinc proteína matrin tipo dedo 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = SV 2 = 1
101 de la proteína del dedo del cinc OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = SV 2 = 1

Tabla 1: Composición del cECM polvo determinado por espectrometría de masas.

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Discussion

Al preparar el ECM miocardio humano, el objetivo es lograr lo siguiente: retiro de material celular inmunógenos relevante, preservación de la integridad de la ECM y bioactividad, esterilidad, no toxicidad del producto final, compatibilidad de procesos GMP, y idoneidad del producto para una aplicación determinada en términos de manejo. Combinando nuestro protocolo de descelularización de 3 pasos con tratamiento posterior en micropartículas o uno mismo-montaje de hidrogel, material humano de ECM cardiaca se obtiene que posee actividad biológica específica, es fácil de manejar, y tiene el potencial para múltiples aplicaciones en vitro y en vivo, similar a lo que se ha demostrado para los productos de ECM de varias especies de animales11,13,de20,21.

Durante el proceso inicial del tejido miocardio, es importante para rebanadas miocardio sección de idéntico grosor, porque compuesta duración concentración y tratamiento han sido graduado para 300 μm rebanadas. Serán incompleto decellularized rodajas más gruesas y cortes más delgados sufrirá no deseado desglose de componentes de ECM con la pérdida de bioactividad. Esto es particularmente importante en el tratamiento de la SDS, donde la toxicidad puede afectar negativamente propiedades de ECM y análisis celular16. Además, el tratamiento prolongado de SDS puede conducir a la completa ausencia de fibronectina, como se ve en el estudio de Godier-Fournement et al. 22, mientras que se preserva con el método17. Las secciones del cECM son adecuadas para utilizarse en experimentos sin tratamiento posterior (es decir, en los modelos de cultura 3D análisis de diferenciación de la célula o las interacciones célula-ECM, o "ingeniería de tejidos" repoblación celular enfoques). El uso de equipos para la extracción de ADN es muy eficiente, pero potencialmente podría llevar a algunas proteínas residuales de FBS en las secciones de ECM. Esto podría influir en cualquier análisis sensibles de la FBS. La traducción de un protocolo clínico grado GMP debería ser posible con el uso de sueros certificados, sin embargo, una adaptación puede ser necesaria dependiendo de las regulaciones. Esto podría ya sea confirmar la ausencia de residuos FBS en el ECM o una alteración en el Protocolo será necesaria reemplazar los equipos con el tratamiento de DNasa. Por último, ciclos de congelación y descongelación repetida del tejido y de las secciones de ECM deben evitarse para prevenir la degradación de la matriz.

Cuando se produce el hidrogel del cECM, digestión de la pepsina es el paso más crítico en el proceso. En nuestros experimentos iniciales, digestión de la pepsina a pH 1 durante 48 h a 37 ° C condujo a una pérdida de bioactividad, que se podría prevenir mediante la modificación de la incubación a pH 2 durante 48 h a 27 oC. Además, ten en cuenta que el hidrogel se produce del cECM liofilizada suspensión de micropartículas, no de recién decellularized rebanadas mojadas cECM. Además de la manipulación general mejorada de hidrogel en comparación con el cECM rebanadas, el hidrogel tiene la ventaja que se puede diluir para su uso en diferentes concentraciones, por ejemplo en una mayor concentración en combinación con otros materiales o para 3D cultura, o a una concentración menor para el recubrimiento de platos de la cultura de célula o como añadido al medio de cultivo.

Este protocolo se ha establecido como una concesión de grado de laboratorio para la preparación del cECM humano ayudar a rellenar los huecos en Medicina Regenerativa Traslacional que recientemente fueron descritos por Saldin et al. 10 mientras cECM decellularized rebanadas se pueden aplicar como hojas sobre la superficie epicárdica del corazón enfermo, como la recientemente descrita por Sarig et al., con cECM porcino en un modelo de rata de infarto23, transformación en un hidrogel permite mayor diversidad en vivo aplicaciones, tales como la inyección de cECM en miocardio como se muestra por Singelyn et al. 13 , 24 para proceder hacia la actividad traslacional clínica, el protocolo actual tendrá que convertirse en procedimientos GMP-grado. En principio, todos los materiales utilizados también son parte de procesos de producción de dispositivos médicos aprobados/ATMP (es decir, decellularized las válvulas del corazón o los vasos sanguíneos) y no los obstáculos principales son de esperarse. Sin embargo, información sobre la duración de almacenamiento seguro y la ausencia de gérmenes patógenos será necesaria. En última instancia, es necesario una fuente confiable de cantidades más grandes de tejido fresco y estéril corazón de donantes sin enfermedad cardíaca. Corazones de donantes de órganos fallecidos que no son aptos para el trasplante, son el escenario más probable.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki. Pacientes siempre el consentimiento informado para el uso del tejido para fines de investigación, y el proceso de recogida de tejido fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética de Charité - Universitätsmedizin Berlín (EA4/028/12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

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References

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