Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Developmental Biology

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Summary

Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.

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Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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Abstract

Preparações de matriz acelular extracelular são úteis para estudar interações célula-matriz e facilitam aplicações da terapia celular regenerativa. Vários produtos comerciais da matriz extracelular estão disponíveis como hidrogel ou membranas, mas estes não possuem atividade biológica de tecido-específica. Porque decellularization de perfusão geralmente não é possível com o tecido do coração humano, desenvolvemos um processo de decellularization de imersão de 3 passos. Fatias do miocárdio humanas, adquiridas durante a cirurgia são primeiro tratadas com tampão de Lise hiperosmolar livre de detergente, seguida de incubação com o iônico detergente, Dodecil sulfato de sódio, e o processo é concluído, explorando a atividade de DNase intrínseca de soro fetal bovino. Esta técnica resulta em folhas sem célula da matriz extracelular cardíaca com em grande parte preservada composição arquitetura e biopolímero de tecido fibroso, que foram mostrados para fornecer pistas ambientais específicas para populações de células cardíacas e tronco pluripotentes células. Folhas de matriz extracelular cardíaca podem então ser mais transformadas em um pó microparticulado sem mais modificação química, ou, através de digestão de pepsina a curto prazo, em um hidrogel de matriz extracelular cardíaca auto-montagem com conservados Bioatividade.

Introduction

A matriz extracelular (ECM) fornece não somente estrutural apoio mas também é importante para a célula biológica e tecido função1. No coração, o ECM participa na regulação das respostas fisiopatológicas como fibrose, inflamação, angiogênese, função contrátil de casos e viabilidade e destino de células progenitoras residente. Além de seus principais componentes fibrosas glicoproteínas, glicosaminoglicanos e proteoglicanos - contém uma série de fatores de crescimento secretados, citocinas e vesículas membranosas que contém proteínas e ácidos nucleicos2,3.

Recentemente tornou-se claro que preparações de ECM acelulares não são apenas inestimáveis para o estudo de interacções célula-matriz, mas também para potenciais aplicações terapêuticas baseada em célula. A importância de fornecer um ambiente adequado para produtos terapêuticos celular ou tecidos engenharia agora é amplamente reconhecida. Foram feitas tentativas para combinar suspensões celulares ou compostos ativos com hidrogel de biopolymeric definido4,5,6 ou com coquetéis de proteína secretadas pelas células de sarcoma murino (i.e., Matrigel, Geltrex) 7. no entanto, o antigo limitaram bioatividade, estes últimos são problemáticos em processos de qualidade GMP, e ambas faltam a bioatividade de tecido-específica de cardíaca ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization do miocárdio tem sido realizado anteriormente por perfusão do coração toda via a vasculatura coronária14,15. Enquanto isso é possível em animais corações, corações humanos intactas são raramente disponíveis. Portanto, um processo de imersão que permite a manipulação de amostras de tecidos obtidas na sala de cirurgia foi favorecido. Nosso protocolo de "3 passos" contém separado 3 etapas de incubação ou seja Lise, solubilização e remoção de DNA. Que produz o ECM do miocárdio humano com em grande parte preservada da proteína e glicosaminoglicano composição16,17. Essas fatias cECM permitem em vitro estudos de interacções célula-matriz, mas são mal adaptadas para aplicações terapêuticas de potenciais humano-escala. O processo de fabricação estendeu-se então para produzir cECM liofilizado micropartículas ou um hidrogel de cECM18.

Este protocolo permite a decellularization do miocárdio humano obtido de amostras cirúrgicas, preservando os principais componentes da matriz extracelular do miocárdio (ECM) e sua atividade biológica. Este protocolo é recomendado quando ECM cardíaco humano com conserva bioatividade de tecido-específica é necessária para estudos experimentais de interacções célula-matriz, ou quando um ambiente adequado é necessário para abordagens baseadas em células de regeneração miocárdica. Em princípio, também é possível adaptar este protocolo para condições GMP-classe, para que o uso de cECM processado deve ser viáveis aplicações terapêuticas no futuro.

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Protocol

O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque e foi aprovado pela Comissão de Conselho e ética a revisão institucional da Universidade de medicina Charité. Todos os pacientes fornecidos escritos, consentimento informado para o uso de tecido cardíaco para estudos experimentais.

1. preparação do miocárdio humano para seccionamento

  1. Obter o miocárdio ventricular esquerdo (tamanho varia dependendo do tipo de cirurgia) diretamente da sala de operações e transporte em PBS frio em um recipiente estéril.
  2. Remova todo o tecido gordo com um bisturi estéril com uma lâmina n º 10 em condições estéreis.
  3. Corte o miocárdio em cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 cm com um bisturi.
  4. Coloque os cubos em tubos estéreis de 50 mL.
    Nota: Para pausar, executar passo 1.5, caso contrário continue com o passo 2.2. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento para evitar a degradação das proteínas e uma diminuição na qualidade do tecido.
  5. Armazenar os tubos que contém os cubos a-80 ° C. O tecido pode ser armazenado por vários meses.

2. corte dos cubos de miocárdio em fatias

  1. Leve os tubos contendo os cubos preparados fora do congelador.
  2. Transporte em gelo para o criostato.
  3. Definir o objeto e a câmara de temperatura-15 ° c.
    Nota: A temperatura certa é crucial para garantir o corte perfeito.
  4. Relaxa os tubos vazios de 50 mL e selos na câmara ou em gelo seco.
  5. Adicione uma camada (aproximadamente 0,5 - 1,0 mL) de cryosection médio para o carimbo frio e deixá-la congelar até é branca e sólida.
  6. Adicionar uma segunda camada de cryosection médio e coloque um cubo de miocárdio para esta camada.
  7. Certifique-se de meio de cryosection e miocárdio são completamente congelado antes de continuar.
    Nota: Quando o meio da amostra e cryosection não são congelados o seccionamento será prejudicada. Cryosection completamente congelado médio gira de fluídos e transparentes para sólido, branco e não transparente. Os cubos do miocárdio precisam de pelo menos 30 min a 1 h para congelar completamente se continuar imediatamente da etapa 1.4. Quando o tecido é congelado não deve deformar quando tocou/tratado com pinças.
  8. Insira o selo com miocárdio congelado no suporte e aperte os parafusos.
  9. Apare a superfície do tecido até à obtenção de uma superfície de corte mesmo.
  10. Conjunto de corte espessura a 300 µm.
  11. Seção do miocárdio congelado com seccionamento automático. Isto garante a seções de corte uniformes. Aproximadamente 30 a 40 seções podem ser cortadas de um cubo.
  12. Coloque cada fatia após seccionamento frouxamente em um tubo de 50ml pré-resfriada.
    Nota: Não pressione as fatias ou pacote firmemente. Aproximadamente 40 fatias podem caber em um tubo.
  13. Fechar os tubos cheios e colocar no gelo.
    Nota: Para pausar ir sobre com passo 2.14, caso contrário continue com o passo 3.2.
  14. Fatias de miocárdio loja a-80 ° C. As fatias podem ser armazenadas por vários meses.

3. decellularization do miocárdio humano fatias

  1. Pegue o número necessário de tubos de 50 mL contendo seções de miocárdio fora do congelador-80 ° C e transporte no gelo.
  2. Transferi as seções congeladas de todos os tubos de 50 mL do passo 3.1 em um béquer estéril. Aproximadamente 40 fatias são adicionadas para o copo por tubo de 50 mL. O copo deve ser três vezes o volume dos tubos de 50 mL; por exemplo, para decellularization de um tubo de 50 mL, use um copo de 150 mL.
  3. Adicione 50 mL de solução de lise (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7,4 em H2O) pelo tubo de 50 mL com fatias do miocárdio.
  4. Agite as fatias do miocárdio em um béquer estéril em 100-150 rpm continuamente por 2 h à temperatura ambiente.
  5. Coe o líquido com as fatias de tecido através de uma peneira grossa. Transferi as fatias de tecido com uma pinça contundente para um novo copo estéril. Adicione 50 mL de SDS 0,5% em PBS por tubo de 50ml inicial de fatias do miocárdio (por exemplo, usar 100ml SDS solução quando dois tubos de 50 mL de seções do miocárdio estão sendo decellularized).
  6. Agitar continuamente durante 6 h em 100-150 rpm, à temperatura ambiente.
  7. Coe o líquido com as fatias de tecido através de uma peneira grossa. Transferir as fatias de tecido com uma pinça contundente para um novo copo estéril e lavar 3 vezes com 50 mL de PBS por 10 min cada e agitando a 150 rpm. Em seguida, lave a noite em PBS com 1% penicilina/estreptomicina e 1% nistatina (PBS-P/S-N) em 100-150 rpm e 4 ° C, agitando.
    Nota: A lavagem completa é crucial para remover completamente qualquer SDS residual. Os restos de SDS são tóxicos quando o ECM é usado em combinação com células.
  8. Remover a solução de lavagem e adicionar 25 mL pré-aquecido FBS (37 ° C) com 1% penicilina/estreptomicina e 1% nistatina para as decellularized fatias por tubo inicial 50 mL de fatias do miocárdio.
  9. Incubar durante 3 h a 37 ° C. Nesta etapa, qualquer DNA restante é removido da matriz devido a atividade de DNase intrínseca do FBS.
  10. Transfira as fatias para um novo copo estéril e lavar 3 vezes com 50 mL de PBS por 10 min cada e agitando a 150 rpm.
    Nota: As fatias de ECM podem ser armazenadas em PBS-P/S-N em 4 ° C por vários dias. No entanto, recomenda-se proceder de imediato.

4. processamento do cECM Decellularized a pó

  1. Coloque as fatias de ECM frouxamente em uma placa nova de estéril 6. Congelar o ECM a-80 ° C e lyophilize para 2 dias em um liofilizador.
    Nota: mais do que uma fatia pode ser colocada por bem. Disponha as fatias para cobrir completamente a superfície do poço. Sobrepondo as fatias não afeta o sucesso subsequente de pulverização.
  2. Para a pulverização da fatia ECM, uso de moagem específicos tubos contendo grânulos de cerâmica 1,4 mm (ver Tabela de materiais). Encha os tubos frouxamente com ECM liofilizado usando uma pinça estéril de Franco. Para obter melhores resultados, recomenda-se um peso total de ECM entre 10-20 mg.
    Nota: Se o ECM é embalado demasiado firmemente em tubos de moagem o processo de pulverização será negativamente afetado.
  3. Os tubos snap-congelamento em nitrogênio líquido.
    ATENÇÃO: nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa, usar proteção pessoal apropriada.
  4. Inserir os tubos congelados a máquina de trituração e pulverizar o ECM.
    1. Definir a duração de 30 s e um máximo de velocidade e iniciar o dispositivo.
    2. Depois de terminar, retire os tubos e snap-congelar novamente em nitrogênio líquido.
    3. Repeti cinco vezes.
  5. Lave as micropartículas dos tubos, adicionando 1 mL ddH2O pelo tubo e agitar ou vórtice para solubilizing completa. Filtre a solução heterogênea, através de uma malha de 200 µm em um tubo de 50 mL.
  6. Congele o tubo em nitrogênio-80 ° C ou líquido.
  7. Substitua a tampa padrão do tubo com um filtro de 0,22 µm. Esta tampa de filtro impede que o pó fluindo para fora do tubo, mas permite a circulação de ar para evaporação da água.
  8. Inserir os tubos no Liofilizador e lyophilize novamente para remover a água da etapa (etapa 4.5)
    Nota: Liofilização neste passo pode demorar até 3 dias.
  9. Armazenar o pó a-80 ° C até o processamento adicional ou continuar com a etapa 5.1.

5. homogeneização de base enzima de cECM Micropartículas

  1. Pepsina suína em 0,01 M HCl (pH 2,0) a uma concentração de 1 mg/mL, dissolva. Coloque em um agitador rotativo à temperatura ambiente até que é completamente dissolvido.
  2. Dissolva o pó liofilizado de ECM humano (4.8. etapa) da solução de pepsina a uma concentração final de 10 mg/mL. Homogeneizar através de pipetagem. O volume total varia de acordo com a quantidade de solução de ECM necessária. Por exemplo, dissolvem-se 10 mg de pó de ECM em 1 mL de solução de pepsina.
    Nota: Dissolver as partículas pode ser suportado através da utilização do Vortex suave (1.000-1.500 RPM). Restante em pedaços de micropartículas afetará negativamente a digestão.
  3. Transferi a solução para tubos de 2 mL com um volume de 1 mL por tubo.
  4. Coloque os tubos em um agitador de tubo por 48 h a 27 ° C e 1.200 rpm.
  5. Tirar os tubos do agitador e colocar no gelo ou um suporte de tubo pré-refrigerado.
  6. Mistura 1/9 do volume da solução de ECM de frio 10x PBS (pH 7,4) com 1/10 do volume da solução de ECM frio 0,1 M de NaOH em um tubo pré-resfriado e lugar no gelo. Esta mistura irá neutralizar a solução ECM digerida e irreversivelmente inativar a pepsina.
  7. Adicione a solução de ECM para a mistura de neutralização e misture completamente através de pipetagem ou num Vortex.
  8. Defina o ECM para a concentração desejada com 1X PBS (pH 7,4). O pH da solução pode ser verificado com papel de pH.
    Nota: O cálculo de exemplo para 10 mL digerido solução ECM:
    Adicione 10 mL de HCl (pH 2,0) pepsina suína 10 mg.
    Adicione 100 mg ECM em pó para solução de pepsina.
    Nota: O cálculo de exemplo para neutralizar 10 mL digerido solução ECM e definindo a concentração para 8 mg/mL:
    Vol.Final = cIniciar x VolIniciar / cFinal = 10 mg / mL x 10ml / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol.10xPBS = Volcomeçar / 9 = 1/9 da PBS de 10 x 10 mL = 1,11 mL
    VolNaOH = Volcomeçar / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL
    Vol.1xPBS = Vol VolFinal - Volcomeçar -10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL

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Representative Results

O protocolo de 3 passos para decellularization do miocárdio humano aqui apresentados resultados em quase completa remoção de material celular, preservando-se os principais componentes de ECM e a estrutura fibrillar do ECM. Após decellularization, a bruta remoção de células do tecido é evidente pela mudança na cor (figura 1A). A análise histológica com H & E e Masson Trichrome manchas revelou a ausência completa de células intactas residuais (figura 1B). Ensaios quantitativos para componentes individuais do ECM revelaram uma remoção de DNA mais completa e melhor preservação da total colágeno, elastina e glicosaminoglicanos, em comparação com decellularization por SDS sozinho (Figura 2A). Provas funcionais da atividade biológica de cECM é mostrada na Figura 2B. Aqui, o RT-PCR foi usado para quantificar a expressão das proteínas estruturais casos (Myh6, Tnnt2), cedo (Mef2c, Nkx2.5) e final (Gata4) cardiomyogenic fatores de transcrição e genes de marcadores de superfície de células endoteliais (von Willibrand fator (vWF), VE-cadherin) no ESC murino, passando por diferenciação espontânea. Comparado a superfície do prato de cultura não revestidos e o revestimento Matrigel-ECM, é evidente que o contato com cECM drives células-tronco pluripotentes de preferência para um fenótipo de casos semelhantes.

Fatias de ECM liofilizadas podem ser subsequentemente transformadas em micropartículas sem usar reagentes enzimáticos ou químicos. Mecânica de moagem ou pulverização usando kits apropriados autorizados para produção de micropartículas com um tamanho uniforme (Figura 3A). Espectrometria de massa fornece uma visão geral de todas as proteínas reconhecíveis presentes em cECM. Análise de gene ontology concentrando-se em componentes celulares revelou que a maioria das proteínas de ECM na verdade é derivada do espaço extracelular, com alguns resíduos de hemoglobina e um número de proteínas predominantemente intracelulares (Figura 4). Esse padrão pode determinar a função biológica de tecido-específica do cECM, mas esta hipótese precisa de mais investigação. Um resumo da composição da proteína cECM é mostrado no tabela 1. Transformação do ECM em micropartículas preserva sua atividade biológica. HL-1 células expostas a condições simuladas "isquêmico" (privação de hipóxia, glicose e soro) exibido um aumento no metabolismo celular (Figura 3B) e uma diminuição na morte celular quando cultivadas em cECM (Figura 3).

Limitada com base em pepsina digestão do pó cECM, baseado em um protocolo modificado desenvolvido por colágeno purificação19, resulta em uma solução de ECM homogeneizada. Fotos de microscopia de luz de contraste de fase (Figura 5A) demonstram o processo de digestão após 0 h e 48 h. Esta etapa de homogeneização facilita aplicações na medicina regenerativa10. O cECM transformado resultante é mostrada na Figura 5B. Abaixo da temperatura ambiente permanece líquido (Figura 5B, à esquerda), mas a 37 ° C forma um hidrogel auto-montagem com estabilidade adequada para uma sobreposição com suspensões celulares permitindo cultura 3D (imagem representativa, Figura 5B direito, hidrogel em camadas com meio de cultura). Ao vivo/morto coloração de fibroblastos humanos cardíacos também mostra os efeitos benéficos do cultivo em cECM (Figura 5). Ambos cECM micropartículas e hidrogel cECM reforçada a atividade metabólica das células contráteis de HL1 em condições isquêmicas em comparação com células em cultura padrão (Figura 5, painel canto inferior direito).

Figure 1
Figura 1: Decellularization do miocárdio cardíaco humano. (A) análise macroscópica de cECM por microscópio estéreo revela a remoção de material celular com o protocolo de decellularization de 3 passos. Isso é evidente pelo aumento da transparência. (B) histologia coloração de fatias do miocárdio antes e depois decellularization com ele-(à esquerda; Barra de escala = 50 µm) e Masson Trichrome mancha (à direita; Barra de escala = 200 µm) mostra a remoção bem sucedida das células do tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: conteúdo e efeito de fatias cECM. (A) análise quantitativa bioquímica de selecionados componentes de ECM e DNA, comparando o protocolo de decellularization de 3 passos para 0,5% decellularization SDS-sozinho. Dados são expressos em percentagem do conteúdo no miocárdio nativo. Com o protocolo de 3 etapas, o conteúdo de DNA residual era quase zero e significativamente inferiores que após uma incubação de 9 h, com um padrão combinado de 0,5% SDS/lysis buffer combinação e FBS (SDS 9 h + FBS). Respectivos ensaios bioquímicos demonstraram uma preservação quase completa do colágeno, aproximadamente 20% de preservação de glicosaminoglicano conteúdo em relação ao tecido nativo e uma preservação quase 30% do conteúdo de elastina, tudo é significativamente maior do que com o protocolo padrão da SDS referência (barras representam a média ± SEM). (B) a expressão de RNAm de genes selecionados em células-tronco pluripotentes induzidas diferenciando na cECM, em comparação com pratos de cultura não revestido e a superfície revestida Matrigel. cECM dados são normalizados aos obtidos nos materiais respectivo controle (controle = 1, tracejado linha). A maioria dos genes cardíacas significativamente mais altamente é expressos quando cultivadas em cECM (barras representam a média ± SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: aparência e atividade biológica de micropartículas cECM. (A) cECM microparticulado pó após a liofilização. (B) metabolismo (MTS) e células (C) morte (liberação de LDH) análise de HL-1 células cultivadas com cECM ou gelatina. cECM reduz a morte celular e aumenta o metabolismo. Barras representam a média ± SEM, significância estatística, testada por One-Way ANOVA e Bonferroni. Figura 3B -C foram modificados de Kappler et al 18 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: composição de proteína de micropartículas cECM. Na sequência de espectrometria de massa, análise de sequência DB retrata os componentes principais do cECM, que são principalmente associados com o espaço extracelular (GO: 0005615; esferas vermelhas p > 0,05). Linhas indicam interações da proteína baseiam em dados experimentais-bioquímica (roxos), na expressão co dados (pretos), sobre interações de banco de dados (azuis) e expressão co (verde). DB de sequência de caracteres exigido confiança: Pontuação > 0,4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: processamento de cECM para um hidrogel preservar a efetividade biológica. Fotos de microscopia de luz de contraste de fase demonstram essa digestão enzimática do cECM para resultados de 48 h em uma solução de ECM mais homogeneizada; Barra de escala = 500 µm. O ECM (A) solução permanece líquido até a temperatura ambiente (B, esquerda) e contém o potencial de auto-montagem para um hidrogel quando incubadas a 37 ° C (B, direita). Ao vivo/morto mancha de fibroblastos humanos cardíacas cultivadas com e sem cECM revela uma maior calceína coloração intensidade de células vivas; Barra de escala = 50 µm (C). O hidrogel cECM aumenta a atividade metabólica das células de HL1 em condições isquêmicas da mesma maneira como as micro partículas (C, painel inferior direito, modificado de Kappler et al 18) barras representam a média ± SEM, significância estatística, testada por One-Way ANOVA e Bonferroni. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Descrição da proteína
receptor 5-hidroxitriptamina 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2
Proteína actina, como OS de 6B = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
Actina, músculo liso da aorta OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
Albumina de soro OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2
OS de antitrombina III = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
Apolipoproteína C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein E OS Homo sapiens GN de = = APOE PE = 1 SV = 1
Coiled-coil domínio-contendo proteínas 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1
Membro da família 11 do domínio lectina tipo C A ósmio = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
Proteína 1 canal intracelular de cloreto OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
Cadeia de alpha-2(I) de colágeno OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7
Complementam OS C3 = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2
Cadeia de alpha-2(IV) de colágeno OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4
AMP cíclico-responsivo elemento-proteína 3, como proteína 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
OS Dermatopontin = Homo sapiens GN = PE DPT = SV 2 = 2
OS fibronectina = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4
Glutationa peroxidase 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2
Alfa de subunidade de hemoglobina OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
Beta de hemoglobina subunidade OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2
Região de cadeia C Ig kappa OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1
OS Lumican = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2
OS Mimecan = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1
OS Nidogen-1 = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3
Pseudopodium-enriquecido atípica quinase 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
Fator de epitélio derivado do pigmento OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4
Transportador mitocondrial coenzima A SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = SV 2 = 2
Amiloide soro OS P-componente = Homo sapiens GN = APCS PE = 1 SV = 2
Transcrição iniciação TFIID subunit 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3
Tudor domínio-contendo proteínas 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
Proteína de matrin-tipo 4 do dedo do zinco OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = SV 2 = 1
Proteína do dedo 101 zinco OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = SV 2 = 1

Tabela 1: Composição de proteína de pó cECM conforme determinado por espectrometria de massa.

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Discussion

Ao preparar o ECM do miocárdio humano, o objetivo é alcançar o seguinte: remoção de material celular imunogênica relevante, preservação da integridade de ECM e bioatividade, esterilidade, não-toxicidade do produto final, compatibilidade de GMP-processo, e adequação do produto para um determinado aplicativo em termos de manipulação. Combinando nosso protocolo de decellularization de 3 passos com tratamento subsequente em micropartículas ou auto-montagem hidrogel, material de ECM cardíaco humano é obtido que possui actividade biológica específica, é fácil de manusear, e tem o potencial para múltiplas aplicações em vitro e em vivo, semelhante ao que foi mostrado para produtos de ECM de vários animais espécies11,13,20,21.

Durante o processamento inicial do tecido do miocárdio, é importante para fatias miocárdica de seção de espessura idêntica, porque a duração composta de concentração e tratamento têm sido titulado para 300 µm fatias. Fatias mais grossas será incompleta decellularized e mais finas fatias sofrerá avaria indesejada dos componentes de ECM com perda de Bioatividade. Isto é particularmente importante no que diz respeito ao tratamento de SDS, onde toxicidade pode afetar negativamente a propriedades de ECM e análises celular16. Além disso, o tratamento prolongado de SDS pode levar a completa ausência de fibronectina, como visto no estudo por Godier-Fournement et al . 22, enquanto está preservado com nosso método17. As seções de cECM são adequadas para uso em experimentos sem processamento adicional (i.e., em modelos 3D cultura analisando a diferenciação celular ou interações célula-ECM, ou de "engenharia de tecidos" abordagens de repovoamento celular). O uso de FBS para remoção de DNA é altamente eficiente, mas pode potencialmente levar a algumas proteínas FBS residuais nas seções de ECM. Isto poderia influenciar qualquer ensaios sensíveis FBS. A tradução de um protocolo clínico da classe GMP deve ser possível com o uso do certificado sera, no entanto, uma adaptação pode ser necessária dependendo de regulamentos. Isso também poderia ser confirmando a ausência de resíduos FBS em ECM ou uma alteração ao protocolo, será necessária substituir o FBS com tratamento de DNase. Por último, ciclos repetidos de congelamento-descongelamento do tecido e seções de ECM devem ser evitados para prevenir a degradação da matriz.

Ao produzir o hidrogel cECM, digestão de pepsina é o passo mais crítico no processo. Em nossos experimentos iniciais, digestão de pepsina em pH 1 para 48 h a 37 ° C levou a uma perda de bioatividade, que poderia ser evitada, modificando a incubação a pH 2 por 48 h a 27 oC. Além disso, tenha em mente que o hidrogel é produzido a partir de suspensão de micropartículas cECM liofilizado, não de fatias cECM molhado recém decellularized. Além da melhor movimentação geral do hidrogel em comparação com cECM fatias, o hidrogel tem a vantagem que ele pode ser diluído para uso em diferentes concentrações, por exemplo, em uma concentração mais elevada em combinação com outros materiais ou para 3D cultura, ou em uma concentração mais baixa para o revestimento de pratos de cultura celular ou como aditivo para meio de cultura.

Este protocolo foi estabelecido como um laboratório-classe SOP para preparação de cECM humana ajudar a preencher as lacunas na medicina regenerativa translacional que recentemente foram descritas por Saldin et al 10 enquanto cECM decellularized fatias podem ser aplicadas como folhas na superfície Epicárdica do coração doente, como recentemente descrita por Sarig et al, com cECM dos suínos em um modelo do rato do miocárdio23, transformação em um hidrogel permite mais diversificada na vivo aplicações, tais como a injeção de cECM no miocárdio como mostrado por Singelyn et al 13 , 24 para prosseguir em direção a atividades clínicas de translação, o atual protocolo terá de ser convertido em procedimentos de GMP-grau. Em princípio, todos os materiais utilizados também fazem parte dos processos de produção aprovado dispositivo médico/ATMP (i.e., decellularized válvulas cardíacas ou vasos sanguíneos) e sem grandes obstáculos são esperadas. No entanto, a informação sobre a duração de armazenamento seguro e a ausência de patógenos certamente serão necessária. Em última análise, uma fonte confiável de maiores quantidades de tecido do coração fresco e estéril de doadores sem doença cardíaca é necessária. Eis o cenário mais provável, corações de doadores de órgãos falecido que não sejam adequados para transplante.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque. Pacientes fornecido o consentimento informado para o uso do tecido para fins de investigação, e o processo de coleta de tecido foi aprovado pelo Comitê de ética da Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) e Conselho de revisão institucional.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

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References

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