속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

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Summary

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

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Pidatala, V. R., Mahboubi, A., Mortimer, J. C. Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE. J. Vis. Exp. (128), e56424, doi:10.3791/56424 (2017).

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Abstract

식물 세포 벽 다 당 류는 악명 높게 분석 어렵다 고 대부분 방법을 사용 하려면 고가의 장비, 숙련 된 운영자 및 순화 된 물자의 다량. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 방법을 확보에 대 한 상세한 구조상이 성체의 해상도 포함 하 여 다 당 류 구조 정보. 다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도)에 따라 분석, 식물 세포 벽 재료 glycosyl hydrolases 특정 관심 (mannan에 대 한예를 들어, mannanases)의 다 당 류로 분해 이다. 대형 polyacrylamide 젤 다음 붙일 분류 되었습니다 릴리스 oligosaccharides 분리 하는 데 사용 됩니다. 이미징 시스템 수정 젤 젤을 구상 될 수 있다 ( 재료의 표참조). 결과 처리한후 지문도 비교할 수 있습니다 질적으로 하거나, 복제, 양적. 연계 및 분기 정보 추가 glycosyl hydrolases (예를 들어, mannosidases 및 galactosidases)를 사용 하 여 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 만점 구조를 분석 하는 방법에 설명 합니다, 하는 동안 어떤 다 당 류는 특징이 glycosyl hydrolases 존재에 적용할 수 있습니다. 또는, 그것은 소설 glycosyl hydrolases 사용 하 여 정의 된 다 당 류 기판의 특성을 사용할 수 있습니다.

Introduction

젤 전기 이동 법 (속도)에 의해 다 당 류 분석 류1,2,3의 상세한 특성에 대 한 방법입니다. 식물 세포 벽 다 당 류는 악명 높게 분석 어렵다 고 대부분 방법을 사용 하려면 고가의 장비, 숙련 된 운영자 및 순화 된 물자의 다량. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 방법을 확보에 대 한 상세한 구조상이 성체의 해상도 포함 하 여 다 당 류 구조 정보.

이해 식물 세포 벽 다 당 류 구조는 식물 세포 벽 생 합성 또는 식물 개발에서 식물 세포 벽의 역할을 탐구 하는 그 연구원은 필요 합니다. 그러나 최근에,, 식물 세포 벽 구성이 되었다 바이오 연료와 바이오4를 생산 하는 원료로 식물 바이오 매스 (기본적으로 세포 벽)를 사용 하 여 포커스로 인해 연구자의 넓은 그룹에 흥미로운. 예를 들어,이 자료의 효율적인 효소 젖 필요 다 당 류 구조의 상세한 이해 최적화 된 효소 칵테일 선택된5될 수 있도록 합니다.

속도 빠른 복잡 한 glycan 구조 분석에 적합 하 게 하는 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 그것은 다 당 류 문제의 솔루션 상태 핵 자기 공명 (NMR)6에 대 한 필요의 정화를 요구 하지 않습니다. 둘째, 속도 질량 분석 달리 구조이 성체를 해결할 수 있습니다 (MS, 예를 들어, 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI) 및 분무 이온화 (ESI)),이 또한도 전하실 수 있습니다 액체 크로마토그래피 (LC) 에 의해 수행 하 7. 셋째, 속도 낮은 picomole 해상도, 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 또는 종이 크로마토그래피와 달리 매우 민감한. 마지막으로, 그것은 필요 하지 않습니다 비싼 장비 또는 전문 지식, MS, NMR, 및 LC에 대 한 경우입니다.

속도 방법의 다 당 류 혼합물에서 특정 glycosidic 연계 대상 glycosyl 가수분해 효소 (GH) 효소의 특이성에 의존 합니다. GH 효소 다 당 류 사슬에 행위 때 수 다음 수 화학적으로 derivatized,이 경우에 형광 성 상표로 줄이는 끝을 보여준다. 따라서이 샘플의 unhydrolyzed 부분이이 방법으로 탐지 렌더링 됩니다. 레이블이 oligosaccharides 다음 전기 이동 법으로 대형 아크릴 아 미드 젤에서 분리 된다. 이 매우 유사한 분자의 뛰어난 해상도 제공, 예를 들어 Glc-남자-남자와 Glc-남자-Glc trisaccharides 다른 Rf해야한다.

페이스 애기6,,910,11 glycosyltransferase 돌연변이 식별 하기 위해 식물 종8년에 걸쳐 다른 xylan 구조 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. , glycosyltransferase 분석 실험9, 수행 하 고 소설 GH 활동12,13하. 우리는 또한 최근 효 모 세포 벽 mannan (Mahboubi와 모 티 머, 준비에서) 하 그것을 이용 했다. 여기 우리는 식물 세포 벽 만점 구조, 이전 보고서11,14에 따라 특성화 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

1. 식물 재료의 수확

  1. 신선한 식물 소재 (~ 20 밀리 그램)을 수확 즉시 96% (v/v) 에탄올에 잠수함 및 30 분 동안 70 ° C에서 품 어;이 비활성화 모든 세포 벽 타락 효소 존재. 건조 소재, 2 단계부터 시작.
    주의: 에탄올은 인화성.
    참고: 단일 줄기 또는 근 엽 잎 분석에 대 한 충분 한 자료를 제공할 것입니다. 그러나, 적은 오류 조직의 큰 금액 풀링된 이며 이것은 쉽게 밖으로 무게를 처리 분석 하는 경우 발생할.
  2. 신중 하 게 조직의 종류를 기록 하 고 발달 단계, 다 당 류 구조 변화 한다 둘 다. 예를 들어 애기 thaliana (사용된 여기)와 함께 Boyes 에서 방법 조직 단계 15
    참고:이 프로토콜에서 우리가 사용한 화 서 줄기의 아래쪽 첫 번째 silique 하지 yellowing 하지만 길쭉한 완전히.

2. 준비의 알코올 불용 성 잔류물 (공기)

  1. 준비 공기, 모 티 머 의 방법을 9 또는 녹는 설탕, 자당, 전 분 등 부족 한 분말을 생성 하기 위해 다른 유사한 방법.

3. Aliquoting 및 전처리의 공기

참고: 각 샘플 자료에 대 한 관심의 다 당 류 및 oligosaccharides 발표의 평균 크기 (b)의 (a)는 풍부에 따라 달라 집니다에 필요한 공기의 정확한 양을 Gh입니다. 메서드는 oligosaccharides 수 실험의 감도 결정 하는 그래서 각 처리한후 줄이는 끝에 단 하나 형광 성 분자를 추가 합니다. 으로 GH5/GH26 (설명) 하는 대로로 소화 하는 애기 줄기에 만점 500 µ g는 것이 좋습니다 11, 반면 xylan GH11로 소화 하는 애기 줄기에, 100 µ g는 것이 좋습니다 모 티 머와 같이 ' s 연구 3.

  1. 15 mL 원심 분리기 튜브에 공기 (10-15 mg)를 무게 및 H 2 O 2 mg/mL의 최종 농도에 추가. 소용돌이 현 탁 액을 달성 하기 위해입니다. 이 문제가 있는 경우, 다음이 프로세스를 지원 하기 위해 유리 균질 화기를 사용.
  2. Aliquot 500 µ g microfuge에 튜브입니다. Aliquots 진공 원심 분리기를 사용 하 여 건조 (재료의 표 참조) 하룻밤에 30 ° c.
  3. 사전 치료 공기 1 M NaOH (20 µ L); 실 온에서 1 h이 드 acetylates는 다 당 류와 셀 룰 로스 microfibrils, 바이오 매스 구조 방해와 GH 접근 부.
    참고:이 단계 정제 류 위해 생략 수 있습니다. 주의 – 강한 산 또는 기초.
    1. 아니 효소 공기 제어에 대 한 약 수 포함 (단계 4.1 제외 하 고 모든 샘플 취급. 제외).
  4. 추가 200 µ L H 2 O 및 20의 µ L 1 M HCl를 중화. 테스트는 pH는 1 µ L을 제거 하 고 종이 pH 지시자 지구에 안보 여 ~ 6-7.
  5. 추가 50 µ L 1m 암모늄 아세테이트 버퍼, pH 6.0 (또는 중 pH는 연구에 사용 된 GHs에 적합) 및 H 2 O 500 µ L의 총 볼륨 주고.
    참고: 암모늄 아세테이트 그리고 추가 소금 샘플을 추가 하지 않습니다 그것은 건조, 따라 sublimes 이후 사용 됩니다. 소금의 과잉 속도 젤에 가난한 밴드 모양 및 해상도를 발생할 수 있습니다.

4. Glycosyl Hydrolases (GHs)와 공기의 가수분해

참고:는 GHs의 순수성은 중요 한 토론에 설명 했 듯이. Heterologously 표현 사용, 선호도 효소 정화. 제조 업체에서 많은 각을 접수 한 후, 하룻밤 GH의 수량 증가 함께 기판 (예를 들어, 500 µ g 공기)의 정의 된 aliquots은 (예를 들어, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ L) (3 단위 / µ L). GH의 과잉이 있을 때, 속도 지문 동일 보일 것 이다. 효소의 과잉은 해야 하기 때문에 그것 특정 가수분해 반응 끝점 다가오고 재현 가능한 결과 제공 하는 데 필요한.

  1. 추가 단계 3.5에서에서 버퍼에 공기 aliquots mannanases (GH5 및 GH26 11) 긍정의 미리 정해진된 금액 (위 참조) 컨트롤 (곤 약 만점의 30 µ g), 그리고 아니오 공기 부정적인 컨트롤 (효소 혼합에는 빈 관)입니다. 소용돌이, 그리고 튜브의 하단에 반응 혼합물을 수집 하는 짧게 다음 스핀.
  2. 부드러운 동요 (~ 100 rpm)와 함께 37 ° C (또는 선택의 GH에 대 한 적절 한 온도)에서 밤새 품 어.
  3. 20 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 반응을 중지
    참고: 모자 폐쇄 플립-가기 microfuge 관을 밀봉 하기 위하여 사용할 수 있습니다.
    1. 10 분, 최대 속도 벤치 가기 microfuge를 사용 하 여 원심과 상쾌한 유지.
  4. 250 µ L H 2 O, 원심 분리기, 위와 같이 펠 릿을 resuspend 하 고 상쾌한을 유지.
  5. 두 supernatants 결합 하 고 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 3 h 또는 난방 없이 하룻밤).

5. 올리고 당 표준의 준비

H 2 O만 노 오 스 (남자), mannobiose (남자 2), mannotriose (맨 3), mannotetraose (남자 4), mannopentaose (남자 5)의
  1. 준비 1 m m 재고 솔루션 및 mannohexaose (남자 6), 모든 β, 1-4 연결. 약 수와-20 ° c까지 필요한 저장소.
  2. 1 µ L s (표준 1) 2 µ L (S2)를 결합 하 여 남자의 3 다른 농도 1-6 혼합 준비 또는 5 µ L (S3)의 모든 6.
  3. 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 1 h).

6. Derivitization의 Oligosaccharides

  1. 준비 H 2 O에서에서 0.2 M 개미 (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic 산)의 재고 솔루션: 초 산 17:3. 고체를 완전히 분해를 60 ° C에 따뜻한 주식. 2-3 개월에 대 한 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장소.
  2. 는 DMSO에 2 삐 borane (2-PB)의 0.2 M 재고 솔루션을 준비합니다. 이것은 매우 검 습기 이다, 그래서 즉시 DMSO에 접수 한 후 모든 분말을 resuspend. 약 수, 그리고 1-2 년 동안-20 ° C에서 저장소. 필수 (2 주, 및 다음 삭제를 위한 4 ° C에서 저장소)로 aliquots를 녹여.
  3. H 2 O의 derivatization 버퍼 준비: DMSO 산: 아세트산 17: 3시 20분.
  4. 각 샘플, 개미, derivatization 버퍼의 2 PB 및 10 µ L의 5 µ L의 5 µ L을 추가. 짧게는 튜브의 하단에 수집 하는 회전 소용돌이 철저 하 게, 다음 짧게 다시 스핀. 그림 1 반응 설명을 참조 하십시오.
  5. 품 샘플 빛 으로부터 보호 37 ° C에서 하룻밤.
  6. 진공 원심 분리기에서 건조 (재료의 표 참조) 30 ° c (~ 2 h).
  7. Resuspend 샘플 및 100 µ L 3 M 요소에 표준. 필요할 때까지 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장소.

7. 속도의 준비 젤

참고: 젤 주조 장비의 조립 브랜드에 따라 달라 집니다. 여기, 우리 use 수직 전기 시스템 (재료의 표 참조)를 갖춘 18 cm x 24 cm 유리 접시와 1.5 m m 스페이서.

  1. 조립 제조 업체 당 젤 주조 장비 ' s 지침.
  2. 확인 10 배 속도 버퍼 (1 M Tris-붕 산 염, pH 8.2) 다음과 같이: 트리 스 베이스의 121.14 g H 2 O, 그리고 해산 믹스의 ~ 400 mL에 추가. 단단한 붕 (약 60 g)의 추가 의해 8.2에 pH를 조정 하 고 다음 1 볼륨 L.
  3. 10% (w/v) 염화 persulfate (AP) 주식 H 2 o. 약 수와 한 번-20 ° c. 해 동 aliquots에서 저장, 4 ° C에서 저장 만들고 2 주 후 삭제.
  4. 만들고 해결 젤을 붓는 다. 위의 장비에 대 한 1 젤 50 mL에 동일시 한다. 50 mL 원심 분리기 튜브, H 2 O (20.2 mL), 5ml 10 배 속도 버퍼, 24.6 mL 40% 아크릴 아 미드/비스-아크릴 (29: 1 acrylamide:Bis) 혼합. (주의: 독성).
    1. APS의 200 µ L과 N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) 20 µ L 추가. (소개 하는 기포 방지)을 섞어 부드럽게 반전. 사용 하는 혈 청 학적인 젤 또는 다른 대용량 피 펫, ~ 4 cm 유리 접시의 맨 아래에 부 어. 공기 방울 젤에 갇혀 지 고의 가능성에 주목. 만약 그들이 할 따르고, 멈추고 틸트/탭 해제 하 젤.
  5. 소 프로 파 놀 (주의: : 가연성) 또는, 신중 하 게, H 2 유해 (20-30 분), 다음 상위 레이어 부 O. 허용 젤 젤 오버레이. 소 프로 파 놀, 사용 하는 경우 다음 씻어 H 2 o. 드라이 2 배 압 지를 사용 하 여 모든 초과 액체.
  6. 만들고 겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 다. 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 배 속도 버퍼, 2.8 mL 아크릴 아 미드/비스-아크릴 믹스 (주의: 독성), 80 µ L APS와 15ml 원심 관에 TEMED의 8 µ L. 생산 해결 젤 위에 오버레이 및 혼합, 반전. 부드럽게 빗, 빗 이빨에서 트랩 공기 방울을 피하 삽입.
  7. 허용 젤 (20-30 분), 유해 촉촉한 조직 그리고, 플라스틱 포장에서 포장 하 고 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 합니다. 매장 장소에 빗.
    참고: 젤 속도 저장 될 수 있다 최대 2 주 동안 (비록 1 주 미만 이상적 이다), 그들은 습 한 유지 하는 경우.

8. 실행 속도 젤

  1. 영구 마커를 사용 하 여 로드 순서를의 추적을 유지에 도움이 될 것입니다, 유리에 잘 위치를 그리고 어디 식별 우물 빗 제거 되 면.
  2. 빗을 제거합니다. 1 x 속도 버퍼에 채울 우물.
  3. 10 µ L microsyringe를 사용 하 여 우물에 표준 및 샘플 2 µ L을 로드. 샘플을 제대로 실행 하는 경향이 가장 바깥쪽 차선을 사용 하지 마십시오.
  4. 젤 실행 기구의 상단 챔버를 조립 하 고 1 x 속도로 버퍼를 포함 하는 냉각된 (~ 10 ° C) 실행 탱크 (10 ° C)에서 젤 장소. 1 x 속도 버퍼에 채워 상단 챔버.
  5. 설정 능력과 실행 200 V 젤 (상수 V) 30 분, 그리고 1000 V 증가 전압에 대 한 1 시간 40 분. 빛 (예를 들어, 검은 쓰레기 봉투에 탱크를 배치 하 여)에서 젤을 보호.
    참고: 1000 V 전압을 증가 후 전압, 설정 하 고 다른 5 분 후 젤 ~ 5 분에 확인 하십시오. 파워 팩 버퍼 누출 가능성이 다음 전압을 유지할 수 없는 경우에. 탱크에서 젤을 제거 합니다. 상부 챔버, 모든 가스 켓의 배치를 신중 하 게 검사를 재조 립. 유리 접시의 위쪽 가장자리에 큰 칩 개 스와 함께 좋은 물개를 형성 하는 접시를 방지할 수 있습니다. 이 일반적으로 일시적으로 해결 될 상단 챔버를 추가 하기 전에 유리의 부서진된 부분에 5% (w/v) 녹은 agarose의 한 방울을 추가 하 여.

9. 페이스 젤 시각화

참고: 이미징 시스템 긴 웨이브 UV 전구는 transilluminator에 fluorophore, 여기 530 nm에 대 한 적합 한 카메라에 대 한 배출 필터를 장착 하는 젤을 사용 하 여. 또한, 레이저 스캐너도 사용할 수 있습니다, Goubet 2에서 설명한 대로.

  1. 이미징 시스템 젤 촉촉한 보풀 티슈로 닦아 먼지 무료입니다 보장.
  2. 속도 탱크에서 젤을 제거 하 고 젤은 유리 접시에 아직도 하는 동안 간단히 볼 (< 80 ms) 젤에 아직도 염료 앞 인지 확인 하려면.
  3. 젤 쐐기 도구를 사용 하 여 열고 젤 한 유리 접시에 아직도 하는 동안 피자 커터를 사용 하 여 모두 겹쳐 쌓이는 젤을 제거 하 고 염료 전면 젤, 젤의 하단에 남아 있으면.
  4. 는 Transilluminator의 표면에 ~ 5 mL H 2 O 넣은 다음은 transilluminator에 직접 젤을 전송 합니다. UV 605에 필터를 설정 하 고 장파 UV transilluminator 설정 (재료의 표 참조) 소프트웨어를 사용 하 여.
    참고: 여기에 사용 되는 개미 fluorophore는 흥분/353/520의 방출 nm.
  5. 다양 한 노출 시간에 여러 이미지를 (예를 들어, 10 100 ms s). UV 빛 형광 저하를 피하기 위해 UV 빛 단추 (해제)를 클릭 하 여 이미지 사이 해제 되어 있는지 확인 합니다. 이미지의 적어도 2는 없는 포화 밴드 (이미징 소프트웨어 젤이 표시 됩니다) 확인 하십시오.
  6. 높은 resolution.tif 이미지 파일을 저장 하는
  7. .
    참고: 이미지를 분석할 수 있습니다 이미징 시스템, 젤 또는 ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 등 자유롭게 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여. 정량에 대 한 논의 결과 섹션을 참조 하십시오.

Representative Results

여기, 우리가 보여 데이터 해석 및 문제 해결 지원에 대해 설명 프로토콜 당 실행 예제 속도 젤 그리고 이것은 일반적인 가이드 젤 해석13,16속도 성공적인 옵니다. 대표적인 젤 표준 속도의 세포 벽 mannan 콘텐츠 분석 결과 그림 2, 그리고 설명 차선으로 차선.

표준
차선 1, 2, 3 5 (S1), 10 (S2), 50 (S3) pmol 농도에 상업적으로 구입한 oligosaccharides (남자1-남자6)의 사다리를 보여줍니다. 새로운 상업 처리한후 많은 받을 때 그것은 젤에 순도 확인 하는 것이 중요입니다. 많은 oligosaccharides, 특히 tetrasacccharides 하 고, 수 중 합 (DPs), 다른도의 oligosaccharides와 중요 한 오염 같이 남자6 (으로 표시 된 *). 젤 quantitating, 하는 동안 때문에 표준 곡선을 계산 하는 것이 필요 하다는 표준의 적어도 3 농도 중요 하다. 표준 곡선의 계산 derivatization 반응 본질적으로 완료에 보장 도움이 수 있습니다. 알려진된 농도의 표준 젤, 사이 비교 되며 분리 품질 및 derivatization 품질에 대 한 유용한 제어.

긍정적인 통제
레인 4 곤 약 만점의 mannanase 소화를 보여준다. 곤 약 만점 상업적으로 사용할 수 있으며 그것은 것과 같은 구조를가지고 있지 않다면, 하는 동안 예를 들어 있는 애기, 역할 두 가지 목적. 첫째, 그것은 소화 효소에 대 한 중요 한 컨트롤입니다. 연구원은 선택의 그들의 GHs와 소화 상업 기판 모습 때 소화 완료 (즉, GH의 광대 한 과잉 반응에 추가 됩니다) 설정 해야 합니다. 미래에 실험 패턴 변경,이 활동의 손실 또는 GH의 오염을 나타낼 수 있습니다. 둘째, 그것은 derivatization 반응 효소 및 버퍼 소금의 존재에 대 한 컨트롤 역할을 합니다. 표준 보기 좋은, 하지만 긍정적인 통제는 가난,이 가수분해 반응의 구성 요소는 derivatization에 금지는 나타낼 수 있습니다.

야생 타입 (WT) 애기 줄기 공기 + mannanase 칵테일 (GH5 + GH26)
레인 5 WT 애기 줄기 (참조11,14와 비교)의 속도 지문을 보여줍니다.

csla9 애기 줄기 공기 + mannanase 칵테일 (GH5 + GH26)
레인 6 쇼는 애기에서 줄기의 속도 지문 주요 부족 식물 줄기 mannan synthase11보여줍니다. 지문을 WT 및 부정적인 제어를 비교 합니다. mannan의 대부분은 결 석 하는 동안이 공장에서 소량 남아, 모든 mannanase 파생 oligosaccharides이 추가 mannan synthases (CSLA2, 3)에 의해 합성에 대 한 감소 밴드 농도 의해 입증으로11.

부정적인 통제-효소만
레인 8 하지 않은 젤에 밴드를 보여줍니다 칵테일, mannanase에서 오염 물질에서 파생 되는 분석에서 제외 해야 하는 특정 (으로 표시 된 *).

부정적인 통제-WT 공기만
레인 9 특정 되지 않으며 분석에서 제외 해야 하는 젤에 밴드를 보여준다 (표시 *).

네거티브 제어- csla9 공기만
레인 10 특정 되지 않으며 분석에서 제외 해야 하는 젤에 밴드를 보여줍니다 (으로 표시 된 *).

소나무 나무 공기 + mannanase 칵테일 (GH5 + GH26)
레인 7 galactoglucomannan를 포함 하는 소나무의 속도 지문을 보여줍니다. 이것은 명확 하 게 그것의 다른 구조 때문에 애기, 출시 oligosaccharides의 다른 패턴은 있다.

부정적인 통제-파인에 어만
레인 11 특정 되지 않으며 분석에서 제외 해야 하는 젤에 밴드를 보여줍니다 (으로 표시 된 *).

해석 속도 젤은 비교적 간단 하지만 다음 사항에 대 한 인식을 요구 한다. 강력한 데이터를 수행 하기 위해 적어도 3 독립적으로 생물학 성장 속도 복제, 그리고 각 생물 복제에 적어도 2 기술 복제를 수행 하는 것이 좋습니다 하는 것이 좋습니다. 컨트롤 설명가 해석, 일반적인 밴드 제외 해야 합니다. 효과 transilluminator에 의해 고르지 조명에서 결과 제외 하려면 복제 젤에 다른 순서로 샘플 로드 것이 좋습니다. 정확한 해석 포화 되지 밴드의 분석을 요구 한다. 이후 일부 처리한후 지문을 모두 매우 높고 낮은 풍부한 다 당 류를 포함 될 수 있습니다, 같은 젤의 다중 노출 분석 하는 것이 좋습니다. 표준 다른 이미지 사이 정상화를 사용할 수 있습니다.

일부 유형의 실험에 대 한 공기 준비에서 다 당 류의 양을 계량 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다. 페이스 젤에서 계량 하는 것이 가능 하다, 하는 동안 각 처리한후는 GHs에 의해 발표의 정확한 분자 id의 지식 그리고 속도 젤에 위치. 이것은 현재 완전히 알려져 있지 mannan, 하지만 그것은 다른 다 당 류 예: xylan3에 대 한 결정 되었습니다. 표준 정량 수행 하지 경우에 그리고 어떤 질적 또는 반 정량 분석에 도움이 될 것입니다 그래서 젤, 사이 정상화의 방법의 제공지 않습니다.

개별 oligosaccharides의 구조 식별 얻을 수 있는 칵테일을 사용 하 여 GHs 순차의 추가 GHs의 추가 연계 및 출시 oligosaccharides (예를 들어, 추가 β-1, 4-의 대체에 대 한 정보를 계시 할 수 있다 감소 비 끝에 glucosidase 발표할 예정 이다 혼합물에서 어떤 oligosaccharides 기능 포함). 사용할 수 있는 효소는 galactosidases, glucuronidases 및 glucosidases (자세한 내용은 CAZy 데이터베이스16 참조); Hogg, D. 그 외 참조 예를 들어 17 .

위의 프로토콜은 알 수 없는 GHs의 활동 특성을 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 정의 된 바이오 매스, 애기 줄기 또는 곤 약 만점 등 알 수 없는 GHs13화면 사용 되어야 한다.

Figure 1
그림 1 :이 개미와 oligosaccharides의 형광 derivatization에 대 한 계획을 보여 줍니다. Goubet2에서 수정.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 소나무, 애기, 애기 돌연변이에서 mannan 지문 보여주는 대표적인 페이스 젤 (csla9)는 mannan 생 합성 장애는. AlR 칵테일, mannanase로 분해 했다 고 발표 oligosaccharides는 fluorophore와 derivatized 했다. oligosaccharides 크기, 모양, 충전 단위의 젤 전기 이동 법으로 분리 되었다. 마 노-oligosaccharides (Man1-6)의 사다리 출시 oligosaccharides의 상대 mobilities 식별을 지원 하기 위해 표시 되 고 순화 mannan (곤 약에서 파생 된)의 가수분해는 긍정적인 컨트롤로 표시 됩니다. * 일반적인 밴드 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

속도 다 당 류 구조를 특성화에 대 한 간단한 방법입니다. 그것은 적용 될 수 있는 어떤의 다 당 류는 알려진 GHs 특징이 활동,에 문학1,6,,911에서 수많은 예제를 참조 하십시오. Tt 또한 소설 GHs12,,1318 및 glycosyltransferases9의 특성에 적용 된 정의 된 다 당 류 기판 및 수락자의 사용 하 여.

재현성, 해석할 결과 세 가지 주요 단계에 따라 다릅니다. 첫째, 사용 하는 GHs 활동을 오염에서 무료로 해야 합니다. 이것은 가장 선호도 효소 정화만 heterologously 표현 사용 하 여 달성. 둘째, 대부분의 실험에 대 한 완료 된 기판의 효소 가수분해는 중요 하다. 이렇게 하면 동일한 GH와 분해 같은 바이오 매스 모든 실험에서 동일한 지문 제공. 마지막으로, derivatization 반응에 fluorophore의 초과 해야 합니다. 이렇게 하면 100% 사용 가능한 줄이는 끝에 표시 됩니다. 이 높은 재현성 결과 양적 데이터의 발생 합니다.

젤과 시 약 품질 데이터를 재현할 수 있도록 중요 하다. 특히 잘못 된 pH의 품질이 버퍼, 젤, 거품 공기와 소금의 초과 샘플 수는 oligosaccharides의 모든 영향을 해상도 고정 요소. 그러나, 프로토콜결과 섹션에 설명 된 권장된 컨트롤의 포함 문제 해결 수 있게 된다.

속도는 oligosaccharides 식별 하는 능력에 의해 제한 됩니다. 몇 가지 실험에 대 한 간단한 지문이 다 필요한 것입니다. 그러나, 진정으로 quantitate 만점 공기 샘플에서의 양을, 예를 들어 모든 릴리스된 oligosaccharides id를 필요 시간이 걸리는 과정입니다. 이것은 더 복잡 한 류 xylan3등 덜 간단입니다. 때문에 상업적으로 사용할 수 있는 몇 가지 올리고 당 기준이 있다, 그것은 않을 수 있습니다 항상 가능한 또는 모든 밴드를 식별 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 속도 질량 분석 (즉, MALDI CID9 또는 ESI 석사7및 NMR6)를 매우 무료 데이터를 제공할 수 있습니다. 이러한 방법에 대 한 그것은 종종 대규모 준비, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리 고 다음 MS 나 NMR 이전 두 걸음에 의해 각 분수를 분석 하는 데 도움이. 그것은 알려졌다 밴드 excised 되 고 MALDI CID로 식별 될 수 있다, 하는 동안 실제로 우리가 나타났습니다 이것은 (아마도 때문에 아크릴 아 미드 젤 UV 빛에 드러낼 때 레이블이 oligosaccharides의 상호 작용) 성공의 낮은 비율.

속도의 다른 주요 한계 처리량입니다. 좋은 품질, 적절 한 컨트롤과 해석할 젤을가지고 각 젤 것입니다만 ~ 10 실험 샘플, 있고 연구원 하루 ~ 4 속도 젤 실행을 기대할 수 있습니다. 최근, 모 세관 전기 이동 법 (세 륨)를 사용 하 여 속도 버전 개발된19, 96 잘 접시에 샘플의 준비를 허용 되었습니다. 그것은 사용 되었습니다 성공적으로 glycosyltransferase 효소 활동 및 다 당 류 구조6,19, 성격 그것 구입 하 고 유지 하는 비용이 될 수 있는 CE 컴퓨터에 액세스 해야 하지만.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

속도 방법 개발 및 년간, 듀 프리 그룹 (캠브리지 대학, 영국)의 다양 한 멤버에 의해 최적화 그리고 그들의 모든 기여 부탁 드립니다. 이 작품 드-AC02-05CH11231 로렌스 사이 계약을 통해 미국 에너지 부, 과학, 생물의 사무실 및 환경 연구, 지원 DOE 공동 BioEnergy 연구소 (http://www.jbei.org)의 일환으로 투자 되었다 버클리 국립 연구소와 미국 에너지 부 우리는 또한 감사 Thea 선택 및 비 Ngo csla9 샘플을 준비 하 고는 방법에 대 한.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligosaccaharide Standards
Mannose Sigma-Aldrich CAS 3458-28-4
Mannobiose Megazyme CAS: 14417-51-7
Mannotriose Megazyme CAS: 28173-52-6
Mannotetraose Megazyme CAS: 51327-76-5
Mannopentaose Megazyme CAS: 70281-35-5
Mannhexaose Megazyme CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) Megazyme P-GLCML
Name Company Catalog Number Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (Molecular probes) Thermo A350
2-picoline borane TCI B3018
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) Bio-rad 1610146
Name Company Catalog Number Comments
Specialty Equipment
Gel casting kit Hoefer SE660 kit 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers
Cooling recirculating water bath  Hoefer RCB20-plus 115v Needs to be able to maintain temperature at ~10 C
G:Box Chemi XRQ Imaging System Syngene 05-GBOX-CHEMI-XRQ Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs
High Voltage Power Pack Thermo EC1000XL 1000V 
Vacuum centrifuge(Speedvac) Savant SPD131
Vertical Gel electrophoresis system Hoefer SE660
Glycosyl hydrolases
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.
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Lab supplies
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-918
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-951
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gel imaging software ( Genesys) Syngene

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References

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