पौधों में Mannan कोशिका दीवार Polysaccharides के संरचनात्मक लक्षण का उपयोग कर गति

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जेल ट्रो (गति) द्वारा polysaccharides के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल, एक उदाहरण के रूप में mannan का उपयोग करते हुए वर्णित है ।

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Pidatala, V. R., Mahboubi, A., Mortimer, J. C. Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE. J. Vis. Exp. (128), e56424, doi:10.3791/56424 (2017).

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Abstract

संयंत्र सेल दीवार polysaccharides बेहद मुश्किल का विश्लेषण कर रहे हैं, और सबसे तरीकों महंगा उपकरण, कुशल ऑपरेटरों, और शुद्ध सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यहां, हम विस्तृत polysaccharide संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन, संरचनात्मक isomers के संकल्प सहित । जेल ट्रो (गति) द्वारा polysaccharide विश्लेषण के लिए, संयंत्र सेल दीवार सामग्री ब्याज की hydrolases के लिए विशिष्ट glycosyl polysaccharide के साथ hydrolyzed है (जैसे, mannanases के mannan के लिए) । बड़े प्रारूप polyacrylamide जैल तो जारी oligosaccharides, जो फ्लोरोसेंट लेबल किया गया है अलग किया जाता है । जैल एक संशोधित जेल इमेजिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ visualized किया जा सकता है । परिणामी oligosaccharide फ़िंगरप्रिंट या तो गुणात्मक की तुलना की जा सकती है या, प्रतिकृति के साथ, मात्रात्मक रूप से । अतिरिक्त glycosyl hydrolases (उदा., mannosidases और galactosidases) का उपयोग करके लिंकेज और बंटी जानकारी स्थापित की जा सकती है । Whilst इस प्रोटोकॉल glucomannan संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन, यह किसी भी polysaccharide के लिए लागू किया जा सकता है जो glycosyl hydrolases मौजूद विशेषता । वैकल्पिक रूप से, यह उपंयास glycosyl hydrolases परिभाषित polysaccharide सब्सट्रेट का उपयोग कर विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

जेल ट्रो द्वारा Polysaccharide विश्लेषण (गति) polysaccharides1,2,3के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए एक विधि है । संयंत्र सेल दीवार polysaccharides बेहद मुश्किल का विश्लेषण कर रहे हैं, और सबसे तरीकों महंगा उपकरण, कुशल ऑपरेटरों, और शुद्ध सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यहां, हम विस्तृत polysaccharide संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन, संरचनात्मक isomers के संकल्प सहित ।

संयंत्र सेल दीवार polysaccharide संरचना को समझना उन शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है संयंत्र सेल दीवार के संश्लेषण या संयंत्र के विकास में संयंत्र सेल दीवार की भूमिका की खोज । हाल ही में, तथापि, संयंत्र सेल दीवार संरचना के कारण शोधकर्ताओं का एक व्यापक समूह के लिए दिलचस्प हो गया है संयंत्र बायोमास (अनिवार्य रूप से सेल की दीवार) का उपयोग कर एक टाक के रूप में जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए4। एक उदाहरण के रूप में, इस सामग्री के कुशल एंजाइमी शर्करीकरण polysaccharide संरचनाओं की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता है, ताकि अनुकूलित एंजाइमी कॉकटेल5का चयन किया जा सकता है ।

गति वैकल्पिक तरीकों जो यह जटिल glycan संरचनाओं के तेजी से विश्लेषण के लिए आदर्श बनाने पर कई फायदे हैं । सबसे पहले, यह प्रश्न में polysaccharide की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है, के रूप में समाधान राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर)6के लिए आवश्यक है । दूसरे, गति संरचनात्मक isomers को हल कर सकते हैं, जन स्पेक्ट्रोमेट्री के विपरीत (MS, उदा., मैट्रिक्स की सहायता से लेजर desorption/ionization (मालदी) और electrospray ionization (ईएसआई)), जो भी तरल क्रोमैटोग्राफी (LC) द्वारा प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है 7. तीसरा, गति बहुत संवेदनशील है, कम picomole संकल्प के साथ, पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) या कागज क्रोमैटोग्राफी के विपरीत । अंत में, यह महंगी उपकरण या विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता नहीं है, के रूप में एमएस, एनएमआर, और नियंत्रण रेखा के लिए मामला है ।

गति विधि glycosyl hydrolase (GH) एंजाइमों, जो polysaccharides के एक मिश्रण में कुछ glycosidic संपर्क लक्ष्य की विशिष्टता पर निर्भर करता है । जब GH एंजाइम polysaccharide श्रृंखला पर कार्य करता है, यह एक को कम करने अंत जो तो रासायनिक derivatized हो सकता है पता चलता है, एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ इस मामले में. नमूना का unhydrolyzed भाग इसलिए इस विधि द्वारा undetectable रेंडर किया जाता है । लेबल oligosaccharides तो ट्रो द्वारा एक बड़े प्रारूप acrylamide जेल में अलग कर रहे हैं । यह बहुत ही अणुओं के उत्कृष्ट संकल्प देता है, उदाहरण के लिए, trisaccharides Glc-man-man और Glc-man-Glc एक अलग आरएफहोगा ।

गति बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है के लिए संयंत्र प्रजातियों में विभिंन xylan संरचनाओं8विशेषताएं, Arabidopsis6,9,10,11 में glycosyltransferase म्यूटेंट की पहचान के लिए , glycosyltransferase परख9प्रदर्शन करने के लिए, और उपंयास GH गतिविधियों12,13की विशेषता है । हम भी हाल ही में इस्तेमाल किया है यह खमीर सेल दीवार mannan (Mahboubi और मोर्टिमर, तैयारी में) की विशेषताएं । यहां हम निस्र्पक संयंत्र सेल दीवार glucomannan संरचना के लिए एक विधि का वर्णन, पिछले रिपोर्ट11,14के आधार पर ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. संयंत्र सामग्री की कटाई

  1. फसल ताजा संयंत्र सामग्री (~ 20 मिलीग्राम) और तुरंत यह ९६% में (v/v) इथेनॉल और गर्मी में डूब ७० & #176; C 30 मिनट के लिए; यह किसी भी कोशिका दीवार अपमानजनक एंजाइमों मौजूद निष्क्रिय करता है । शुष्क सामग्री के लिए, चरण 2.
    पर प्रारंभ करें सावधानी: इथेनॉल ज्वलनशील है.
    नोट: एक एकल स्टेम या rosette पत्ती विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करेगा । हालांकि, अगर ऊतक की एक बड़ी राशि और परित के बाद से यह बाहर वजन और संभाल करने के लिए आसान है विश्लेषण है कम त्रुटियाँ उत्पन्न होती हैं ।
  2. ध्यान से रिकॉर्ड ऊतक प्रकार और विकासात्मक चरण, के रूप में polysaccharide संरचना दोनों के साथ बदलता है । उदाहरण के लिए, Arabidopsis थालियाना (यहां इस्तेमाल किया) के साथ, बोयेस एट अल से तरीकों के अनुसार ऊतक चरण < सुप वर्ग = "xref" > १५
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम फूलना स्टेम के निचले आधे का उपयोग किया है, जहां पहली silique पूरी तरह से लम्बा है लेकिन नहीं तेजाब.
< p class = "jove_title" > 2. शराब अघुलनशील अवशेषों की तैयारी (air)

  1. हवा तैयार, मोर्टिमर एट अल की विधि का पालन. < सुप वर्ग = "xref" > 9 या ऐसी ही एक अन्य विधि, जिसमें सुक्रोज और स्टार्च जैसे घुलनशील शर्करा की कमी पाउडर का उत्पादन करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. वायु के Aliquoting और पूर्व उपचार

< p class = "jove_content" > नोट: प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक हवा की सटीक मात्रा (a) सामग्री में रुचि के polysaccharide की बहुतायत पर निर्भर करेगा और (b) द्वारा जारी oligosaccharides का औसत आकार GH. विधि प्रत्येक oligosaccharide के अंत को कम करने के लिए एक फ्लोरोसेंट अणु कहते हैं, तो oligosaccharides की संख्या प्रयोग की संवेदनशीलता को निर्धारित करता है । एक दिशानिर्देश के रूप में, Arabidopsis स्टेम में glucomannan के लिए GH5 के साथ पच/GH26 (वर्णित के रूप में), ५०० & #181; छ सिफारिश की है < सुप class = "xref" > 11 , जबकि xylan के लिए Arabidopsis तना पच में GH11 के साथ, १०० & #181; g की सिफारिश की है के रूप में मोर्टिमर & #39; s अि < सुप वर्ग = "xref" > ३ .

  1. एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में वजन हवा (10-15 मिलीग्राम), और 2 मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एच 2 ओ जोड़ें । एक भी निलंबन को प्राप्त करने के भंवर । यदि यह समस्या है, तो इस प्रक्रिया में मदद करने के लिए एक ग्लास homogenizer का उपयोग करें ।
  2. Aliquot ५०० & #181; छ microfuge ट्यूबों में । सूखी aliquots एक निर्वात केंद्रापसारक का उपयोग (सामग्री के तालिका देखें) रातोंरात 30 & #176; ग.
  3. प्री-इलाज हवा 1 मीटर NaOH (20 & #181; L) के लिए 1 ज के कमरे के तापमान पर; इस de-acetylates polysaccharides और फूल फाइबर microfibrils, बायोमास संरचना में खलल न डालें और GH का उपयोग की अनुमति ।
    नोट: यह चरण शुद्ध polysaccharides के लिए छोड़ा जा सकता है । सावधानी & #8211; मजबूत अम्ल/
    1. शामिल है एक no-एंजाइम वायु नियंत्रण के लिए एक aliquot (सभी नमूनों के रूप में एक ही इलाज, ४.१ कदम के अलावा. शामिल है) ।
  4. Add २०० & #181; l के H 2 O र 20 & #181; l 1 M HCl को बेअसर. परीक्षण कि पीएच 1 & #181 को हटाकर ~ 6-7 है; L और यह कागज पीएच संकेतक स्ट्रिप्स पर खोलना.
  5. Add ५० & #181; एल 1 एम अमोनियम एसीटेट बफर, पीएच ६.० (या जो भी पीएच अध्ययन में प्रयुक्त GHs के लिए उपयुक्त है) और एच 2 O ५०० & #181 की कुल मात्रा देने के लिए; l
    नोट: अमोनियम एसीटेट के बाद से यह सुखाने पर उदात्त प्रयोग किया जाता है, और इसलिए यह नमूना के लिए अतिरिक्त नमक नहीं जोड़ता है । नमक की एक अतिरिक्त गरीब बैंड आकार और गति जेल पर संकल्प करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
< p class = "jove_title" > 4. Glycosyl Hydrolases (GHs) के साथ हवा का Hydrolysis

< p class = "jove_content" > नोट: चर्चा में उल्लेखित है कि, GHs की पवित्रता महत्वपूर्ण है । केवल उपयोग heterologously व्यक्त की, अपनत्व शुद्ध एंजाइमों । निर्माता से हर बहुत की प्राप्ति पर, hydrolyze निर्धारित aliquots सब्सट्रेट ( उदा., ५०० & #181; g AIR) GH की बढ़ती मात्रा के साथ रातोंरात ( उदा, ०.५, 1, 2, 5, 10, 15, 20 & #181; l) (3 इकाइयां/& #181; l). जब GH की एक अतिरिक्त है, गति फिंगरप्रिंट समान दिखेगा । एंजाइम की एक अतिरिक्त एक प्रतिलिपि परिणाम देने के लिए आवश्यक है क्योंकि यह निश्चित होना चाहिए कि hydrolysis प्रतिक्रिया समापन बिंदु आ रहा है ।

  1. एक पूर्व निर्धारित मात्रा (ऊपर देखें) के mannanases (GH5 और GH26 < सुप वर्ग = "xref" > 11 ) के लिए एयर aliquots से बफर स्टेप ३.५ में जोड़ें, के रूप में अच्छी तरह से एक सकारात्मक नियंत्रण (30 & #181 konjac glucomannan के जी), और एक नहीं हवा नकारात्मक नियंत्रण (एक में एंजाइम मिश्रण खाली ट्यूब) । भंवर, और फिर संक्षेप में स्पिन ट्यूब के तल में प्रतिक्रिया मिश्रण इकट्ठा करने के लिए ।
  2. रात भर में ३७ & #176; सी (या पसंद की GH के लिए उपयुक्त तापमान) कोमल आंदोलन (~ १०० rpm) के साथ ।
  3. ९५ पर मशीन द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो & #176; ग के लिए 20 min.
    नोट: कैप क्लोजर फ्लिप टॉप microfuge ट्यूबों को सील करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से एक बेंच शीर्ष microfuge का उपयोग कर केंद्रापसारक, और supernatant.
    2. बनाए रखने
  4. reसस्पैंड गोली में २५० & #181; L ज 2 हे, के रूप में ऊपर के केंद्रापसारक, और बनाए रखने supernatant.
  5. दोनों supernatants गठबंधन, और एक निर्वात केंद्रापसारक में सूखी (सामग्री के तालिका देखें) 30 & #176; C (~ 3 h या रात भर हीटिंग के बिना).
< p class = "jove_title" > 5. Oligosaccharide मानकों की तैयारी

  1. 1 mM स्टॉक सॉल्यूशंस तैयार करने में ज 2 ओ ऑफ mannose (मैन), mannobiose (मैन 2 ), mannotriose (मैन 3 ), mannotetraose (मैन 4 ), mannopentaose (मैन 5 ) और mannohexaose (Man 6 ), all & #946;, 1-4 linked. Aliquot और दुकान पर-20 & #176; ग जब तक अपे.
  2. 1 & #181 के संयोजन से एक आदमी 1-6 मिश्रण के 3 अलग सांद्रता तैयार करें; l (मानक s), 2 & #181; l (S2) या 5 & #181; l (S3) के सभी छह.
  3. एक निर्वात केंद्रापसारक में
  4. सूखी (देखें सामग्री की टेबल ) पर 30 & #176; ग (~ 1 ज).
< p class = "jove_title" > 6. Derivitization ऑफ Oligosaccharides

  1. ज Aminonaphthalene 2 trisulfonic एसिड 17:3 में ०.२ एम चींटियों (8--1, 3, 6-O:acetic एसिड) के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करते हैं । गर्म स्टॉक को ६० & #176; ग पूरी तरह से ठोस भंग करने के लिए. स्टोर at-20 & #176; C, प्रकाश से रक्षित, 2-3 माह के लिए ।
  2. DMSO में 2-picoline borane (2-पंजाब) के एक ०.२ मीटर शेयर समाधान तैयार करते हैं । यह अत्यंत hygroscopic है, इसलिए तुरंत DMSO में रसीद पर सभी पाउडर को फिर से सस्पेंड कर दें । Aliquot, और दुकान पर-20 & #176; ग के लिए 1-2 साल । गल aliquots यथा आवश्यक (स्टोर 4 & #176; C 2 सप्ताह के लिए, और तब छोड़ें) ।
  3. के derivatization बफर तैयार कर H 2 O:acetic अम्ल: DMSO पर 17:3:20.
  4. प्रत्येक नमूने के लिए, जोड़ें 5 & #181, चींटियों का l 5 & #181; l का 2-पंजाब और 10 & #181; l का derivatization बफर. संक्षेप में ट्यूब के नीचे में इकट्ठा करने के लिए स्पिन, अच्छी तरह से भंवर, और फिर संक्षेप में फिर से स्पिन । See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ प्रतिक्रिया वर्णन.
  5. में रात भर के नमूने ३७ & #176; ग, प्रकाश से रक्षित.
  6. एक निर्वात केंद्रापसारक में
  7. सूखी (देखें सामग्री की टेबल ) पर 30 & #176; ग (~ 2 ज).
  8. reसस्पैंड नमूनों और मानक में १०० & #181; L 3 मीटर यूरिया. संग्रह पर-20 & #176; C, आवश्यक होने तक प्रकाश से रक्षित.
< p class = "jove_title" > 7. पेस की तैयारी जैल

< p class = "jove_content" > नोट: जेल कास्टिंग उपकरण के विधानसभा ब्रांड पर निर्भर करेगा । यहां, हम uएसई एक ऊर्ध्वाधर ट्रो प्रणाली (सामग्री के टेबल देखें), 18 सेमी x 24 सेमी ग्लास प्लेटों और १.५ mm स्पेसिंग से सुसज्जित ।

  1. इकट्ठा जेल कास्टिंग उपकरण प्रति निर्माता & #39; s निद.
  2. 10x गति बफर (1m Tris-बोराटे, पीएच ८.२) बनाने के रूप में इस प्रकार है: Tris के १२१.१४ जी-आधार को ~ ४०० एमएल के एच 2 ओ, और मिश्रण को भंग करने के लिए जोड़ें । ठोस बोरिक एसिड (लगभग ६० ग्राम) के अलावा द्वारा ८.२ के लिए पीएच समायोजित करें, और फिर 1 एल
  3. करने के लिए मात्रा बनाने
  4. एक 10% (w/v) अमोनियम persulfate (एपीएस) स्टॉक में ज 2 ओ. Aliquot और स्टोर पर-20 & #176; ग. गल aliquots एक बार, 4 & #176 पर स्टोर; c और 2 सप्ताह के बाद छोड़ें.
  5. बनाओ और संपति जेल डालो । उपरोक्त उपकरणों के लिए, 1 जेल ५० मिलीलीटर के समान । एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में, मिश्रण एच 2 ओ (२०.२ मिलीलीटर), 5 मिलीलीटर 10x गति बफर, २४.६ मिलीलीटर ४०% acrylamide/बीआईएस-acrylamide (29:1 acrylamide: बीआईएस) । (सावधानी: विषाक्त).
    1. Add २०० & #181; अनुप का l व 20 & #181; l का n, n, n, n & #180;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). धीरे मिश्रण करने के लिए पलटना (हवा बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए) । एक सीरम या अंय बड़ी मात्रा पिपेट का उपयोग कर जेल डालो, ~ गिलास प्लेटों के ऊपर से नीचे 4 सेमी । जेल में फंस रही हवाई बुलबुले की संभावना के लिए ध्यान देना । अगर वे करते हैं, बहना बंद करो, और झुकाव/जेल उंहें रिहा करने के लिए नल
  6. ओवरले के साथ जेल isopropanol (सावधानी : ज्वलनशील) या, ध्यान से, एच 2 के साथ ओ. polymerize को जेल (20-30 मिनट) की अनुमति दें, तो शीर्ष परत बंद डालो । अगर isopropanol इस्तेमाल किया गया था, तो एच 2 के साथ 2x धो सोख्ता कागज का उपयोग कर किसी भी अतिरिक्त तरल सूखी ।
  7. बनाने और स्टैकिंग जेल डालना । मिक्स ६.८ एमएल एच 2 ओ, 1 एमएल 10x पेस बफर, २.८ एमएल acrylamide/बीआईएस-acrylamide ( सावधानी: विषाक्त), ८० & #181; एल ए पी एस, और 8 & #181; एल के TEMED में एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । मिश्रण करने के लिए पलटना, और बहुलक समाधान जेल के शीर्ष पर ओवरले । कंघी दांत के नीचे हवा के बुलबुले फँसाने से परहेज
  8. polymerize करने के लिए जेल की अनुमति दें (20-30 मिनट), नम ऊतक में लपेट और फिर प्लास्टिक की चादर में, और 4 पर स्टोर & #176; C जब तक आवश्यक है । जगह में कंघी के साथ स्टोर ।
    नोट: पेस जैल 2 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए संग्रहीत किया जा सकता है (हालांकि कम 1 सप्ताह आदर्श है), अगर वे नम रखा जाता है ।
< p class = "jove_title" > 8. चल रहा है एक गति जेल

  1. एक स्थाई मार्कर का उपयोग करने के लिए कांच पर अच्छी तरह से पदों लेबल, जो लोडिंग आदेश का ट्रैक रखने में मदद करेगा, और पहचान जहां कुओं एक बार कंघी हटा दिया जाता है ।
  2. कंघी को निकाल
  3. । 1x गति बफर के साथ कुओं भरें ।
  4. उपयोग क 10 & #181; l microsyringe को भार 2 & #181; क l मानकों और नमूनों का कुओं में बाहरी गलियों के उपयोग से बचें, जो नमूने खराब चल जाते हैं ।
  5. जेल-चल तंत्र के ऊपरी चैंबर इकट्ठा, और एक ठंडा (~ 10 & #176 में जेल जगह) चल टैंक (10 & #176; सी) 1x गति बफर युक्त । 1x गति बफर के साथ ऊपरी चैंबर भरें.
  6. पावर चालू करें, और 30 मिनट के लिए २०० v (निरंतर v) पर जेल चलाने, और फिर वृद्धि वोल्टेज के लिए १००० v 1 h ४० मिनट के लिए । जैल को हल् के से बचाएं ( जैसे, को काले कचरे के थैले में लपेटकर टैंकर) ।
    नोट: जैल पर जांच करें ~ 5 मिनट पर वोल्टेज मोड़ के बाद, और फिर एक और 5 मिनट के लिए वोल्टेज में वृद्धि के बाद १,००० वी. यदि पावर पैक वोल्टेज बनाए रखने में असमर्थ है तो वहां एक बफर रिसाव की संभावना है । टैंक से जेल हटा दें । ऊपरी चैंबर पुनः, ध्यान से सभी गैसकेट के स्थान की जांच । कांच की थाली के ऊपरी छोर पर एक बड़ी चिप प्लेट गैसकेट के साथ एक अच्छी मुहर बनाने को रोकने सकता है । यह आमतौर पर अस्थाई रूप से 5% (डब्ल्यू/वी) पिघला हुआ agarose की एक बूंद जोड़ने के द्वारा हल किया जा सकता है गिलास के छिल हिस्सा, ऊपरी चैंबर जोड़ने से पहले ।
< p class = "jove_title" > 9. visualizing एक गति जेल

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: transilluminator में लंबी लहर यूवी बल्बों से सुसज्जित एक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करें, और fluorophore के लिए उपयुक्त है, जो कैमरे के लिए एक उत्सर्जन फिल्टर, यहाँ ५३० एनएम. वैकल्पिक रूप से, एक लेज़र स्कैनर का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसा कि Goubet < सुप वर्ग में वर्णित है = "xref" > 2 .

  1. सुनिश्चित जेल इमेजिंग प्रणाली यह नम एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ पोंछते द्वारा धूल मुक्त है ।
  2. गति टैंक से जेल निकालें, और संक्षेप में देखने whilst जेल ग्लास प्लेटों में अभी भी है (& #60; ८० ms) निर्धारित करने के लिए अगर डाई सामने अभी भी जेल पर है ।
  3. एक कील उपकरण का उपयोग कर जेल खुला है, और whilst जेल अभी भी एक गिलास प्लेट पर है, दोनों स्टैकिंग जेल को दूर करने के लिए एक पिज्जा कटर का उपयोग करें और, अगर डाई मोर्चा जेल पर अभी भी है, जेल के नीचे.
  4. डाल ~ 5 एमएल एच 2 transilluminator की सतह पर, और फिर सीधे transilluminator पर जेल हस्तांतरण । ६०५ यूवी के लिए फिल्टर सेट, और longwave यूवी transilluminator पर बारी (सामग्री के तालिका देखें) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
    नोट: चींटियों fluorophore यहां इस्तेमाल किया एक उत्तेजना/353/520 एनएम के उत्सर्जन है ।
  5. विभिंन जोखिम समय पर कई छवियां ले ( उदा, १०० ms 10 एस के लिए) । यूवी प्रकाश बटन पर क्लिक करके छवियों के बीच बंद कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें (इसे बंद करने के लिए) प्रतिदीप्ति अपमानजनक से बचने के लिए । सुनिश्चित करें कि छवियों के कम से 2 कोई संतृप्त बैंड है (जेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर इस का संकेत होगा) ।
  6. फ़ाइलों को high-resolution. tif images.
    के रूप में सहेजें नोट: छवियां जेल इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है, या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, जैसे ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करके । quantitation.
  7. की चर्चा के लिए परिणाम अनुभाग देखें

Representative Results

यहां, हम एक उदाहरण के गति जेल प्रोटोकॉल प्रति चलाने के विवरण के साथ डेटा व्याख्या और समस्या निवारण के साथ सहायता दिखाने के लिए, और यह सफल पेस जेल व्याख्या13,16के लिए एक सामांय गाइड के बाद है । सेल दीवार mannan सामग्री की एक मानक गति परख के एक प्रतिनिधि जेल चित्रा 2में दिखाया गया है, और लेन द्वारा लेन का वर्णन किया है ।

मानकों
लेन 1, 2 और 3 व्यावसायिक रूप से खरीदा oligosaccharides (मैन1-मैन6) पर 5 (s), 10 (S2) और ५० (S3) pmol एकाग्रता की एक सीढ़ी दिखाओ । एक वाणिज्यिक oligosaccharide की एक नई बहुत प्राप्त करते हैं, यह एक जेल पर शुद्धता की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है. कई oligosaccharides, विशेष रूप से tetrasacccharides और अब, बहुलकीकरण (डीपीएस) के अंय डिग्री के oligosaccharides के साथ महत्वपूर्ण संदूषण हो सकता है, के रूप में आदमी के लिए यहां दिखाया गया है6 (* के साथ चिह्नित) । एक जेल quantitating करते समय, यह मानक वक्र की गणना के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह मानकों के न्यूनतम 3 सांद्रता है करने के लिए महत्वपूर्ण है । मानक वक्र की गणना भी derivatization प्रतिक्रिया पूरी होने पर अनिवार्य है कि यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोगी हो सकता है । ज्ञात सांद्रता के मानकों जैल के बीच तुलना की अनुमति है, और जुदाई की गुणवत्ता और derivatization गुणवत्ता के लिए एक उपयोगी नियंत्रण कर रहे हैं ।

सकारात्मक नियंत्रण
लेन 4 konjac glucomannan के एक mannanase पाचन से पता चलता है । Konjac glucomannan व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और whilst यह है कि के रूप में एक ही संरचना नहीं है, उदाहरण के लिए, Arabidopsis में पाया, यह दो प्रयोजनों के कार्य करता है । सबसे पहले, यह एंजाइमी पाचन के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है । शोधकर्ता स्थापित करना चाहिए जो एक वाणिज्यिक सब्सट्रेट पसंद के अपने GHs के साथ पचा जब पूरा करने के लिए पचा (यानी, GH का एक विशाल अतिरिक्त प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जाता है) की तरह लग रहा है. यदि भविष्य के प्रयोगों में पैटर्न में परिवर्तन, यह या तो या तो GH शेयर की गतिविधि या संदूषण की हानि का संकेत कर सकते हैं । दूसरे, यह एंजाइम और बफर लवण की उपस्थिति में derivatization प्रतिक्रिया के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । यदि मानक अच्छे लग रहे हैं, लेकिन सकारात्मक नियंत्रण गरीब है, तो यह संकेत हो सकता है कि hydrolysis प्रतिक्रिया के एक घटक derivatization को निरोधात्मक है ।

जंगली प्रकार (WT) Arabidopsis स्टेम एयर + mannanase कॉकटेल (GH5 + GH26)
5 लेन एक WT Arabidopsis स्टेम की गति फिंगरप्रिंट दिखाता है (संदर्भ11,14) के साथ तुलना करें ।

csla9 Arabidopsis स्टेम एयर + mannanase कॉकटेल (GH5 + GH26)
लेन 6 से पता चलता है एक Arabidopsis प्रमुख स्टेम mannan सिंथेस11कमी संयंत्र से स्टेम की गति फिंगरप्रिंट दिखाता है । WT और नकारात्मक नियंत्रण उंगलियों के निशान से तुलना करें । mannan के बहुमत Whilst इस संयंत्र में अनुपस्थित है, एक छोटी मात्रा रहता है, के रूप में सभी mannanase के लिए कम बैंड तीव्रता द्वारा सबूत-व्युत्पंन oligosaccharides यह अतिरिक्त mannan synthases (CSLA2, 3) द्वारा संश्लेषित है11

नकारात्मक नियंत्रण-केवल एंजाइम
लेन 8 जेल कि विशिष्ट है कि mannanase कॉकटेल में संदूषणों से प्राप्त नहीं कर रहे है पर बैंड से पता चलता है, और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए (* के साथ चिह्नित) ।

नकारात्मक नियंत्रण-WT हवा ही
लेन 9 जेल है कि विशिष्ट नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए पर बैंड से पता चलता है (के साथ चिह्नित *) ।

नकारात्मक नियंत्रण- csla9 हवा ही
लेन 10 जेल है कि विशिष्ट नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए पर बैंड से पता चलता है (के साथ चिह्नित *) ।

पाइन वुड एयर + mannanase कॉकटेल (GH5 + GH26)
लेन 7 पाइन लकड़ी, जो galactoglucomannan शामिल की गति फिंगरप्रिंट से पता चलता है । यह स्पष्ट रूप से Arabidopsis को जारी oligosaccharides का एक अलग पैटर्न है, अपनी अलग संरचना के कारण ।

नकारात्मक नियंत्रण-चीड़ की हवा ही
लेन 11 जेल है कि विशिष्ट नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए पर बैंड से पता चलता है (के साथ चिह्नित *) ।

एक गति जेल व्याख्या अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन निंनलिखित बिंदुओं के बारे में जागरूकता की आवश्यकता है । मजबूत डेटा के लिए, यह गति से बाहर ले जाने के लिए सिफारिश की है कम 3 स्वतंत्र रूप से जैविक प्रतिकृति, और यह करने के लिए सिफारिश की है करने के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति पर कम से 2 तकनीकी प्रतिकृति । वर्णित नियंत्रण व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं, के रूप में गैर विशिष्ट बैंड के लिए बाहर रखा जाना चाहिए । हम भी दोहराने जैल पर एक अलग क्रम में नमूने लोड करने की सिफारिश, प्रभाव को बाहर करने के लिए जो transilluminator द्वारा असमान रोशनी से परिणाम. सटीक व्याख्या बैंड जो संतृप्त नहीं कर रहे है के विश्लेषण की आवश्यकता है । के बाद से कुछ oligosaccharide फिंगरप्रिंट दोनों बहुत उच्च और कम बहुतायत polysaccharides शामिल हो सकते हैं, हम एक ही जेल के कई जोखिम का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं । मानकों के लिए विभिंन छवियों के बीच सामांय इस्तेमाल किया जा सकता है ।

कुछ प्रकार के प्रयोगों के लिए, हवा की तैयारी में polysaccharide की मात्रा का अंदाजा लगाने के लिए वांछनीय हो सकता है । Whilst यह एक गति जेल से यों तो संभव है, यह प्रत्येक GHs द्वारा जारी oligosaccharide और जहां यह गति जेल पर स्थित है की सटीक आणविक पहचान के ज्ञान की आवश्यकता है । यह वर्तमान में mannan के लिए पूरी तरह से ज्ञात नहीं है, लेकिन यह xylan3 उदा polysaccharides के लिए निर्धारित किया गया है । मानकों जैल के बीच सामान्य करने का एक तरीका प्रदान करते हैं, यहां तक कि जब quantitation नहीं किया जा रहा है, और इसलिए किसी भी गुणात्मक या अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण में सहायता करेगा.

व्यक्तिगत oligosaccharides की संरचना की पहचान GHs के कॉकटेल का उपयोग करके हासिल की जा सकती है । आगे GHs के अनुक्रमिक इसके अलावा जारी oligosaccharides के लिंकेज और प्रतिस्थापन के बारे में विवरण प्रकट कर सकते हैं (उदा., β-1, 4- ग्लुकोसिडेस है कि गैर पर कार्य करता है अंत को कम करने का पता चलता है जो मिश्रण में oligosaccharides कि सुविधा शामिल होगा) । उपलब्ध एंजाइमों galactosidases, glucuronidases और glucosidases (अतिरिक्त जानकारी के लिए CAZy डेटाबेस16 देखें) शामिल हैं; देखें हॉग, डी. एट अल. 17 एक उदाहरण के रूप में ।

इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल के लिए अज्ञात GHs की गतिविधि विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, Arabidopsis स्टेम या konjac glucomannan के रूप में एक परिभाषित बायोमास, अज्ञात GHs13स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1 : यह चींटियों के साथ oligosaccharides के फ्लोरोसेंट derivatization के लिए योजना को दर्शाता है । Goubet2से संशोधित । इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिनिधि पेस Arabidopsis से mannan फिंगरप्रिंट दिखा जेल, पाइन और एक Arabidopsis उत्परिवर्ती (csla9)) जो mannan के संश्लेषण बिगड़ा है । AlR एक mannanase कॉकटेल के साथ hydrolyzed था, और स्पर्म oligosaccharides एक derivatized से fluorophore थे । oligosaccharides जेल ट्रो द्वारा आकार, आकार, और चार्ज के आधार पर अलग किया गया । manno की एक सीढ़ी-oligosaccharides (Man1-6) जारी oligosaccharides के सापेक्ष मोबिल की पहचान करने में सहायता करने के लिए दिखाया गया है, और शुद्ध hydrolysis के एक mannan (konjac से व्युत्पंन) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है । * = गैर विशिष्ट बैंड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

पेस निस्र्पक polysaccharide संरचना के लिए एक सीधी विधि है । यह किसी भी polysaccharide के लिए लागू किया जा सकता है जिसके लिए वहां विशेषता गतिविधि के साथ GHs ज्ञात कर रहे हैं, साहित्य में कई उदाहरण देखें1,6,9,11। टीटी भी उपंयास GHs12,13,18 और glycosyltransferases9के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया गया है, परिभाषित polysaccharide सब्सट्रेट और स्वीकार करने का उपयोग करके ।

प्रतिलिपि, व्याख्यात्मक परिणाम तीन महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर हैं । सबसे पहले, इस्तेमाल किया GHs प्रदूषित गतिविधियों से मुक्त किया जाना चाहिए । यह सबसे अच्छा केवल heterologously का उपयोग कर व्यक्त की, अपनत्व शुद्ध एंजाइमों द्वारा प्राप्त की है । दूसरा, ज्यादातर प्रयोगों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सब्सट्रेट्स के एंजाइमी hydrolysis पूरा होने पर है । यह सुनिश्चित करेगा कि एक ही GH के साथ एक ही बायोमास hydrolyzed हर प्रयोग में एक ही फिंगरप्रिंट देता है । अंत में, वहां derivatization प्रतिक्रिया में fluorophore की एक अतिरिक्त होना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि उपलब्ध कम करने समाप्त होता है पर लेबल १००% के करीब है । यह परिणाम की उच्च reproducibility, साथ ही मात्रात्मक है कि डेटा में परिणाम होगा ।

जेल और एजेंट गुणवत्ता प्रतिलिपि डेटा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । खराब गुणवत्ता बफ़र्स, विशेष रूप से गलत पीएच, जेल में हवा के बुलबुले, और नमक की एक अतिरिक्त के साथ नमूने सभी संकल्प और oligosaccharides के प्रतिधारण कारक को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल और परिणाम अनुभाग में वर्णित अनुशंसित नियंत्रणों को शामिल करने से समस्या निवारण सक्षम हो जाएगा ।

गति oligosaccharides की पहचान करने की क्षमता तक सीमित है । कुछ प्रयोगों के लिए, एक सरल फिंगरप्रिंट है कि सभी आवश्यक है । हालांकि, वास्तव में हवा के एक नमूने में glucomannan की मात्रा quantitate, उदाहरण के लिए, सभी जारी oligosaccharides की पहचान की आवश्यकता है, जो एक समय लेने वाली प्रक्रिया है । यह xylan3जैसे कम जटिल polysaccharides के लिए अधिक सरल है । के बाद से वहां कुछ oligosaccharide मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, यह हमेशा संभव नहीं हो सकता है या वांछनीय सभी बैंड की पहचान । इस मामले में, गति बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (यानी, मालदी-सीआईडी9 या ईएसआई-MS7, और एनएमआर6) के लिए बहुत मानार्थ डेटा प्रदान कर सकते हैं । इन विधियों के लिए, यह अक्सर एक बड़े पैमाने पर तैयारी करने के लिए उपयोगी है, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग है, और फिर दोनों गति से प्रत्येक अंश का विश्लेषण करने से पहले एमएस या एनएमआर । Whilst यह बताया गया है कि बैंड और उत्पाद की पहचान की जा सकती है मालदी-सीआईडी, व्यवहार में हमने पाया है कि इस सफलता की एक कम दर है (संभवतः acrylamide जेल के साथ लेबल oligosaccharides की बातचीत के कारण जब यूवी प्रकाश को उजागर) ।

गति के अंय प्रमुख सीमा प्रवाह है । उचित नियंत्रण के साथ अच्छी गुणवत्ता, व्याख्यात्मक जैल है, प्रत्येक जेल केवल ~ 10 प्रयोगात्मक नमूनों होगा, और एक शोधकर्ता प्रति दिन ~ 4 गति जैल चलाने के लिए उम्मीद कर सकते हैं । हाल ही में, केशिका ट्रो (CE) का उपयोग कर गति का एक संस्करण है, जो ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों की तैयारी की अनुमति देता है19विकसित किया गया है । यह सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है glycosyltransferase एंजाइम गतिविधियों और polysaccharide संरचनाओं की विशेषताएं6,19, हालांकि यह एक CE मशीन है, जो खरीद और बनाए रखने के लिए महंगा हो सकता है के लिए उपयोग की आवश्यकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

गति विधि Dupree समूह (कैंब्रिज विश्वविद्यालय, यूके) के विभिंन सदस्यों द्वारा वर्षों से विकसित और अनुकूलित किया गया था, और हम उनके सभी योगदान की सराहना करते हैं । यह काम डो संयुक्त जैव ऊर्जा संस्थान (http://www.jbei.org) के भाग के रूप में वित्त पोषित किया गया था अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान के कार्यालय, अनुबंध DE-AC02 के माध्यम से-05CH11231 के बीच लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला और ऊर्जा विभाग के यू. एस. हम भी थीा उठाओ और csla9 नमूने तैयार करने के साथ मदद के लिए Vy एनजीओ धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligosaccaharide Standards
Mannose Sigma-Aldrich CAS 3458-28-4
Mannobiose Megazyme CAS: 14417-51-7
Mannotriose Megazyme CAS: 28173-52-6
Mannotetraose Megazyme CAS: 51327-76-5
Mannopentaose Megazyme CAS: 70281-35-5
Mannhexaose Megazyme CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) Megazyme P-GLCML
Name Company Catalog Number Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (Molecular probes) Thermo A350
2-picoline borane TCI B3018
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) Bio-rad 1610146
Name Company Catalog Number Comments
Specialty Equipment
Gel casting kit Hoefer SE660 kit 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers
Cooling recirculating water bath  Hoefer RCB20-plus 115v Needs to be able to maintain temperature at ~10 C
G:Box Chemi XRQ Imaging System Syngene 05-GBOX-CHEMI-XRQ Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs
High Voltage Power Pack Thermo EC1000XL 1000V 
Vacuum centrifuge(Speedvac) Savant SPD131
Vertical Gel electrophoresis system Hoefer SE660
Glycosyl hydrolases
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.
Name Company Catalog Number Comments
Lab supplies
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-918
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-951
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gel imaging software ( Genesys) Syngene

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References

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