Strukturel karakterisering af Mannan cellevæg polysaccharider i anlaeg, der anvender PACE

* These authors contributed equally
Biochemistry
JoVE Journal
Biochemistry
AccessviaTrial
 

Summary

En protokol til den strukturelle analyse af polysaccharider af gelelektroforese (tempo), ved hjælp af mannan som et eksempel, er beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pidatala, V. R., Mahboubi, A., Mortimer, J. C. Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE. J. Vis. Exp. (128), e56424, doi:10.3791/56424 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plant cell wall polysaccharider er notorisk vanskeligt at analysere, og de fleste metoder kræver dyrt udstyr, operatorer og store mængder af oprenset materiale. Her, vi beskriver en simpel metode til at få detaljerede polysaccharid strukturelle oplysninger, herunder opløsning af strukturelle isomerer. For polysaccharid analyse af gelelektroforese (tempo) hydrolyseret plant cell wall materialet med glycosyl hydrolaser specifikke polysaccharid af interesse (f.eks. mannanases for mannan). Storformat polyacrylamidgeler bruges derefter til at adskille de frigivne oligosaccharider, som er blevet fluorescently stemplet. Gels kan visualiseres med en modificeret gel imaging system (Se Tabel af materialer). Den resulterende oligosaccharid fingeraftryk kan enten være sammenlignet kvalitativt eller med replikering, kvantitativt. Kobling og forgrening oplysninger kan oprettes ved hjælp af yderligere glycosyl hydrolaser (f.eks. mannosidases og galactosidases). Mens denne protokol beskriver en metode til at analysere glucomannan struktur, kan det anvendes på enhver polysaccharid, som karakteriserede glycosyl hydrolaser findes. Alternativt, kan det bruges til at karakterisere romanen glycosyl hydrolaser bruger definerede polysaccharid substrater.

Introduction

Polysaccharid analyse af gelelektroforese (tempo) er en metode for den detaljerede karakterisering af polysaccharider1,2,3. Plant cell wall polysaccharider er notorisk vanskeligt at analysere, og de fleste metoder kræver dyrt udstyr, operatorer og store mængder af oprenset materiale. Her, vi beskriver en simpel metode til at få detaljerede polysaccharid strukturelle oplysninger, herunder opløsning af strukturelle isomerer.

Forståelse plante cellevæg polysaccharid struktur er nødvendig for disse forskere at udforske plante cellevæg biosyntesen eller rollen som plante cellens væg i plante udvikling. For nylig, dog, plant cell wall sammensætning er blevet interessant til en bredere gruppe af forskere på grund af fokus på bruger plantebiomasse (hovedsagelig cellevæg) som en råvare til fremstilling af biobrændstoffer og biokemikalier4. Som et eksempel kræver effektivt enzymatisk stivelsen af dette materiale en detaljeret forståelse af polysaccharid strukturer, så optimeret enzymatisk cocktails kan være valgt5.

TEMPO har flere fordele sammenlignet med alternative metoder, som gør den ideel til hurtig analyse af komplekse glycan strukturer. For det første, det kræver ikke rensning af den pågældende, som er nødvendig for løsningen stat Kernemagnetisk resonans (NMR)6polysaccharid. For det andet tempo kan løse strukturelle isomerer, i modsætning til massespektrometri (MS, fx matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI) og electrospray Ionisation (ESI)), som også kan være en udfordring for at udføre ved væskekromatografi (LC) 7. for det tredje, tempoet er meget følsomme, med lav-picomole opløsning, i modsætning til tyndtlagskromatografi (TLC) eller papir kromatografi. Endelig, det ikke kræver dyrt udstyr eller specialist viden, som det er tilfældet for MS, NMR og LC.

TEMPO-metoden er baseret på specificitet af glycosyl hydrolase (GH) enzymer, der er målrettet mod visse glycosidic forbindelser i en blanding af polysaccharider. Når GH enzym agerer på polysaccharid kæden, afslører det en reducerende ende, hvilket kan derefter være kemisk derivatized, i dette tilfælde med en fluorescerende etiket. Den unhydrolyzed del af prøven er derfor gengives målbart af denne metode. Mærket oligosaccharider adskilles derefter i et stort format acrylamid gel ved elektroforese. Dette giver fremragende opløsning af meget lignende molekyler, for eksempel, trisaccharider Glc-mand-mand og Glc-mand-Glc vil have en anden Rasmussenf.

TEMPO er blevet brugt flittigt til at karakterisere forskellige xylan strukturer på tværs af plante arter8, for at identificere glycosyltransferase mutanter i Arabidopsis6,9,10,11 , til at udføre glycosyltransferase assays9, og at karakterisere romanen GH aktiviteter12,13. Vi har også for nylig brugt det til at karakterisere gær cellevæg mannan (Mahboubi og Mortimer, under forberedelse). Her beskriver vi en metode for kendetegner plant cell wall glucomannan struktur, baseret på tidligere rapporter11,14.

Protocol

1. høst af plantemateriale

  1. høste friske plantemateriale (~ 20 mg) og straks nedsænke det i 96% (v/v) ethanol og inkuberes ved 70 ° C i 30 min, og på denne måde deaktiveres eventuelle cellevæg, nedværdigende enzymer til stede. Til tørt materiale, starter på trin 2.
    Forsigtig: Ethanol er brandfarligt.
    Bemærk: En enkelt stilk eller roset blade vil give nok materiale til analyse. Imidlertid færre fejl opstår, hvis en større mængde væv er samlet og analyseret da det er lettere at afvejes og håndtere.
  2. Optage omhyggeligt vævstype og udviklingsstadiet, som polysaccharid struktur varierer med begge. For eksempel, med Arabidopsis thaliana (bruges her), fase væv efter metoderne fra Boyes et al. 15
    note: I denne protokol, vi har brugt den nederste halvdel af Blomsterstanden stamceller, hvor den første silique fuldt aflange men ikke gulfarvning.

2. forberedelse af alkohol uopløselige rester (luft)

  1. Forbered luft, efter metoden for Mortimer et al. 9 eller en anden tilsvarende metode, for at producere et pulver mangler opløselige sukker, saccharose og stivelse.

3. Aliquoting og forbehandling af AIR

Note: den nøjagtige mængde luft nødvendige for hver prøve vil afhænge af (en) overfloden af polysaccharid interesse i materialet og (b) den gennemsnitlige størrelse af oligosaccharider udgivet af GH. Metoden tilføjer en enkelt fluorescerende molekyle til den reducerende ende af hver oligosaccharid, så antallet af oligosaccharider bestemmer følsomheden af eksperimentet. Som en retningslinje for glucomannan i Arabidopsis stilk fordøjes med GH5/GH26 (som beskrevet), 500 µg anbefales 11, mens xylan i Arabidopsis stilk fordøjes med GH11, 100 µg anbefales som bedemand ' s undersøgelse 3.

  1. afvejes luft (10-15 mg) i en 15 mL centrifugeglas, og tilføje H 2 O til en slutkoncentration på 2 mg/mL. Vortex at opnå en endda suspension. Hvis dette er problematisk, så bruge et glas homogeniseringsapparat for at bistå denne proces.
  2. Alikvot 500 µg i mikrofuge rør. Tørre prøver ved hjælp af et vakuum centrifuge (Se Tabel af materialer) natten over ved 30 ° C.
  3. Pre-omgås luft med 1 M NaOH (20 µL) i 1 time ved stuetemperatur; dette de acetylates polysaccharider og svulmer cellulose microfibrils, forstyrre biomasse struktur og GH adgang.
    Bemærk: Dette trin kan hoppet for renset polysaccharider. FORSIGTIGHED – stærk syre/base.
    1. Omfatter en alikvot for en no-enzym AIR control (behandles på samme måde som alle prøver, undtagen trin 4.1. er udelukket).
  4. Tilføje 200 µL af H 2 O og 20 µL 1 M HCl til at neutralisere. Test at pH-værdien er ~ 6-7 ved at fjerne 1 µL og spotting det på pH indikator papirstrimler.
  5. Tilsættes 50 µL 1 M ammonium acetat buffer, pH 6.0 (eller uanset hvilken pH er passende for GHs anvendes i undersøgelsen) og H 2 O til at give en samlet maengde paa 500 µL.
    Bemærk: Ammoniumacetat bruges da det sublimes efter tørring, og så det ikke føje ekstra salt til prøven. En overskydende salt kan føre til dårlig band-form og opløsning på tempo gel.

4. Hydrolyse af luft med Glycosyl Hydrolases (GHs)

Note: som nævnt i diskussionen, renheden af GHs er kritisk. Kun bruge heterologously udtrykt, affinitet renset enzymer. Ved modtagelsen af hvert parti fra producenten, hydrolyserer definerede delprøver af substratet (fx 500 µg luft) med stigende mængder af GH natten over (f.eks. 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 enheder/µL). Når der er et overskud af GH, vil tempo fingeraftryk Se ens. Et overskud af enzym er forpligtet til at levere en reproducerbar resultatet, fordi det skal være sikker på, at hydrolyse reaktion nærmer slutpunktet.

  1. Tilføj en forud fastsat mængde (se ovenfor) af mannanases (GH5 og GH26 11) til luft delprøver i bufferen fra trin 3.5, samt en positiv kontrol (30 µg af konjac glucomannan), og en no-AIR negativ kontrol (enzym mix i en tomme rør). Vortex, og derefter spin kort at indsamle reaktionsblandingen i bunden af røret.
  2. Inkuberes natten over ved 37 ° C (eller den passende temperatur for GH valg) med blid agitation (~ 100 rpm).
  3. Stoppe reaktionen af inkubere ved 95 ° C i 20 min.
    Bemærk: Cap lukninger kan bruges til at forsegle flip-top mikrofuge rør.
    1. Der centrifugeres ved hjælp af en bænk top mikrofuge ved maksimal hastighed for 10 min, og bevare supernatanten.
  4. Resuspend pellet i 250 µL H 2 O, centrifugeres som ovenfor, og bevare supernatanten.
  5. Kombinerer begge analysere, og tørre i et vakuum centrifuge (Se Tabel af materialer) ved 30 ° C (~ 3 timer eller natten over uden varme).

5. Forberedelse af oligosaccharid standarder

  1. Forbered 1 mM lager løsninger i H 2 O mannose (mand), mannobiose (mand 2), mannotriose (mand 3), mannotetraose (mand 4), mannopentaose (mand 5) og mannohexaose (mand 6), alle β, 1-4 knyttet. Alikvot og opbevares ved-20 ° C indtil kræves.
  2. Udarbejde 3 forskellige koncentrationer af en mand 1-6 blanding ved at kombinere 1 µL (Standard S1), 2 µL (S2) eller 5 µL (S3) af alle seks.
  3. Tørre i et vakuum centrifuge (Se Tabel af materialer) ved 30 ° C (~ 1 h).

6. Derivitization af oligosaccharider

  1. Forbered en stamopløsning af 0,2 M MYRER (8-Aminonaphthalen-1,3,6-trisulfonic syre) i H 2 O: eddikesyre 17:3. Varm materiel til 60 ° C opløses fuldstændigt udfyldte. Opbevares ved-20 ° C, beskyttet mod lys, for 2-3 måneder.
  2. Udarbejde en 0,2 M stamopløsning af 2-picolin borane (2-PB) i DMSO. Dette er meget hygroskopisk, så straks resuspend alle pulver ved modtagelsen i DMSO. Alikvot, og opbevares ved-20 ° C i 1-2 år. Tø delprøver som kræves (butik ved 4 ° C i 2 uger, og derefter discard).
  3. Forbereder forædling bufferen af H 2 O: eddikesyre syre: DMSO på 17:3:20.
  4. Til hver prøve indsamles, tilsæt 5 µL af MYRER, 5 µL af 2-PB og 10 µL af forædling buffer. Spin kort at indsamle i bunden af røret, vortex grundigt, og derefter dreje kortvarigt igen. Se figur 1 reaktion beskrivelse.
  5. Incubate prøver natten over ved 37 ° C, beskyttet mod lys.
  6. Tørre i et vakuum centrifuge (Se Tabel af materialer) ved 30 ° C (~ 2 h).
  7. Resuspend prøver og standard i 100 µL 3 M urinstof. Opbevares ved-20 ° C, beskyttet mod lys indtil kræves.

7. Forberedelse af tempo geler

Bemærk: montering af gel støbning udstyr afhænger af mærke. Her, vi uSe en lodret elektroforese system (Se Tabel af materialer), udstyret med 18 cm x 24 cm glasplader og 1,5 mm spacere.

  1. Samle gel støbning udstyr pr. fabrikanten ' s instruktioner.
  2. Gøre 10 x tempo buffer (1 M Tris-Borat, pH 8,2) som følger: tilføjes ~ 400 mL H 2 O og blandes til at opløse 121.14 g af Tris-Base. PH indstilles til 8.2 ved tilsætning af solid borsyre (ca. 60 g), og derefter gøre volumen op til 1 L.
  3. Gøre en 10% (w/v) ammonium persulfat (APS) bestand i H 2 O. delprøve og opbevares ved-20 ° C. tø delprøver engang, opbevares ved 4 ° C og kassér efter 2 uger.
  4. Gøre og hæld den løsning gel. For ovenstående udstyr, 1 gel svare til 50 mL. Bland H 2 O (20.2 mL), 5 mL 10 x tempo buffer, 24.6 mL 40% acrylamid/Bis-acrylamid (29: 1 acrylamide:Bis) i et 50 mL-centrifugerør. (Advarsel: giftige).
    1. Tilføje 200 µL af APS og 20 µL af N, N, N, N´-tetramethyl-ethylendiamin (TEMED). Vend forsigtigt for at blande (for at undgå at indføre luftbobler). Hæld gel ved hjælp af en serologisk eller andre store volumen pipette til ~ 4 cm under toppen af glasplader. Opmærksomme på muligheden for luftbobler at få fanget i gelen. Hvis de gør, stoppe hælde og tilt/tap gel for at frigive dem.
  5. Overlay gel med isopropanol (forsigtighed : brandfarlig) eller omhyggeligt, H 2 O. Tillad gel til at polymerisere (20-30 minutter), så hæld det øverste lag. Hvis isopropanol blev brugt, så vask 2 x med H 2 O. tør overskydende væske ved hjælp af trækpapir.
  6. Gøre og hæld den stabling gel. Bland 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 x tempo buffer, 2,8 mL acrylamid/Bis-acrylamid (forsigtighed: giftige), 80 µL APS, og 8 µL af TEMED i en 15 mL centrifugeglas. Vend for at blande og overlay på toppen af polymeriseret løsning gel. Isæt forsigtigt kamme, undgå fældefangst luftbobler under kam tænder.
  7. Tillad gel til at polymerisere (20-30 min), wrap i fugtige væv og derefter i plastikfolie, og opbevares ved 4 ° C indtil kræves. Butik med kamme i sted.
    Bemærk: Tempo geler kan opbevares i højst 2 uger (selv om mindre end 1 uge er ideel), hvis de holdes fugtig.

8. Kører et tempo Gel

  1. bruge en permanent markør til at mærke de godt positioner på glas, som vil hjælpe med at holde styr på lastning ordren, og i at identificere hvor brøndene er når kam er fjernet.
  2. Fjern kammen. Fylde brøndene med 1 x tempo buffer.
  3. Bruge mikrosprøjte 10 µL til at indlæse 2 µL af standarder og prøver til brøndene. Undgå at bruge de yderste baner, som har tendens til at køre prøver dårligt.
  4. Samle den øverste kammer af gel-kører apparater, og placere gel i en kølet (~ 10 ° C) kører tank (10 ° C) indeholdende 1 x tempo buffer. Fyld den øverste kammer med 1 x tempo buffer.
  5. Tænd for magt, og Kør gelen på 200 V (konstant V) for 30 minutter, og derefter øge spændingen til 1000 V for 1 time 40 minutter. Beskytte geler fra lys (f.eks. af indpakning kampvogne i sort skraldeposer).
    Bemærk: Check på geler ~ 5 min efter tænde spændingen, og derefter en anden 5 minutter efter stigende spænding til 1.000 V. Hvis batteriet er ude af stand til at bevare spændingen, så der er sandsynligvis en buffer lækage. Fjerne gel fra tank. Saml den øverste kammer, omhyggeligt kontrollere placeringen af alle pakninger. En stor chip på den øverste kant af glaspladen kan forhindre pladen danner en god tætning med pakningen. Dette kan normalt være midlertidigt løst ved at tilføje et fald på 5% (w/v) smeltet Agarosen den tilhugget del af glas, før du tilføjer den øverste kammer.

9. Visualisere en tempo gel

Bemærk: Brug en gel imaging system udstyret med langbølge UV pærer i transilluminator, og en emission filter til kameraet som er velegnet til fluorophore, her 530 nm. Alternativt, en laserscanner kan også bruges, som beskrevet i Goubet 2.

  1. Sikre gel imaging system er støvfri ved at tørre den med fugtig fnugfri serviet.
  2. Fjerner gel fra tempo tank, og Se kort mens gelen er stadig i glasplader (< 80 ms) at afgøre, om farvestoffet front er stadig på gelen.
  3. Åbne gel ved hjælp af en kile værktøj, og mens gel er stadig på en glasplade, bruge en pizza cutter til at fjerne både stabling gel og hvis dye front er stadig på gel, bunden af gelen.
  4. Sætte ~ 5 mL H 2 O på overfladen af transilluminator, og derefter overføre gel direkte på transilluminator. Angiv filteret til UV-605, og tænde longwave UV transilluminator (Se Tabel af materialer) ved hjælp af softwaren.
    Bemærk: MYRER fluorophore bruges her har en excitation/emission af 353/520 nm.
  5. Tage flere billeder på forskellige eksponeringstider (f.eks. 100 ms til 10 s). Sikre, at UV-lys er slukket mellem billeder ved at klikke på knappen UV lys (for at deaktivere) for at undgå at forringe fluorescens. Sikre, at mindst 2 af billederne har ingen mættede bands (gel imaging software vil indikere dette).
  6. Gem filer som high-resolution.tif billeder.
    Bemærk: Billeder kan analyseres ved hjælp af softwaren, der leveres med gel imaging system, eller ved hjælp af frit tilgængelige billede analyse software, såsom ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Se afsnittet resultater for en diskussion af kvantitering.

Representative Results

Her viser vi et eksempel tempo gel køre per protokol sammen med beskrivelser til at bistå med data fortolkning og fejlfinding, og dette er efterfulgt af en generel vejledning til vellykket tempo gel fortolkning13,16. En repræsentativ gel af en standard tempo assay af cellevæggen mannan indhold er vist i figur 2, og er beskrevet lane af lane.

Standarder
Baner 1, 2 og 3 viser en stige af kommercielt købt oligosaccharider (mand1- mand6) 5 (S1), 10 (S2) og 50 (S3) pmol koncentration. Når du modtager en ny masse en kommerciel oligosaccharid, er det vigtigt at kontrollere renhed på en gel. Mange oligosaccharider, især tetrasacccharides og længere, kan have betydelig forurening med oligosaccharider af andre grader af polymerisation (DPs), som vist her for mand6 (markeret med *). Mens quantitating en gel, er det vigtigt at have mindst 3 koncentrationer af standarder, da det er nødvendige for beregning af standardkurven. Beregning af standardkurven kan også være nyttigt for at sikre at forædling reaktionen er hovedsagelig ved afslutning. Standarder af kendte koncentrationer foretage sammenligninger mellem geler, og er en nyttig kontrol for adskillelse og forædling kvalitet.

Positiv kontrol
Lane 4 viser en mannanase fordøjelse af konjac glucomannan. Konjac glucomannan findes kommercielt, og mens den ikke har den samme struktur som, for eksempel fundet i Arabidopsis, det tjener to formål. For det første er det en vigtig kontrol for enzymatisk fordøjelsen. Forskeren bør etablere en kommerciel substrat fordøjes med deres GHs valg ligner når fordøjet afsluttet (dvs. et stort overskud af GH er føjet til reaktion). Hvis fremover eksperimenter mønstret ændres, kan dette angive enten en tab af aktivitet eller forurening af GH lager. For det andet, det tjener som en kontrol for forædling reaktion i overværelse af enzym og buffer salte. Hvis standarderne ser godt ud, men den positive kontrol er dårlig, kan dette indikere, at en komponent af hydrolyse reaktion er hæmmende for forædling.

Vildtype (WT) Arabidopsis dæmme op for luft + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 5 viser tempo fingeraftryk af en WT Arabidopsis stilk (Sammenlign med henvisninger11,14).

csla9 Arabidopsis dæmme op for luft + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 6 viser viser tempo fingeraftryk af stamceller fra en Arabidopsis plante mangler store stammer mannan syntase11. Sammenlign med WT og negativ kontrol fingeraftryk. Mens fleste af mannan er fraværende i denne plante, en lille mængde forbliver, som det fremgår af de reducerede band intensiteter for alle mannanase-afledte oligosaccharider dette er syntetiseret af yderligere mannan synthases (CSLA2, 3)11.

Negativ kontrol - enzymet kun
Lane 8 viser bands på den gel, der ikke er specifikke, der skyldes forurenende stoffer i mannanase cocktail, og bør være udelukket fra analysen (markeret med *).

Negativ kontrol - WT luft kun
Lane 9 viser bands på den gel, der er ikke specifikke og bør udelukkes fra analysen (markeret med *).

Negativ kontrol- csla9 Luft kun
Lane 10 viser bands på den gel, der er ikke specifikke og bør udelukkes fra analysen (markeret med *).

Fyrretræ træ AIR + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 7 viser tempo fingeraftryk af fyrretræ, som indeholder galactoglucomannan. Dette har klart et andet mønster af frigivne oligosaccharider til Arabidopsis, på grund af sine forskellige struktur.

Negativ kontrol - Pine luft kun
Lane 11 viser bands på den gel, der er ikke specifikke og bør udelukkes fra analysen (markeret med *).

Fortolke en tempo gel er relativt ligetil, men kræver bevidsthed om følgende punkter. For robust data anbefales det for at udføre tempo på mindst 3 uafhængigt dyrkes biologisk replikerer, og det anbefales at udføre mindst 2 tekniske replikater på hver biologiske replikeres. Kontrolelementerne beskrevet er kritisk for fortolkning, som ikke-specifikke bands skal udelukkes. Vi anbefaler også lastning prøver i en anden rækkefølge på Repliker geler, at udelukke virkninger som følge af ujævn belysning af transilluminator. Nøjagtig fortolkning kræver analyse af bands, som ikke er mættet. Da nogle oligosaccharid fingeraftryk kan indeholde begge meget høj og lav overflod polysaccharider, anbefaler vi, at analysere flere eksponeringer af samme gel. Standarderne, der kan bruges til at normalisere mellem forskellige billeder.

For nogle typer af forsøg, kan det være ønskeligt at kvantificere mængden af polysaccharid i luften forberedelse. Selv om det er muligt at kvantificere fra et tempo gel, det kræver kendskab til den nøjagtige molekylære identiteten af hver oligosaccharid udgivet af GHs og hvor det er placeret på tempoet gel. Dette er i øjeblikket ikke fuldt ud kendt for mannan, men det er fastslået for andre polysaccharider fx xylan3. Standarderne, der giver en måde at normalisere mellem geler, selv når kvantitering ikke udføres, og så vil hjælpe med nogen kvalitative eller semi-kvantitative analyse.

Identificerer strukturen af individuelle oligosaccharider kan opnås ved hjælp af cocktails af GHs. sekventiel tilføjelsen af yderligere GHs kan afsløre detaljer om forbindelser og substitution af de frigivne oligosaccharider (f.eks. tilføjelse af β - 1,4 - glucosidase, der fungerer på den ikke-reducerende ende vil afsløre hvilke oligosaccharider i blandingen indeholder denne funktion). Tilgængelige enzymer omfatter galactosidases, glucuronidases og glucosidases (Se CAZy database16 for yderligere oplysninger); Se Hogg, D. et al. 17 som eksempel.

Den ovennævnte protokol kan bruges til at karakterisere aktiviteten af ukendt GHs. I dette tilfælde bør en defineret biomasse, såsom Arabidopsis stilk eller konjac glucomannan, anvendes til at screene den ukendte GHs13.

Figure 1
Figur 1 : Dette viser ordningen for de fluorescerende forædling af oligosaccharider med MYRER. Modificeret fra Goubet2. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative tempo gel viser mannan fingeraftryk fra Arabidopsis, pine og en Arabidopsis mutant (csla9) som har svækket mannan biosyntesen. AlR blev hydrolyseret med en mannanase cocktail, og de frigivne oligosaccharider var derivatized med en fluorophore. Oligosaccharider var adskilt af gelelektroforese på grundlag af størrelse, form og ladning. En stige af manno-oligosaccharider (Man1-6) er vist sig at hjælpe med at identificere relative mobiliteter af de frigivne oligosaccharider, og en hydrolyse af renset mannan (afledt af konjac) er vist som en positiv kontrol. * = ikke-specifik bands. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

TEMPO er en enkel metode til kendetegner polysaccharid struktur. Det kan anvendes til enhver polysaccharid, hvortil der er kendte GHs med karakteriseret aktivitet, se talrige eksempler i litteratur1,6,9,11. TT er også blevet anvendt til karakterisering af roman GHs12,13,18 og glycosyltransferases9, ved at gøre brug af definerede polysaccharid substrater og acceptorer.

Reproducerbar, fortolkelige resultater er afhængige af tre vigtige trin. Først, GHs brugt bør være fri for forurenende aktiviteter. Dette er bedst opnås ved kun at bruge heterologously udtrykt, affinitet renset enzymer. For det andet, for de fleste eksperimenter, det er vigtigt at enzymatisk hydrolyse af substraterne er ved afslutning. Dette vil sikre, at den samme biomasse hydrolyseret med samme GH giver den samme fingeraftryk i hvert eksperiment. Endelig bør der være et overskud af fluorophore i forædling reaktion. Dette sikrer, at de tilgængelige reducerende ender mærkes på næsten 100%. Dette vil resultere i høj reproducerbarhed af resultaterne samt kvantitative data.

Gel og reagens kvalitet er afgørende for at sikre reproducerbare data. Dårlig kvalitet buffere, især af forkert pH, luft bobler i gelen, og prøver med en overskydende salt kan alle påvirke beslutningen og fastholdelse faktor af oligosaccharider. Medtagelsen af de anbefalede kontrol beskrevet i afsnittet protokol og resultater vil imidlertid aktivere fejlfinding.

TEMPOET er begrænset af sin evne til at identificere oligosaccharider. For nogle forsøg er et simpelt fingeraftryk alt, hvad der er nødvendigt. Dog for at virkelig kvantificere mængden af glucomannan i et udsnit af luft, for eksempel, identiteten på alle de frigivne oligosaccharider er påkrævet, hvilket er en tidskrævende proces. Dette er mere ligetil for mindre komplekse polysaccharider såsom xylan3. Da der er få oligosaccharid standarder kommercielt tilgængelige, kan det ikke altid være muligt eller ønskeligt at identificere alle bandene. I dette tilfælde kan tempo give meget gratis data til massespektrometri (dvs. MALDI-CID9 eller ESI-MS7, og NMR6). For disse metoder er det ofte nyttigt at gøre en omfattende forberedelse, adskilt af størrelse-udelukkelse kromatografi og derefter analysere hver fraktion af både tempo før MS eller NMR. Mens det er blevet rapporteret at bands kan være skåret ud og identificeret ved MALDI-CID, i praksis har vi fundet, at dette har en lav grad af succes (muligvis på grund af vekselvirkninger mellem de mærket oligosaccharider acrylamid gel når den udsættes for UV-lys).

Andre store begrænsning af tempo er overførselshastighed. Hvis du vil have god kvalitet, fortolkelige geler med de passende kontrol, hver gel har kun ~ 10 eksperimentelle prøver og en forsker kan forvente at køre ~ 4 tempo geler pr. dag. En version af tempo ved hjælp af kapillær elektroforese (CE) har for nylig været udviklede19, som giver mulighed for forberedelse af prøver i 96-brønd plader. Det har været anvendt med succes til at karakterisere glycosyltransferase enzym aktiviteter og polysaccharid strukturer6,19, selv om det kræver adgang til en CE-maskine, som kan være dyrt at købe og vedligeholde.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

TEMPO-metoden blev udviklet og optimeret af forskellige medlemmer af gruppen Dupree (University of Cambridge, England) i år, og vi værdsætter alle deres bidrag. Dette arbejde blev finansieret som en del af DOE fælles BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) understøttes af U. S. Department of Energy, Office of Science, Office af biologiske og miljømæssige forskning, gennem kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellem Lawrence Berkeley National Laboratory og U. S. Department of Energy. Vi takker også Thea Pick og Vy Ngo for hjælp med csla9 prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligosaccaharide Standards
Mannose Sigma-Aldrich CAS 3458-28-4
Mannobiose Megazyme CAS: 14417-51-7
Mannotriose Megazyme CAS: 28173-52-6
Mannotetraose Megazyme CAS: 51327-76-5
Mannopentaose Megazyme CAS: 70281-35-5
Mannhexaose Megazyme CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) Megazyme P-GLCML
Name Company Catalog Number Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (Molecular probes) Thermo A350
2-picoline borane TCI B3018
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) Bio-rad 1610146
Name Company Catalog Number Comments
Specialty Equipment
Gel casting kit Hoefer SE660 kit 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers
Cooling recirculating water bath  Hoefer RCB20-plus 115v Needs to be able to maintain temperature at ~10 C
G:Box Chemi XRQ Imaging System Syngene 05-GBOX-CHEMI-XRQ Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs
High Voltage Power Pack Thermo EC1000XL 1000V 
Vacuum centrifuge(Speedvac) Savant SPD131
Vertical Gel electrophoresis system Hoefer SE660
Glycosyl hydrolases
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.
Name Company Catalog Number Comments
Lab supplies
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-918
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-951
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gel imaging software ( Genesys) Syngene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224, (1), 163-174 (2006).
  2. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300, (1), 53-68 (2002).
  3. Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
  4. Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, (4), 559-568 (2008).
  5. Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11, (3), 329-337 (2008).
  6. Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83, (3), 413-426 (2015).
  7. Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22, (17), 2723-2730 (2008).
  8. Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171, (4), 2418-2431 (2016).
  9. Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (40), 17409-17414 (2010).
  10. Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109, (3), 989-993 (2012).
  11. Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60, (3), 527-538 (2009).
  12. Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289, (1), 53-64 (2014).
  13. Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
  14. Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218, (1), 27-36 (2003).
  15. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13, (7), 1499-1510 (2001).
  16. The Carbohydrate Active Enzyme Database. www.cazy.org (2017).
  17. Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
  18. Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70, (6), 3609-3617 (2004).
  19. Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics