Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы представляем протокол к точно quantitate белки с Изобарический маркировки, обширные фракционирования, Биоинформатика инструменты и меры контроля качества в сочетании с жидкостной хроматографии, сопряжена с высоким разрешением масс-спектрометр.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Многие исключительные успехи в масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомики, с конкретного технического прогресса в жидкостной хроматографии (LC) в сочетании с тандем масс-спектрометрия (LC-MS/MS) и изобарических маркировки мультиплексирования потенциала. Здесь мы представляем глубоко протеомики профилирования протокол, который сочетает в себе 10-plex тандем массового тег (ТМТ) маркировки с обширной платформой LC/LC-MS/MS и исправление после МС вычислительной вмешательства точно quantitate весь протеомов. Этот протокол включает следующие основные шаги: белка добычу и пищеварение, TMT маркировки, двухмерный (2D) LC, с высоким разрешением масс-спектрометрии и вычислительной обработки данных. Контроль качества шаги включены для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Более чем 10 000 белки в млекопитающих образцы можно уверенно предел с настоящим Протоколом. Этот протокол также может быть применен к количественный столб-поступательные изменения с незначительными изменениями. Этот мультиплексированных, надежный метод предоставляет мощный инструмент для протеомного анализа в различных сложных проб, включая культуру клеток, тканей животных и человека клинических образцов.

Introduction

Достижения в технологии секвенирование нового поколения привели к новый ландшафт для изучения биологических систем и болезни человека. Это позволило большое количество измерений генома, транскриптом, протеом, метаболом и других молекулярных систем станет ощутимым. Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее чувствительных методов в аналитической химии, и его применение в протеомике быстро расширилась после секвенирования генома человека. В области протеомики за последние несколько лет были достигнуты крупные технические достижения в основе MS количественного анализа, включая Изобарический маркировки и мультиплексирования возможности в сочетании с обширной жидкостной хроматографии, помимо инструментария авансы, позволяя быстрее, более точные измерения с меньше материала образца требуется. Количественные протеомике стали основной подход для профилирования десятки тысяч белков и Посттрансляционная модификаций в весьма сложных биологических образцов1,2,3,4 , 5 , 6.

Мультиплексированных Изобарический обозначая методы, такие как Изобарический тег для относительной и абсолютной количественный (например, iTRAQ) и тандем массового тег (ТМТ) MS значительно улучшили образца пропускной способности и увеличил количество образцов, которые могут быть проанализированы в отдельном эксперимент1,6,,78. Наряду с другими на основе MS количественный методы например метка бесплатно количественный и стабильных изотопов, маркировки с аминокислоты в культуре клеток (например, SILAC), потенциал этих методов протеомики поле является значительным9 ,10,11. Например метод ТМТ позволяет 10 образцы протеина, чтобы быть проанализированы вместе в 1 эксперимент с использованием 10-plex реагентов. Эти структурно идентичны TMT теги имеют той же общей массы, но тяжелые изотопы распределяются дифференцировано на атомы углерода и азота, обусловило уникальный репортер Ион во время МС/МС фрагментации каждого тега, тем самым позволяя относительной количественный между 10 образцов. TMT стратегия обычно применяется для изучения биологических пути, прогрессирования заболевания и клеточных процессов12,,1314.

Значительные технические усовершенствования улучшили жидкостной хроматографии (LC)-MS/MS систем, как с точки зрения LC цветоделение и MS параметры, чтобы максимизировать идентификации белок без ущерба для точности количественный. Разделение первом измерении пептидов путем разделения технику с высоким ортогональности для второго измерения имеет решающее значение в этом типе метода протеомики ружье для достижения максимальных результатов20. Высоком рН обратная фаза жидкостной хроматографии (RPLC) обеспечивает лучшую производительность, чем обычных сильных катионообмен хроматографии20. При высоком рН RPLC сочетается с второго измерения низкого pH RPLC, аналитический динамический диапазон и белка охват улучшаются, результате способность определить основную часть выраженных белков при выполнении всего протеома анализы15 ,16,17,18. Другие технические достижения включают в себя мелкие частицы C18 (1.9 мкм) и продлил длинный столбец (~ 1 м)19. Кроме того другие заметные улучшения включают в себя новые версии масс-спектрометров с быстрого сканирования ставки, улучшена чувствительность и резолюции20и сложные биоинформатики трубопроводов для интеллектуального анализа данных MS21.

Здесь мы описываем подробный протокол, который включает в себя самые последние методики с изменениями для повышения чувствительности и пропускную способность, сосредоточив внимание на механизмы контроля качества на протяжении всего эксперимента. Протокол включает извлечения белков и пищеварение, TMT 10-plex маркировки, базовых pH и рН RPLC фракционирования, с высоким разрешением MS обнаружения и обработки данных MS (рис. 1). Кроме того мы осуществляем несколько этапов контроля качества для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Этот подробный протокол призван помочь исследователям новые на местах регулярно выявлять и точно quantitate тысячи белков от lysate или ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

внимание: перед использованием обратитесь все соответствующие паспорта безопасности (т.е., MSDS). Пожалуйста, используйте все практики безопасности при выполнении настоящего Протокола.

Примечание: в настоящем Протоколе для протеома количественный 10 образцов используется набор реагент Изобарический метка 10-plex TMT.

1. Подготовка клеток/тканей

Примечание: очень важно для сбора образцов в минимальное время при низких температурах держать белков в их исходном состоянии биологического.

  1. Мыть адэрентных клеток (например, клетки ГЭС 293) на 10 см пластины дважды с 10 мл льда холодной фосфат амортизированное saline (PBS). Скрип и собирать клетки (~ 2 x 10 6 клеток) в 1 мл ФСБ. Передача для 1.5 мл пробирок и удалить PBS после центрифугирования в 600 x g за 5 мин при 4 ° C. хранить клетки окатышей на-80 ° C до лизис.
    Примечание: Часто эксперимент выполняется для изучения белков урожайности. Примерно в 1 мг белков может быть извлечено от 10 х 10 6 клеток млекопитающих или от 15 см пластины с 80% слияния.
  2. В качестве альтернативы, лизируют адэрентных клеток на их пластине, добавив буфера lysis непосредственно к плите после стирки. Собирать лизатов в 1,5 мл пробирок и использовать описание протокола на шаге 2.5.
  3. Сбор подвеска клетки в 15 мл пробирок, мыть дважды с 10 мл холодного льда PBS, перевести в 1,5 мл пробирок и центрифуги на 600 x g для удаления PBS. Удалите из мыть шаги полностью поддерживать нужную концентрацию ингредиентов буфера lysis PBS. Хранить клетки окатышей на-80 ° C до лизис.
  4. Собирать и весят тканей быстро. Держите ткани в жидком азоте сразу после вскрытия и хранить на -80 ° C.
    Примечание: Урожайность белка тканей-примерно 5% до 10% массы ткани
  5. использовать размеры однородных тканей и анатомических областей для 10 образцов для уменьшения образца неоднородности. Удалять загрязнение крови промыв образцы дважды с 1 мл раствора лед холодной PBS избежать белки очень обильные крови белка количественный и данных анализа.

2. Извлечения белков, контроля качества западный Blotting, пищеварение в решение и обессоливания пептида

Примечание: обработка каждого из 10 образцов так же на любом этапе до объединения TMT-меченых образцов имеет важное значение для уменьшения Вариация.

  1. Сделать литического буфера (50 мм HEPES [рН 8,5], мочевина 8 М и 0,5% Дезоксихолат натрия) в день эксперимента.
    Примечание: Денатурации белков частично во время выборки лизис влияет на эффективность переваривания белка.
  2. Добавить лизис буфера так, что отношение буфера объем образца составляет 10:1 и ~ 20% от окончательного объема стеклянных шариков (диаметром 0.5 мм) гранулы клеток или тканей (например, соотношение 10: 1 объем буфера и образцы) для достижения окончательного белка концентрацию 5 до 10 мг/мл. Держите все 10 образцов такой же концентрации, учитывая количество ячеек, которые используются или ткани вес каждого образца.
  3. Поддерживать концентрацию мочевины на 8 М, добавив твердой мочевины в образце. Не забудьте рассмотреть объем Пелле клетки или ткани, при расчете размера твердых мочевины для добавления образца для достижения концентрации 8 М.
    Примечание: ООН свежие мочевины буфер можно ввести искусственные химические модификации (то есть, белок carbamylation) и негативно влияет на количество выявленных пептидов. Мочевина занимает значительный объем (100 мг мочевины занимает ~ 73 мкл в растворе).
  4. Держать нерастворимых мусора в lysate разрешить пищеварение нерастворимые белки 23.
  5. Лизируйте образцы в блендер на 4 ° C на скорости 8 для 30 s, остальные 5 s, и повторите 5 раз или до тех пор, пока гомогенизированных образцов. Образцы также могут быть лизированы, vortexing для 30 s при комнатной температуре (RT) с 30 s, охлаждение период на льду для ~ 10 циклов. Отрегулируйте лизис условий в случае необходимости, в зависимости от типа образца.
  6. Смесь lysate хорошо без центрифугирования и сделать 2 малых аликвоты (~ 15 мкл). Используйте 1 Алиготе для измерения концентрации протеина и 1 Алиготе для выполнения проверки позитивного управления, выполняя Западный анализ помаркой. Храните остальные большие Алиготе для анализа протеомики.
  7. Измерения концентрации протеина assay количественный стандарт протеина или окрашенных Кумасси короткие натрия Додециловый сульфат геля полиакриламида (10%) 22 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) как стандарт. Используйте стандартный BSA с высокой степенью точности известной концентрации. Для достижения высокого уровня точности, выполнить анализ аминокислоты стандарта BSA.
    Примечание: Другие точные стандарты могут быть доступны. Концентрация белка также может быть оценена путем числа клеток или тканей весов. Хотя рекомендуется 1 мг белка (100 мкг/образец), анализ может выполняться с как 100 мкг белка (10 мкг/образец).
  8. Добавить 100% Ацетонитрил (ACN) для достижения конечной концентрации 10% АКС и LysC протеазы на фермент субстрат соотношение 1: 100 (w/w) переваривать белки под высоко денатурации условий в РТ за 2 ч 1. Добавить Дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 1 мм для уменьшения дисульфидными облигаций в белках и инкубировать 1 h. выполняют LysC пищеварение в конечной концентрации мочевины 7,2 М.
  9. Разбавления проб до 2 М мочевины с 50-мм HEPES (рН 8,5) и далее дайджест с трипсина на RT 3 часа или на ночь на трипсина белка соотношение 1:50 (w/w). Использование примерно 2 мкг трипсина 100 мкг белка и концентрация трипсина приблизительно 10 нг/мкл.
    Примечание: Факторы, которые могут привести к неэффективной трипсина пищеварение являются вопросы рН, неактивные трипсина или использование ненадлежащее отношение фермента в субстрат.
  10. Добавить DTT дают 1 мм и дальнейшему сокращению пептиды для 2 ч на RT.
  11. Добавить iodoacetamide (IAA) для достижения 10 мм. Инкубируйте 30 мин в темноте, чтобы алкилата Cys содержащих пептидов на RT.
  12. Утолить непрореагировавшего IAA, добавив DTT до достижения 30 мм и Инкубируйте 30 мин на RT.
  13. Проверить эффективность Пищеварение трипсина путем изучения небольших Алиготе каждого образца. Опреснения с помощью кончика пипетки 10 мкл хроматографии СМИ, встроенных в Мертвое пространство, по словам производителя ' протокол s. Анализировать каждый образец, LC-MS/г-жа LC-MS/MS параметры такие же, как в шаге 5, за исключением, что градиент составляет 10 мин 23.
  14. Выполнить поиск базы данных MS необработанных данных (см. более подробно в шаге 6) с помощью 4 пропущенных разобщенность как параметр поиска.
    Примечание: Если количество пропущенных разобщенность это > 10%, это может свидетельствовать о пищеварении трипсина неполной. Это отрицательно скажется на течению результаты. Это шаг критического контроля качества (QC).
  15. Дайджест образцы снова, если пропустил расщепление > 10% путем добавления дополнительных 10 мкл трипсина образцы.
  16. Подкисляет образцы, добавив trifluoroacetic кислоты (ТФК) для достижения концентрации 1%. Измерение pH с помощью РН газа. Убедитесь, что pH ставкимежду 2 и 3. Добавить больше TFA падение мудрым (1 мкл) при необходимости вплоть до достижения правильного pH.
  17. Центрифуг в 20000 x g в РТ за 10 мин и собирать супернатант.
  18. Мыть 0,5-60 мкг потенциала спин столбцов, содержащих C18 реверс фазы смолы с 0,25 мл метанола при использовании 100 мкг образцов. Вымойте 0,03 до 30 мкг потенциала спин столбцы с 0,25 мл 60% TFA ACN/0.1% при использовании 10 мкг образцов. Центрифуга спин столбцы в 500 g x 30 s.
  19. Сбалансировать столбцы с 0,5 мл 0,1% TFA и удалить центрифугированием на 500 x g 30 s.
  20. Загрузить образцы по столбцам и связывать столбцы образцов центрифугированием на 100 g x 3 мин, или до тех пор, пока все образца прошло через колонку.
  21. Добавить 0,5 мл 0,1% TFA столбцы и центрифуги на 500 x g 30 s.
  22. Добавить 125 мкл 60% TFA ACN/0.1% для каждого столбца и элюировать центрифугированием при 100 x g на 3 мин обеспечить, чтобы все решения прошло через колонку.
  23. Сухой eluents в вакуумной концентратор. Убедитесь, что образцы полностью сухой и не жидкость остается в трубах. Хранить при температуре-80 ° C до дальнейшего анализа.

3. TMT маркировки пептиды

Примечание: очень важно обеспечить, что все образцы полностью обозначены TMT реагентов. TMT маркировки эффективности, который негативно повлияет все ниже по течению результаты могут влиять несколько факторов (например, количество TMT замотают, рН и точность белка количественный).

  1. Воссоздать каждый образец обессоленной пептида в 50 мкл буфера HEPES 50 мм (рН 8,5). Проверьте pH и убедитесь, что он находится между 7 и 8.
    Примечание: Образец может быть кислой, если не полностью высушить после опреснительной шаг, который будет влиять на эффективность маркировки.
  2. Держать ~ 1 мкг каждого немеченого образца для последующих TMT маркировки эффективности теста, как описано в шаге 3.3.
  3. Распустить TMT реагентов в безводный АКС и ярлык пептид образцы, следуя производитель ' s инструкции. Инкубировать реагентов в РТ за 1 ч.
  4. Тест КК TMT маркировки эффективности, опреснительные ~ 1 мкг каждого TMT-помечены и - неподписанных образца с помощью 10 мкл наконечники с встроенных хроматографии СМИ по данным производителя ' протокол s. Анализировать образцы TMT-меченых и немеченого по LC-MS/г-жа
    Примечание: LC-MS/MS параметры такие же, как и раздел 5, за исключением, что градиент — 10 мин
  5. Изучать необработанные данные, чтобы убедиться, что немеченого пептиды не обнаруживаются в обозначенные образцах, обеспечения полной эффективности маркировки ( рис. 2). Делайте это в течение 6-10 отдельные пептиды для проверки эффективности маркировки.
  6. Утолить реакции путем добавления 4 мкл рабочего раствора гидроксиламина 5% и Инкубируйте 15 мин
  7. Смесь Алиготе малого и равного объема (2 мкл) каждого TMT-меченых образца. Опреснения с помощью 10 мкл наконечники с встроенный хроматографии СМИ. Анализ образцов на LC-MS/MS, как описано в пункте 3.4. Использование программного обеспечения прыжок (открытым исходным кодом базы данных поиска алгоритм, который преобразует тандем MS raw файлов в список пептидов и белков) чтобы определить коэффициент относительной концентрации всех 10 образцов по интенсивности тег TMT всех выявленных пептиды.
    Примечание: Этот тест соотношение премикс КК полезно определить правильное соотношение равно смешивания до окончательного объединения, как дозирования ошибки могут произойти что будет меняться, концентрации и шаг количественный белка не всегда может быть точным. Это также лучший способ гарантировать, что количество каждого из 10 образцов, используемых для окончательного микса, все в равной пропорции, как описано в шаге 3.5.
  8. Повторять столько раз, сколько необходимо для достижения в соотношении 1:1 во всех 10 образцов.
  9. Одинаково смешать 10 образцов по результатам теста соотношение премикс. Используйте образец с низкой концентрацией как базовый для настройки томов 9 образцов.
  10. Удаление побочных продуктов тушения реакции пуле TMT-меченых образца, обессоливания.
  11. Мыть 1 мл твердофазный извлечения картриджи, содержащие 50 мг сорбента каждого столбца с 1 мл/0,25 мл метанола при использовании 100 мкг образцов. Мыть емкость 0,5 - 60 мкг C18 спин столбцы с 1 мл/0,25 мл 60% TFA ACN/0.1% при использовании 10 мкг образцов. Центрифуга для столбцов в 500 g x 30 s.
  12. Сбалансировать столбцы с 0,5 мл 0,1% TFA и удалить центрифугированием на 500 x g 30 s.
  13. Загрузить образцы по столбцам и привязать центрифугированием при 100 x g на 3 мин, или до тех пор, пока все образца прошло через колонку.
  14. Добавить 0,5 мл 0,1% TFA столбцы и центрифуги на 500 x g 30 s.
  15. Добавить 125 мкл 60% TFA ACN/0.1% для каждого столбца и элюировать центрифугированием на 100 g x 3 мин обеспечить, чтобы все решения прошло через колонку.
  16. Сухой eluents в вакуумной концентратор. Убедитесь, что образцы полностью сухой и не жидкость остается в трубах. Хранить при температуре-80 ° C до дальнейшего анализа.

4. Обширные с высоким разрешением, основные рН LC Prefractionation

  1. набор 2 подключенных C18 столбцы, содержащие частицы гибрид мостовой этилена (4,6 мм x 25 см, на общую сумму 50 см; 3,5 размер частиц мкм) и использовать микролитр потока насос высокой производительности LC для фракционирование.
    Примечание: Использование 2 колонок увеличивает загрузки пептидной и не обязательно улучшить хроматографии. Для образцов, содержащих ≤ 200 мкг пептидов, 1 колонка является достаточным.
  2. Мыть 100 мкл цикла с последующими дополнениями 300 мкл метанола, воды и буфера A (Формиат аммония 10 мм, pH 8.0).
  3. Вымойте столбцы с 100 мкл одинаково смешанные изопропаноле, метанол, АКС, и воды и сбалансировать столбца в буфере 95% для 2 h.
  4. Солюбилизировать последнего образца обессоленной пуле TMT-меченых пептида в 65 мкл буфера A. Убедитесь, что образец pH ~ 8.0. Если еще кислые, используйте Гидроксид аммония для регулировки рН 8.0.
  5. Fractionate образца, используя следующий градиент с буфером B (буфер плюс 90% ACN): 15% до 20% за 15 мин, 20% до 35% на 100 мин и 35% до 50% для 30 минут установить коллектор фракций для сбора фракций каждые 2 мин, включая время загрузки. Установите скорость потока до 0,4 мл/мин. Смотрите ссылку 29 и Рисунок 1 представитель хроматограммы.
  6. Собрать в общей сложности 80 фракций и сухая 40 фракций (каждый другой фракции) с вакуумной концентратор до полной сухости.
  7. Использовать 40 высушенные образцы для анализа LC-MS/MS.
  8. Анализировать все 80 фракций, LC-MS/MS для достижения охвата Ультра глубокое протеома.

5. LC-MS/MS подготовка и параметры

Примечание: на основе в TMT количественный, пептид ионы Изобарический и отображаются как 1 Масса в MS1 сканирования. Однако они являются предел по интенсивности репортер ионов (10 уникальных репортер ионов) в МС/МС сканирования после того, как Ион пептида были фрагментированы с более высокой энергии столкновения диссоциации (HCD). TMT репортер ионные коэффициенты могут быть подавлены от совместное Элюирующий TMT-обозначенных ионов 24. Сужение Ион изоляции окна 25, газовой фазы очистки 26, MultiNotch MS3 метод 27 или обширные фракционирование многомерные LC и длинные градиентов (4-8 ч) 28-альтернативные подходы.

  1. Пакет 75 мкм внутренний диаметр (ID) пустые столбцы с 1,9 мкм C18 смолы от 30 до 40 см длиной (~1.3 мкл кровать тома).
  2. Тепло столбцы при 65 ° C с утеплителем портфолио бабочка для уменьшения противодавления и предотвратить давление на ультра-высокого давления Жидкостная хроматография (UPLC) системы. Катушка столбце 2-3 раза в течение бабочка нагревательному прибору убедитесь, что длина постели весь столбец нагревается. Лента столбце внутри нагревателя, стараясь не ленту через датчик температуры внутри нагревателя.
    Примечание: Бабочка портфолио нагреватель установлен и выявляется на заказ кусок оргстекла, придает XYZ этап инструмента.
  3. Подготовка буфера (3% этанного сульфоксида и 0,2% муравьиной кислоты) и буфера B (буфер плюс 67% ACN) и мыть столбцы тщательно с буфером 95% B. Затем полностью сбалансировать столбцов в буфере 95% A (по крайней мере 3 колонки томов). Использовать скорость потока ~0.25 мкл/мин и противодавления бара 280-320
  4. Изучить качество системы LC-MS/MS, запустив 100 нг крыса мозга пептидов (или стандарт нашего выбора) дважды, прежде чем анализировать образцы TMT-меченых. Проверьте следующие параметры часто для обеспечения сбора качественных данных: обследование MS интенсивности сигнала (между e8 и e9 для базового пика интенсивности), качество МС/МС спектры (хорошее представление y и b ионов), ширина пик (12-22 сек), общее время хранения, Давление системы LC (повышение давления > 50 баров указывает грязные столбец или оконечности засорение эмиттера) и запуска к запуску изменчивости (должно быть идентичным пики < 30 s между запусками).
    Примечание: Для устранения вблизи Изобарический репортер ионов 10-plex TMT реагентов (6.32 mDa разница), в резолюции МС/МС должно быть присвоено по крайней мере 30.000 в 400 m/z. HCD обычно используется для TMT10-plex репортер Ион фрагментации, как это не могут быть одной трети правило, которое применяется для столкновения индуцированной диссоциации (CID) в документах ионная ловушка.
  5. Чистые и калибровки инструмента MS регулярно и использовать свежие LC буферов для улучшения производительности системы.
  6. Восстановить сушеные пептидов из разделения базовых pH в 5% TFA.
  7. Загрузить ~0.2 мкг на столбце а течет буфера 5% а.
  8. Elute с 15% до 45% буфера B в 150 мин. В качестве отправной точки, использовать следующий градиент: время 0, буфера B 5%; время 2, буфера B 15%; 135, 45% буфера B, в режиме 145, буфера B 70%; и времени 150, буфера B 95%. Настройте градиент слегка для раннего и позднего базовых pH RPLC фракции после изучения базовых пик хроматограммы.
  9. Работают масс-спектрометр в зависящих от данных режиме с обследования сканирования в анализаторе ионная ловушка массы (400-1600 m/z; 60000 резолюции; 1 x 10 6 автоматическая регулировка усиления (AGC) управления целевой; время максимальная Ион 50 мс; и тяжести режим). Выполнение 20 МС/МС с высоким разрешением сканирования (60000 резолюции, 1 х 10 5 СМЖЛ целевой, время максимальной Ион ~ 100 мс, 35 энергии столкновения HCD нормированный, 0.4 m/z изоляции окна и 20 s динамического исключения).
    Примечание: Электрона передачи диссоциации (ETD) не рекомендуется для TMT10-plex реагентов ETD расщепления сайтов отличаются от HCD, привело репортер Ион перекрытия. Кроме того, ETD не эффективна как HCD потому что tryptic пептидов обычно генерируют + 2 заряженном состоянии, и ETD является более эффективным в высокий заряд государства.

6. Анализ данных MS

Примечание: мы описываем анализ данных с помощью программы перехода. Однако, анализ данных может выполняться с другими коммерчески доступных или бесплатные программы.

  1. Процесс raw файлов от масс-спектрометр с совместной работы на основе тегов поиска двигатель прыжок 21, который сочетает в себе Поиск базы данных на основе шаблона и последовательности на основе тегов de novo для повышения чувствительности и специфичности.
  2. Преобразовать необработанные данные в mzXML формат и поиск спектров MS2 против базу человеческого UniProt цель манок (или другие соответствующие вегетационных базы данных), чтобы вычислить уровень ложных обнаружения (ДРД).
  3. Выполнять поиск с помощью массового терпимости 10 ppm для прекурсоров и фрагмент ионов. Установите другие параметры поиска полностью tryptic ограничения с 2 максимум пропущенных разобщенность, 3 Максимальная модификации сайтов за пептида и назначение , b и y ионов забить пептидов. Задать статические изменения TMT Теги на Lys остатков и N Термини (+229.162 Da) и carbamidomethylation остатки Cys (+57.021 Da). Установка динамического изменения включают встретил окисления (+15.994 Da), который является общий артефакт пептид с пробами.
  4. Фильтр данных следующие критерии: 7 аминокислоты минимум пептид длина, точность m/z (например, 5 ppm) и сопоставления ноты (J Оценка и deltaCn). Группа пептидов в зависимости от длины пептида, trypticity и зарядки состояние.
  5. Использовать дополнительный уровень фильтрации, сопоставляя результаты для уменьшения белка FDR для ниже 1%. Белки, выявленные одной спектральной игр требуют высокий показатель сопоставления.
  6. Для совместно несколькими членами семьи белков, пептидов кластера членов соответствующего белка в группу 1.
    Примечание: Согласно принципу экономичности, Группа представлена белка с наибольшим числом назначенных пептидов и другие белки, сопровождается уникальным пептидами 1.
  7. Quantitate белков путем суммирования репортер Ион пунктам во всех матчах спектра соответствует пептида (PSMs) с помощью программы встроены в набор программного обеспечения прыжок.
  8. Для каждого признаны PSM, извлекать и исправить TMT репортер Ион интенсивности согласно изотопного распределения маркировки реагентов и загрузки предвзятость, которая рассчитывается от глобальных данных количественный PSM. Фильтр PSMs с низкой интенсивности и высокий уровень шума с пользователем порогами во время quantitation.
  9. Расчет относительной сигнала между каждой репортер Ион и среднее всех 10 репортер ионов. Сумма относительной сигналы PSMs для определенных белков. Преобразовать эти относительные сигналы абсолютного сигналов путем умножения усредненной репортер Ион интенсивность PSMs Топ-3 в соответствующих белков.
  10. Использовать после МС вычислительной подход для устранения помех. Предполагая, что y 1 Ион интенсивность пропорциональна интенсивности Ион репортер, рассчитать линейную связь из чистого сканирования и получают уровень помех от зараженных y1ion интенсивности в шумной сканирует 23.
    Примечание: Для TMT-меченых tryptic пептидов, остатки K-ТМТ и R, 2 типа y 1 ионов (376.27574 да и 175.11895 Да, соответственно) в MS2 сканирования. Если только 1 y 1 Ион обнаруживается и в соответствии с выявленными пептид, мс2 считается чистой сканирования ( рис. 3A). Если оба y1ions обнаружены, мс2 считается шумной сканирования.
  11. Экспорта значений количественный белка в программу электронных таблиц программного обеспечения для дальнейшего анализа. Используйте попарных сравнений или дисперсионный анализ для определения белков, которые выражаются в дифференциально.

7. Проверка данных MS

Примечание: для оценки качества данных MS, по крайней мере 1 метод проверки должны выполняться перед длительным биологические эксперименты.

  1. Вручную изучить МС/МС спектры протеинов интереса для проверки последовательности пептида и ТМТ репортер Ион количественный.
  2. Использование известных белков количественный данные для подтверждения результатов MS.
  3. Проверить изменения протеина с подходы на основе антител (например, Уэстанализ помаркой и иммуногистохимии RN).
  4. Химически синтеза пептидов интерес и использовать их как внутренние стандарты для подтверждения идентификации нативных пептидов.
    Примечание: Их модели МС/МС и удержания время LC-MS/MS должны быть идентичны.
  5. Проверить изменения протеина с целенаправленный подход MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы использовали сочетание ранее описанных кросс видов пептида систематически анализировать влияние коэффициента сжатия в 3 основных протокола шаги, включая pre-MS фракционирования, MS параметры и коррекции post-MS23. Фракционирование pre-MS оценены и оптимизированы с помощью комбинации базовых pH RPLC и кислой рН RPLC. Для post-MS анализа были рассмотрены только вегетационных пептиды. Мы использовали эту модель вмешательства для изучения ряда параметров в LC/LC-MS/MS, включая MS2 изоляции окна, онлайн LC резолюции, Загрузка количество онлайн кислой рН RPLC и разрешение автономный RPLC высоком рН (см. Рисунок 3 в ссылке 29).

Изменить резолюцию во время автономного LC, мы разделены Изобарический помечены пептидов на 320 фракций и затем объединены отдельных фракций вместе, чтобы отрегулировать разделения власти. Автономный LC резолюции был протестирован с помощью число подмножеств собираемой фракции (1, 5, 10, 20, 40, 80 и 320), при мониторинге уровней вмешательства. Мы обнаружили, что уровни вмешательства постепенно сократилось с 16,4% до 2,8%, указанием что обширные фракционирование во время автономного разделения LC несколько смягчить проблему совместного элюирующие пептиды, но был не способен полностью удалить помех.

Далее мы оценивали эффект MS2 изоляции окна на вмешательство. Мы экспериментально определено, что вмешательство было примерно пропорциональна размеру окна изоляции, по согласованию с предыдущих исследований29,30. Например, 4-кратный разница размер окна (1.6 до 0,4 Da) привела к ~ 4 раза разница уровня вывода (14,4% до 3,7%). Мы также определяется сумма оптимальной загрузки на столбце для MS анализа и использовать эту информацию для дальнейшего инверсия вмешательства. Мы сократили помехи от 9,4% до 3,3%, загрузив правильное количество образцов. Загрузка слишком много выборки может привести к пик, расширение31 и таким образом поднять уровень помех, обусловило снижение белка количественный точности. И наконец мы оптимизировали онлайн RPLC резолюции, изменив градиента длины (1, 2 и 4 h) и с помощью длинного столбца (~ 45 см). Мы обнаружили, что градиент 4-h почти устранить помехи (до 0,4%), но также добавил инструмент время. Оптимизированные параметры выявили узкие изоляции окна (0.4 Da), ~ 100 нг образца загружен на колонке и среднего фракционирования (~ 40 x 2 h, 3.3 дней). Мы также показали, что с помощью компьютерного post-MS коррекции стратегии мы улучшили количественных точности при определении соотношения белков (рисунок 3B).

Наши результаты показывают, что использование оптимизированных параметров LC-MS и post-MS коррекции может обеспечить тщательное proteomic профиль и фактически устранить помехи, которые часто производится Изобарический обозначая методы для белка количественный.

Figure 1
Рисунок 1: Схема состава протеома профилирования анализа TMT-LC/LC-MS/г-жа Десять биологических образцов были лизированы, перевариваются и помечены с 10 различных тегов TMT, обобщённые одинаково и фракционированный в 80 фракций, автономных базовых pH реверс фаза жидкостной хроматографии (LC). Каждая фракция была далее разделены кислой RPLC и проанализированы онлайн с высоким разрешением масс-спектрометр. Файлы raw МС/МС были обработаны и поиск в базе данных Uniprot для идентификации пептидов и белков. Белки были предел согласно относительной интенсивности TMT тэгов. Наконец выявленных и предел белки были представлены для анализа комплексных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: TMT маркировки эффективности экспертизы. Оба TMT-меченых и их соответствующие без маркировки образцы были проанализированы LC-MS/MS отдельно для изучения TMT маркировки энергоэффективности. Для полного TMT маркировки, (A) немеченого пептид пик был полностью отсутствует в образце Приклеенные этикетку, (B), тогда как пептид TMT-меченых присутствовал только в обозначенных образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: вычислительный подход для удаления вмешательства после сбора данных MS. (A) все MS2 сканирования были разделены в чистой (левая панель) и шумный сканирование (правая панель). Шумные сканирует экспонат оба y1 ионов K и R (1 от целевой пептид и других от загрязняющих пептидов). (B) Escherichia coli пептиды индивидуально были помечены с 3 различными реагентами ТМТ и объединены в 1:3:10 соотношений. Примерно кратной больше пептиды крысы были добавлены в качестве фона. Суммируются относительных интенсивностей E. coli пептидов в 3 группах показал, что коррекции на основе ионных y1 является более точным для TMT-основе количественный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описываем высок объём протокол для количественный белков с 10-plex Изобарический маркировки стратегию, которая была успешно внедрена в ряде публикаций12,13,14,32 . В этом протоколе мы можем анализировать до 10 различных белков биологических образцов в 1 эксперимент. Обычно мы можем определить и quantitate свыше 10 000 белки с высокой степенью уверенности. Хотя Изобарический маркировки является эффективной технологии чтобы quantitate белков, он ограничивается коэффициент сжатия, которые могут привести к количественным неточность. Наш протокол, с помощью различных стратегий, таких как оптимизация LC/LC и МС/МС настройки в сочетании с y1 на основе Ион post-MS коррекции, эффективно удаляет большинство эффекты интерференции и поэтому значительно повышает точность количественный белка.

Для белка количественный, прыжок набор функций программы в ряде способами. Мы измеряется изотопный примеси для каждого пакета приобретенных реагентов, который несколько отличается от значения сообщил в условии для поставщиков сертификатов. Измерения изотопного примеси используется для коррекции интенсивности репортер ионов в программном обеспечении прыжок. Белок обычно предел, многие PSMs с различными абсолютной интенсивности, которые находятся под влиянием многочисленных факторов, таких как эффективность ионизации. Потому что влияние факторов неизвестен, массовые спектры показывают только относительного обилия репортер ионов в TMT assay. Относительного обилия репортер ионов рассчитываются путем деления интенсивность каждого иона репортер, средней интенсивности всех 10 журналистов. Чтобы обеспечить лучший представитель «абсолютной сигнал» белка, мы подсчитали, в среднем по относительной интенсивности 3 PSMs с высокой абсолютной интенсивности от белка и среднем сильнейших абсолютной интенсивности для оценки абсолютной сигнал белка. Мы определили эти шаги как масштабирование. Коррекция1 y является универсально применимым к любой TMT анализов; Однако в некоторых случаях мы могли не исправить для пептидов с МС/МС спектры, содержащий Ион1 y. Однако мы обнаружили, что ~ 90% спектры имеют y1 ионов от лизина и аргинина. Чтобы компенсировать помехи, вызванные совместно элюирующие пептидов, которые имеют же остатки C-терминала как выявленных пептид, уровень предполагаемое вмешательство было по существу удвоилось и используется для коррекции. Это предположение было основано на эмпирических данных, которые мы собрали более многочисленные TMT эксперименты, в которых мы наблюдали же уровень интенсивности для y1 в K - и R-содержащих пептидов.

Вмешательство может быть уменьшена многих методов, отличных от того, что мы описали в настоящем Протоколе, например MS3 multinotch подход. Все эти методы являются действительными и имеют их индивидуальных достоинств. В конечном итоге используемая методология зависит от целого ряда факторов, включая, но не ограничиваясь образца суммы, наличие инструмента (например, тип инструмента и время, необходимое для анализа образцы), желаемых результатов (то есть, количество белки определены) и количественный точность, необходимые.

Чтобы обеспечить наиболее точные результаты, важно прислушаться к шаги контроля качества на протяжении всего протокола. К ним относятся использование точных стандартов для образца количественный (например, BSA, которая претерпела анализ аминокислоты), тестирование маркировки эффективности реагента TMT, определения эффективности пищеварения трипсина, выполнение теста соотношение премикс для обеспечения равных смешивания всех 10 образцов и исправить любые смещения загрузки с помощью программного обеспечения. В тех случаях, в которых известный белка или несколько белков ожидается exhibit изменения выражения между отдельными пробами важно выполнять Западный анализ помаркой после начальной ячейки lysis подтвердить, что эти изменения присутствуют и может быть обнаружено. Это гарантирует, что образцы представляют биологии проверяемый и экономит время, деньги и усилия перед проведением весь протокол TMT. Если ожидается, что конкретного образца не выразить некоторые белки, также важно использовать Западный анализ помаркой для подтверждения их отсутствие после лизиса прежде чем продолжить с протоколом. Премикс соотношение теста используется, когда большинство белков, как ожидается, не менять через 10 биологических образцов. Мы также удалены известных загрязняясь протеины, например кератины, поэтому они не будут негативно наша коррекции. Наши количественный метод исправления любых ошибок, которые могут произойти с дозирования ошибки и т.д. Когда это возможно, мы специально используется пипеточные объемом более 5 мкл для уменьшения количества ошибок. Мы провели несколько раундов этот премикс test, чтобы удостовериться, что мы получили Точная смесь 1:1. Важно отметить, что мы не имели этот тип премикс соотношение теста при использовании иммунопреципитации образцов для протокола, как мы ожидали, что большой процент белков для изменения. В таких случаях премикс тест бы исказить результаты. Это также справедливо в отношении любого эксперимента, в котором, как ожидается, по крайней мере 1 10 образцов варьироваться в выражении протеина (пустой вектор, ингибирование протеасом и т.д.) в таких случаях, настоятельно рекомендуется использовать реплицирует для облегчения количественный Статистика. Мы обычно рекомендуем выполнять 3 реплицирует эти виды выборок. В конечном счете количество реплицирует на основе ожидаемых изменчивость каждого образца.

С некоторыми уточнениями, это надежный протокол может использоваться как общий proteomic трубопровода для изучения белков, белковых пути, прогрессирования заболевания и другие биологические функции. Протокол, представленные здесь обеспечивает мощный метод для получения покрытия глубокие белка и уменьшить коэффициент подавления во время количественной оценки. С незначительными изменениями этот протокол может быть легко адаптирована к quantitate Посттрансляционная изменения протеина, например фосфорилирование, ubiquitination и ацетилирование33,34. Эти типы проектов всеобъемлющей протеомики может быть интегрирована с геномика, transcriptomics и, возможно, метаболомики подход биологии систем для понимания биологических систем и содействия Роман открытия молекулярных механизмов, Биомаркеры и терапевтических целей в болезни13,28,35,36,,3738.

Мы продемонстрировали метод точно quantitating свыше 10 000 белки от всего клетки или ткани лизатов. Мы ожидаем этот метод широко применяться для многих биологических систем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят всех других членов лаборатории и учреждения для полезной дискуссии. Эта работа частично была поддержана NI H предоставляет R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 и ALSAC. Был проведен анализ MS в St. Jude Children's исследований больницы протеомики, поддерживаемый, частично гранта NIH рака центр поддержки P30CA021765. Авторы благодарят Nisha Badders за помощь в редактировании рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13, (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85, (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13, (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13, (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28, (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14, (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9, (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13, (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82, (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14, (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13, (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13, (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8, (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89, (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8, (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83, (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8, (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86, (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83, (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15, (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8, (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46, (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15, (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17, (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32, (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11, (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13, (2), 397-406 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics