깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Biochemistry

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Summary

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

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High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

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Abstract

많은 뛰어난 발전 질량 분석 (MS)에서 만들어진-proteomics, 액체 크로마토그래피 (LC)에 특정 기술 진보와 함께 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)을 isobaric 라벨 멀티플렉싱 용량 결합을 기반으로. 여기, 우리는 광범위 한 LC/LC-MS/MS 플랫폼, 그리고 정확 하 게 전체 proteomes을 quantitate 후 MS 전산 간섭 보정 10-플렉스 연동 대량 태그 (TMT) 라벨을 결합 하는 깊은 단백질 프로 파일링 프로토콜을 소개 합니다. 다음과 같은 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜: 단백질 추출 및 소화, TMT 라벨, 2 차원 (2D) LC, 고해상도 질량 분석 및 전산 데이터 처리. 품질 관리 단계는 문제 해결 및 실험적인 변화를 평가 합니다. 포유류 샘플에서 10000 개 이상의 단백질이 프로토콜 자신 있게 quantitated 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 사소한 변화를 가진 포스트 번역 상 수정 정량에도 적용할 수 있습니다. 다중화, 강력한 방법이 다양 한 세포 배양, 동물의 조직, 그리고 인간의 임상 들을 포함 하 여 복잡 한 샘플에서에서 proteomic 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다.

Introduction

차세대 시퀀싱 기술의 발전은 생물 학적 시스템을 연구 하 고 인간의 질병에 대 한 새로운 풍경에 이르렀다. 이 게놈, transcriptome, 프로테옴, 대사체, 및 유형 될 다른 분자 시스템의 측정의 많은 허용 하고있다. 질량 분석 (MS) 분석 화학에서 가장 중요 한 방법 중 하나 이며 proteomics에의 응용 인간 게놈 시퀀싱 후 급속 하 게 확장 했다. 프로 테오 믹스 분야에서 지난 몇 년 동안 MS 기반 정량 분석, isobaric 라벨 및 멀티플렉싱 계측 뿐만 아니라 광범위 한 액체 크로마토그래피와 결합 하는 기능을 포함 하 여 주요 기술 발전을 굴복 했다 진보, 더 빨리, 더 정확한 측정을 위해 필요한 적은 샘플 자료 허용. 양이 많은 proteomics 단백질과 posttranslational 수정 매우 복잡 한 생물 학적 샘플1,2,,34 에 수천 수만의 프로 파일링을 위한 주류 접근 되고있다 , 5 , 6.

멀티플렉스 isobaric 라벨 isobaric 태그 등 상대 및 절대 정량 (, iTRAQ) 및 탠덤 질량 태그 (TMT) MS는 크게 샘플 처리량 향상 방법과 단일에서 분석할 수 있는 샘플 수를 증가 실험1,6,,78. 다른 MS 기반 정량 방법과 함께 레이블 없는 정량 등 안정 동위 원소는 proteomics에 이러한 기술의 잠재력 세포 배양 (, 단기), 아미노산 라벨 필드는 상당한9 10,11. 예를 들어 방송 통신 방법 10 단백질 샘플 10 플렉스 시 약을 사용 하 여 1 실험에 함께 분석을 허용 한다. 이러한 구조적으로 동일 TMT 태그 같은 전체 질량, 하지만 무거운 동위 원소는 차동 상대 정량 함으로써 각 태그의 MS/MS 조각화 동안 독특한 기자 이온 인 탄소 또는 질소 원자에 배포 10 샘플 사이. 방송 통신 전략 생물 학적 경로, 질병의 진행 및 세포질 과정12,,1314에 정기적으로 적용 됩니다.

실질적인 기술 향상 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 시스템, LC 분판와 정량 정확도 희생 하지 않고도 단백질 식별을 최대화 하기 위해 MS 매개 변수 향상 했습니다. 에 2 차원 높은 직교로 분리 기술에 의해 펩 티 드의 첫 번째 차원 분리는이 유형의20최대 결과 달성 하기 위해 샷건 proteomics 방법에 중요 합니다. 높은 pH 반전 단계 액체 착 색 인쇄기 (RPLC)에 기존의 강한 이온-교환 크로마토그래피20보다 더 나은 성능을 제공 합니다. 분석 동적 범위와 단백질 범위 개선 높은 pH RPLC 낮은 pH RPLC의 두 번째 차원, 결합 될 때, 전체 프로테옴 분석15 를 수행할 때 표현한 단백질의 대량을 식별 하는 기능 결과 16,,1718. 기타 기술 진보 작은 C18 입자 (1.9 µ m)를 포함 하 고 긴 열 (~ 1 m)19를 확장. 또한, 다른 주목할 만한 개선 빠른 스캔 속도, 향상 된 감도 및 해상도20, MS 데이터 마이닝21에 대 한 정교한 생물 정보학 파이프라인 질량 분석기의 새 버전을 포함합니다.

여기, 우리는 실험을 통해 품질 관리 메커니즘에 집중 하면서 감도 처리량을 개선 하기 위해 수정 최신 방법론을 통합 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 포함 단백질 추출 및 소화, TMT 10-플렉스 라벨, 기본적인 pH 및 산 성 pH RPLC 분류, 고해상도 MS 검출 및 MS 데이터 처리 (그림 1). 또한, 우리는 문제 해결 하 고 실험적인 변화를 평가 하기 위한 여러 가지 품질 관리 단계를 구현 합니다. 이 상세한 프로토콜 연구원은 새로운 분야를 정기적으로 확인 하 고 정확 하 게는 lysate에서 단백질의 수천을 quantitate 도움을 것입니다 또는 조직.

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Protocol

주의: 사용 하기 전에 모든 관련 안전 데이터 시트 (, MSDS)를 참조 하십시오. 이 프로토콜을 수행할 때 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하십시오.

참고: TMT 10-플렉스 isobaric 라벨 시 약 세트 10 샘플의 프로테옴 정량이이 프로토콜에 사용 됩니다.

1. 준비의 세포/조직

참고: 최소한의 시간에 그들의 원래 생물 학적 상태에서 단백질을 계속 낮은 온도에서 샘플을 수집 하는 것이 중요.

  1. 세척 부착 세포 (예를들면, HEK 293 세포) 얼음의 10 mL로 두 번 10 cm 접시에 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 긁 고 1 mL의 PBS에 셀 (2 ~ 10 6 셀 x)를 수집 합니다. 1.5 mL 튜브에 전송 하 고 세포까지-80 ° C에서 4 ° C. 저장소 셀 알갱이에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리 후 PBS를 제거.
    참고: 파일럿 실험 종종 단백질 수율 검사를 수행 합니다. 단백질의 약 1 밀리 그램 추출 될 수 있다 또는 15 cm 접시 10 x 10 6 포유류 세포에서 80% 합류와.
  2. 또는 직접 접시 세척 후 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 그들의 접시에 부착 세포를 lyse. 1.5 mL 튜브에 lysates를 수집 하 고 사용 프로토콜 설명 단계 2.5.
  3. 수집 정지 15 mL 튜브, 두 번 세척에에서 얼음 차가운 PBS의 10 mL, 1.5 mL 튜브로 전송할 전지와 PBS를 제거 하려면 600 x g에서 원심. 세포의 용 해 버퍼 재료의 원하는 농도 유지 하기 위해 완전히 세척 단계에서 PBS를 제거 합니다. 세포까지-80 ° C에서 셀 펠 릿 저장.
  4. 수집 하 고 조직을 신속 하 게 무게. 조직에서에서 계속 액체 질소 해 부 및 저장 후 즉시-80 ° c.
    참고: 조직의 단백질 수확량은 약 5% ~ 10%의 조직 무게
  5. 동질적인 조직 크기와 10 샘플에 대 한 해부학 영역을 사용 하 여 샘플이 감소. 단백질 정량 및 다운스트림 데이터 분석에 영향을 미치는 매우 풍부한 혈액 단백질을 피하기 위해 얼음 차가운 PBS의 1 mL로 두 번 샘플을 rinsing 하 여 혈액 오염 제거.

2. 단백질 추출, 품질 관리 부 럽, 솔루션에서 소화 및 펩 티 드 담

참고: 줄이기 위해 필수적 이다 TMT 표시 된 샘플의 풀링 하기 전에 어떤 단계 동안 동일한 방식으로 샘플 10의 각 처리 변형.

  • 확인
      세포의 용 해 버퍼 (50 mM HEPES [pH 8.5], 8 M 요소, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate) 실험의 날.
      참고: 샘플 세포 중 일부 단백질 변성에 영향을 미치는 단백질 소화 효율.
    1. 추가 세포의 용 해 버퍼는 버퍼 샘플 볼륨의 비율 10: 1과 ~ 20%의 유리 구슬 (0.5 m m 직경)의 최종 볼륨 셀 펠 릿 또는 조직 (예를 들어, 버퍼 및 샘플 사이의 볼륨 10: 1 비율) 5의 최종 단백질 농도 달성 하기 위해 10 mg/ml. 사용 하는 셀의 수 또는 각 샘플의 조직 무게를 고려 하 여 모든 10 샘플 같은 농도 유지.
    2. 유지 요소 농도 샘플을 고체 요소를 추가 하 여 8 M에. 고체 요소 8 M 농도 달성 하기 위해 샘플에 추가 금액을 계산할 때 셀 펠 릿 또는 조직의 볼륨을 고려 하는 기억.
      참고: 해제 신선한 요소 버퍼 인공 화학 수정 (, 단백질 carbamylation)를 소개 하 고 식별 하는 펩 티 드의 수에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 상당한 볼륨을 차지 하는 우 레 아 (요소의 100 mg 솔루션에서 ~ 73 µ L을 차지).
    3. 23 불용 성 단백질 소화 수 있도록 lysate에서 불용 성 파편을 유지.
    4. Lyse 30 s, 5 s, 그리고 반복에 대 한 나머지 8 속도에서 4 ° C에서 믹서 기에 샘플 5 번 또는 샘플 무 균 때까지. 샘플 30에 대 한 vortexing에 의해 lysed 또한 수 30와 실 온 (RT)에서 s s ~ 10 주기 위한 얼음에 기간을 냉각. 세포의 용 해 조건 샘플 유형에 따라 필요에 따라 조정.
    5. 원심 분리 하지 않고 lysate 잘 혼합 하 고 2 작은 aliquots (~ 15 µ L 각). 서쪽 오 점 분석을 수행 하 여 긍정적인 컨트롤 유효성 검사를 수행 하기 위해 측정 단백질 농도를 1 약 수와 약 수 1을 사용 합니다. Proteomics 분석에 대 한 나머지 큰 약 수 유지.
    6. 측정 단백질 농도 표준 단백질 정량 분석 결과 또는는 Coomassie 스테인드 짧은 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 (10%) 22 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 함께 표준으로. BSA 표준을 사용 하 여 알려진된 농도 정확도의 높은 학위와 함께. 정확도 높은 수준을 달성 하기 위해 BSA 표준의 아미노산 분석을 수행.
      참고: 다른 정확한 기준을 사용할 수 있습니다. 단백질 농도 또한 핸드폰 번호 또는 조직 가중치 추정 수 있습니다. 단백질 (100 µ g/샘플)의 1 밀리 그램을 권장 되지만 분석 단백질 (10 µ g/샘플)의 작은 100 µ g으로 수행할 수 있습니다.
    7. 추가 100% 이기 (ACN) 1: 100 (w/w) 매우 2 h 1에 대 한 실시간 조건을 변성 시키기에서 단백질을 소화 하는 효소-기질 비율에서 10% = 뉴스 및 LysC 효소의 최종 농도 달성 하기 위해. 단백질에 있는 이황화 결합을 1 헤 7.2 M 우 레 아의 최종 농도에서 수행 LysC 소화에 대 한 품 어 1 m m의 최종 농도를 dithiothreitol (DTT) 추가.
    8. 샘플을 2m 50 mM HEPES (pH 8.5)를 가진 우 레 아와 3 h에 대 한 실시간에 트립 신 다이제스트 샘플 추가 희석 또는 단백질 비율 1:50 (w/w)의 트립 신에서 하룻밤. 약 10 ng / µ L의 트립 신 농도를 100 µ g 단백질의 트립 신의 사용 약 2 µ g.
      참고: 비효율적인 트립 신 소화 될 수 있는 요소는 pH 문제, 비활성 트립 신, 또는 기판에 효소의 부적당 한 비율의 사용.
    9. 1mm 항복을 더 실시간에 2 h에 대 한 펩 티 드를 감소 DTT 추가
    10. 추가 iodoacetamide (IAA) 10 m m를 달성 하기 위해. Cys 포함 된 펩 티 드 알을 어둠 속에서 30 분 동안 RT에서 품 어.
    11. DTT 30 m m를 달성 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어를 추가 하 여 unreacted IAA를 끄다
    12. 각 샘플의 작은 약 수를 검사 하 여 트립 신 소화의 효율성을 확인 하십시오. 죽은 공간에 포함 된 크로마토그래피 미디어 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 제조 업체에 따르면 desalt ' s 프로토콜. 각 샘플 분석 LC-MS/양 LC-MS/MS에 의해 매개 변수는 그라데이션 10 분 23는 예외와 함께 5 단계에서와 같이.
    13. 검색 매개 변수로 4 놓친된 분열을 사용 하 여 MS 원시 데이터 (6 단계에서 더 많은 정보를 참조)에 대 한 데이터베이스 검색을 수행.
      참고: 경우의 수는 분열을 놓친은 > 10%, 그것은 불완전 한 트립 신 소화를 나타낼 수 있습니다. 이 부정적인 다운스트림 결과 영향을 것입니다. 이것은 중요 한 품질 관리 (QC) 단계.
    14. 놓친된 분열 경우 샘플을 다시 소화 > 샘플에는 추가 10 µ L의 트립 신을 추가 하 여 10%.
    15. 는 Trifluoroacetic 산 (TFA) 1% 농도 달성 하기 위해 추가 하 여 샘플을 시 어 지 다. 산도 스트립을 사용 하 여 pH를 측정 합니다. PH 내기 확인2와 3을 싸우는. 더 많은 TFA 드롭 현명한 (1 µ L) 올바른 pH 달성 될 때까지 필요에 따라 추가.
    16. 10 분 및 수집은 상쾌한 RT에서 20000 x g에서 원심 분리기.
    17. 100 µ g 샘플을 사용 하는 경우 메탄올의 0.25 mL C18 역 상 수 지를 포함 하는 0.5 ~ 60 µ g 용량 스핀 열 세척. 0.03에 30 µ g 용량 스핀 열 60%의 0.25 mL 세척 ACN/0.1% TFA 10 µ g 샘플을 사용 하는 경우. 500 x g 30에 스핀 열 원심 s.
    18. Centrifuging 500 x g 30에 의해 0.5 mL 0.1 %TFA 제거와 열 평형 s.
    19. 샘플 열에 로드 하 고 3 분 또는 때까지 모든 샘플 열 통과 100 x g에서 원심 분리 하 여 열에 바인딩할 샘플.
    20. 0.5 mL 0.1%의 추가 열을 30 500 x g에서 원심 분리기 TFA s.
    21. 60%의 추가 125 µ L을 각 열 ACN/0.1% TFA centrifuging 100 x g 3 분 확인 모든 솔루션 열 통과에 의해 elute 고.
    22. 건조 진공 집중 장치에서 eluents. 샘플 튜브에서 완전히 건조 하 고 더 액체 남아 확인 하십시오. 추가 분석까지-80 ° C에서 저장소.

    3. TMT 라벨의 펩 티 드

    참고: 모든 샘플 완전히 TMT 시 약에 의해 표시 확인 하는 것이 중요. 여러 요인 (, TMT 시 약 사용의 금액, pH 값, 단백질 정량의 정확도) TMT 부정적인 모든 다운스트림 결과 변경 효율 라벨에 영향을 미칠 수.

    50 mM HEPES buffer (pH 8.5)의 50 µ L에서
      각 reconstitute
    1. desalted 펩 티 드 샘플. 산도 확인 하 고 그것은 7과 8 사이 확인.
      참고: 샘플 라벨 효율에 영향을 미칠 것 이다 염 단계 후 완전히 건조 하지 경우 산 성 수.
    2. 단계 3.3에에서 설명 된 대로 테스트에 대 한 후속 TMT 라벨 효율, 레이블이 각 샘플의 ~ 1 µ g를 유지.
    3. 무수 ACN 시 약 TMT를 해산 하 고 펩 티 드 샘플 제조 업체에 따라 라벨 ' s 지시. 1 헤에 대 한 실시간에 시 약을 품 어
    4. 제조 업체에 따라 포함 된 크로마토그래피 미디어 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 각 TMT 레이블-레이블 없는 샘플의 염 ~ 1 µ g에 의해 QC TMT 라벨 효율 테스트를 수행 ' s 프로토콜. LC-MS/양 여 TMT 분류, 레이블이 없는 샘플 분석
      참고: LC-MS/MS 매개 변수는 그라데이션 10 분은 예외 섹션 5에서와 같이
    5. 레이블이 펩 티 드를 보장 완전 한 라벨 효율 ( 그림 2) 표시 샘플에서 검색 되지 않습니다 수 있도록 원시 데이터를 검사 합니다. 6 ~ 10 라벨 효율성을 확인 하기 위해 별도 펩 티 드에 대 한이.
    6. 담금질 5 %hydroxylamine 4 µ L을 추가 하 여 반응 하 고 15 분에 대 한 품 어
    7. 혼합 각 TMT 표시 된 샘플의 작고 동등한 볼륨 (2 µ L) 약 수 있습니다. Desalt 임베디드 크로마토그래피 미디어 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여. 3.4 단계에서 설명한 대로 LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다. 점프 소프트웨어 프로그램 (오픈 소스 데이터베이스 검색 알고리즘을 펩 티 드와 단백질의 목록에 탠덤 MS raw 파일을 변환)를 사용 하 여 모든 10 샘플의 상대적 농도 비율의 TMT 태그 농도 의해 결정 확인 펩 티 드.
      참고: QC 섞은 비율 테스트는 최종 풀링 하기 전에 동등한 혼합에 대 한 정확한 비율을 결정 하는 데 도움이, 농도 변경 됩니다 고 단백질 정량 단계 되지 않을 수 있습니다 항상 정확한 pipetting 오류가 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 3.5 단계에서 설명한 대로 최종 믹스 사용 10 샘플의 각각의 금액 모두 동등한 비율에는 보장 하는 가장 좋은 방법은.
    8. 모든 10 샘플에서 1:1 비율을 달성 하는 데 필요한 횟수 만큼 반복 합니다.
    9. 동등 하 게 섞은 비율 테스트의 결과 따라 10 샘플 혼합. 기준으로 최저 농도와 예제를 사용 하 여 다른 9 샘플의 볼륨 조정.
    10. 담 여 풀링된 TMT 표시 된 샘플의 냉각 반응의 부산물 제거.
    11. 워시 1 mL 고체 상 추출 카트리지 50 mg와 1/0.25 mL 메탄올의 열당 매를 포함 하는 100 µ g 샘플을 사용 하는 경우. 씻어 0.5 µ-60 g 용량 C18 스핀 열으로 1/0.25 mL 60%의 ACN/0.1% TFA 10 µ g 샘플을 사용 하는 경우. 500 x g 30에 열 원심 s.
    12. Centrifuging 500 x g 30에 의해 0.5 mL 0.1 %TFA 제거와 열 평형 s.
    13. 샘플 열에 로드 하 고 3 분 또는 때까지 모든 샘플의 열 통과 100 x g에서 원심 분리 하 여 바인딩합니다.
    14. 0.5 mL 0.1%의 추가 열을 30 500 x g에서 원심 분리기 TFA s.
    15. 추가 125 µ L 60%의 각 열에 ACN/0.1% TFA 고 3 분 모두 솔루션의 열 통과 확인을 위한 100 x g에서 centrifuging 의해 elute.
    16. 건조 진공 집중 장치에서 eluents. 샘플 튜브에서 완전히 건조 하 고 더 액체 남아 확인 하십시오. 추가 분석까지-80 ° C에서 저장소.

    4. 광범위 한 고해상도, 기본적인 pH LC Prefractionation

    1. 세트 2 연결된 C18 열 브리지 에틸렌 하이브리드 입자 (4.6 m m x 25 cm, 50 cm 총, 3.5 µ m 입자 크기)를 포함 하 고 위한 microliter 흐름 고성능 LC 펌프를 사용 하 여 분별 법.
      참고: 2 열 사용 펩 티 드 부하 증가 하 고 반드시 크로마토그래피를 개선 하지 않습니다. 포함 된 샘플에 대 한 ≤ 펩 티 드의 200 µ g, 1 열이 충분.
    2. 세척 (10 m m 염화 편대, pH 8.0) 300 µ L 각의 메탄올, 물, 그리고 버퍼 A의 후속 추가 100 µ L 루프.
    3. 똑같이 혼합된 소 프로 파 놀, 메탄올, ACN, 및 물 100 µ L 열 세척 하 고 95% 버퍼 2 h. A 열 equilibrate
    4. Solubilize 버퍼 A. 확인 샘플 pH 8.0 ~은의 65 µ L에서 desalted 풀링된 TMT 표시 된 펩 티 드 샘플. 아직도 산 성를 사용 하 여 수산화 암모늄 pH 8.0 조정.
    5. Fractionate 샘플 버퍼 B 다음 그라디언트를 사용 하 여 (버퍼 더하기 90 %ACN): 15 분 동안 15% ~ 20%, 20% ~ 35 %100 분, 및 30 분에 대 한 35% ~ 50% 설정 수집 분수를 분수 수집기 로딩 시간을 포함 한 모든 2 분. 0.4 mL/min 흐름 속도 설정. 대표적인 크로마 참조 29 그림 1을 참조 하십시오.
    6. 80 분수의 총을 수집 하 고 완벽 한 건조에 진공 집중으로 40 분수 (모든 다른 분수) 건조.
    7. LC-MS/MS 분석을 위한 40 말린된 샘플을 사용 하 여.
    8. LC-MS/MS 매우 깊은 프로테옴 범위를 달성 하 여 모든 80 분수 분석.

    5. LC-MS/MS 준비 및 매개 변수

    참고: TMT에 기반 정량, 펩 티 드 이온 isobaric 고 MS1 스캔에서 1 질량으로 나타납니다. 그러나, 그들은 있다 quantitated 기자 이온 (10 독특한 기자 이온)의 강도 따라 MS/MS 스캔에서 펩 티 드 이온 높은 에너지 충돌 분리 (HCD)와 조각화 되었습니다 후. TMT 기자 이온 비율 TMT 표시 된 이온 24의 공동 차입에서 억제 될 수 있습니다. 이온 격리 창 25, 가스 단계 정화 26, MultiNotch MS3 방법 27 또는 다차원 LC와 긴 그라디언트 (4-8 h) 광범위 한 분류를 축소 28 가지 대체 방법을.

    1. 팩 75 µ m 내경 (ID) 빈 1.9 µ m 40 c m 길이 (~1.3 µ L 침대 볼륨) 30 C18 수 지의 열.
    2. 는 Backpressure을 통해 매우 높은 압력의 압력 방지 나비 포트폴리오 히터 65 ° C에서 열 열 액체 크로마토그래피 (UPLC) 시스템입니다. 2 ~ 3 배 온 열 침대 길이가 열 되도록 나비 히터에서 열을 코일. 히터는 히터 내부 온도 센서에 테이프 주의 안쪽 열 테이프.
      참고: 나비 포트폴리오 히터는 탑재 하 고 악기의 XYZ 단계에 연결 된 플 렉 시 유리의 맞춤 조각에 녹화.
    3. 준비는 (3% 디 메 틸 sulfoxide 및 0.2% 개미 산 성)를 버퍼링 하 고 B 버퍼 (버퍼 더하기 67 %ACN) 95% 버퍼 B. 철저 하 게 열을 씻어 다음, 완전히 열 95% 버퍼 A에에서 (적어도 3 열 볼륨) equilibrate. ~0.25 µ L/분의 유량을 사용 하 여 280 320 바의 배 압
    4. 100을 실행 하 여 LC-MS/MS 시스템의 품질을 검토 쥐 두뇌 펩 티 드 (또는 우리의 선택의 표준) TMT 표시 된 샘플을 분석 하기 전에 두 번의 ng. 자주 높은-품질 데이터 수집을 위해 다음 매개 변수를 확인 하십시오: MS 신호 강도 (사이 e8, e9 기본 피크 강도 대 한) 조사 MS/MS 스펙트럼 (y와 b 이온의 좋은 표현), 최대 폭 (12 월 22 일 s), 전반적인 보존 기간, 품질 LC 시스템 압력 (압력 상승 > 50 바 나타냅니다 더러운 열 또는 막힌된 미터 팁), 그리고 실행 실행 가능한 가변성 (동일한 봉우리 이어야 한다 < 30 s 실행 사이의).
      참고: 10 플렉스 TMT 시 약 (6.32 mDa 차이)의 근처 isobaric 기자 이온을 해결 하려면 MS/MS 해상도 400 m/z에 30000 이상 설정 되어야 합니다. HCD 일반적으로 사용 됩니다 TMT10 플렉스 기자 이온 조각화로 이온 함정 악기에 충돌 유도 된 분리 (CID)에 적용 되는 1 / 3 규칙 적용 되지 않습니다.
    5. 클린 MS 악기를 정기적으로 보정 하 고 신선한 LC 버퍼를 사용 하 여 시스템 성능을 향상.
    6. 5%에서 기본적인 pH 분리에서 말린된 펩 티 드 reconstitute TFA.
    7. ~0.2 µ g 흐르는 5% 버퍼 대답 하는 동안 열에 로드
    8. Elute 버퍼 B 150 분의 45%에 15%와 함께. 시작 지점으로 다음 그라디언트 사용: 시간 0, 버퍼 B 5%; 시간 2, 버퍼 B 15%; 135, 버퍼 B 45%를 시간, 145, 버퍼 B 70%; 그리고 시간 150, 버퍼 B 95%. 기본 피크 chromatograms를 검토 한 후 약간 초기 및 런타임에 기본 pH RPLC 분수에 대 한 그라디언트를 조정.
    9. 이온 트랩 질량 분석기 (400-1600 m/z; 60000; 1 x 10 6 자동 이득 제어 (AGC) 대상; 50 최대 이온 시간; 확인과 중심 모드)에서 조사 스캔 데이터 종속 모드에서 질량 분석기를 작동합니다. 20 MS/MS 고해상도 스캔 (60000 해상도, 1 x 10 5 AGC 대상, ~ 100 ms 최대 이온, 35 HCD 정규화 충돌 에너지, 0.4 m/z 격리 창, 시간과 20 s 동적 제외) 수행.
      참고: 전자 이동 분리 (ETD)은 권장 되지 않습니다 TMT10 플렉스 시 약 ETD 분열 사이트 HCD에서 다르기 때문에 기자 이온 오버랩의 결과. 또한, ETD은 효과적으로 HCD tryptic 펩 티 드 일반적으로 + 2 충전된 상태, 생성 및 ETD 높은 충전 상태에서 더 효율적입니다 때문에.

    6. MS 데이터 분석

    참고: 점프 소프트웨어 프로그램과 데이터 분석 설명. 그러나 다른 상업적으로 사용할 수 또는 무료 프로그램과 데이터 분석을 수행 하는,.

    1. 태그 기반 하이브리드와 질량 분석기에서 프로세스 raw 파일 검색 엔진 점프 21, 패턴 기반 데이터베이스 검색 및 태그 기반 드 노 보 시퀀싱 민감도 특이성을 개선 하기 위해 결합 하.
    2. 변환 mzXML 원시 데이터 형식과 MS2 스펙트럼 틀린 발견 비율 (FDR) 계산 대상 미끼 UniProt 인간의 데이터베이스 (또는 다른 적절 한 종의 데이터베이스)에 대 한 검색.
    3. 수행 전조와 조각 이온을 위한 10 ppm 질량 허용 오차를 사용 하 여 검색 합니다. 2 최대 놓친된 분열, 펩 티 드, 당 3 최대 수정 사이트와 , b 및 점수는 펩 티 드 y 이온의 할당 완전히 tryptic 제한에 다른 검색 매개 변수를 설정 합니다. Lys 잔류물 및 N termini에 TMT 태그 정적 수정 설정 (+229.162 Da) 그리고 Cys의 잔류물의 carbamidomethylation (+57.021 다). 메트로 산화를 포함 하도록 동적 수정 설정 (+15.994 Da), 샘플 처리에서 발생 하는 일반적인 펩 티 드 아티팩트입니다.
    4. 다음 필터 데이터 기준: 7 아미노산 펩타이드 최소 길이, m/z 정확도 (, 5 ppm), 및 일치 점수 (J 점수와 deltaCn). 펩 티 드는 펩 티 드 길이, trypticity에 따라 그룹화 하 고 충전 상태.
    5. 점수와 일치 하 여 필터링의 추가 수준을 사용 하 여 단백질을 루즈벨트 1% 감소. 단일 스펙트럼 수로 확인 된 단백질 필요 높은 일치 점수.
    6. 펩 티 드 단백질 가족의 여러 구성원에 의해 공유 클러스터 일치 단백질 회원 1 그룹에 대 한.
      참고: 간결 원칙에 따라 그룹으로 표시 됩니다 할당 된 펩 티 드의 가장 높은 번호와 단백질 및 다른 단백질에 독특한 펩 티 드 1 일치.
    7. 점프 소프트웨어 제품군에 내장 된 프로그램을 사용 하 여 모든 일치 펩 티 드 스펙트럼 일치 (Psm)에 걸쳐 기자 이온 수를 요약 하 여 단백질을 quantitate.
    8. 각 PSM 허용, 추출 및 라벨 시 약 및 글로벌 PSM 정량 데이터에서 계산 된 로드 바이어스의 동위 원소 분포에 따라 방송 통신 기자 이온 농도 수정. 정량 중 낮은 강도와 높은 잡음 레벨 사용자 정의 임계값과 Psm를 필터링.
    9. 상대 신호 각 기자 이온 사이의 모든 10 기자 이온의 평균을 계산합니다. 합계는 Psm의 상대적인 신호 확인 된 단백질에 대 한. 해당 단백질에 상위 3 Psm의 평균된 기자 이온 강도 곱하여 절대 신호에 상대적인 신호 변환.
    10. 후 MS 계산 방법을 사용 하 여 간섭 문제 해결. Y 1 이온 강도 기자 이온 강도에 비례, 깨끗 한 검사에서 선형 관계를 계산와 시끄러운 스캔 23에 오염 된 y1ion 강도에서 간섭 레벨을 파생.
      참고: TMT 표시 tryptic 펩 티 드에 대 한 K-TMT와 R 잔류물의 2 종류가 y 1 이온 (376.27574 Da와 175.11895 다, 각각) MS2 검사에. 경우에 1 y 1 이온 감지 되 고 식별 된 펩 티 드와 일치 하는는 MS2 깨끗 한 스캔 ( 그림 3A)으로 간주 됩니다. 두 y1ions 검색 되는 MS2 시끄러운 스캔 하다.
    11. 는 단백질 정량 값 추가 분석을 위해 스프 레트 시트 소프트웨어 프로그램에 내보냅니다. 인덱스도 비교 또는 분석의 차이 사용 하 여 차동 표현 단백질 확인.

    7. MS 데이터 유효성 검사

    참고: MS 데이터의 품질을 평가 하 시간이 걸리는 생물학 실험을 진행 하기 전에 적어도 1 방법의 유효성 검사를 수행.

    1. 수동으로 펩 티 드 순서 및 방송 통신 기자 이온 정량 확인 하는 관심사의 단백질의 MS/MS 스펙트럼 검사.
    2. MS 결과 확인 하려면 단백질 정량 데이터를 알려진 사용.
    3. 항 체 기반 접근 방식 (예를 들어, weste 확인 단백질 변화rn 오 점 및 immunohistochemistry 분석).
    4. 화학적 관심의 펩 티 드를 합성 하 고 네이티브 펩 티 드의 id를 확인 하려면 내부로 표준 사용.
      참고: 해당 MS/MS 패턴 및 LC-MS/MS 동안 보존 기간 동일 해야 합니다.
    5. 타겟된 MS 방식으로 단백질 변화를 확인 합니다.
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    Representative Results

    우리는 pre-MS 분류, MS 설정 및 post-MS 수정23를 포함 하 여 3 주요 프로토콜 단계에서 비율 압축의 효과 체계적으로 분석 하는 앞에서 설명한 간 종 펩 티 드 믹스를 사용. Pre-MS 분류 평가 되었고 기본적인 pH RPLC의 조합 및 산 성 pH RPLC 사용 하 여 최적화 된. Post-MS 분석만 종의 펩 티 드로 간주 됐다. 이 간섭 모델 LC/LC-MS/MS, MS2 격리 창, 온라인 액정 해상도, 로드 양의 온라인 산 성 pH RPLC, 및 오프 라인 높은 pH RPLC의 해상도 포함 하 여 매개 변수를 검사 하는을 사용 하는 우리 (참조 그림 3 참조 29)입니다.

    오프 라인 LC 중 해상도 변경, 우리 320 조각으로 isobaric 레이블이 펩 티 드를 분리 하 고 분리 전원 조정 하려면 함께 선택한 분수 합니다. 오프 라인 액정 해상도 간섭 레벨을 모니터링 하는 동안 수집 된 일부 하위 집합 (1, 5, 10, 20, 40, 80, 및 320)의 수를 사용 하 여 테스트 되었습니다. 우리는 간섭 수준 발견 점차적으로 16.4%에서 2.8%로 감소, 다소 오프 라인 LC 별거 동안 그 광범위 한 분류를 나타내는 공동 펩 티 드 방출의 문제를 완화 했지만 완전히 제거 할 수는 합니다.

    다음으로, 우리는 간섭에 MS2 격리 창의 효과 평가. 우리는 실험적으로 방해 했다 이전 연구29,30와 격리 창의 크기에 대략 비례 결정 됩니다. 예를 들어 4-fold 차이 창 크기 (1.6 0.4 다)의 결과 ~ 유추 수준 (14.4% 3.7%)의 4-fold 차이. 우리는 또한 MS 분석에 대 한 열의에 최적의 로드 금액을 결정 하 고 더 방해를 부정 하는이 정보를 사용. 우리는 적절 한 양의 샘플을 로드 하 여 3.3%로 9.4%에서 방해를 감소. 너무 많은 샘플을 로드 이어질 피크31 을 확대 하 고 따라서 감소 단백질 정량 정확도 결과 간섭 레벨을 올릴 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 그라디언트 길이 (1, 2, 및 4 h)를 변경 하 고 긴 열 (~ 45 cm)를 사용 하 여 온라인 RPLC 해상도 최적화. 우리는 4-h 그라데이션 거의 (0.4%)까지 간섭 제거 하지만 악기 시간 추가 발견. 최적화 된 매개 변수 공개 좁은 격리 창 (0.4 다), ~ 100 ng 샘플의 열, 그리고 간부의 분류 (x 2 h, 3.3 일 ~ 40)에 로드 된. 우리는 또한 그는 post-MS 교정 컴퓨터 기반 전략을 사용 하 여 우리가 개선 양적 정밀 (그림 3B) 단백질 비율을 결정할 때 보였다.

    우리의 결과의 사용 최적화 LC MS 매개 변수 및 post-MS 교정 철저 한 proteomic 프로필을 제공할 수 있으며 사실상 종종 단백질 정량 isobaric 라벨 기술에 의해 생산 되는 간섭 제거를 나타냅니다.

    Figure 1
    그림 1: TMT-LC/LC-MS/양 전체 프로테옴 프로 파일링 분석의 계획 10 생물 학적 샘플 lysed, 소화, 되었고 10 다른 TMT 태그, 오프 라인 기본 pH 역 상 액체 크로마토그래피 (LC)에 의해 동등 하 게, 풀링된 및으로 분류 한 80 분수와 함께 표시. 모든 다른 분수 신랄 한 RPLC 구분 추가 되었고 온라인 고해상도 질량 분석기로 분석. MS/MS raw 파일 처리 되었고 펩 티 드 및 단백질 식별 Uniprot 데이터베이스에 대 한 검색. 단백질은 TMT 태그의 상대적 강도 따라 quantitated 했다. 마지막으로, 확인 및 quantitated 단백질 통합 데이터 분석을 위해 제출 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 2
    그림 2: 방송 통신 효율 시험 라벨. TMT 레이블이 모두 LC-MS/MS TMT 효율 라벨 검사를 별도로 분석 했다 그들의 해당 샘플을 레이블 없음. 전체 TMT 라벨에 대 한 (A) 레이블이 펩타이드 피크는 완전히 TMT 표시 된 펩 티 드 레이블된 샘플에만 반면 분류 샘플, (B)에서 결 석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 3
    그림 3: MS 데이터 수집 후 간섭 제거를 위한 전산 접근. (A) 모든 MS2 검사 깨끗 한 (왼쪽된 패널)와 시끄러운 스캔 (오른쪽 패널)로 분할 되었다. 시끄러운 검사 전시 두 y1 이온의 K와 R (대상 펩 티 드와 펩 티 드를 오염 하는에서 다른 사람에서 1). (B) 대장균 펩 티 드 했다 개별적으로 3 다른 TMT 시 약으로 분류 하 고 1: 3에서 풀링된: 10 비율. 약 20-fold 더 많은 쥐 펩 티 드 배경으로 추가 되었다. 3 그룹에 대장균 펩 티 드의 총계 상대 농도 y1 이온 기반 보정 TMT 기반 정량에 대 한 더 정확 하 게 밝혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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    Discussion

    여러 출판물12,,1314,32에서에서 성공적으로 구현 되었습니다는 10-플렉스 isobaric 라벨 전략으로 단백질의 정량에 대 한 높은 처리 프로토콜 설명 . 이 프로토콜에서 우리 1 실험에서 최대 10 다른 생물학 단백질 견본을 분석할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 식별 하 고 높은 자신감을가지고 잘 10000 단백질을 quantitate 수 있습니다. Isobaric 라벨은 단백질을 quantitate에 효과적인 기술, 비록 양적 부정확성으로 이어질 수 있는 비율 압축에 의해 제한 됩니다. LC/LC의 최적화와 함께 y1 이온 기반 post-MS 교정, MS/MS 설정 등 다양 한 전략을 사용 하 여 우리의 프로토콜 효과적으로 대부분의 간섭 효과 제거 하 고 따라서 상당히의 정밀도 향상 단백질 정량입니다.

    단백질 정량, 여러 가지 방법으로 프로그램 기능 점프 제품군에 대 한 우리는 공급 업체에서 제공한 인증서에서 보고 된 값에서 약간 다릅니다 구입한 시 약의 모든 배치를 위한 동위 원소 불순물 측정. 측정된 동위 원소 불순물 점프 소프트웨어에서 기자 이온의 농도 수정 하는 데 사용 됩니다. 단백질은 일반적으로 이온화 효율 등의 여러 요인에 의해 영향을 다양 한 절대 농도와 많은 Psm으로 quantitated 됩니다. 요인의 영향 알려져, 때문에 질량 스펙트럼 TMT 분석 결과에서 기자 이온의 상대적인 나타났는데만 공개. 기자 이온의 상대적인 나타났는데 모든 10 기자 들의 평균 강도 의해 각 기자 이온의 강도 나누어 계산 됩니다. 최고의 대표는 단백질의 "절대 신호"를 제공 하려면 우리 단백질에서 높은 절대 농도와 3 Psm의 상대 농도의 평균와 절대 추정 하 강한 절대 강도의 평균 계산 단백질의 신호입니다. 우리는 리 스케일링으로 이러한 단계를 정의. Y1 교정은 어떤 사건 분석;에 보편적으로 적용 되 그러나, 어떤 경우에 우리가 수 정정 하지 펩 티 드에 대 한 y1 이온을 포함 하는 MS/MS 스펙트럼으로. 그러나, 우리는 스펙트럼의 ~ 90%는 리 신과 아르기닌에서 y1 이온 발견. 공동 식별 된 펩 티 드로 같은 C 맨끝 잔류물을 펩 티 드 방출로 인 한 간섭에 대 한 보상, 예상된 간섭 레벨 본질적으로 두 배로 되었고 교정에 사용. 이 가정은 우리는 우리가 y1 K R 포함 펩 티 드에 대 한 동일한 강도 레벨을 관찰 하는 수많은 방송 통신 실험을 통해 수집 된 경험적 증거에 근거 했다.

    방해는 우리가 MS3 multinotch 접근 등이 프로토콜에서 설명 된 다른 많은 방법으로 줄일 수 있습니다. 이러한 메서드의 모든 유효 하 고 그들의 개인적인 장점을. 궁극적으로, 사용 하는 방법론 등 요인의 수에 따라 다릅니다에 국한 되지 않는 샘플 금액, 악기 여부 (, 악기 종류 및 샘플을 분석 하는 데 필요한 시간), 원하는 결과 (, 수의 식별 하는 단백질의 경우) 및 정량 정확도 필요.

    가장 정확한 결과 보장 하기 위해, 그것은 프로토콜에 걸쳐 품질 관리 단계를 주의 하는 것이 중요입니다. 이러한 샘플 (예를 들면, 아미노산 분석을 겪고 있다 BSA), 정량에 대 한 정확한 표준을 사용 하 여 포함 TMT 시 약의 라벨 효율 테스트, 트립 신 소화의 효율을 결정, 프리 믹스 비율 테스트 수행 에 모든 10 샘플의 동등한 혼합 어떤 로드 바이어스를 해결 하기 위해 소프트웨어를 사용 하 여 확인 합니다. 알려진된 단백질 또는 여러 단백질 것으로 예상 된다 개별 샘플 사이 식 변화를 전시 하는 경우에 이러한 변화는 검출 될 수 있다을 확인 초기 세포 세포의 용 해 후 서쪽 오 점 분석을 수행 하기 위해 중요 하다. 이렇게 하면 샘플 테스트를 생물학을 대표 하 고 전체 방송 통신 프로토콜 수행 하기 전에 시간, 돈 및 노력을 저장. 경우 특정 샘플 특정 protein(s)를 표현 하지, 그것은 또한 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 세포의 용 해 프로토콜 계속 하기 전에 후 그들의 부재를 확인 하는 것이 중요. 프리 믹스 비율 테스트는 대부분 단백질 10 생물 학적 샘플에서 변경 되지 것으로 예상 된다 때 사용 됩니다. 우리 또한 알려진된 오염 단백질, keratins, 등 그들은 부정적인 우리의 교정 미치지 않을 제거 합니다. 우리의 정량 pipetting 오류, 등에서 발생 한 모든 오류에 대 한 해결 방법입니다. 가능 하면 우리는 특히 오류를 줄이기 위해 5 µ L 보다 큰 피 펫 볼륨을 사용 합니다. 우리는 우리가 정확한 1:1 혼합 얻을 수 있도록이 섞은 테스트의 여러 라운드를 수행. 그것은 주의 우리 않았다 때 수행 하지 섞은 비율 시험의이 유형은 immunoprecipitation 샘플을 사용 하 여 프로토콜에 대 한 우리가 변경 하려면 단백질의 큰 비율을 예상 하는 것이 중요. 이러한 경우에 섞은 테스트 결과 왜곡 것 이다. 이것은 또한 적어도 1 10 샘플의 단백질 표정 (빈 벡터, 프로테아좀 억제, ) 같은 경우에 크게 달라질 것으로 예상 된다 어떤 실험의 사실,이 좋습니다 복제를 사용 하 여 정량 촉진 하 통계입니다. 일반적으로 이러한 유형의 샘플에 대 한 복제 3을 수행을 권장 합니다. 궁극적으로, 복제의 수는 각 샘플의 예상된 변화 기반으로 합니다.

    일부 조정와 함께이 강력한 프로토콜 사용할 수 있습니다 일반적인 proteomic 파이프라인으로 단백질, 단백질 경로, 질병의 진행, 그리고 다른 생물 학적 기능을 조사. 여기에 제시 된 프로토콜 깊은 단백질 범위 정량화 동안 비율 억제를 완화 하는 강력한 기법을 제공 합니다. 사소한 수정이 프로토콜 quantitate acetylation33,34, ubiquitination, 등 인 산화 단백질 posttranslational 수정에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이러한 유형의 포괄적인 proteomics 프로젝트 유전체학, transcriptomics, 그리고 생물 학적 시스템을 이해 하 고 분자 메커니즘의 새로운 발견을 용이 하 게 하는 시스템 생물학 접근에 대 한 대사체학와 통합 될 수 있다 생체, 그리고 치료 대상 질환13,28,35,36,,3738에.

    우리가 정확 하 게 전체 셀 또는 조직 lysates에서 10000 이상의 단백질을 quantitating 하는 방법을 설명 했다. 우리는 많은 생물 학적 시스템에 광범위 하 게 적용할 수 있도록이 메서드를 기대 합니다.

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    Disclosures

    저자는 공개 없다.

    Acknowledgments

    저자는 모든 다른 연구소 및 시설 회원을 도움이 토론에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 부분적으로 지원 되었다 NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, 및 ALSAC 부여. MS 분석 세인트 주드 어린이 연구 병원 Proteomics 시설, 보건원 암 센터 지원 그랜트 P30CA021765에 의해 부분적으로 지원 되는에서 수행 되었다. 저자에 대 한 원고를 편집 도움말 Nisha Badders 감사 합니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1220 LC system Agilent G4288B
    50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
    Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
    Bullet Blender Next Advance BB24-AU
    Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
    C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
    Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
    DMSO Sigma 41648
    Formic acid Sigma 94318
    Fraction Collector Gilson FC203B
    Glass Beads Next Advance GB05
    HEPES Sigma H3375
    Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
    Lys-C Wako 125-05061
    Methanol Burdick & Jackson AH230-4
    Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
    Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
    nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
    ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
    Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
    Sodium deoxycholate Sigma 30970
    Speedva Thermo Scientific SPD11V
    TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
    Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
    Trypsin Promega V511C
    Urea Sigma U5378
    Xbridge Column C18 column Waters 186003943
    Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
    SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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