Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att exakt kvantifiera proteiner med isobariska märkning, omfattande fraktionering, bioinformatiska verktyg och kvalitetskontroll steg i kombination med vätskekromatografi kopplats ihop till en högupplöst masspektrometer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

High, A. A., Tan, H., Pagala, V. R., Niu, M., Cho, J. H., Wang, X., Bai, B., Peng, J. Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification. J. Vis. Exp. (129), e56474, doi:10.3791/56474 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Många enastående framsteg har gjorts i masspektrometri (MS)-baserad proteomik, med särskilda tekniska framsteg i vätskekromatografi (LC) kopplat till tandem masspektrometri (LC-MS/MS) och isobariska märkning multiplexering kapacitet. Här introducerar vi ett deep-proteomik profilering protokoll som kombinerar 10-plex tandem mass tagg (TMT) märkning med en omfattande LC/LC-MS/MS-plattform, och efter MS computational störningar korrigering att exakt kvantifiera hela proteom. Detta protokoll omfattar följande huvudsteg: protein utvinning och matsmältning, TMT märkning, 2-dimensionell (2D) LC, högupplösande masspektrometri och computational databehandling. Åtgärder för kvalitetskontroll ingår för felsökning och utvärdering av experimentell variation. Mer än 10.000 proteiner i däggdjur prover kan vara tryggt quantitated med detta protokoll. Detta protokoll kan också tillämpas på kvantitering av inlägget translationella modifieringar med smärre ändringar. Multiplexering, robust metoden ger ett kraftfullt verktyg för proteomiska analys i en mängd komplexa prover, inklusive cellkultur, djurvävnader och mänskliga kliniska prover.

Introduction

Framsteg i nästa generations sekvensering teknik har lett till ett nytt landskap för att studera biologiska system och mänskliga sjukdomar. Detta har möjliggjort ett stort antal mätningar av genomet, transkriptom, proteomet, bröstmjölkssammansättningen och andra molekylära system att bli påtagliga. Masspektrometri (MS) är en av de mest känsliga metoderna i analytisk kemi och dess tillämpning i proteomik expanderat snabbt efter kartläggningen av det mänskliga genomet. I fältet proteomik, har de senaste åren gett stora tekniska framsteg i MS-baserade kvantitativa analyser, inklusive isobariska märkning och multiplexing förmåga i kombination med omfattande vätskekromatografi, förutom instrumentering förskott, vilket möjliggör snabbare, exaktare mätningar med mindre provmaterial krävs. Kvantitativ proteomik har blivit en mainstream strategi för profilering tiotusentals proteiner och posttranslationalen ändringar i mycket komplexa biologiska prover1,2,3,4 , 5 , 6.

Multiplexade isobariska märkning metoder såsom isobariska tagg för relativ och absolut kvantifiering (dvs., iTRAQ) och tandem mass tagg (TMT) MS har kraftigt förbättrat provkapacitet och ökade antalet prover som kan analyseras i en enda experiment1,6,7,8. Tillsammans med andra MS-baserad kvantitering metoder, såsom etikett-fri kvantifiering och stabil isotop märkning med aminosyror i cellkultur (dvs.SILAC), potentialen hos dessa tekniker i proteomik är fältet betydande9 ,10,11. Till exempel tillåter metoden TMT 10 protein prov som ska analyseras tillsammans i 1 experiment genom att använda 10-plex reagenser. Dessa strukturellt identisk TMT-Taggar har samma totala massan, men tunga isotoper är differentially fördelade på kol eller kväve atomer, vilket resulterade i en unik reporter ion under MS/MS fragmentering av varje tagg, vilket möjliggör relativ kvantifiering mellan de 10 proverna. TMT strategin används rutinmässigt för att studera biologiska spridningsvägar, sjukdomsprogression och cellulära processer12,13,14.

Betydande tekniska förbättringar har förstärkt vätskekromatografi (LC)-MS/MS system, både vad gäller LC separationer och MS parametrar, att maximera protein identifiering utan att offra kvantitering noggrannhet. Första-dimension separation av peptider genom en separation teknik med hög ortogonalitet till den andra dimensionen är avgörande i denna typ av hagelgevär proteomik metod för att uppnå maximalt resultat20. Hög-pH omvänd fas vätskekromatografi (Byt) ger bättre prestanda än konventionella stark katjon-exchange kromatografi20. När hög-pH Byt kombineras med en andra dimension av låg-pH Byt, både analytiska dynamiskt omfång och protein täckning förbättras, vilket resulterar i förmåga att identifiera huvuddelen av uttryckta proteiner när du utför hela-proteomet analyser15 ,16,17,18. Andra tekniska framsteg inkluderar små C18 partiklar (1,9 µm) och extended lång kolumn (~ 1 m)19. Andra anmärkningsvärda förbättringar är dessutom nya versioner av masspektrometrar med snabb scan priser, förbättrad känslighet och upplösning20och sofistikerade bioinformatik rörledningar för MS data mining21.

Här beskriver vi ett detaljerade protokoll som omfattar de senaste metoderna med ändringar för att förbättra både känslighet och genomströmning, medan du fokuserar på mekanismer för kvalitetskontroll i hela experimentet. Protokollet innehåller protein utvinning och matsmältning, TMT 10-plex märkning, grundläggande pH och syra pH Byt fraktionering, högupplösta MS upptäckt och MS databehandling (figur 1). Dessutom genomför vi flera kvalitetskontroll steg för felsökning och utvärdering av experimentell variation. Detta detaljerade protokoll är avsedd att hjälpa forskare nya till fältet rutinmässigt identifiera och korrekt kvantifiera tusentals proteiner från en lysat eller vävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

försiktighet: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (dvs MSDS) före användning. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner när du utför detta protokoll.

Obs: en TMT 10-plex isobariska etikett reagens som används i detta protokoll för proteomet kvantitering av 10 prover.

1. beredning av cellerna eller vävnaderna

Obs: det är viktigt att samla in prover i minimal tid vid låg temperatur att hålla proteiner i biologiska ursprungsversionen.

  1. Tvätta vidhäftande celler (t.ex., HEK 293 celler) på en 10 cm platta två gånger med 10 mL is kallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Skrapa och samla celler (~ 2 x 10 6 celler) i 1 mL PBS. Överför till 1,5 mL rör och avlägsna PBS efter centrifugering vid 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Store cell pellets vid-80 ° C tills lysis.
    Obs: En pilot experiment utförs ofta för att undersöka protein avkastning. Cirka 1 mg av proteiner kan extraheras från 10 x 10 6 däggdjursceller eller från en 15 cm tallrik med 80% sammanflödet.
  2. Lyse alternativt fastsittande celler på sin tallrik lägga till lyseringsbuffert direkt till plattan efter tvätt. Samla lysates i 1,5 mL rör och använda protokoll beskrivning i steg 2.5.
  3. Samla suspension celler i 15 mL rör, tvätta två gånger med 10 mL is kallt PBS, överföra i 1,5 mL rör och centrifugera 600 x g ta bort PBS. Ta bort PBS från tvätta stegen helt för att upprätthålla önskad koncentration av Lys buffert ingredienser. Lagra cell pellets vid-80 ° C tills lysis.
  4. Samlar in och väga vävnader snabbt. Hålla vävnader i flytande kväve omedelbart efter dissektion och store vid -80 ° C.
    Obs: Protein utbytet av vävnader är cirka 5% till 10% av vävnaden vikt
  5. använda homogen vävnad storlekar och anatomiska regioner för 10 prover för att minska prov heterogenitet. Ta bort blod kontaminering genom att skölja prov två gånger med 1 mL is kallt PBS att undvika mycket riklig Blodproteiner som påverkar protein kvantifiering och nedströms dataanalys.

2. Protein utvinning, kvalitetskontroll Western Blotting, i-lösning matsmältningen och peptid avsaltning

Obs: hantering av varje av 10 prover på samma sätt under varje steg innan sammanslagningen av TMT-märkt prover är viktigt att minska variation.

  1. Göra lyseringsbuffert (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M urea och 0,5% natriumdeoxikolat) dagen för experimentet.
    Obs: Partiell protein denaturering under provet lysis påverkar protein matsmältningen effektivitet.
  2. Lägg till lysis buffert så att förhållandet mellan buffert till provvolymen är 10:1 och ~ 20% av den slutliga volymen av glaspärlor (0,5 mm i diameter) till cell pellets eller vävnader (t.ex., 10: 1 förhållandet mellan buffert och prover) att uppnå en slutlig proteinkoncentration av 5 10 mg/ml. Hålla alla 10 prover samma koncentration genom att beakta antalet celler används eller vävnad vikten av varje prov.
  3. Underhåll urea koncentration på 8 M genom att lägga fast urea till provet. Kom ihåg att överväga volymen av cellpelleten eller vävnad när beräkningen av solid urea att lägga till provet att uppnå 8 M koncentrationen.
    Obs: Un-färska urea buffert kan införa konstgjord kemisk modifiering (dvs, protein carbamylation) och negativt påverka antalet peptider som identifierats. Urea upptar en betydande volym (100 mg urea upptar ~ 73 µL i lösningen).
  4. Hålla olösliga skräp i den lysate att tillåta matsmältningen av olösliga proteiner 23.
  5. Lyse proverna i en mixer vid 4 ° C hastighet 8 för 30 s, resten för 5 s, och upprepa 5 gånger eller tills proven är homogeniserad. Proverna kan också vara lyserat av vortexa för 30 s vid rumstemperatur (RT) med en 30 s kylning period på is för ~ 10 cykler. Justera lysis villkor som nödvändigt, beroende på provet.
  6. Blanda lysate brunnen utan centrifugering och göra 2 små delprover (~ 15 µL varje). Använd 1 alikvot till åtgärd proteinkoncentration och 1 alikvot för att utföra positiv kontroll validering genom att utföra western blot analys. Hålla den återstående stora alikvoten för proteomik analys.
  7. Åtgärd proteinkoncentration av en standard protein kvantifiering analys eller av en Coomassie-färgade kort sodium dodecyl sulfate Polyakrylamidgelen (10%) 22 med bovint serumalbumin (BSA) som standard. Använd en BSA-standarden med en hög grad av känd koncentration noggrannhet. För att uppnå den högsta nivån av noggrannhet, utföra aminosyra analys av standarden BSA.
    Obs: Andra korrekt standarder kan vara tillgängliga. Koncentrationerna som protein kan också uppskattas genom cell nummer eller vävnad vikter. Även om 1 mg protein (100 µg/prov) rekommenderas, analysen kan utföras med så lite som 100 µg av protein (10 µg/prov).
  8. Lägg till 100% acetonitril (ACN) att uppnå en slutlig koncentration av 10% ACN och LysC proteashämmare på en enzym-till-substrat förhållandet 1: 100 (w/w) att smälta proteiner under mycket denatureringen villkor på RT för 2 h 1. Lägg till Ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration på 1 mM för att minska disulfide obligationer i proteiner och inkubera i 1 h. utföra LysC matsmältning med en slutlig koncentration på 7,2 M urea.
  9. Späd prover till 2 M urea med 50 mM HEPES (pH 8,5) och ytterligare digest prover med trypsin på RT för 3 tim eller över natten på en trypsin protein-förhållandet 1:50 (w/w). Använd ca 2 µg av trypsin för 100 µg av protein och en trypsin koncentration av ca 10 ng/µL.
    Obs: Faktorer som kan leda till ineffektiva trypsin matsmältningen är pH problem, inaktiva trypsin eller användningen av en olämpligt förhållandet av enzym till substrat.
  10. Lägg till DTT avkastning 1 mM och ytterligare minska peptider för 2 h på RT.
  11. Lägg till iodoacetamide (IAA) att uppnå 10 mM. Inkubera vid RT i 30 min i mörkret att alkylate Cys-innehållande peptider.
  12. Släcka oreagerad IAA genom att lägga till DTT för att uppnå 30 mM och inkubera i 30 min på RT.
  13. Kontrollera effektiviteten av trypsin matsmältningen genom att undersöka en liten del av varje prov. Avsalta genom att använda en 10 µL pipettspetsen med kromatografi media inbäddade i döda rymden, enligt tillverkaren ' s-protokollet. Analysera varje prov av LC-MS/MS. LC-MS/MS parametrar är samma som i steg 5, med det undantaget att lutningen är 10 min 23.
  14. Utför en databas sökning för MS rådata (se mer i detalj i steg 6) genom att använda 4 missade Klyvningar som en sökparameter.
    Obs: Om antalet missade Klyvningar är > 10%, kan det indikera ofullständig trypsin matsmältningen. Detta kommer att påverka efterföljande resultat negativt. Detta är en kritisk kvalitetskontroll (QC) steg.
  15. Smälta prover igen om missade klyvning är > 10% genom att lägga till ett ytterligare 10 µL av trypsin proverna.
  16. Syrsätt proverna genom att lägga till trifluorättiksyra (TFA) att uppnå koncentration av 1%. Mäta pH-värdet med hjälp av en pH-remsa. Kontrollera att pH är insatsWeen 2 och 3. Tillsätt mer TFA droppe klokt (1 µL) som behövs tills rätt pH uppnås.
  17. Centrifugera vid 20 000 x g vid RT i 10 min och samla supernatanten.
  18. Tvätta 0,5 till 60 µg kapacitet spin kolumner som innehåller C18 omvänd-fas harts med 0,25 mL metanol om använder 100 µg prover. Tvätta 0,03 till 30 µg kapacitet spin kolumner med 0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA om använder 10 µg prover. Centrifugera spin kolumner vid 500 x g för 30 s.
  19. Jämvikta kolumner med 0,5 mL av 0,1% TFA och ta bort genom centrifugering vid 500 x g för 30 s.
  20. Ladda prover på kolumner och binda prover till kolumner genom centrifugering vid 100 x g i 3 min eller tills alla provet har passerat genom kolonnen.
  21. Tillsätt 0,5 mL av 0,1% TFA till kolumner och centrifugera vid 500 x g för 30 s.
  22. Lägg till 125 µL av 60% ACN/0.1% TFA till varje kolumn och eluera genom centrifugering vid 100 x g i 3 min. Kontrollera att all lösning har passerat genom kolonnen.
  23. Torka eluenter i en vakuum koncentrator. Se till att proven är helt torr och inte vätska kvar i rören. Förvaras vid-80 ° C tills vidare analys.

3. TMT märkning av peptider

Obs: det är viktigt att se till att alla prover märks fullt av TMT reagenser. Flera faktorer (t.ex. mängden TMT reagenser som används, pH-värde och noggrannhet för protein kvantifiering) kan påverka TMT märkning effektivitet, som negativt kommer att påverka alla efterföljande resultat.

  1. Rekonstituera varje desalted peptid provet i 50 µL av 50 mM HEPES buffert (pH 8,5). Kontrollera pH och se till att det är mellan 7 och 8.
    Obs: Urvalet vara sura om inte torkat helt efter avsaltning steget, som kommer att påverka märkning effektivitet.
  2. Hålla ~ 1 µg av varje omärkt prov för en efterföljande TMT märkning testet, som beskrivs i steg 3.3.
  3. Lös TMT reagenser i vattenfri ACN och etikett peptid prover genom att följa tillverkaren ' anvisningar. Inkubera reagenser på RT för 1 h.
  4. Utföra en QC TMT märkning testet genom avsaltning ~ 1 µg av varje TMT-märkt och -omärkt prov med 10 µL pipettspetsar med inbäddade kromatografi media enligt tillverkaren ' s-protokollet. Analysera TMT-märkt och omärkt prover av LC-MS/MS.
    Obs: LC-MS/MS parametrar är densamma som i avsnitt 5, med det undantaget att lutningen är 10 min.
  5. Undersöka raw-data för att säkerställa att omärkt peptider inte upptäcks i märkta proven, att säkerställa fullständig märkning effektivitet ( figur 2). Gör detta för 6 till 10 separata peptider att verifiera märkning effektivitet.
  6. Släcka reaktionen genom att lägga till 4 µL av 5% hydroxylamin och inkubera i 15 min.
  7. Blanda en liten och lika volym (2 µL) alikvot av varje TMT-märkt provet. Avsalta med 10 µL pipettspetsar med inbäddade kromatografi media. Analysera proverna med LC-MS/MS, som beskrivs i steg 3,4. Använda programmet hoppa programvara (en öppen databas sökalgoritm som konverterar tandem MS raw-filer till en lista av peptider och proteiner) att avgöra den relativa förhållandet av alla 10 prover av TMT tagg stödnivåerna alla identifierade peptider.
    Obs: Denna QC premix baserat test är till hjälp att bestämma det rätta förhållandet för lika blandning innan slutgiltig sammanslagning, som pipettering fel kan inträffa som kommer att förändra koncentrationer och protein kvantifiering steget kanske inte alltid är korrekt. Det är också det bästa sättet att säkerställa att beloppet av varje av de 10 prover som används för den slutliga blandningen är alla på ett lika förhållande, som beskrivs i steg 3.5.
  8. Upprepa så många gånger som behövs för att uppnå en 1:1 ratio över alla 10 prover.
  9. Blanda lika 10 proverna enligt resultaten av testet premix baserat. Använda provet med den lägsta koncentrationen som baslinje för att justera volymerna av de andra 9 proverna.
  10. Ta bort biprodukter av släcka reaktionen av poolade TMT-märkt provet genom avsaltning.
  11. Tvätta 1 mL fasta fasen extraktion patroner innehållande 50 mg sorbent per kolumn med 1 mL/0,25 mL metanol om använder 100 µg prover. Tvätta 0,5 - till 60-µg kapacitet C18 spin kolumner med 1 mL/0,25 mL 60% ACN/0.1% TFA om använder 10 µg prover. Centrifugera kolumner vid 500 x g för 30 s.
  12. Jämvikta kolumner med 0,5 mL av 0,1% TFA och ta bort genom centrifugering vid 500 x g för 30 s.
  13. Ladda prover på kolumner och binda genom centrifugering vid 100 x g i 3 min eller tills alla provet har passerat genom kolonnen.
  14. Tillsätt 0,5 mL av 0,1% TFA till kolumner och centrifugera vid 500 x g för 30 s.
  15. Lägg till 125 µL av 60% ACN/0.1% TFA till varje kolumn och eluera genom centrifugering vid 100 x g i 3 min. Kontrollera att all lösning har passerat genom kolonnen.
  16. Torka eluenter i en vakuum koncentrator. Se till att proven är helt torr och inte vätska kvar i rören. Förvaras vid-80 ° C tills vidare analys.

4. Omfattande högupplöst, grundläggande pH LC Prefractionation

  1. Set 2 anslutna C18 kolumner som innehåller bryggade eten hybrid partiklar (4,6 mm x 25 cm, totalt 50 cm; 3,5 µm partikelstorlek) och använda en mikroliter flöde högpresterande LC pump för fraktionering.
    Obs: Användning av 2 kolumner ökar peptid belastning och förbättrar inte nödvändigtvis kromatografi. För prover som innehåller ≤ 200 µg av peptider, 1 kolumn räcker.
  2. Tvätta 100-µL slingan med senare tillägg av 300 µL varje metanol, vatten och buffert A (10 mM ammonium formate, pH 8,0).
  3. Tvätta kolonnerna med 100 µL av lika blandade isopropanol, metanol, ACN, och vatten och låt jämvikta kolonnen i 95% buffert A för 2 h.
  4. Solubilize desalted poolade TMT-märkt peptid provet i 65 µL buffert A. Verifiera att provet pH är ~ 8.0. Om fortfarande surt, använda ammoniumhydroxid för att justera pH till 8.0.
  5. Fractionate prov med följande övertoningen med buffert B (buffert en plus 90% ACN): 15% till 20% i 15 min, 20% till 35% för 100 min och 35% till 50% för 30 min. Ställ bråkdel samlare att samla fraktioner varje 2 min inklusive laddningstid. Ställa in flödet till 0,4 mL/min. Se referens 29 och figur 1 för ett representativt kromatogram.
  6. Samla totalt 80 fraktioner och torka 40 fraktioner (varje andra fraktion) med en vakuum koncentrator till fullständig torrhet.
  7. Använder de 40 torkade proverna för LC-MS/MS analys.
  8. Analysera alla 80 fraktioner av LC-MS/MS att uppnå extremt djupa proteomet täckning.

5. LC-MS/MS förberedelse och parametrar

Observera: I TMT-baserade kvantitering, peptid joner är isobariska och visas som 1 massan i en MS1 scan. Dock är de quantitated enligt intensiteten av reporter joner (10 unika reporter joner) i MS/MS scan efter peptid jonen har splittrats med högre energi kollision dissociation (HCD). TMT reporter ion nyckeltalen kan undertryckas från samtidig eluering av TMT-märkt joner 24. Förträngning av ion isolering fönster 25, gas-fas rening 26, MultiNotch MS3 metod 27 eller omfattande fraktionering med flerdimensionella LC och långa lutningar (4-8 h) 28 är alternativa metoder.

  1. Pack 75 µm innerdiameter (ID) Töm kolumner med 1,9 µm C18 harts till 30 till 40 cm längd (~1.3 µL säng volym).
  2. Värma kolumnerna vid 65 ° C med en fjäril portfölj värmare att minska mottrycket och förhindra över pressa av ultra-hög-tryck vätskekromatografi (UPLC) system. Spolen kolumnen 2 till 3 gånger inom fjäril värmaren se till att hela sängen kolumnlängden värms. Tejpa kolumnen på insidan av värmaren vara noga med att inte tejpa över temperatursensorn inuti värmaren.
    Obs: Fjäril portfölj värmaren monteras och tejpade på en skräddarsydd bit plexiglas bifogas XYZ scenen instrumentets.
  3. Förbered buffert en (3% dimetyl sulfoxid och 0,2% myrsyra) och buffert B (buffert en plus 67% ACN) och tvätta kolonnerna grundligt med 95% buffert B. Sedan, helt jämvikta kolumner i 95% buffert A (minst 3 kolumn volymer). Använda en flödeshastighet av ~0.25 µL/min och mottrycket i 280 till 320 bar
  4. Undersöka kvaliteten på LC-MS/MS systemet genom att köra 100 ng av råtta hjärnan peptider (eller standard av vårt val) två gånger innan analysera TMT-märkt proverna. Kontrollera följande parametrar ofta för att säkerställa hög kvalitet datainsamling: undersökning MS signalintensitet (mellan e8 och e9 för bas peak intensitet), kvaliteten på MS/MS spectra (en bra representation av y och b joner), toppens bredd (12-22 s), övergripande retentionstid, LC systemtrycket (tryckökning > 50 barer indikerar en smutsig kolumn eller igensatt emitter tip), och kör-och-kör variabilitet (identiska toppar bör < 30 s mellan körningar).
    Obs: Lös nära-isobariska reporter jonerna 10-plex TMT reagenser (6.32 mDa skillnad), MS/MS resolutionen måste anges till minst 30 000 på 400 m/z. HCD används vanligtvis för TMT10-plex reporter ion fragmentering, eftersom det inte omfattas av en tredjedel regeln som gäller kollision inducerad dissociation (CID) i ion trap instrument.
  5. Rena och kalibrera instrumentet MS regelbundet och använder färska LC buffertar för att förbättra systemets prestanda.
  6. Beredes de torkade peptiderna från grundläggande pH avskiljandet i 5% TFA.
  7. Ladda ~0.2 µg på kolumnen medan flödande 5% buffert A.
  8. Elute med 15% till 45% av buffert B i 150 min. Som utgångspunkt, använda följande övertoningen: tid 0, buffert B 5%; tid 2, buffert B 15%; gången 135, buffert B 45%, gången 145, buffert B 70%; och tid 150, buffert B 95%. Justera lutningen något för tidiga och sena grundläggande pH Byt fraktioner efter att ha granskat bas peak kromatogrammen.
  9. Fungerar masspektrometer i data-beroende-läge med en undersökning scan i den ion trap massa analyzer (400-1600 m/z; 60.000 upplösning; 1 x 10 6 Automatisk gain control (AGC) mål; 50 ms maximal ion tid; och centroiden läge). Utföra 20 MS/MS högupplösta skannar (60.000 upplösning, 1 x 10 5 AGC mål, ~ 100 ms maximal ion tid, 35 HCD normaliserade kollision energi, 0.4 m/z isolering fönster och 20 s dynamiska utslagning).
    Obs: Elektron överföring dissociation (ETD) rekommenderas inte för TMT10-plex reagenser eftersom ETD klyvning webbplatser skiljer sig från HCD, vilket resulterar i reporter ion överlappning. Dessutom ETD är inte effektivt som är HCD eftersom tryptic peptider vanligtvis genererar + 2 laddade stater, och ETD är effektivare vid högre laddningstillstånd.

6. MS dataanalys

Obs: vi beskriver dataanalys med hoppa program. Men dataanalys kan utföras med andra kommersiellt tillgängliga eller gratis program.

  1. Process raw-filer från masspektrometer med tagg-baserad hybrid söka motor JUMP 21, som kombinerar en mönster-baserad databas sökning och en tagg-baserad de novo sekvensering att förbättra känsligheten och specificiteten.
  2. Konvertera rådata till mzXML format och söka MS2 spectra mot målet-decoy UniProt mänskliga databasen (eller annan lämplig artspecifika databas) att beräkna falsk upptäckten (FDR).
  3. Utför sökningar med hjälp av en 10 ppm massa tolerans för både föregångare och fragment joner. Ange andra sökparametrar till fullt tryptic begränsning med 2 maximal missade Klyvningar, 3 högsta modifiering platser per peptid och tilldelningen av a, b och y joner till Poäng peptiderna. Ställa in statiska ändringar till TMT taggar på Lys rester och N termini (+229.162 Da) och carbamidomethylation av Cys rester (+57.021 Da). Ställ in dynamiska ändringar inkludera Met oxidation (+15.994 Da), som är en gemensam peptid artefakt följd provhantering.
  4. Filtrera data med följande kriterier: 7 aminosyra minsta peptid längd, m/z noggrannhet (t.ex., 5 ppm), och matchande noter (J Poäng och deltaCn). Gruppera peptider enligt peptid längd, trypticity, och debitera staten.
  5. Använda en ytterligare nivå av filtrering genom att matcha noter för att minska protein FDR till under 1%. Proteiner som identifieras av en enda spektrala räkna kräver en högre matchande poäng.
  6. För peptider som delas av flera medlemmar av en protein familj, kluster matchade protein medlemmarna i 1 grupp.
    Obs: Enligt principen om sparsamhet, koncernen är representerad av proteinet med det högsta antalet tilldelade peptider och andra proteiner som matchas av unika peptider 1.
  7. Kvantifiera proteiner genom att summera reporter ion räknas över alla matchade peptid spektrum matcher (PSMs) med ett program inbyggt i hoppa programsviten.
  8. För varje accepterade PSM, extrahera och korrigera TMT reporter ion stödnivåerna enligt den isotopiska fördelningen av märkning reagenser och lastning bias, som beräknas från den globala PSM kvantitering data. Filtrera PSMs med låg intensitet och hög ljudnivå med användardefinierade tröskelvärden under kvantitering.
  9. Beräkna en relativ signal mellan varje reporter ion och genomsnittet av alla 10 reporter joner. Summera relativa signalerar av PSMs för de identifiera proteinerna. Konvertera dessa relativa signaler till absoluta signaler genom att multiplicera i genomsnitt reporter ion intensiteten av de topp 3 PSMs i motsvarande proteiner.
  10. Använd en efter MS computational metod för att korrigera störningen. Förutsatt att y 1 ion intensitet är proportionell mot reporter ion intensiteten, beräkna linjära förhållandet från ren skanningar och härleda nivån störningar från förorenade y1ion intensiteten i bullriga skanningar 23.
    Obs: För TMT-märkt tryptic peptider, K-TMT och R rester finns 2 typer av y 1 joner (376.27574 Da och 175.11895 Da, respektive) i MS2 genomsökningar. Om bara 1 y 1 ion upptäcks och är konsekvent med den identifierad peptiden, anses MS2 rena scan ( figur 3A). Om båda y1ions upptäcks, MS2 anses en bullrig scan.
  11. Exportera protein kvantifiering värdena till ett kalkylprogram programvara för vidare analys. Använda parvisa jämförelser eller en variansanalys för att identifiera proteiner som uttrycks differentially.

7. MS dataverifiering

Obs: för att utvärdera kvaliteten på MS data, minst 1 metod för validering ska utföras innan du fortsätter med tidskrävande biologiska experiment.

  1. Manuellt granska MS/MS spektra av proteiner av intresse att validera peptid sekvens och TMT reporter ion kvantitering.
  2. Användning känd protein kvantifiering data för att bekräfta resultaten MS.
  3. Verifiera protein förändringar med antikroppsbaserade metoder (t.ex., det westeRN blot och immunohistokemi analys).
  4. Kemiskt syntetisera peptiderna sevärdheter och använda dem som interna standarder för att bekräfta identifieringen av infödda peptider.
    Obs: Sin MS/MS mönster och retentionstiden under LC-MS/MS bör vara identiska.
  5. Verifierar protein förändringar med en målinriktad MS strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi använde en tidigare beskrivna mellan djurarter peptid blandning att systematiskt analysera effekten av baserat på kompression i 3 stora protokollstegen, inklusive pre-MS fraktionering, MS inställningar och post-MS korrigering23. Den pre-MS fraktionering var utvärderas och optimerad med hjälp av en kombination av grundläggande pH Byt och sura pH Byt. För post-MS analys ansågs endast artspecifika peptider. Vi använde denna störning modell för att undersöka ett antal parametrar i LC/LC-MS/MS, inklusive MS2 isolering fönster, online LC upplösning, lastning mängden online sura pH Byt och upplösning av den offline hög-pH-Byt (se figur 3 i referens ( 29).

För att ändra resolutionen under offline LC, vi separerade isobariska märkt peptiderna till 320 fraktioner och sedan kombinerade valda fraktioner tillsammans för att justera separation makt. Offline LC resolution testades med hjälp av ett antal insamlade bråkdel undergrupper (1, 5, 10, 20, 40, 80 och 320), medan övervakning störning nivåerna. Vi fann att störningar nivåerna minskade gradvis från 16,4% till 2,8%, vilket indikerar att omfattande fraktionering under offline LC separation något mildras problemet med samtidig eluering peptider men var inte kan helt ta bort den störningar.

Nästa, vi utvärderat effekten av fönstret MS2 isolering på störningar. Vi bestämmas experimentellt att störningen var ungefärligt proportionell mot storleken på fönstret isolering, i samförstånd med tidigare studier29,30. Till exempel en 4-faldig skillnad på fönstrets storlek (1,6 till 0,4 Da) resulterade i en ~ 4-faldig skillnad av inferens nivå (14,4% till 3,7%). Vi har också fastställt optimal lastning på kolumnen för MS analys och används denna information för att ytterligare motverka störningar. Vi minskade störningen från 9,4% till 3,3% av fylla rätt mängd prov. Laddar för mycket prov kan leda till peak bredda31 och därför höja störningar, vilket resulterar i minskad protein kvantifiering noggrannhet. Slutligen har optimerat vi online Byt resolutionen genom att ändra lutning längderna (1, 2 och 4 h) och använder en lång kolonn (~ 45 cm). Vi hittade att en 4-h lutning nästan elimineras störningar (ner till 0,4%) men också lagt till instrument tiden. De optimerade parametrarna avslöjade ett smalt isolering fönster (0.4 Da), ~ 100 ng av provet lastas på kolumn och midlevel fraktionering (~ 40 x 2 h, 3,3 dagar). Vi visade också att vi med hjälp av en datorbaserad post-MS korrigering strategi bättre kvantitativa precision vid fastställandet av protein nyckeltal (figur 3B).

Våra resultat tyder på att användning av optimerad LC-MS parametrar och post-MS korrigering kan ge en grundlig proteomiska profil och praktiskt taget eliminera de störningar som ofta produceras av isobariska märkning tekniker för protein kvantifiering.

Figure 1
Figur 1: systemet för hela-proteomet profilanalys av TMT-LC/LC-MS/MS. Tio biologiska prover var lyserat, rötas och märkt med 10 olika TMT taggar, poolade lika, och fraktionerade in 80 fraktioner av offline grundläggande pH omvänd-phase vätskekromatografi (LC). Varje andra bråkdel var ytterligare avgränsade med sura Byt och analyserat online med en högupplöst masspektrometer. MS/MS råfiler var bearbetas och sökning mot en databas med Uniprot för peptid- och identifiering. Proteiner var quantitated enligt de relativa intensitet TMT taggar. Slutligen lämnades de identifiera och quantitated proteinerna för integrativ dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: TMT märkning effektivitet undersökning. Båda TMT-märkt och deras motsvarande omärkt prover analyserades med LC-MS/MS separat för att undersöka TMT märkning effektivitet. För full TMT märkning, (A), omärkt peptiden peak var helt frånvarande i märkt provet, (B) medan TMT-märkt peptiden var endast i märkt provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Computational strategi för störningar borttagning efter MS datainsamling. (A) alla MS2 skanningar delades in i ren (vänster) och bullriga skanningar (höger panel). Bullriga skanningar uppvisar båda y1 joner av K och R (1 från en mål-peptid och de andra från att förorena peptider). (B) Escherichia coli peptider var individuellt märkt med 3 olika TMT reagenser och poolade 1:3:10 nyckeltal. Cirka 20-fold mer råtta peptider lades till som bakgrund. De summerade relativa intensitet av E. coli peptiderna i 3 grupper visade att y1 ion-baserade korrigering är mera exakt för TMT-baserade kvantifieringsmetoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver ett hög genomströmning protokoll för kvantitering av proteiner med en 10-plex isobariska märkning strategi, som har genomförts framgångsrikt i flera publikationer12,13,14,32 . I detta protokoll, kan vi analysera upp till 10 olika biologiska protein prover i 1 experiment. Vi kan rutinmässigt identifiera och kvantifiera väl över 10 000 proteiner med högt förtroende. Även om isobariska märkning är en effektiv teknik för att kvantifiera proteiner, är det begränsat genom baserat kompression som kan leda till kvantitativa felaktighet. Våra protokoll som använder olika strategier, såsom optimering av LC/LC och MS/MS inställningar i kombination med y1 ion-baserade post-MS korrigering, tar effektivt bort de flesta störningseffekter och därför förbättrar avsevärt precision protein kvantifiering.

För protein kvantifiering, hoppa svit av program funktioner i ett antal sätt. Vi mätte den isotopiska orenhet för varje parti av köpta reagenser, som skiljer sig något från de rapporterade värdena i certifikat som tillhandahålls av leverantören. Den uppmätta isotopiska förorening används för att korrigera reportern joner i programvaran hoppa stödnivåerna. Ett protein är vanligtvis quantitated av många PSMs med olika absolut intensitet som påverkas av flera faktorer, såsom jonisering effektivitet. Eftersom inverkan av faktorerna är okänd, avslöja masspektra endast de relativa förekomsten av reporter joner i en TMT-analys. De relativa förekomsten av reporter joner beräknas genom att dividera varje reporter ion intensitet av genomsnittliga intensiteten av alla 10 reportrar. För att ge den bästa representanten ”absoluta signal” av protein, beräknat vi genomsnitt 3 PSMs relativa stödnivåerna med de högsta absoluta intensiteter från proteinet och genomsnittet av de starkaste absolut intensiteten att uppskatta absolut signal om proteinet. Vi definierade stegen som skalas. Y1 korrigering är allmänt tillämplig på någon TMT analyser; dock i vissa fall kunde vi inte korrigera för peptider med MS/MS spectra som innehåller y1 jonen. Vi fann dock att ~ 90% av spectra har y1 jonerna från både lysin och arginin. För att kompensera för de störningar som orsakas av samtidig eluering peptider som har samma C-terminal resthalter som identifierade peptiden, var nivån uppskattade störningar i huvudsak fördubblats och som används för korrigering. Detta antagande bygger på empiriska bevis som vi har samlat över talrika TMT experiment, där vi observerat samma intensitetsnivå för y1 i K - och R-innehållande peptider.

Störningar kan minskas genom många andra metoder än vad vi har beskrivit i detta protokoll, till exempel metoden MS3 multinotch. Alla dessa metoder är giltiga och har sina egna meriter. Slutligen, den metod som används beror på ett antal faktorer, inklusive men begränsat inte till provmängd, instrumentet tillgänglighet (dvs, instrumenttyp och tid som krävs för att analysera prover), önskat resultat (dvs, det antal proteiner identifierats), och kvantitering noggrannhet som krävs.

För att säkerställa de mest exakta resultaten, är det viktigt att beakta kvalitetskontroll stegen i hela protokollet. Dessa inkluderar med korrekt standarder för provet kvantitering (t.ex., BSA som genomgått aminosyra analys), provning märkning effektiviteten av TMT reagens, av trypsin matsmältningen effektivitet, utför en premix baserat test för att säkerställa en lika blandning av alla 10 prover, och använder en programvara för att korrigera någon lastning bias. I fall där en känd protein eller flera proteiner förväntas uppvisar uttryck förändringar mellan enskilda prover, är det viktigt att utföra western blot analys efter den inledande cellys att bekräfta att dessa förändringar är närvarande och kan upptäckas. Detta säkerställer att proverna representerar biologi ska testas och sparar tid, pengar och ansträngning innan de utför hela TMT protokollet. Om ett särskilt prov förväntas inte uttrycka vissa proteinernas, är det också viktigt att använda western blot analys för att bekräfta deras frånvaro efter Lys innan du fortsätter med protokollet. Premix baserat på testet används när de flesta proteiner förväntas inte förändras över de 10 biologiska proverna. Vi också bort kända kontaminerande proteiner, såsom keratins, så de inte skulle påverkade våra korrigering. Vår kvantitering metod korrigerat för eventuella fel som kan ha uppstått från pipettering fel, etc. När det är möjligt används vi specifikt pipetten volymer större än 5 µL minska fel. Vi genomförde flera rundor av detta premix-test för att se till att vi fått en exakt 1:1 blandning. Det är viktigt att Observera att vi inte utföra denna typ av premix baserat test när du använder immunoprecipitation prover för protokollet som vi förväntade oss en stor andel av proteinerna ändra. I sådana fall skulle premix testet förvränga resultaten. Detta gäller även av några experiment där minst 1 av 10 proverna förväntas variera kraftigt i proteinuttryck (tom vektor, proteasom hämning, etc.) i sådana fall, rekommenderas det starkt att använda replikerar för att underlätta kvantitering statistik. Vi rekommenderar normalt utför 3 replikat för dessa typer av prover. I slutändan baseras antalet replikat på förväntade variabiliteten av varje prov.

Med viss finjustering, kan detta robust protokoll användas som en allmän proteomiska pipeline för att undersöka proteiner, protein vägar, sjukdomsprogression och andra biologiska funktioner. Det protokoll som presenteras här ger en kraftfull teknik för att få djup protein täckning och lindra baserat dämpning under kvantifieringsgränsen. Med smärre ändringar, kan detta protokoll anpassas lätt att kvantifiera protein posttranslationell modifieringar, såsom fosforylering, ubikvitinering och acetylering33,34. Dessa typer av omfattande proteomik projekt kan integreras med genomik, transkriptomik, och möjligen metabolomik för ett systemtänkande biologi att förstå biologiska system och underlätta nya upptäckter av molekylära mekanismer, biomarkörer och terapeutiska mål i sjukdom13,28,35,36,37,38.

Vi har visat en metod för exakt quantitating över 10 000 proteiner från hela-cell eller vävnad lysates. Vi förväntar oss att denna metod ska vara allmänt tillämpliga på många biologiska system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar alla andra lab och anläggning medlemmar för bra diskussion. Detta arbete var delvis stöds av NI H beviljar R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 och ALSAC. MS analysen utfördes i St. Jude Children's Research Hospital proteomik Facility, delvis stöds av NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Författarna vill tacka Nisha Badders för hjälp med redigering manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1220 LC system Agilent G4288B
50% Hydroxylamine Thermo Scientific 90115
Acetonitrile Burdick & Jackson AH015-4
Bullet Blender Next Advance BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater Phoenix S&T PST-BPH-20
C18 tips Harvard Apparatus 74-4607
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545
DMSO Sigma 41648
Formic acid Sigma 94318
Fraction Collector Gilson FC203B
Glass Beads Next Advance GB05
HEPES Sigma H3375
Iodoacetamide (IAA) Sigma I6125
Lys-C Wako 125-05061
Methanol Burdick & Jackson AH230-4
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Mass Spectrometer Thermo Scientific Q Exactive HF
nanoflow UPLC Thermo Scientific Ultimate 3000
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um Dr. Maisch GmbH r119.aq.0003
Self Pck Columns New Objective PF360-75-15-N-5
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Speedva Thermo Scientific SPD11V
TMT 10plex Isobaric label reagent Thermo Scientific 90110
Trifluoroacetic acid (TFA) Applied Biosystems 400003
Trypsin Promega V511C
Urea Sigma U5378
Xbridge Column C18 column Waters 186003943
Ziptips C18 Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mg Waters WAT054960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13, (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85, (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13, (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13, (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28, (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14, (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9, (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13, (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82, (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14, (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13, (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13, (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8, (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89, (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8, (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83, (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8, (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86, (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83, (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15, (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8, (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46, (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15, (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17, (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32, (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11, (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13, (2), 397-406 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics