تقييم الكهربية من مورين الاذينين مع رسم الخرائط الضوئية عالية الدقة

* These authors contributed equally
Medicine
 

Summary

هذا البروتوكول يصف تقييم مورين اتريا استخدام نظام رسم خرائط بصرية مع ارتفاع قرار الزماني والمكاني، بما في ذلك التسجيلات المزدوجة للجهد غشاء الكهربية و Ca2 + عابرة تحت المبرمجة التحفيز عن طريق قسطرة قطب متخصصة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ihara, K., Sugiyama, K., Takahashi, K., Yamazoe, M., Sasano, T., Furukawa, T. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. J. Vis. Exp. (132), e56478, doi:10.3791/56478 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

قد بينت الدراسات على نطاق الجينوم جمعية الأخيرة استهداف الرجفان الاذيني (AF) رابطة قوية بين النمط الوراثي والنمط الظاهري الكهربية في الاذينين. أن يشجعنا على استخدام نموذج الفأر وراثيا لتوضيح إليه بالعربية. ومع ذلك، من الصعب تقييم الخصائص الكهربية في الاذينين مورين نظراً لصغر حجمها. ويصف هذا البروتوكول الكهربية تقييم استخدام نظام رسم خرائط بصرية مع عالية دقة المكانية والزمانية في قلوب مورين لانجيندورف perfused اتريا. يتم تجميعها نظام رسم الخرائط البصرية مع ثنائي أكسيد المعدن المتمم عالية السرعة أشباه الموصلات الكاميرات والعدسات هدف تضخم عالية، للكشف عن الأسفار صبغة حساسة للجهد ومؤشر Ca2 + . للتركيز على تقييم موريني الاذينين، يتم رسم الخرائط الضوئية تبلغ مساحتها 2 × 2 مم أو 10 مم × 10 مم، 100 × 100 قرار (20 ميكرون/بكسل أو 100 بيكسل ميكرومتر) ومعدل أخذ العينات لتصل إلى 10 كيلوهرتز (0.1 مللي ثانية) كحد أقصى. يوضع قطب كوادريبولار حجم 1-الفرنسية سرعة القسطرة إلى الاذين الأيمن عن طريق الأجوف فينا متفوقة تجنب أية أضرار ميكانيكية للحديقة الشتوية، وسرعة التحفيز يتم تسليمها عن طريق القسطرة. تتم دراسة الكهربية مع تحفيز المبرمجة، بما في ذلك سرعة ثابتة، انفجر سرعة، وتصل إلى سرعة اكستراستيمولي الثلاثي. تحت عفوية أو سرعة إيقاع، سجلت رسم الخرائط البصرية إمكانات العمل مدة وتفعيل خريطة، وسرعة التوصيل و Ca2 + عابرة على حدة في الاذينين الأيمن والأيسر. وباﻹضافة إلى ذلك، يحدد تحفيز المبرمجة كما إيندوسيبيليتي تاتشيارهيثمياس أذينية. يتم تنفيذ التعيين التنشيط دقة تحديد نشر الإثارة في الحديقة الشتوية خلال تاتشيارهيثميا أذينية مستحث. رسم الخرائط البصرية مع إعداد متخصصة يمكن إجراء تقييم شامل الكهربية للحديقة الشتوية في النماذج المرضية مورين.

Introduction

القلب يتكون من 4 غرف في الثدييات. دائرتي العليا الاذينين، وهم أقل البطينين. البطينين تعمل كمضخة لإخراج الدم إلى الدورة الدموية الجهازية أو الرئوية. اتريا تلقي الدم العودة من الأوردة الجهازية أو الرئوية، والمساعدة في نقل الدم إلى البطينين الحصول على وظيفة كفاءة ضخ القلب. من جانب الكهربية، مهمة هامة الاذينين لتنظيم ضربات القلب. الإشارات الكهربائية التي تنشأ من العقدة الجيوب الأنفية تقع على مفترق الطرق بين أعلى الوريد الأجوف (SVC) والاذين الأيمن (RA)، ثم تنتشر إلى جمهورية أرمينيا والاذين الأيسر (LA)، وإجراء البطين عبر العقدة الأذينية وصاحب بوركنجي نظام التوصيل.

عدم انتظام ضربات القلب، واضطرابات إيقاع القلب، تصنف إلى الرجفان والبطين وفقا لأصلهم. الرجفان الاذيني (AF) هو الأكثر شيوعاً المستمر عدم انتظام ضربات القلب، تتميز بإثارة العشوائية والسريعة الاذينين. وقد أظهرت التحليلات الجينية الحديثة والدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جوس) الرابطة بين AF والطفرات الوراثية أو مونوبوليمورفيسمس1،2،،من34. تشير هذه النتائج إلى AF يرتبط على الأقل جزئيا سبب وراثي. ولذلك، من المهم تقييم التفاعلات الوراثي-النمط الظاهري في الاذينين استخدام نموذج حيوانات المهندسة وراثيا. من المقبول على نطاق واسع أن الماوس هو الثدييات الأكثر رسوخا للتحوير الوراثي.

تقنية رسم الخرائط الضوئية وضعت لتقييم إثارة أنسجة القلب. ومع ذلك، مراقبة اتريوم موريني برسم الخرائط البصرية يعوقها حجمها الصغير نسبيا. ونحن في محاولة لتحقيق تقييم مفصل اتريوم مورين مع عالية دقة المكانية والزمانية.

Protocol

ووافقت هذه التجربة الحيوانية والمؤداة بموجب اللائحة لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لطوكيو الطبية وطب الأسنان جامعة.

1-إعداد

  1. حلول الأسهم
    1. حل الأصباغ المراعية للجهد (دي-4-أنيبس و RH237) ومؤشر Ca2 + (وأنا Rhod-2) مع 100% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لجعل الحلول الأسهم مع تركيزات من 6، 10 مم، و 10 ملم، على التوالي.
    2. حل أونكوبلير الإثارة--انكماش (E-C)، بليبيستاتين، مع [دمس] 90% لجعل حل أسهم 50 مم.
    3. الكوة الحلول الأسهم في مل 0.2 PCR أنبوب في غرفة مظلمة، وتحل محل الهواء في الأنبوب المخزون باستخدام غاز النيتروجين لتجنب الأكسدة.
    4. لف الأنابيب الأسهم في رقائق الألومنيوم فردياً للحماية من الضوء، وتخزينها في ˚C-20.
  2. حلول العمل
    1. تحضير 1 لتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون Ca2 + (137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل و 8.0 ملم Na2هبو4و 1.5 مم خ2ص4، الأس الهيدروجيني 7.40 ضبط بواسطة هيدروكسيد الصوديوم)
    2. تحضير 1 لتر من الحل تيرودي (135 ملم كلوريد الصوديوم، 5.4 مم بوكل، 1.8 مم كاكل2مم 0.53 مجكل2، 0.33 مم NaH2بو45.5 ملم د-الجلوكوز و 5.0 مم هيبيس، الأس الهيدروجيني 7.40 ضبط بواسطة هيدروكسيد الصوديوم).
    3. تصفية الحل تيرودي مع عامل تصفية أعلى زجاجة 0.22 ميكرومتر وتهوية كان جيدا من قبل تهوية فقاعة استخدام حجر هواء متصلاً اسطوانة غاز2 س.

2-رسم الخرائط في قلوب perfused لانجيندورف الضوئية

  1. تجميع النظام البصري رسم الخرائط باستخدام أكسيد معدني متمم (CMOS) الكاميرات اثنين (الشكل 1 أوب)
    1. تجميع كاميرات CMOS وشعاع الخائن والعدسات الهدف، مسدس عدسة، ومصدر الضوء، مرايا مزدوج اللون، مرشحات وأجزاء أخرى في نظام رسم الخرائط البصرية كما هو مبين في الشكل 1 أوب.
    2. حدد التكبير بتغيير العدسة الهدف في برج، مجهزة بتكبير مختلفة (1.6 X و 5 X).
      ملاحظة: حجم جهاز استشعار CMOS هو 10 مم × 10 ملم، مع قرار 100 × 100، مما يعني، مع عدسة الهدف X 5، هذا النظام يوفر دقة مكانية 20 ميكرومتر.
    3. ضبط في ضوء الإثارة باستخدام مصباح الضوء – باعث (الصمام) مع طول موجي مركز من 530 نانومتر، تم تمريرها من خلال مرشح تمرير نطاق (520/35 نانومتر)، وينعكس مع مرآة مزدوج اللون (560 نانومتر).
    4. السجل إشارة الانبعاثات مقسمة حسب تقسيم (665 شمال البحر الأبيض المتوسط)، في الكاميرا التي الإعداد 1 مع طويل تمرير عامل التصفية (697/75 نانومتر) يكشف الأسفار باستخدام صبغة حساسة للجهد غشاء (دي 4-أنيبس أو RH237)، وكاميرا 2 مع مرشح تمرير نطاق (572/28 نانومتر) يكشف إشارة من Ca2 + المؤشر (Rhod2-ص).
  2. تجميع الدارة نضح لانجيندورف
    1. إرفاق أنابيب البولي فينيل كلوريد (PVC) مضخة تمعجية.
    2. وضع الجانب المدخول من أنبوب بولي كلوريد الفينيل في حل تيرودي للرغوة مع 100 ٪ س2 كما هو مذكور في الخطوة 1.2.3.
    3. الاتصال إلى جانب تفريغ أنبوب بولي كلوريد الفينيل فخ هواء المصنوعة يدوياً، ثم ترتيب 5 تصفية ميكرومتر، ستوبكوكس الثلاثية، الضغط على المفاتيح، تدفئة لفائف الزجاج، وقياس 21 إبرة يتثلم (حجم الإبرة وقابل للتغيير وفقا لحجم الشريان الاورطي) التتابع ، استخدام الأنابيب البلاستيكية الأخرى.
    4. ملء الدائرة التروية مع الحل تيرودي لتجنب أي فقاعات الهواء في الدائرة، ووقف التدفق حتى القلب متصل بالدائرة.
  3. هيبارينيزيشن والتخدير
    1. حقن الهيبارين غير المجزأ مع الاسبيرين (200 وحدة دولية، بغض النظر عن وزن الجسم) إينترابيريتونيلي في ماوس باستخدام إبرة 25-قياس وحقنه 1 مل.
    2. تخدير الماوس بحقن داخل بينتوباربيتال (65 مغ/كغ) 10 دقيقة بعد حقن الهيبارين.
  4. كانوليشن والتروية
    1. ضع الماوس في موقف ضعيف. تأكيد يتم تخديره الحيوانات بعدم الرد على أخمص القدمين قرصه. فتح جدار البطن أقل من مستوى الرهابه عملية استخدام المقص. جعل شق عرضية في الحجاب الحاجز وقطع جانبي الأضلاع في الخط الابطي الآنسي دون أي ضرر للقلب، والوجه جدار الصدر الأمامي صعودا. النهوض بالملقط منحنى خلف القلب، وعقد الابهر تنازلي، والمريء، وأدنى من الوريد الأجوف. ثم، المكوس القلب مع مقص سريعاً إلى جانب السفن المجاورة والأنسجة، مثل الشريان الاورطي والرئتين، والقصبة الهوائية، والمريء، والأنسجة الدهنية، والغدة الصعترية.
    2. يغسل القلب مع 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج في طبق بتري، وإزالة النسيج المجاور.
    3. يعرض تلميح 21-قياس الإبرة يتثلم متصل بالدائرة التروية في الشريان الاورطي تصاعدي، وإصلاحه مع مؤشر ترابط تحت ستيريوميكروسكوبي.
    4. تبدأ نتخلل القلب لمدة 10 دقائق مع الحل تيرودي للرغوة مع 100% O2.
    5. مراقب ضغط التروية باستمرار مع الضغط على المفاتيح متصلة بمكبر للصوت ومسجل.
    6. إبقاء الضغط نضح بين 80-100 مم زئبق (عادة ما يقابل 2-5 مل/دقيقة لمعدل التدفق) خلال كافة الخطوات التالية.
    7. أثناء التروية الأولى (الخطوة 2.4.4.)، إدراج أنبوب رقيقة البولي إيثيلين (PE) (القطر الخارجي: 0.8 مم) إلى SVC، وإصلاحه مع مؤشر ترابط. ثم، ضع القلب في قاعة الزجاج المعالجون (الشكل 1وج).
    8. ثقب إبرة نائحين 24-قياس (القطر الخارجي: 0.7 مم) في التجويف (LV) البطين الأيسر من خلال قمة البطين تجنب أي ضرر للحديقة الشتوية، وإزالة الإبرة الداخلية ترك قنية الخارجية في العائلة
    9. إدخال قسطرة قطب حجم 1-الفرنسية مخصصة المقدمة من خلال أنبوب PE في SVC القيام بالتحفيز الكهربائي في رع. إذا لزم الأمر، النهوض بالقسطرة في البطين الأيمن (RV) لسرعة البطين.
    10. إدراج قطب دبوس في قمة البطين لتسجيل ولﻷخصائيين القطبين (ECG) بشكل مستمر بين القطب و cannulation دبوس الإبرة في الشريان الاورطي تصاعدي (الشكل 1 ج).
    11. مواصلة رصد الضغط تخطيط القلب والتروية طوال الدراسة بأكملها.
    12. إطفاء الضوء، وإجراء التجربة التالية في غرفة مظلمة.
    13. انتقل إلى الخطوة 2، 5. لتسجيل واحد من الجهد غشاء أو 2.6. لتسجيل مزدوج غشاء الجهد و Ca2 + عابرة.
  5. تلوين لتسجيل واحد من الجهد الغشاء
    1. الحفاظ على الحل نضح ساخنة في 37 ˚C خلال هذا البروتوكول المصبوغة لتسجيل واحد من الجهد الغشاء.
    2. تمييع ميليلتر 8.3 الحل الأسهم دي-4-أنيبس (6 مم) مع 10 مل من محلول في تيرودي (تركيز النهائي هو 5 ميكرومتر).
    3. ضخ الحجم الإجمالي (10 مل) من الحل دي-4-أنيبس المخفف في قلب طريق نضح لدقيقة 2-5، تليها تبييض مع الحل في تيرودي لمدة 5 دقائق.
    4. تمييع 5 ميليلتر من الحل بليبيستاتين الأسهم (50 مم) مع 1 مل من محلول في تيرودي (تركيز النهائي هو 250 ميكرومتر).
    5. إدارة المبلغ الإجمالي للحل بليبيستاتين مخففة عن طريق التروية.
    6. تخطي الخطوة 2.6 والمضي قدما إلى الخطوة 2.7 لتبييض.
  6. تلوين لتسجيل مزدوج غشاء الجهد و Ca2 + عابرة
    1. يبقى الحل تيرودي في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: هذا الإعداد الأولية لدرجة الحرارة يختلف في تلطيخ لتسجيل واحد من الجهد غشاء (الخطوة 2.5.).
    2. إدارة بليبيستاتين بنفس الطريقة كما هو الحال في الخطوات 2.5.4 و 2.5.5.
    3. ميليلتر 3 مزيج من حل Rhod2AM الأسهم (10 مم) و 30 ميليلتر من بوليوكسيثيليني-بوليوكسيبروبيليني كتلة كوبوليمر F-127 (20% في [دمس])، ثم تضعف المخلوط مع 10 مل من محلول تيرودي.
    4. تحميل المبلغ الإجمالي لحل Rhod2AM (3 ميكرومتر) أكثر من 2-5 دقيقة عبر نفس الطريق كما بليبيستاتين.
    5. تمييع ميليلتر 7 RH237 حل الأسهم (10 مم) مع 10 مل من محلول في تيرودي.
    6. إدارة المبلغ الإجمالي للحل RH237 المخفف (7 ميكرومتر) أكثر من 2-5 دقائق.
    7. بعد انتهاء الإجراء المذكور أعلاه، تبدأ الحرارة الحل تيرودي في 37 ˚C.
  7. تبييض
    1. الحفاظ على درجة حرارة للحل في تيرودي في ˚C 37 في التجربة التالية.
    2. نتخلل القلب مع الحل في تيرودي لمدة 5 دقائق على الأقل تغسل الأصباغ المفرط.
      ملاحظة: ليس هناك حاجة إلى زيادة معدل التدفق أثناء غسل هذه الخطوة (راجع الخطوة 2.4.6).
    3. تأكيد اختفاء أي قطعة أثرية الحركة بسبب تقلصات، وتلطيخ متجانسة في قلب بيرفوسيد.
  8. أخذ العينات وتحليل البيانات
    1. وضع زجاج الغطاء (25 مم × 60 مم) على القلب بيرفوسيد بعناية، تسطيح السطح الرجفان دون الكثير من الضغط الميكانيكي، ومنع الحركة قطعة أثرية من اهتزاز الحل. وتؤكد أن الأتريوم تعلق على زجاج الغطاء على نحو ملائم.
    2. سجل الأسفار بكاميرات CMOS مع أخذ عينات معدل يصل إلى 0.1 مللي دي 4-أنيبس، و 1 مللي ثانية ل RH237 و Rhod2AM تلطيخ.
    3. تحليل التسجيلات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج تحليل، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة للتطبيق الفعلي للبرنامج.
    4. إنشاء خريطة التنشيط والفيلم بعد استخراج المنطقة من الفائدة وإزالة الانجراف وتصفية الزمانية و binning53 × 3.

3-الكهربية الدراسة

  1. تحديد سرعة أقطاب ومشجعا
    1. تأكيد اتصال غيض مسرى سرعة مصنوعة خصيصا في جمهورية أرمينيا للأنسجة للتحفيز (راجع الخطوة 2.4.9.).
    2. تقديم المحفزات سرعة كل من القسطرة سرعة متصلاً مشجعا للبرمجة.
  2. تحديد سرعة عتبة
    1. تعيين الفاصل الزمني سرعة بين 100 و 150 مرض التصلب العصبي المتعدد (عرض النبض 0.4 مللي ثانية)، تجنب أي إيقاع الجوهرية يفوق معدل سرعة.
    2. تقديم التحفيز سرعة ثابتة ليدق على الأقل 20 للحصول على سرعة أذينية مستقرة.
    3. تعيين سرعة الإنتاج في 5 mV، ثم خفض تدريجيا حتى فشل سرعة تسليمها ديبولاريزي الشتوية.
    4. تأكيد الإثارة أذينية بوجود موجات P في تخطيط القلب، و/أو إشارة إثارة أذينية بتسجيل بصري.
    5. تحديد سرعة الإخراج التي قادرة على ديبولاريزي الشتوية كسرعة عتبة الحد الأدنى.
    6. تعيين سرعة الإخراج للدراسات التالية على أعتاب سرعة مرتين.
  3. ثابت وسرعة الاندفاع
    1. تقديم سرعة ثابتة ليدق 99، مع فاصل سرعة بدءاً من 150 مرض التصلب العصبي المتعدد، أو فترة أطول أن يتجنب متجاوزا إيقاع الجوهرية.
    2. الحد الفاصل الزمني سرعة تدريجيا مع الخطوات 5 مللي ثانية، وصولاً إلى 40 مللي ثانية أو حتى التوصل إلى الفاصل الزمني الذي أخفق في الحصول على التقاط 1:1 للحديقة الشتوية.
  4. واحد اكستراستيمولوس سرعة
    1. تعيين طول دورة سرعة محرك الأقراص الأساسية (S1) إلى 120 مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد 100 80 مرض التصلب العصبي المتعدد إلا على إيقاع جوهري يتجاوز محرك الأقراص الأساسي أو في فشل سرعة الحصول على الإثارة أذينية 1:1.
    2. تعيين العدد من سرعة المحفزات ليدق 10 للقطار محرك الأقراص الأساسية.
    3. تعيين اكستراستيمولوس الأولى (S2)-10 مللي ثانية على طول دورة الأساسي.
    4. تسليم S2 بعد حافز آخر سرعة محرك الأقراص الأساسية.
    5. تقصير فترة اقتران S2 تدريجيا مع الخطوات 5 مللي ثانية، حتى يفشل S2 ديبولاريزي الشتوية.
    6. تحديد فترة صهر فعالة (ERP) كفاصل S2 أطول يفشل في ديبولاريزي الشتوية.
    7. تقييم نظام تخطيط موارد المؤسسات ذات أطوال مختلفة دورة الأساسي على الأقل 3 لتقييم تكييف معدل لتخطيط موارد المؤسسات.
  5. اكستراستيمولي مزدوجة وثلاثية سرعة لحمل تاتشيارهيثمياس أذينية
    1. إعادة تعيين الفاصل الزمني S2 إلى نقطة 20 مللي ثانية خارج نظام تخطيط موارد المؤسسات S2 إذا لوحظت لا عدم انتظام ضربات القلب.
    2. إضافة اكستراستيمولوس ثانية (S3)، بدءاً من الفاصل الزمني نفسه ك S2.
    3. تقليل الفاصل الزمني اقتران بين S2 و S3 تدريجيا مع الخطوات 5 مللي ثانية حتى يفشل S3 ديبولاريزي الشتوية.
    4. إعادة تعيين الفاصل زمني S2 إلى نقطة 10 مللي ثانية خارج تخطيط موارد المؤسسات، ثم كرر الخطوة 3.5.3.
    5. إعادة تعيين الفواصل الزمنية S2 و S3 بالنقاط 20 مللي ثانية خارج كل نظام تخطيط موارد المؤسسات.
    6. إضافة اكستراستيمولوس ثالث (S4)، بدءاً من الفاصل الزمني نفسه كالعنوان S3.
    7. تقليل الفاصل الزمني اقتران بين S3 و S4 تدريجيا مع الخطوات 5 مللي ثانية حتى يفشل S4 ديبولاريزي الشتوية.
    8. تعيين الفاصل الزمني S3 إلى نقطة 10 مللي ثانية خارج تخطيط موارد المؤسسات، ثم كرر الخطوة 3.5.7.
    9. إعادة تعيين الفواصل الزمنية S2 و S3 بالنقاط 10 مللي ثانية خارج تخطيط موارد المؤسسات، ثم كرر الخطوة 3.5.7.
    10. تعريف إيندوسيبيليتي تاتشيارهيثمياس أذينية بالاستقراء استنساخه باستخدام المحفزات المثل المبرمجة.
  6. تقييم إيندوسيبيليتي تاتشيارهيثمياس أذينية
    1. باستمرار تسجيل تخطيط القلب أثناء تسريع كافة البروتوكولات (الخطوة 3، 3 إلى 3.5.).
    2. إجراء التسجيلات البصرية أثناء وبعد كل التحفيز، وأن يسجل تحريض من أي تسرع القلب الاذيني (AT) أو استجابة الرجفان المتكررة (رر).
    3. تأكيد إمكانية تكرار نتائج عن طريق تطبيق بروتوكول سرعة نفسه عندما AF أو RAR فعل.

Representative Results

وتجري التجارب رسم الخرائط البصرية استخدام الأجهزة كما هو مبين في الشكل 1 ألف. ويتضح في الشكل 1bمخطط النظام البصري. يوفر النظام إجراء تحليل الاستبانة غشاء المحتملة و Ca2 + عابر في الحديقة الشتوية.

كما هو مبين في الشكل 1 ج ود، يتم وضع قلب معزولة في غرفة للتحكم في درجة الحرارة. يتم وضع قسطرة قطب كهربائي حجم 1-الفرنسية في جمهورية أرمينيا من خلال أنبوب PE إدراجها في SVC، ويتم إدراج آخر أنبوب PE نائحين في تجويف LV من ذروة LV لتجنب الضغط المفرط على قاعة القلب. لتسجيل تخطيط القلب متزامنة، الكاثود (ECG بقيادة [--]) متصل بإبرة كانولاتيون والانود (ECG بقيادة [+]) متصل بمسرى دبوس إدراجها في قمة البطين. أن ميزة هذه الجمعية لتجنب أية أضرار ميكانيكية الاذينين.

لتقييم الجهد غشاء، يتم تسجيل الأسفار استخدام دي-4-أنيبس مع ما يصل إلى معدل أخذ عينات إطارات/s 10,000 (الشكل 2). يتم الحصول على خريطة التنشيط خلال سرعة ثابتة من رع. تعيين غرامة يتيح تحليل نمط التوصيل مفصلة في الاذينين موريني الصغيرة.

ويوضح الشكل 3 آثار الممثل الفولتية الغشاء و Ca2 + عابر في لوس أنجليس باستخدام RH237 و Rhod2AM خلال سرعة ثابتة من رع. نحن خفض معدل أخذ العينات من التعيين إلى 1000 إطارات/ثانية للحصول على نسبة إشارة/ضوضاء كافية لإشارة Rhod2AM مع الوضع الحالي. ومع ذلك، يوفر النظام نوعية كافية لتحليل العلاقة بين إمكانات العمل و Ca2 + عابرة.

ثم نقوم تحريض من تاتشيارهيثميا أذينية مع تحفيز المبرمجة باستخدام الفئران تحت حالة مرضية. الشكل 4 معارض تسجيل بصري المستحث في ردهة مورين الملون مع دي-4-أنيبس. الماوس يخضع إجراء انقباض الابهري عرضية لتطبيق ضغط زائد على الأتريوم 10 أيام قبل التجربة6. نحن الحث على طريق اكستراستيمولي ثلاثة إضعاف سرعة (120/100/100/80)، ومراقبة انتشار الدارة عنها.

Figure 1
رقم 1. نظام رسم الخرائط البصرية- أ- الجمعية العامة نظام رسم الخرائط/الكهربية الضوئية. باء التخطيطي لتكوين نظام رسم الخرائط البصرية: يشير السهم الأزرق إلى الإثارة الخفيفة التي تم إنشاؤها بواسطة مصدر الضوء. يمكن تبادل عدسة الهدف مع البرج. يتم تقسيم الضوء المنبعثة من القلب الملون بين 1 والكاميرا 2. كاميرا 1 الكشف عن الإشارات الطويلة الطول الموجي للجهد الغشاء، والكاميرا 2 السجلات أطوال موجية مع ممر الموجه مرشح من 580 ± 20 نانومتر ل Ca2 + العابرة. أثناء الإجراء، الضغط ECG ونضح وتسجل باستمرار، وإشارة ECG أيضا في نفس الوقت المستوردة في الخريطة البصرية تسجيل البرامج. ج- إعداد قلوب المنعزلة: هي مقني القلوب بإبرة يتثلم عبر الشريان الاورطي تصاعدي التروية. متزامنة ECG التسجيلات، الكاثود متصل بإبرة كانوليشن، ويتم إدراج اﻷنود بالقطب دبوس في قمة البطين. أنبوب كانوليشن د والأقطاب: القلب هو مقني بإبرة يتثلم 21-مقياس التروية (إبرة كانوليشن). حجم 1-الفرنسية حفز قطب كهربائي (القطب) يوضع في الاذين الأيمن عن طريق أنبوب بولي إيثيلين إدراج الأجوف فينا متفوقة. هو ارتفعت درجة حرارة الغرفة الزجاج في 37 ˚C بالماء الساخن المتداولة في تجويف الدائرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. خريطة التنشيط في الأتريوم. أ خرائط التنشيط الممثل في العرض الأمامي مع عدسة الهدف X 5، و ب في طريقة العرض الخلفي مع عدسة هدف 1.6 X. (غادر الفريق) التخطيطي القلب معزولة والحديقة الشتوية. (اللوحة اليمنى) الحصول على خريطة التنشيط من الاذين الأيسر مع دي-4-أنيبس تلطيخ 10,000 الإطارات في الثانية. ويتم التسجيل تحت سرعة ثابتة مع مسرى حفز وضع في الاذين الأيمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. التسجيل المزدوج لإمكانات العمل و Ca2 + عابرة في الاذين الأيسر. ألف التخطيطي للقلب معزولة. ب صورة تمثيلية من شدة الأسفار في الاذين الأيسر باستخدام RH237 للغشاء الجهد (Vm) و Rhod2AM ل Ca2 + العابرة. يتم إجراء التسجيل مع عدسة هدف X 5 في إطارات/س. 1,000 جيم تسجيل المتزامنة لتخطيط القلب (أعلى) وإشارة RH237 (وسط)، وإشارة Rhod2AM (أسفل)، أثناء سرعة ثابتة مع التحفيز الكهربائي في الاذين الأيمن. السهام السوداء تشير إلى التحفيز والتموج، وأسهم صفراء الإثارة البطين. تأثير تشتت ضوء من البطين كما يمكن ملاحظة (رؤوس الأسهم الصفراء) في إشارة RH237 وإشارة Rhod2AM على حد سواء. دال مدمجة RH237 و Rhod2AM تتبع. وتسجل في الوقت نفسه إمكانات العمل وعابر Ca2 + التغييرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. رسم خرائط التنشيط خلال خفقان أذينية. (غادر الفريق) التخطيطي للقلب معزولة. (لوحة الأوسط) خريطة التنشيط خلال خفقان الرجفان (AT). لدى حملت بسرعة اكستراستيمولي ثلاثية من الاذين الأيمن. (اللوحة اليمنى) خريطة التنشيط خلال إيقاع الجيوب الأنفية في قلب الماوس نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

فيلم التكميلي 1. ممثل الفيلم من غشاء المحتملة في الحديقة الشتوية باستخدام التلوين مع دي-4-أنيبس. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

فيلم تكميلي 2- أفلام الممثل لتعيين التنشيط خلال الرجفان إيقاع خفقان والجيوب الأنفية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

رسم الخرائط البصرية هو مناورة راسخة لدراسة القلب الكهربية7، وهو أداة مفيدة للغاية لتقييم عدم انتظام ضربات البطين8،9، ليس فقط، بل أيضا منها أذينية10،11 . رسم الخرائط المتزامن إمكانيات transmembrane والعابرين Ca2 + مفيدة لفهم الآليات الكامنة لعدم انتظام ضربات القلب فيما يتعلق بفشل القلب وغيرها من أمراض القلب1312،. عند مقارنة أساليب تقييم الكهربية الأخرى، مثل تلك التي تستخدم خلية مفردة أو خلية ورقة، واحدة من المنفعة المطلقة لرسم الخرائط البصرية في قلب perfused هو تقييم نمط التوصيل في الأتريوم سليمة و بطين، ليس فقط من خلال إيقاع الجيوب الأنفية، بل أيضا من خلال الناجمة عن عدم انتظام ضربات القلب14. محاولة لاستغلال موريني القلوب، لا سيما الأتريوم، كبديل البشر قد واجه صعوبة أساسا بسبب صغر حجمها، إلا أن الفأر نموذج تجريبي جذاب من حيث التقييم في الحيوانات المهندسة وراثيا الطراز، وهذه المشكلة يجب التغلب عليها. ويوفر النهج الذي نتبعه اتجاه واحد لحلها.

على الرغم من أن لدينا جهاز رسم الخرائط البصرية مماثلة أساسا للنظام التقليدي لقلوب أسرة مورين15، مزية لدينا طريقة لتقييم اتريوم مورين بإجراء بعض التعديلات عليه. أولاً، نحن السعي للحصول على قرار المكانية والزمانية عالية تصل إلى 0.1 مللي/الإطار و 20 ميكرومتر/بكسل، وهذا التعيين الاستبانة ساهمت في قياس أكثر دقة لنمط السرعة ونشر التوصيل في الأتريوم مورين. وثانيا، لتجنب أي أضرار ميكانيكية لا داعي لها أو امتداد الحديقة الشتوية، التي يمكن أن تغير خصائص الكهربية 16،17، يتم إدراج إبرة نائحين مباشرة في LV لتقليل الضغط داخل الدائرة، بدلاً من إدراجه من خلال لوس أنجليس كما يؤديها في السابق دراسة15. وعلاوة على ذلك، يتم تسليم التحفيز سرعة عن طريق قسطرة قطب مخصصة حجم 1-الفرنسية صنع وضعت في جمهورية أرمينيا، ولكن لا قبل قطب إبرة، التي قد تصيب الأتريوم. يتم تجنب أي دبابيس في تحديد أطرافهم الرجفان، التي استخدمت في الدراسة السابقة15. ثالثا، من حيث تقييم الآلية الأساسية لعدم انتظام ضربات القلب، هو بروتوكول تحفيز مبرمجة لحمل تاتشيارهيثمياس أذينية الحاسمة18،19. نقوم بتحفيز المبرمجة مماثلة لتلك في الدراسات السريرية الكهربية، بما في ذلك سرعة الاندفاع وحتى اكستراستيمولي ثلاثة إضعاف سرعة، مع تعديل الفاصل الزمني سرعة للقلب الماوس. وهكذا، بالإضافة إلى معلمات قياس خط الأساس، يمكن تقييم البروتوكول إيندوسيبيليتي AT. عند الحاجة، ويتم تقييم إيندوسيبيليتي AT مع إدارة isoproterenol أو غيرها من المخدرات. في تجربتنا، تظهر الفئران البرية من نوع لا يكاد أي المنشطات حتى بعد بروتوكول تحفيز كامل. ولذلك، ينبغي إيندوسيبيليتي على معلومات هامة لتقييم مساهمة العديد من الحالات المرضية مثل الطفرات الوراثية، والعمليات الجراحية، وإدارة المخدرات11. يمكن أن يعظم تلك التعديلات تقييم الكهربية الدقيقة في الأتريوم مورين سليمة.

هذا الأسلوب أيضا على بعض القيود. أولاً، استخدام الحد أقصى قرار مكانية مع عدسة هدف X 5، مجال الرؤية (FOV) يقتصر على جزء من الحديقة الشتوية (أي. أطرافهم أذينية الأيسر فقط كما هو مبين في الشكل 2 ألف). للحصول على أكبر فوف من الأتريوم، عدسة هدف 1.6 X هو أحياناً الأفضل (الشكل 2). ثانيا، دون تحديد الأتريوم مع دبابيس، أحياناً من الصعب قياس خصائص التوصيل الرجفان بشكل صحيح، لأنه منحنى على سطح أذينية. لذا، وضعنا زجاج الغطاء على سطحه تسطيح أنه بدلاً من تحديد ذلك بدبابيس. هذا الأسلوب مفيد أيضا لمنع الحركة قطعة أثرية من اهتزازات الحل. ثالثا، مع أسلوبنا، أنه من الصعب جداً الحصول على كامل فوف، لذلك، لاستخدام العرض الأمامي والخلفي بشكل صحيح أكثر أهمية في نهجنا من النهج الأخرى كما هو مبين في الشكل 2. وميزة العرض الأمامي سيكون الملاحظة واضحة لإعادة الإدخال في حالة الظروف المرضية، خاصة في أطرافهم (الشكل 4). من ناحية أخرى، رأي الخلفي يتمتع بميزة الحصول على عرض جيد للجدار الخلفي الرجفان، وقد يكون تسجيل مفصلة لتحريك النشاط من الأكمام احتشاء عضلة القلب. عندما يصعب الحصول على وجهة نظر مناسبة وتسطيح سطحه المنحنى باسلوبنا، يمكن أن تكون ثابتة الأتريوم مع الحد الأدنى من التوتر بدبابيس.

مع أسلوبنا، وهناك 3 مشاكل محتملة، عدم تلطيخ وسرعة، والحث على عدم انتظام ضربات القلب. لفشل تلطيخ، إذا لم يوجد أو يلاحظ fluorescence طفيف، يجب عليك التحقق من ما إذا كان جهاز رسم الخرائط البصرية، يتم تجميعها بشكل صحيح، وما إذا كان الكاشف هو مناسب المخزنة واستخدامها. شرط الحل التروية أيضا حاسمة، التي يمكن أن تؤثر أيضا على الخصائص الكهربية للقلب نفسها، لذا، الشرط للحل بما في ذلك درجة الحموضة، درجة الحرارة، وعما إذا كان هناك تهوية كافية وقد يكون رصدها بدقة. من المهم أيضا تجنب أي انصمام الهواء في القلب. لسرعة الفشل، إذا كانت لا تثير المنبهات سرعة الأتريوم، يجب التحقق الباحثين سواء الأسلاك بشكل صحيح باستخدام اختبار دوائر. عندما يتم بشكل صحيح أنتج المحفزات سرعة، المشكلة هي جهة الاتصال القطب مع الأنسجة. إعادة وضع أقطاب كهربائية يمكن حل المشكلة، والنهج الذي نتبعه باستخدام القسطرة سرعة يجعل من السهل. لصعوبة في عدم انتظام ضربات القلب الاستقراء، يمكن استخدام سرعة RV لتحريض في بعض الحالات المحدودة. استخدام قسطرة قطب كوادريبولار منها قطبين القاصي واقطاب الدانية يمكن أن يقع في RV وجمهورية أرمينيا، على التوالي، من السهل تغيير الموقع سرعة من جمهورية أرمينيا إلى rv. هذه القسطرة مفيد أيضا لتحويل الإثارة البطين عند إشارة تفعيل البطين متزامنة أقنعة إشارة الإثارة أذينية.

وسوف يسهم هذا الأسلوب لتقييم النمط الوراثي-النمط الظاهري التفاعلات في AF المتصلة بالجينات التي وجدت حديثا بدراسات الرواية مثل جوس، خاصة بالنسبة للجينات التي فشل التحقيق تبين لهم بنهج أخرى. مع التقدم في الأجهزة والتقنيات، ويمكن تقييم الخصائص الكهربية للأكمام الوريد الرئوي، وهو مصدر هام للعربية20، في قلب سليمة مع هذا النهج.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل معتمد من قبل البرنامج "تحسين البيئة البحثية" "الباحثين الشبان" من "صناديق تنسيق خاصة" للنهوض بالعلوم والتكنولوجيا (SCF) (أن ت. س.)، ومعونة "البحث العلمي" (رقم 16 ك 09494، ت. س.، رقم 26293052، لامورنا) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) في اليابان. ونحن نقدر براينفيسيون والسيد كينجي تسوبوكورا للمساعدة التقنية، ونحن نقدر أيضا السيد جون مارتن لمساعدته اللغوية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin SIGMA B0560-1MG E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Rhod2AM Biotium 50024 Ca indicator
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Biotium #59000 To enhance the staining with Rhod2AM
Di-4-ANEPPS Wako 041-29111 Voltage-sensitive dye
Dimethyl sulfoxide Wako 046-21981 Solvent for reagents
Bottle top filter Corning 430513 For filtering Tyrode's solution
Haparin Sodium Mochida Pharmaceutical Co., Ltd N/A To avoid blood clots in the coronary artery
Air stone (φ8 mm x 10 mm) Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho N/A for aeration
Pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Corporation N/A For an anesthesia
Programmable stimulator Fukuda Denshi BC-05 Fukuda Denshi kindly rented us.
Power Lab AD Instruments Powerlab 26/8SP To record blood pressure and electrocardiogram
Bio Amp AD Instruments ML132 Amprifier for electrocardiogram
BP Amp AD Instruments FE117 Amprifier for blood pressure
LabChart AD Instruments Version 7 Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram
Disposable BP transducer AD Instruments MLT0670 pressure transducer
1-Fr custom made electrode catheter Unique Medical N/A To pace right atrium
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) Natume Seisakujo SP31 Put into superior vena cava to introduce electrode catheter
Millex-SV 5.00 μm Merk Millipore SLSV025LS To filter the circulating Tyrode
24-gauge indwelling needle TERUMO SR-FS2419 Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber
21-gauge needle TERUMO SN-2170 We cut the tip of needle and blunted it by filing
25-guage needle TERUMO NN-2525R
1-ml syringe TERUMO SS-01T
PVC tube TERUMO SF-ET0525 for Langendorff's perfusion circuit
Three-way stopcock TERUMO TS-TL2K for Langendorff's perfusion circuit
Petri dish As one 3-1491-01
Custum made heating glass coil Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Custum made warming glass chamber Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Constant temperature circulating device Lauda E100 connected to heating coil and warming chamber
Cover glass (25 mm × 60 mm) Matsunami C025601 Put on the atria to flatten the recording area
Perista pump ATTO SJ-1211 peristaltic pump
Stemi DV4 Carl Zeiss N/A Stereomicroscope
MiCAM ULTIMA-L2 Brainvision Inc. UL-L2 Optical mapping System
BV_Ana Software Brainvision Inc. BV_Ana Data Analysis Software
THT Macroscope Brainvision Inc. THT-ZS Epi-Illumination Unit
LED Light Source Brainvision Inc. LEX2-G
Dichroic Mirror 560nm Brainvision Inc. DM560 Epi-Illuminatinon
Excitation Filter 520/35nm Semrock, Inc. FF01-520/35-25
Projection lens Plan S 1.0X Carl Zeiss 435200-0000-000
Focus Drive Carl Zeiss 435400-0000-000
Objective lens Revolver Carl Zeiss 435302-0000-000
Manual Focus Column Carl Zeiss 435400-0000-000
Macroscope Base Carl Zeiss 435430-9901-000
Straight Light Guide MORITEX Corporation MSG10-2200S Epi-Illuminatinon
Condenser Lens MORITEX Corporation ML-50
PLANAPO 5.0X Leica Microsystems 10447243 Objective Lens
PLANAPO 1.0X Leica Microsystems 10447157 Objective Lens
PLANAPO 1.6X Leica Microsystems 10447050 Objective Lens
Beam-Splitter Brainvision Inc. FLSP-2
Dichroic Mirror 665nm Brainvision Inc. DM665 Beam-Splitter
Emission Filter 572/28nm Edmund Optics #84-100 Rhod2-AM
Emission Filter 697/75nm Semrock, Inc. FF01-697/75-25 RH237 and Di-4-ANEPPS
0.2 mL PCR tube Greiner Bio-One 671201
aluminum foil Toyo alumi 0020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
  2. Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
  3. Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
  4. Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
  5. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
  6. Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
  7. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
  8. Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
  9. Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
  10. Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
  11. Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
  12. Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
  13. Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
  14. Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
  15. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).
  16. Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
  17. Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
  18. Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
  19. Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
  20. Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics