Évaluation électrophysiologique des oreillettes murins avec cartographie optique à haute résolution

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Medicine
 

Summary

Ce protocole décrit l’évaluation électrophysiologique des oreillettes murins utilisant un système de cartographie optique à haute résolution temporelle et spatiale, y compris les enregistrements doubles de la tension de la membrane et Ca2 + transitoire sous programmé stimulation au moyen d’une sonde électrode spécialisés.

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Ihara, K., Sugiyama, K., Takahashi, K., Yamazoe, M., Sasano, T., Furukawa, T. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. J. Vis. Exp. (132), e56478, doi:10.3791/56478 (2018).

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Abstract

Des études récentes de liaison pangénomique ciblant la fibrillation auriculaire (FA) indiquent une forte association entre le génotype et le phénotype électrophysiologique dans les oreillettes. Qui nous incite à utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées afin d’élucider le mécanisme de l’AF. Toutefois, il est difficile d’évaluer les propriétés électrophysiologiques dans les oreillettes murines en raison de leur petite taille. Ce protocole décrit l’évaluation électrophysiologique des oreillettes en utilisant un système de cartographie optique avec une haute résolution temporelle et spatiale dans les murins coeurs perfusés. Le système de cartographie optique est assemblé avec des caméras à semi-conducteurs double oxyde de métal complémentaire à grande vitesse et fort grossissement lentilles de l’objectif, pour détecter la fluorescence d’un colorant sensibles à la tension et indicateur de Ca2 + . Se pour concentrer sur l’évaluation de l’oreillette murine, cartographie optique est réalisée avec une superficie de 2 × 2 mm ou 10 mm x 10 mm, avec une résolution × 100 (20 µm/pixel ou 100 µm/pixel) et les taux d’échantillonnage de jusqu'à 10 kHz (0,1 ms) au maximum 100. Une électrode quadripolaire de taille 1-Français stimulation cathéter est placée dans l’oreillette droite par l’intermédiaire de la veine cave supérieure, en évitant des endommagements mécaniques à l’atrium, et stimulation de la stimulation est livrée par le cathéter. Une étude électrophysiologique est réalisée avec une stimulation programmée y compris une stimulation constante, éclater la stimulation et jusqu'à extrastimuli triple stimulation. Sous une spontanée ou à l’amble rythmique, la cartographie optique enregistre la durée du potentiel d’action, carte d’activation, la vitesse de conduction et Ca2 + transitoire individuellement dans les oreillettes droite et gauche. En outre, la stimulation programmée détermine également la capacité d’induction des tachyarythmies auriculaires. Cartographie précise d’activation est réalisée afin d’identifier la propagation de l’excitation dans l’atrium au cours d’une tachyarythmie auriculaire induit. Une cartographie optique avec un cadre spécialisé permet une évaluation approfondie et électrophysiologique de l’atrium dans les modèles murins pathologiques.

Introduction

Le cœur est composé de 4 chambres chez les mammifères. Les deux chambres supérieures sont les oreillettes, et les inférieures sont les ventricules. Ventricules fonctionnent comme une pompe pour éjecter le sang vers la circulation systémique ou pulmonaire. Les oreillettes reçoivent le sang revenant de venas systémiques ou pulmonaires et aider à transporter le sang dans les ventricules pour obtenir une fonction de pompe cardiaque efficace. L’aspect d’électrophysiologiques, la fonction importante de l’oreillette est de réguler le rythme cardiaque. Les signaux électriques proviennent du nœud sinusal, situé à la jonction entre la veine cave supérieure (SVC) et l’oreillette droite (RA), puis propagent à l’AR et l’oreillette gauche (LA) et procéder au ventricule à travers le nœud auriculo-ventriculaire et His-Purkinje système de conduction.

Arythmie, qui est des troubles du rythme cardiaque, est classés en auriculaires et ventriculaires selon leur origine. La fibrillation auriculaire (FA) est la forme la plus commune soutenue d’une arythmie, caractérisée par une excitation aléatoire et rapide des oreillettes. Des analyses génétiques récentes et les études d’association pangénomique (GWAS) ont montré l’association entre AF et mutations génétiques ou monopolymorphisms1,2,3,4. Ces résultats indiquent QU'AF est au moins partiellement associée à une cause génétique. Par conséquent, il est essentiel d’évaluer les interactions génotype-phénotype dans les oreillettes à l’aide d’un modèle animal génétiquement. Il est largement admis que la souris est le mammifère le plus établi pour la modification génétique.

La technique de cartographie optique a été développée pour évaluer l’excitation du tissu cardiaque. Cependant, l’observation de l’atrium murin par cartographie optique est entravée par sa taille relativement petite. Nous tentons de parvenir à une évaluation détaillée de l’atrium murine avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Protocol

Cette expérimentation animale a été approuvée et exécutée en vertu du règlement de l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Tokyo Medical et dentaire Université.

1. préparation

  1. Solutions courantes
    1. Dissoudre les colorants sensibles au voltage (di-4-ANEPPS et RH237) et Ca2 + indicateur (Rhod-2 AM) avec 100 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à faire des solutions mères avec des concentrations de 6 mM, 10 mM et 10 mM, respectivement.
    2. Dissoudre le découpleur excitation-contraction (E-C), blebbistatin, avec 90 % DMSO pour faire une solution stock de 50 mM.
    3. Aliquote les solutions mères dans un PCR de 0,2 mL tube dans une pièce sombre et remplacement l’air dans le tube de stock à l’aide de gaz d’azote pour éviter l’oxydation.
    4. Envelopper les stocks tubes en aluminium individuellement pour la protection contre la lumière et les conserver à-20 ° c.
  2. Solutions de travail
    1. Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM 1,5 mM KH2PO4, KCl et 8,0 mM Na2HPO4pH 7,40 ajusté par NaOH)
    2. Préparer 1 L de solution Tyrode (135 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, D-glucose de 5,5 mM et 5,0 mM HEPES, pH 7,40 ajusté par NaOH 5,4 mM).
    3. Filtrer la solution Tyrode avec un filtre supérieur de bouteille de 0,22 µm et Aérez-la bien par l’aération de bulle à l’aide d’une pierre à air relié à une bouteille de gaz de2 O.

2. cartographie en coeurs Langendorff perfusés optique

  1. Monter le système de cartographie optique à l’aide de deux caméras à semi-conducteurs (CMOS) oxyde de métal complémentaire (Figure 1 a& b)
    1. Assembler les caméras CMOS, séparateur de faisceau, lentilles de l’objectif, revolver de lentille, source de lumière, des miroirs dichroïques, filtres et autres parties dans le système de cartographie optique comme le montre la Figure 1 a& b.
    2. Sélectionner l’agrandissement en changeant la lentille d’objectif dans une tourelle, équipée avec des grossissements différents (1, 6 X et 5 X).
      Remarque : La taille du capteur CMOS est 10 mm × 10 mm, avec une résolution de 100 × 100, ce qui signifie que, avec l’objectif 5 X, ce système fournit une résolution spatiale de 20 µm.
    3. Placez la lampe de l’excitation à l’aide d’une lampe à diode électroluminescente (LED) avec une longueur d’onde centrale de 530 nm, transmise un filtre passe-bande (520/35 nm) et reflète avec un miroir dichroïque (560 nm).
    4. Enregistrer le signal d’émission divisé par un répartiteur (665 nm), dans quel appareil de réglage 1 avec un long filtre passe-bas (697/75 nm) détecte la fluorescence à l’aide d’un colorant sensibles à la tension de membrane (di 4-ANEPPS ou RH237) et la caméra 2 avec un filtre passe-bande (572/28 nm) détecte le signal de l’indicateur Ca2 + (Rhod2-AM).
  2. Assembler le circuit de perfusion de Langendorff
    1. Attachez les tubes de polychlorure de vinyle (PVC) pour une pompe péristaltique.
    2. Mettre le côté de l’admission du tube PVC en solution Tyrode aérée avec 100 % de O2 , tel que mentionné à l’étape 1.2.3.
    3. Connectez l’extrémité de la décharge du tube PVC sur un piège d’air faites à la main, puis organiser le 5 µm filtre, robinets à trois voies, capteur de pression, chauffage verre bobine et l’aiguille atténuée de calibre 21 (la taille de l’aiguille est variable selon la taille de l’aorte) dans l’ordre , à l’aide d’autres tubes de PVC.
    4. Remplir le circuit de perfusion avec une solution de Tyrode en évitant les bulles d’air dans le circuit et d’arrêter le flux jusqu'à ce que le cœur est relié au circuit.
  3. Héparinisation et anesthésie
    1. Injecter par voie intrapéritonéale d’héparine non fractionnée (200 UI, quel que soit le poids du corps) dans une souris à l’aide d’une aiguille de calibre 25 et la seringue de 1 mL.
    2. Anesthésier la souris par une injection intrapéritonéale de pentobarbital (65mg/kg) 10 min après l’injection d’héparine.
  4. Canulation et perfusion
    1. Placez votre souris en décubitus dorsal. Confirmer les animaux est anesthésié par l’absence de réponse à l’orteil pincée. Ouvrir la paroi abdominale sous le niveau de processus xiphoïde à l’aide de ciseaux. Pratiquer une incision transversale dans le diaphragme, couper les deux côtés des côtes dans la ligne axillaire médiale sans endommager le cœur et inversion de la paroi thoracique antérieure vers le haut. Avancer la pince courbe derrière le cœur et maintenez l’aorte, le œsophage et la veine cave inférieure. Ensuite, l’accise coeur avec des ciseaux rapidement ainsi que des comprimer les vaisseaux et les tissus, tels que l’aorte, poumons, trachée, œsophage, tissus adipeux et le thymus.
    2. Laver le cœur avec 10 mL de PBS glacée dans une boîte de Pétri et enlever les tissus adjacents.
    3. Introduire la pointe de l’aiguille atténuée de calibre 21 connecté au circuit de perfusion dans l’aorte ascendante et fixez-le avec fil sous un stéréomicroscope.
    4. Commencer à perfuse le cœur pendant 10 min avec une solution de Tyrode aérée avec 100 % O2.
    5. Surveiller en permanence la pression de perfusion avec le transducteur de pression relié à l’amplificateur et l’enregistreur.
    6. Maintenir la pression de perfusion entre 80-100 mmHg (habituellement correspondant à 2 à 5 mL/min pour le débit d’eau) pendant toutes les étapes suivantes.
    7. Au cours de la perfusion initiale (étape 2.4.4.), insérer le tube mince en polyéthylène (PE) (diamètre extérieur : 0,8 mm) dans le SVC et le fixer avec un fil. Ensuite, placez le cœur dans la chambre de verre chauffée (Figure 1 b& c).
    8. Piquer une aiguille à demeure 24 calibre (diamètre extérieur : 0. 7 mm) dans la cavité ventriculaire gauche de (LV) par le biais de l’apex ventriculaire pour éviter tout dommage à l’atrium et retirer l’aiguille intérieure laissant la canule externe dans le LV.
    9. Introduire une sonde d’électrode 1-Français taille personnalisée faite à travers le tube PE par le CVP à effectuer une stimulation électrique dans l’AR. Si nécessaire, faire progresser le cathéter dans le ventricule droit (RV) pour une stimulation ventriculaire.
    10. Insérer une électrode broche dans l’apex ventriculaire à enregistrer en continu les bipolaires électrocardiogrammes (ECG) entre l’aiguille de l’électrode et la canulation de broche dans l’aorte ascendante (Figure 1C).
    11. Continuer de surveiller la pression d’ECG et de la perfusion dans l’ensemble de l’étude.
    12. Éteindre la lumière et de réaliser l’expérience suivante dans une pièce sombre.
    13. Passez à l’étape 2.5. pour un seul enregistrement de la tension membranaire ou 2.6. pour un enregistrement double de la tension membranaire et Ca2 + transitoires.
  5. Coloration pour un seul enregistrement de la tension de membrane
    1. Maintenir la solution de perfusion chauffée à 37 ° c au cours de ce protocole de coloration pour un seul enregistrement de la tension de la membrane.
    2. Diluer 8,3 µL de la solution mère de di-ANEPPS-4 (6 mM) avec 10 mL d’une solution de Tyrode (la concentration finale est 5 µM).
    3. Infuser le volume total (10 mL) de la solution de di-4-ANEPPS dans le coeur par la voie de perfusion pendant 2-5 min, suivie d’un lavage avec une solution de Tyrode pendant 5 min.
    4. Diluer 5 µL de la solution mère de blebbistatin (50 mM) avec 1mL d’une solution de Tyrode (la concentration finale est 250 µM).
    5. Administrer le montant total de la solution diluée blebbistatin par la voie de perfusion.
    6. Sautez l’étape 2.6 et passez à l’étape 2.7 pour le lavage.
  6. Coloration pour un enregistrement en double de la tension membranaire et Ca2 + transitoires
    1. Conservez une solution de Tyrode à température ambiante.
      Remarque : Ce réglage initial de la température est différent de celle de coloration pour un seul enregistrement de la tension de la membrane (étape 2.5.).
    2. Administrer le blebbistatin de la même manière tout comme aux étapes 2.5.4 et 2.5.5.
    3. Mix 3 µL de solution mère de Rhod2AM (10 mM) et 30 µL de polyoxyéthylène-polyoxypropylene bloquent copolymère F-127 (20 % dans le DMSO), puis diluer le mélange 10 ml d’une solution de Tyrode.
    4. Charger le montant total de la solution de Rhod2AM (3 µM) pendant 2-5 min par le même itinéraire que le blebbistatin.
    5. Diluer 7 µL de la solution mère de RH237 (10 mM) avec 10 mL d’une solution de Tyrode.
    6. Administrer le montant total de la solution diluée de RH237 (7 µM) pendant 2-5 min.
    7. À l’issue de la procédure ci-dessus, commencent à chauffer la solution de la Tyrode à 37 ° c.
  7. Lavage
    1. Maintenir la température de la solution Tyrode à 37 ° c dans l’expérience suivante.
    2. Perfuse le cœur avec une solution de Tyrode pendant au moins 5 min estomper les colorants excessives.
      Remarque : Il est inutile d’augmenter le débit d’eau au cours de cet étape de lavent (reportez-vous à l’étape 2.4.6.)
    3. Confirmer la disparition de tout artefact de mouvement en raison de contractions et la coloration homogène dans le coeur perfusé.
  8. Échantillonnage et analyse de données
    1. Mettre le couvercle en verre (25 mm x 60 mm) sur le coeur perfusé avec soin, pour aplatir la surface auriculaire sans trop de stress mécanique et éviter les artéfacts de mouvement de vibration de la solution. Vérifiez que l’oreillette s’adapte sur la lamelle couvre-objet convenablement.
    2. Taux record de la fluorescence par les caméras CMOS avec un échantillonnage jusqu'à 0,1 ms pour di 4-ANEPPS et 1 ms pour les RH237 et les Rhod2AM de coloration.
    3. Analyser les enregistrements obtenus en utilisant le logiciel d’analyse, selon les instructions du fabricant pour l’opération du logiciel.
    4. Créer une carte d’activation et le film après l’extraction de la région d’intérêt, enlèvement de dérive, un filtrage temporel et 3 X 3 binning5.

3. électrophysiologique étude

  1. Définissant les électrodes et le stimulateur stimulation
    1. Confirmer le contact de la pointe de l’électrode de stimulation sur mesure dans la RA au tissu pour la stimulation (reportez-vous à l’étape 2.4.9.).
    2. Remettre les stimuli toute stimulation de la stimulation sonde connectée au stimulateur programmable.
  2. Détermination du seuil de stimulation
    1. Jeu de l’intervalle de stimulation entre 100 et 150 ms (largeur d’impulsion de 0,4 ms), évitant n’importe quel rythme intrinsèque dépassant le taux de stimulation.
    2. Fournir une stimulation constante stimulation pour au moins 20 bat obtenir une stimulation auriculaire stable.
    3. Définir le rythme sortie à 5 mV, puis le réduire progressivement jusqu'à la livraison échoue stimulation à dépolariser l’atrium.
    4. Confirmer l’excitation auriculaire par la présence des ondes P à l’ECG, et/ou un signal d’excitation auriculaire par l’enregistrement optique.
    5. Déterminer le minimum d’électrostimulation qui est capable de dépolariser l’atrium sous le seuil de stimulation.
    6. Réglez le niveau de stimulation pour les études suivantes à deux fois le seuil de stimulation.
  3. Constante et le rythme de la rafale
    1. Fournir une stimulation constante pour 99 bat, avec un intervalle de stimulation à partir de 150 ms, ou le plus long intervalle qui évite dépassant le rythme intrinsèque.
    2. Réduire l’intervalle de stimulation progressivement avec des marches en 5 ms jusqu'à 40 ms, ou jusqu'à ce que pour atteindre l’intervalle qui échoue à obtenir la capture de 1:1 de l’atrium.
  4. Unique extrastimulus stimulation
    1. Définir la longueur de cycle de stimulation de l’entraînement de base (S1) à 120 ms, 100 ms et ms 80 à moins que le rythme intrinsèque dépasse l’entraînement de base ou la stimulation échoue à obtenir 1:1 excitation auriculaire.
    2. Définir le nombre de stimulation des stimuli à 10 battements pour la base du groupe motopropulseur.
    3. La valeur du premier extrastimulus (S2)-10 ms pour la durée du cycle de base.
    4. Livrer S2 après la dernière impulsion stimulation variateur de base.
    5. Raccourcir l’intervalle de couplage de S2 progressivement avec des marches en 5 ms jusqu'à ce que le S2 ne parvient pas à dépolariser l’atrium.
    6. Déterminer la période réfractaire effective (ERP) comme le plus long intervalle S2 qui ne parvient pas à dépolariser l’atrium.
    7. Évaluer l’ERP au moins 3 cycle de base différentes longueurs afin d’évaluer l’adaptation de débit de l’ERP.
  5. Extrastimuli double et triple stimulation pour provoquer des tachyarythmies auriculaires
    1. Réinitialiser l’intervalle de S2 jusqu'à un point situé 20 ms à l’extérieur de l’ERP de S2 si aucune arythmie n’est observées.
    2. Ajouter une deuxième extrastimulus (S3), commençant par le même intervalle que S2.
    3. Diminuer l’intervalle de couplage entre S2 et S3 progressivement avec ms 5 étapes jusqu'à ce que le S3 ne parvient pas à dépolariser l’atrium.
    4. Réinitialiser l’intervalle de S2 à un point de 10 ms à l’extérieur de l’ERP, puis répétez l’étape 3.5.3.
    5. Réinitialiser les intervalles S2 et S3 aux points 20 ms à l’extérieur de chaque ERP.
    6. Ajouter un troisième extrastimulus (S4), commençant par le même intervalle que S3.
    7. Diminuer l’intervalle de couplage entre S3 et S4 progressivement avec ms 5 étapes jusqu'à ce que le S4 ne parvient pas à dépolariser l’atrium.
    8. Réinitialiser l’intervalle de S3 vers un point 10 ms à l’extérieur de l’ERP, puis répétez l’étape 3.5.7.
    9. Réinitialisez les intervalles S2 et S3 aux points 10 ms à l’extérieur de l’ERP, puis répétez l’étape 3.5.7.
    10. Définir l’inductibilité des tachyarythmies auriculaires par l’induction reproductible à l’aide de stimuli de même programmés.
  6. Évaluation de la capacité d’induction des tachyarythmies auriculaires
    1. Enregistrer en continu l’ECG durant tous les protocoles de stimulation (étape 3.3-3.5.).
    2. Effectuez des enregistrements optiques pendant et après chaque stimulation, pour enregistrer l’induction de tachycardie atriale (AT) ou répétitif réponse auriculaire (RAR).
    3. Confirmer la reproductibilité en appliquant le même protocole de stimulation lorsque AF ou un RAR est induite.

Representative Results

Les expériences de cartographie optique sont effectuées en utilisant les dispositifs comme le montre la Figure 1 a. Le schéma du système optique est illustré dans la Figure 1 b. Le système fournit une analyse à haute résolution du potentiel de membrane et Ca2 + transitoire dans l’atrium.

Comme illustré à la Figure 1 c et d, le coeur isolé est placé dans une chambre à température contrôlée. Une sonde d’électrode de taille 1-Français est placée dans la RA à travers un tube PE inséré dans le SVC, et un autre à demeure PE tube est inséré dans la cavité de LV de l’apex LV pour éviter une pression excessive sur la chambre du coeur. Pour un enregistrement simultané de l’ECG, la cathode (plomb de ECG [-]) est relié à l’aiguille de canulation et l’anode (cordon de ECG [+]) est connecté à l’électrode de tige insérée dans l’apex ventriculaire. La caractéristique de cet assembly est pour éviter des dommages mécaniques pour les oreillettes.

Pour l’évaluation de la tension membranaire, fluorescence à l’aide de di-4-ANEPPS est enregistré avec jusqu'à une fréquence de 10 000 images/s d’échantillonnage (Figure 2). La carte d’activation est obtenue durant une stimulation constante de l’AR. La cartographie fine permet l’analyse du modèle détaillé de conduction dans petit atria murine.

La figure 3 illustre les traces représentatives de la tension de la membrane et Ca2 + transitoire dans le LA à l’aide de RH237 et Rhod2AM durant une stimulation constante de l’AR. Nous réduisons le taux d’échantillonnage de la cartographie à 1000 images/s pour obtenir un rapport signal/bruit suffisant du signal Rhod2AM avec le paramètre actuel. Toutefois, le système fournit une qualité suffisante pour l’analyse de la relation entre le potentiel d’action et Ca2 + transitoire.

Ensuite, nous effectuons une induction d’une tachyarythmie auriculaire avec stimulation programmée à l’aide de la souris dans un état pathologique. La figure 4 montre un enregistrement optique d’un induit AT dans un atrium murin colorées au di-4-ANEPPS. La souris est soumis à une procédure de constriction aortique transversal pour appliquer une surcharge de pression à l’atrium de 10 jours avant l' expérience6. Nous induire AT par extrastimuli triple stimulation (120/100/100/80) et observer la propagation du circuit réentrant.

Figure 1
Figure 1. Système de cartographie optique. a. l’Assemblée générale de l’électrophysiologie/optique système de cartographie. b. schéma de la composition du système cartographie optique : la flèche bleue indique la lumière d’excitation générée par la source lumineuse. L’objectif peut être échangé avec la tourelle. La lumière émise du cœur teinté est partagée entre la photo 1 et photo 2. Caméra 1 détecte les signaux de grande longueur d’onde de la tension de la membrane, et caméra 2 enregistre les longueurs d’onde avec un filtre passe-bande de 580 ± 20 nm pour le Ca2 + transitoire. Au cours de la procédure, la pression de l’ECG et la perfusion sont enregistrées en continu, et le signal ECG est aussi simultanément importé dans le plan optique, logiciel d’enregistrement. c. préparation des cœurs isolés : les coeurs sont canulés avec une aiguille émoussée par l’intermédiaire de l’aorte ascendante pour perfusion. Pour les enregistrements ECG simultanés, la cathode est reliée à l’aiguille de canulation et l’anode avec l’électrode de la broche est insérée dans l’apex ventriculaire. d. tube de canulation et les électrodes : le cœur est canulé avec une aiguille de calibre 21 atténuée pour perfusion (aiguille de canulation). Une taille de 1-Français stimulant électrode (électrode) est placée dans l’oreillette droite à travers un tube de polyéthylène inséré dans la veine cave supérieure. La chambre de verre est chauffée à 37 ° c de l’eau chauffée circule dans la cavité de la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Carte d’activation dans l’atrium. a. cartes d’activation représentatif dans la vue antérieure avec un objectif de 5 X et b. dans la vue postérieure avec un objectif de 1,6 X. (Panneau de gauche) Schéma du coeur isolé et atrium. (Panneau de droite) Carte d’activation de l’oreillette gauche obtenues avec di-4-ANEPPS à 10 000 images/s. L’enregistrement s’effectue sous stimulation constante avec l’électrode de stimulation placé dans l’oreillette droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Double enregistrement du potentiel d’action et Ca2 + transitoire dans l’oreillette gauche. a. schématique du cœur isolé. b. l’image représentative de l’intensité de la fluorescence dans l’oreillette gauche en utilisant RH237 pour la tension de membrane (Vm) et Rhod2AM pour le Ca2 + transitoire. L’enregistrement s’effectue avec un objectif de 5 X à 1 000 images/s. c. Enregistrement simultané de l’ECG (en haut), RH237 signal (au milieu) et le signal de Rhod2AM (en bas), durant une stimulation constante avec l’électrode de stimulation dans l’oreillette droite. Les flèches noires indiquent la stimulation aux clous et flèches jaunes l’excitation ventriculaire. Un effet de diffusion de la lumière du ventricule aussi peut être observé (flèches jaunes) dans les RH237 signal et le signal Rhod2AM. d. une fusion RH237 et Rhod2AM trace. Le potentiel d’action et Ca2 + changements transitoires sont enregistrés simultanément. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Cartographie d’activation lors de tachycardie atriale. (Panneau de gauche) Schéma du cœur isolé. (Panneau de milieu) Carte d’activation durant une tachycardie atriale (AT). AT a été induite par stimulation extrastimuli triple envoyées de l’oreillette droite. (Panneau de droite) Carte d’activation lors du rythme sinusal au cœur même de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Film supplémentaire 1. Film représentatif du potentiel dans l’atrium à l’aide de coloration avec le di-4-ANEPPS membranaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2. Films représentatifs du mappage d’activation pendant le rythme de sinus et de la tachycardie auriculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cartographie optique est une manœuvre bien établie pour l’étude de l' électrophysiologie cardiaque7et est un outil très utile pour évaluer non seulement les arythmies ventriculaires8,9, mais aussi celles auriculaires10,11 . La cartographie simultanée du potentiel transmembranaire et transitoires de Ca2 + est utile pour comprendre les mécanismes sous-jacents des arythmies en ce qui concerne l’insuffisance cardiaque et autres maladies cardiaques12,13. Lorsque l'on compare les autres méthodes d’évaluation électrophysiologique, tels que ceux qui utilisent une seule cellule ou feuille de cellules, d'entre les supériorités absolues de cartographie optique dans le coeur perfusé est l’évaluation au modèle de conduction dans l’atrium intact et ventricule, non seulement pendant un rythme sinusal, mais aussi pendant les arythmies induites14. Une tentative d’utiliser les cœurs murine, surtout l’atrium, comme substitut de l’homme a rencontré des difficultés, principalement en raison de leur petite taille, mais la souris est un modèle expérimental attrayant sur le plan de l’évaluation chez des animaux modifiés par génie génétique modèle et ce problème doivent être surmontée. Notre approche fournit une direction pour le résoudre.

Bien que nos appareils de cartographie optique était essentiellement semblable au système conventionnel pour cœurs ensemble murine15, notre méthode a l’avantage d’évaluer l’atrium murine en faisant quelques modifications. Tout d’abord, nous avons entrepris pour obtenir une haute résolution spatiale et temporelle de cette cartographie à haute résolution ont contribué à une mesure plus précise du motif vitesse et propagation conduction dans l’atrium murine jusqu'à 0,1 ms/cadre et 20 µm/pixel. En second lieu, afin d’éviter tout endommagement mécanique inutile ou étirement de l’atrium, qui pourrait altérer les propriétés électrophysiologiques 16,17, une aiguille à demeure est insérée directement dans le LV pour réduire la pression intra-chambre, au lieu d’introduisant par la LA interprété lors de la précédente étude de15. En outre, le stimulus de stimulation est livré dans un taille faite sur commande de Français-1 électrode cathéter placé dans le RA, mais pas par une électrode à aiguille, qui risquent de se blesser l’atrium. Les broches sont évités lors de la fixation de l’auricule, qui ont été utilisés dans l’étude des dernières15. Troisièmement, en ce qui concerne l’évaluation du mécanisme sous-jacent de l’arythmie, un protocole de stimulation programmée pour induire des tachyarythmies auriculaires est crucial18,19. Nous effectuons une stimulation programmée identique à celui dans des études cliniques et électrophysiologiques, incluant la stimulation de l’éclater et jusqu'à extrastimuli triple stimulation, avec une modification de l’intervalle de stimulation pour le coeur de souris. Ainsi, en plus des paramètres de mesure de base, le protocole permettrait d’évaluer la capacité d’induction de l’AT. Au besoin, la capacité d’induction de l’AT est évaluée avec l’administration de l’isoprotérénol ou d’autres drogues. Dans notre expérience, les souris de type sauvage a peine montrent tout ATs même après un protocole de stimulation complet. La capacité d’induction d’AT devrait donc être une information importante pour l’évaluation de la contribution de plusieurs conditions pathologiques telles que les mutations génétiques, interventions chirurgicales et l’administration de médicaments,11. Ces modifications pourraient optimiser l’évaluation électrophysiologique précise dans l’atrium murine intact.

Cette méthode a également quelques limitations. Tout d’abord, utilisez une résolution spatiale maximale avec un objectif de 5 X, le champ de vision (FOV) est limitée à une partie de l’oreillette (i.e. seulement l’auricule gauche comme illustré à la Figure 2 a). Pour obtenir le champ de vision plus grand de l’atrium, un objectif de 1,6 X est parfois préférable (Figure 2 b). Deuxièmement, sans fixation de l’atrium avec broches, il est parfois difficile de mesurer les propriétés de conduction auriculaire correctement, car la surface auriculaire est courbée. Ainsi, nous avons placé le couvercle en verre sur sa surface pour l’aplatir au lieu de fixation par des goupilles. Cette méthode est également bénéfique pour la prévention des artéfacts de mouvement contre les vibrations de la solution. Troisièmement, avec notre méthode, il est assez difficile d’obtenir le champ de vision complet de celui-ci, alors, d’utiliser la vue antérieure et postérieure correctement est plus importante dans notre démarche que dans l’autre approche, comme illustré à la Figure 2. L’avantage de la vue antérieure serait l’observation claire de rentrée dans le cas de pathologies, en particulier dans l’appendice (Figure 4). En revanche, la vue postérieure a l’avantage d’obtenir une bonne vision de la paroi auriculaire postérieure et pourrait être un enregistrement détaillé de déclencher l’activité de la gaine du myocarde. Lorsqu’il est difficile d’obtenir une vision appropriée et d’aplatir la surface incurvée avec notre méthode, l’atrium peut être fixé avec une tension minimale de pins.

Avec notre méthode, il y a 3 problèmes possibles, échec de la coloration, la stimulation et l’induction de l’arythmie. Pour défaut de coloration, si non ou légère fluorescence est observée, vous devriez vérifier si l’appareil de cartographie optique est monté correctement, et si le réactif est convenablement stocké et utilisé. La condition de la solution de perfusion est également cruciale, qui peut également affecter les propriétés électrophysiologiques du cœur lui-même, par conséquent, la condition de la solution dont le pH, la température, et s’il y avait suffisamment d’aération doit être strictement surveillés. Il est également important d’éviter toute embolie au cœur. Rythme d’échec, si les stimuli stimulation ne peuvent exciter l’atrium, chercheurs doivent vérifier si le câblage est correct à l’aide d’un testeur de circuit. Lorsque les stimuli de stimulation sont émis correctement, le problème est le contact de l’électrode avec le tissu. Repositionnement des électrodes peut résoudre le problème, et notre approche à l’aide de la sonde de stimulation, il est facile. Difficulté dans l’induction de l’arythmie, RV stimulation peut être utilisée pour l’induction d’un AT, dans certains cas limitativement énumérés. À l’aide d’une sonde d’électrode quadripolaire dont le distales deux électrodes et électrodes proximales peuvent se trouver dans le RV et RA, respectivement, il est facile de changer le site de stimulation de la RA à la RV Ce cathéter est également utile pour déplacer l’excitation ventriculaire lorsqu’un signal d’activation ventriculaire simultanée masque le signal d’excitation auriculaire.

Cette méthode va contribuer à l’évaluation du génotype-phénotype interactions dans l’AF associés gènes nouvellement découverts par les études roman comme GWAS, surtout pour les gènes dont l’enquête n’a pas pu leur montrer par d’autres approches. Avec les progrès des dispositifs et techniques, les propriétés électrophysiologiques de l’enveloppe de la veine pulmonaire, qui est la source importante de AF20, peuvent être évaluées dans le coeur intact grâce à cette approche.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par le programme pour l’amélioration du milieu de la recherche pour les jeunes chercheurs de fonds spéciaux de Coordination pour la promotion de la Science et technologie (SCF) (à T.S.), subventions pour la recherche scientifique (n ° 16K 09494, T.S., no 26293052, à T.F.) du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT) du Japon. Nous apprécions Brainvision et M. Kenji Tsubokura pour l’assistance technique, et nous remercions également M. John Martin pour son aide linguistique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin SIGMA B0560-1MG E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Rhod2AM Biotium 50024 Ca indicator
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Biotium #59000 To enhance the staining with Rhod2AM
Di-4-ANEPPS Wako 041-29111 Voltage-sensitive dye
Dimethyl sulfoxide Wako 046-21981 Solvent for reagents
Bottle top filter Corning 430513 For filtering Tyrode's solution
Haparin Sodium Mochida Pharmaceutical Co., Ltd N/A To avoid blood clots in the coronary artery
Air stone (φ8 mm x 10 mm) Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho N/A for aeration
Pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Corporation N/A For an anesthesia
Programmable stimulator Fukuda Denshi BC-05 Fukuda Denshi kindly rented us.
Power Lab AD Instruments Powerlab 26/8SP To record blood pressure and electrocardiogram
Bio Amp AD Instruments ML132 Amprifier for electrocardiogram
BP Amp AD Instruments FE117 Amprifier for blood pressure
LabChart AD Instruments Version 7 Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram
Disposable BP transducer AD Instruments MLT0670 pressure transducer
1-Fr custom made electrode catheter Unique Medical N/A To pace right atrium
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) Natume Seisakujo SP31 Put into superior vena cava to introduce electrode catheter
Millex-SV 5.00 μm Merk Millipore SLSV025LS To filter the circulating Tyrode
24-gauge indwelling needle TERUMO SR-FS2419 Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber
21-gauge needle TERUMO SN-2170 We cut the tip of needle and blunted it by filing
25-guage needle TERUMO NN-2525R
1-ml syringe TERUMO SS-01T
PVC tube TERUMO SF-ET0525 for Langendorff's perfusion circuit
Three-way stopcock TERUMO TS-TL2K for Langendorff's perfusion circuit
Petri dish As one 3-1491-01
Custum made heating glass coil Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Custum made warming glass chamber Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Constant temperature circulating device Lauda E100 connected to heating coil and warming chamber
Cover glass (25 mm × 60 mm) Matsunami C025601 Put on the atria to flatten the recording area
Perista pump ATTO SJ-1211 peristaltic pump
Stemi DV4 Carl Zeiss N/A Stereomicroscope
MiCAM ULTIMA-L2 Brainvision Inc. UL-L2 Optical mapping System
BV_Ana Software Brainvision Inc. BV_Ana Data Analysis Software
THT Macroscope Brainvision Inc. THT-ZS Epi-Illumination Unit
LED Light Source Brainvision Inc. LEX2-G
Dichroic Mirror 560nm Brainvision Inc. DM560 Epi-Illuminatinon
Excitation Filter 520/35nm Semrock, Inc. FF01-520/35-25
Projection lens Plan S 1.0X Carl Zeiss 435200-0000-000
Focus Drive Carl Zeiss 435400-0000-000
Objective lens Revolver Carl Zeiss 435302-0000-000
Manual Focus Column Carl Zeiss 435400-0000-000
Macroscope Base Carl Zeiss 435430-9901-000
Straight Light Guide MORITEX Corporation MSG10-2200S Epi-Illuminatinon
Condenser Lens MORITEX Corporation ML-50
PLANAPO 5.0X Leica Microsystems 10447243 Objective Lens
PLANAPO 1.0X Leica Microsystems 10447157 Objective Lens
PLANAPO 1.6X Leica Microsystems 10447050 Objective Lens
Beam-Splitter Brainvision Inc. FLSP-2
Dichroic Mirror 665nm Brainvision Inc. DM665 Beam-Splitter
Emission Filter 572/28nm Edmund Optics #84-100 Rhod2-AM
Emission Filter 697/75nm Semrock, Inc. FF01-697/75-25 RH237 and Di-4-ANEPPS
0.2 mL PCR tube Greiner Bio-One 671201
aluminum foil Toyo alumi 0020

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References

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