应用脑注射策略建立小鼠 Zika 病毒诱发神经系统疾病模型: 胚胎、新生儿和成人

Neuroscience

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Summary

本文介绍了一种在小鼠中建立 Zika 病毒诱导小头模型的方法。该协议包括胚胎、新生儿和成人期 Zika 病毒的脑内接种方法。

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Herrlinger, S. A., Shao, Q., Ma, L., Brindley, M., Chen, J. F. Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult. J. Vis. Exp. (134), e56486, doi:10.3791/56486 (2018).

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Abstract

Zika 病毒 (ZIKV) 是目前在北部, 中美洲和南美流行的黄。现在建立的 ZIKV 可能导致小头和额外的大脑异常。然而, 在发育中的大脑中 ZIKV 的发病机制仍然不清楚。脑外科方法经常用于神经科学研究, 以解决正常和异常的大脑发育和大脑功能的问题。该协议利用经典的外科技术, 并描述了一种方法, 使一个模型 ZIKV 相关的人类神经系统疾病的小鼠神经系统。虽然直接脑接种没有模型的正常模式的病毒传播, 该方法允许调查人员提出有针对性的问题的后果后, ZIKV 感染的大脑发育。本协议描述 ZIKV 脑室内接种的胚胎、新生儿和成人阶段。一旦掌握, 这种方法就可以成为一种简单而又可重复的技术, 只需几个小时即可完成。

Introduction

小头是由于脑发育缺陷而导致的一种情况, 其特点是新生儿的头部大小小于平均水平。小头儿童表现出一系列的症状, 其中包括发育迟缓、癫痫、智力残疾、听力丧失、视力问题以及运动和平衡等问题, 这取决于疾病的严重性和原因1,2,3。这种情况是多因素的性质, 与遗传, 传染性的代理和环境因素, 导致小头4,5,6,7,8, 9。在 2015-2016 ZIKV 爆发之前, 根据 CDC10, 在美国诊断出1万出生的8儿童患有小头。在 2月1日st 2016年世界卫生组织宣布了 Zika 病毒一个国际关注的公共卫生紧急状态由于母亲的 ZIKV 传染的小头诊断的惊人的增量11, 12。疾病控制中心最近对美国 ZIKV 病例的一项研究表明, 与未感染的个人相比, 产妇 ZIKV 感染导致儿童发展小头的风险增加了20倍, 而来自美国的 4% ZIKV 受感染的母亲导致具有小头11的子级。据报道, 巴西 ZIKV 感染妊娠期间小头相关出生缺陷的发生率已影响到受感染母亲中多达17% 的婴儿, 这表明拉丁美洲的其他因素可能导致增加的风险13. 虽然我们知道 ZIKV 可能导致小头和发病机制在神经祖细胞 (NPC) 人口7,8,14, ZIKV 的完全发病机制在开发的脑子里仍然难以捉摸。重要的是发展动物模型, 以进一步调查的疾病机制的基础上的大脑异常与 ZIKV 感染有关。

为了直接研究 ZIKV 对脑发育的影响, 我们首先开发了用 ZIKV7的胚胎 14.5 (E14.5) 脑接种的小鼠模型。这个阶段被选择了, 因为它被认为是在人类妊娠的第一个月的结尾的代表14。幼崽可以存活到产后5天 (P5) 与这种胚胎脑注射方法 (~ 1 µL 1.7 x 106组织培养感染剂量 (TCID50/mL))。这些产后幼崽在受感染的人类婴儿中表现出相似观察到的一系列表型, 包括心室增大、神经元丢失、轴突稀疏、astrogliosis 和胶质激活1215。新生老鼠的大脑相对不成熟, 类似于怀孕中期的人脑发育阶段16, 老鼠大脑发育包括一个主要的产后部分。为了研究晚期妊娠期感染, 还介绍了一种产后感染的方法。新生儿感染 ZIKV 在 P1 可以存活13天后注射。在老鼠之前的17中已经描述了血液产生的成人阶段感染, 但需要使用干扰素 (干扰素) 调节因子 (IRF-3) 转录因子,-5,-7 三次击倒菌株。该协议描述了一种接种 ZIKV intraventricularly 的方法, 以规避在成人中禁用小鼠模型的抗病毒反应。虽然这绕过了小鼠的免疫系统, 这种注射途径并不直接模仿典型的感染途径。为了直接解决这种差异, 实验者可以在宫内感染 ZIKV 而不是颅内通路。通过以前的工作18, 我们在这个胚胎感染协议中简要描述了这一技术。

使用此技术实现的 Zika 病毒菌株包括墨西哥隔离 MEX1-44719和 1947年20隔离的非洲隔离 MR-766。Zika MEX1-44 于 1月2016年在墨西哥恰帕斯被感染的白纹蚊蚊子隔离。我们通过在加尔维斯顿 (UTMB) 的德克萨斯大学医学处获得了这种病毒。此外, 登革热病毒2型 (DENV2) 接种了这种技术的比较研究。DENV2, 应变 S16803 (序列基因库 GU289914), 被隔离从一个病人样本从泰国1974年和传代在 C6/36 细胞。病毒是传代两次在维罗细胞被世界文献中心的新兴病毒和虫媒病毒 (WRCEVA) 之前, 老鼠注射。这表明, 这项技术同样适用于各种 ZIKV 和其他 flaviviruses 可能对大脑发育有影响的菌株。

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Protocol

所有动物使用协议遵循南加州大学和佐治亚大学的动物保育指南。妊娠大坝和成人的安乐死方法按照批准的协议进行: 二氧化碳窒息, 其次是颈椎脱位, 以确保安乐死。新生幼崽通过斩首被安乐死。

警告: 以下协议涉及处理致病病毒。在处理病毒时应采取适当的预防措施。所有议定书必须在使用前由适当的机构委员会批准。

1. Zika 病毒的胚胎脑内接种

  1. 对于定时怀孕交配, 请考虑在交配后的一天中午 E0.5。在一天结束时对老鼠进行配对, 并在清晨检查插头, 以减少交配时间的变异性。
  2. 在手术前准备玻璃针。拉针和削减1/3 它的长度, 然后锐化在45°角使用微磨床与水滴, 直到毛孔大小为 50-70 µm. 检查针尖在立体镜的质量和破损。
  3. 把病毒整除在冰上。就在手术前, 将 ZIKV 注射剂装入准备好的玻璃注射针中。组装气密注射注射器 (50 µL 容积), 鲁尔锁附件和油管, 并用矿物油将组装好的注射器与油管浸透。一旦饱和, 连接针, 并绘制〜 6-7 µL ZIKV 入针 (1 µL 是 1.7 x 106 TCID50/mL)。
  4. 注射妊娠 C57BL/6J 或 129S1/SvImJ 小鼠胚胎天 E14.5 胚胎 (颅内注射) 或 E10.5 胚胎 (用于宫内注射) 盐酸氯胺酮 (80-100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (5-10 毫克/千克) 稀释的无菌盐水溶液腹腔在母亲身上引起麻醉。另外, 麻醉母亲与监测的异氟醚异氟醚提供的吸入, 并在废气清除, 如果适当的。注射丁丙诺啡-SR (0.5-1.0mg/千克), 以诱发镇痛。
  5. 捏试验麻醉母亲的脚趾头或尾部, 然后躺在动物认可的加热垫 (热垫 100 x 200 2.5 毫米) 仰卧。脚趾夹钳是不育的, 不用于处理组织在手术中。或者, 戴手套的手可以用来测试脚趾夹戒的反射。
    注: 请参考您的机构兽医人员的首选围手术期加热方法。在这个加热垫和动物之间放置了一个盖子。
  6. 在眼睛上加眼膏。
  7. 剃掉腹部的表面, 用碘和酒精消毒三次。交替碘和酒精湿巾;从手术部位抹去圆形的运动。
  8. 用无菌布将手术部位周围的皮肤披上, 以避免切口和器械的污染。
    注: 悬垂开口不应大于准备好的手术部位;在褶皱的开口上不应该看到头发。
  9. 用镊子将母亲的皮肤从腹部掐开, 用不育的手术剪刀在内侧矢状线的 1-1.5 厘米线上切开下腹部。这会把皮肤切开, 进一步进入腹腔, 这样胚胎就会暴露出来了。
    注: 手术剪刀用于切割皮肤和腹膜层。每项手术都使用无菌器械和手套。
  10. 在一个小的不育纱布中间切开一条狭缝, 并应用在手术开口的顶端。水合无菌生理盐水。通过切口将胚胎拉到无菌纱布上, 注意不要将超过 4-5 的胚胎一次聚焦在一个子宫角上。
  11. 在接种前和整个注射过程中, 用无菌生理盐水水合胚胎, 以确保它们不干燥。跟踪哪些胚胎被注射, 以及它们在子宫角内的位置。因此, 单个胚胎被视为单独的实验, 因为胚胎在子宫内发育时不会改变位置。(继续步骤1.15 为宫内注射)。
  12. 轻轻地将刮刀放在胚头下。用一盏灯照亮胚胎, 以可视化头部和头骨缝合线。
    注: 采用无菌技术, 包括无菌手术手套和器械。在无菌物品 ( 如灯 ) 纵后 , 手套应更换为新的无菌手套之前 , 处理无菌仪器和领域。
  13. 通过操纵胚胎与灯 (在头后面为可见性) 和自由手指来定位头部, 直到胚胎的头部被直接推到子宫壁上, 并与非显性手一起举行。
    注意: 定位胚胎是一个关键的部分和技术, 采取了最大的实践。过多的手指压力会破坏导致致命的胚胎膜, 没有足够的压力会使注射变得困难。
  14. 使用沿头骨缝合的血管作为指导。注射 ZIKV 病毒 (〜1µL, 1.7 x 106 TCID50/mL 墨西哥隔离 MEX1-44) 到 E14.5 胚胎大脑的侧脑室与组装的注射器和针。使用控制介质作为假注入。
  15. 为了改善妊娠的保留, 避免病毒注射的两个胚胎旁边的卵巢和两个胚胎旁边的上阴道 (图 1A)。总的来说, 每只垃圾注射的胚胎不超过 6, 以减少手术时间, 防止胚胎丢失。
  16. 将注入的胚胎放回怀孕的水坝, 用0.5 毫升无菌生理盐水填满腹腔。要关闭, 首先缝合腹部腹膜肌, 然后第二缝合外部皮肤层与4.0 无菌缝线。最好使用间断缝线;如果老鼠咀嚼缝线, 就有可能裂开伤口。
  17. 将鼠标放在一个放在加热垫上的笼子里, 如果需要, 可以让鼠标逃到一个不加热的区域。监测的母亲, 而他们恢复 (1-2 小时) 从麻醉。根据个别实验, 在手术后进行不同时间的胚胎发育。
  18. 宫内注射
    1. 与一个子宫喇叭和胚胎暴露, 使用1毫升注射器和27G 针注射 100 ul Zika 病毒 (106 TCID50单位暂停在 100 ul DMEM), 或控制媒介, 进入宫内空间或胎盘组织。注意哪些胚胎已经注射用于胚胎分期解剖。有关更多详细信息, 请参见以前发布的工作18
    2. 将胚胎注入到怀孕的水坝中, 用0.5 毫升无菌生理盐水填满腹腔。要关闭, 首先缝合腹部腹膜肌, 然后第二缝合外部皮肤层与4.0 无菌缝线。最好使用间断缝线;如果老鼠咀嚼缝线, 就有可能裂开伤口。
    3. 将鼠标放在一个放在加热垫上的笼子里, 如果需要, 可以让鼠标逃到一个不加热的区域。监测的母亲, 而他们恢复 (1-2 小时) 从麻醉。根据个别实验, 在手术后进行不同时间的胚胎发育。

2. Zika 病毒新生儿脑内接种: P0/P1

  1. 确保气密注射注射器 (10 µL 量) 和针头不堵塞。通过装载三20毫升一次性注射器和26口径针头进行清洁和测试: 一份含盐水, 一份含70% 乙醇, 一个用空气清除溶液。使用10% 漂白剂消毒, 如果以前用于病毒注射。
  2. 把病毒放在冰上。用盐水填充注射器以减少注射器中的死容积, 并绘制0.75 µL 的空气, 将盐水溶液与注射材料分离。
  3. 为注射的幼崽设置一个温暖的湿润恢复室。使用加热块, 放置一个 closeable 容器 (如空尖盒) 与无菌纱布和 humidify 生理盐水。在开始注射前预热。
  4. 设置 microinjector, 包括泵和控制器。确定特定注射器的设备类型代码 (, 对于10µL 注射器, 设备类型为 "D")。确定注射速度。
  5. 收集的产后一天0或1幼崽 (P0/P1) 附近的手术设置。用病毒装载注射注射器。用70% 乙醇消毒幼头坐骑。
  6. 将幼崽裹在薄薄的纱布里, 将它们完全掩埋在冰层中, 以达到麻醉状态。幼崽的 cryoanesthetized 为5分钟. 确保幼崽有足够的麻醉注射通过执行尾巴/脚趾捏没有反应。这大约产生15分钟的麻醉状态。
  7. 将幼崽放在头上, 用碘和乙醇 (三倍) 消毒头部表面, 然后用无菌擦拭 (异丙醇或70% 乙醇) 擦拭乾燥。
  8. 用黑色标记标记 lambda, 并使用立体定向仪器记录 lambda 上的坐标。测量从 lambda 到眼睛边缘的距离, 从 lambda 的立体定位坐标开始计算2/5 的距离, 从 lambda 到眼睛 (两个半球, 如果你注射两个)。
  9. 在为注射部位创建孔之前重新检查麻醉深度。使用26口径针仔细和表面刺穿头皮和头骨在注射位置 (头骨是非常软的新生儿), 以创建一个开放的注射针。
  10. 将注射针头降低到穿刺部位, 一旦针头刚刚突破皮肤, 用立体定向仪计算注射部位 (侧脑室) 的1毫米深度。
  11. 一旦针被降低到注射深度, 程序 microinjector 注射: 1 µL 病毒, 以 10 nL/秒的速度, 注射大约1µL 1.5 分钟 (~ 1 ul 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV)。
  12. 当注射完成后, 等待三十年代, 并通过旋转螺钉 (背), 在每增加后等待三十年代, 以0.5 毫米的增量收回针。
    注意: 这减少了注射病毒的渗漏。
  13. 一旦删除, 要么快速加载针头和注射器与更多的病毒 (不同的病毒或模拟控制应加载到单独的注射器/针头) 或删除幼崽从头部安装到预热的湿室。每隔几分钟监视幼犬以测量恢复。用它的垃圾代替幼崽。

3. Zika 病毒成人脑内接种

  1. 用盐酸氯胺酮 (80-100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (5-10 毫克/千克) 稀释在无菌生理盐水中注射成年小鼠腹腔麻醉。注射丁丙诺啡-SR (0.5-1.0mg/千克), 以诱发镇痛。脚趾/尾部捏老鼠, 以确保其麻醉状态, 然后将其安装在立体定向仪器 (带加热垫), 以固定头部在手术期间。
  2. 在眼睛上添加眼膏, 防止老鼠的眼睛在手术过程中干燥。把头皮从眼睛后面刮到耳朵的开始。用碘和70% 乙醇三次消毒暴露的皮肤。交替碘和酒精湿巾;从手术部位抹去圆形的运动。
  3. 在切割皮肤前重新检查麻醉深度。使用手术刀, 使一个0.5 厘米的切口沿内侧矢状线头部在消毒的位置, 暴露 bregma。使用带有棉尖涂抹器的滚动运动, 清除脑膜组织颅骨的表面, 同时将皮肤从注射部位推开。
  4. 从 bregma 开始, 将外科钻头对准, 并使用以下坐标识别注射部位: AP-0.5 毫米, ML: +/-1.5 毫米. 使用控制脚踏踏板, 钻入颅骨缓慢, 只钻骨, 直到一个洞已经清除针。
  5. 用 microinjector 泵和气密注射器 (10 µL 容积) 在立体定向上更换钻头。在盐水溶液和病毒之间留下一个小气泡, µL 4-5 的病毒。确定特定注射器容积的设备类型代码 (即, D 为 10 ul 容积注射器)。将针降低到 DV: 从脑表面-1.5 毫米。注射1µL 的病毒, 程序的速度 10 nL/秒, 注射约1µL 超过1.5 分钟。
  6. 当注射完成后, 等待三十年代, 并删除针在0.5 毫米增量, 等待三十年代后每回合。这减少了注射病毒的回流和渗漏。
  7. 注射完毕后, 使用镊子松开皮肤, 恢复外露颅骨。用4.0 缝线缝合头皮, 从立体定向仪器中取出鼠标。将鼠标放在一个固定在加热垫上的笼子里, 让鼠标在需要的地方逃逸到一个不加热的区域, 并在他们恢复 (1-2 小时) 麻醉时进行监测。

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Representative Results

我们对胚胎脑 ZIKV 接种方法的代表性图像显示在描述脑内注射 (图 1A) 和宫内和 intraplacental 注射 (图 1B) 的图示中, 说明方法对妊娠期大坝和胚胎进行手术治疗 (胚胎接种协议)。图 2A展示了 ZIKV (MEX1-44) 感染 (immunostained 与抗体抗黄组抗原, 绿色) 在 E18.5 大脑皮层。Pax6 (红色) 标签的 npc 在发展中的皮层。ZIKV 被接种到 E14.5 胚胎脑中。利用组织样本中的 TCID50 检测7, 我们的生长曲线分析显示, ZIKV 可以有效地在开发的大脑中复制和生长 (图 2B, 2C), 如发布的7图 2D使用胚胎接种方法在发育中的皮质中显示成功感染 DENV2。DENV2 使用抗体对黄组抗原 (绿色) 进行检测。图 2E显示感染的 ZIKV 不同, 即非洲血统 (MR-766)。图 2F显示了 ZIKV (MEX1-44) 在阶段 E10.5 中替代路线、intraplacental 接种的代表性感染。

图 3A是描述用于识别 P0/1 幼崽 ZIKV 接种的侧脑室射入位置的标志的图示。图 3B显示 P0/1 注射后 P13 大脑皮层的 ZIKV (MEX1-44) 感染。ZIKV (MEX1-44) 检测使用抗体抗黄组抗原 (红色)。图 4显示了用于练习注射位置的荧光珠 (红色), 以及成人侧脑室注射的成功。

Figure 1
图 1: ZIKV 的胚胎接种.(A) 图, 代表一个子宫角的曝光, 并注意避免注射邻近阴道的胚胎和沿喇叭的最侧面胚胎。(B) 图, 代表一个子宫角的暴露, 描述 intraplacental 和宫内注射的位置。这些关系图已从其原始出版物21中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: ZIKV 胚胎接种在 E14.5.(A) 在 E18.5, 胚胎大脑感染了 ZIKV 亚洲 (MEX1-44), 横跨发展中的大脑皮层的所有层 (鳞片杆为200µm)。神经祖细胞 immunolabeled 与 Pax6 (红色) 和 ZIKV 通过黄抗原 (绿色)。(B) TCID50 在 E14.5 与 ZIKV 亚洲 (MEX1-44) 的产后 3 (P3) 脑组织中接种的结果。误差线表示在每个测量 (**p < 0.0001, 学生的 t 测试)7中 s.e.m. 三独立测量, 其中一个模拟和一个 ZIKV 感染的大脑。(C) TCID50 结果描述了感染胎儿脑组织中 ZIKV 病毒血症的典型增长曲线。误差线表示 s.e.m. 三独立测量与一个模拟和一个 ZIKV (MEX1-44) 受感染的大脑在每个测量。方差分析检测到病毒滴度的显著增加, 因为开发将进行7。(D) 登革病毒 (DENV2) 感染的代表性组织学 (E14.5 胚胎接种了 ~ 1 µL 3.4 x 105 TCID50/mL, 鳞片条为 200 um), (E) ZIKV-非洲 (MR766) 感染的代表性组织学 (鳞片条200µm)。(F) ZIKV 亚洲 (MEX1-44) 感染的代表性组织学来自 intraplacental 注射策略 (比例条为200µm)。在所有图像中, 赫斯特染色细胞核。这些数字已从其原始出版物7中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: ZIKV P1 接种的代表性组织学.(A) 图, 演示如何确定注射位置到 P1 幼犬侧脑室的方法。(B) 具有代表性的冠状 cryosections immunostained 黄组抗原低 (左, 鳞片条为100µm), 高 (右, 鳞片条为50µm) P1 接种 ZIKV (1 ul 3.4 x 105 P15 TCID50/mL) 的放大倍数。赫斯特染色核。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 成人阶段脑室注射.成人小鼠注射荧光珠是在手术后不久牺牲, 以确定注射位置的成功 (规模酒吧是200µm)。矢状 cryosection 可以在切片后立即查看, 因为珠子不需要进一步染色。赫斯特染色核。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

这里描述的是一种在胚胎、新生儿和成人阶段 ZIKV 脑内接种的方法, 用于研究 ZIKV 诱发的脑发育损伤。虽然直截了当, 调查人员应该采取一些考虑, 以确保研究的质量和有关人员的安全。

DENV 与黄属 ZIKV 密切相关。DENV 并没有与人类的儿童脑功能紊乱有因果关系。DENV2 可以通过胚胎接种方法 (1 µL 3.4 x 105 TCID50/mL) 成功地感染和复制发育中的大脑 (图 2D)。因此, 除了未感染的细胞媒介 (模拟), DENV 感染可以作为一个负控制, 以研究 ZIKV 特定的发病机制在发展中的大脑。重要的是要避免病毒泄漏在子宫内, 这可能导致不必要的污染其他胚胎。因此, 有必要通过对每个胚胎的脑组织进行 qRT PCR 或 TCID50 检测, 来验证感染和非感染的个体。染料可以添加到病毒培养基中, 以直观地确认注射, 但测试以确保染料不会造成损害本身。

小鼠菌株呈现生长变异性, 因此 P1 注射部位需要对每条鼠标线进行验证。用荧光珠进行模拟新生儿注射, 以可视化注射部位。这项初步研究将告知注射是否到达脑室或进入脑组织太深。为理想的结果, 幼崽可以在注射后不久被牺牲, 以确定荧光珠在心室的位置。整个头的幼崽可以固定过夜, 嵌入, 并 cryosectioned 观察精确的注射位置。注入含油饱和注射器需要经验, 建议在 parafilm 上使用染色的假注射来验证注射量是否准确。

在这些研究中, 生物安全措施是至关重要的, 以避免实验室人员意外感染病毒。必须事先在完成工作的设施中进行生物安全批准。ZIKV 被认为是美国疾病控制和预防中心的生物安全2级 (BSL2) 病原体。在处理病毒的地区工作的所有个人应了解并熟悉其机构的生物安全协议。所有接触到 ZIKV 或 DENV2 的工具和表面都应用10% 漂白剂进行消毒, 以在使用后销毁残留的病毒微粒。怀孕或试图受孕的妇女建议不要与接触 ZIKV 或 DENV2 的研究领域进行互动。所有用于组织学的组织都固定在4% 个粉煤灰中, 以使病毒失效以进行分析。储存和培养病毒应在 BSL2 工作的胡德细胞中进行。使用 TCID50 协议可以量化股票病毒和组织滴定。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者想感谢罗切斯特大学的 Abdellatif Benraiss 博士, 他的导师和讨论与学习成人外科和新生儿技术有关。作者还要感谢 UGA 博士在他的立体定向设备的使用和与建立这种技术的方法有关的讨论, 以及研究学院科学家 (弧形) 基金会的进步为他们的支持和我们的 NIH 支持 (NINDS 赠款 R01NS096176-02, R01NS097231-01, & F99NS105187-01)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor Leica 39416001
Mouse Stereotax Kopf 04557R
Micro4 Microsyringe Pump Controller WPI SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump WPI UMP3
Modulamp Schott -
Luer-lock tubing (19-gauge) Hamilton 90619
Melting Point Capillary Kimble 34500-99 Glass needle
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres Thermo Scientific R25 No dilution; Use for practice injections
10 µL, Model 1701 LT SYR Hamilton 80001 for embryonic inoculation
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 Hamilton 80030 for neonate/adult
4-0 Ethilon Nylon Sutures Ethicon -
Mineral Oil VWR -
micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Micropipette Grinder Narishige EG-44
Fastgreen FCF Dye Sigma F7252 inject with 0.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibody Millipore MAB10216 ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)
Pax6 DBHB Pax6-s ms IgG1 1:20

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References

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