İntraserebral enjeksiyon stratejileri kullanarak Zika virüs kaynaklı nörolojik bozukluklar için fare modelleri oluşturma: embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada fare Zika virüs kaynaklı microcephaly bir model oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin-sahne intraserebral aşılama Zika şunun için yöntemler içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Herrlinger, S. A., Shao, Q., Ma, L., Brindley, M., Chen, J. F. Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult. J. Vis. Exp. (134), e56486, doi:10.3791/56486 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zika (ZIKV) bir flavivirus Kuzey, orta ve Güney Amerika'da şu anda endemik virüstür. Şimdi ZIKV microcephaly ve ek beyin anormallikler neden olabilir kuruldu. Ancak, gelişmekte olan beyin ZIKV patogenezinde temel mekanizması belirsizdir. İntraserebral cerrahi yöntemler sık nörolojik araştırma soruları normal ve anormal beyin gelişimi ve beyin fonksiyonu hakkında için kullanılır. Bu iletişim kuralı klasik cerrahi teknikler kullanır ve modeli ZIKV ilişkili insan nörolojik hastalık için fare sinir sisteminde izin yöntemleri açıklar. Doğrudan beyin aşı virüs iletim normal moda model değil iken, yöntemi müfettişler sonucu gelişen beyin ZIKV enfeksiyon sonra ilgili hedeflenen sorular sormak sağlar. Bu iletişim kuralı ZIKV, İntraventriküler aşılama embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin aşamaları açıklar. Hakim sonra bu yöntem sadece gerçekleştirmek için birkaç saat sürer bir basit ve tekrarlanabilir teknik haline gelebilir.

Introduction

Microcephaly hastalarda ortalama baş boyutundan küçük ile karakterize arızalı beyin gelişimi kaynaklanan bir durumdur. Microcephaly çocuklarla gelişimsel gecikme, nöbet, Fikri Engellilik, işitme kaybı, görme sorunları ve hareket ve denge, diğerlerinin yanı sıra, hastalığın şiddetine bağlı olarak sorunları kapsayan belirtiler bir dizi Sergi ve 1,2,3neden. Doğada, genetik, bulaşıcı Ajan ve microcephaly4,5,6,7,8neden için bağlantılı çevresel faktörler ile multifaktöriyel bir durumdur, 9. 2015-2016 ZIKV patlak önce10CDC göre Amerika Birleşik Devletleri'nde microcephaly ile 10.000 doğumlular 8 çocuktan tanısı konuldu. Üzerinde Şubat 1st 2016 Dünya Sağlık Örgütü Zika virüs bir halk sağlığı acil durum uluslararası endişe microcephaly tanı anneler11, ZIKV enfeksiyonu ile ilişkili endişe verici artış nedeniyle ilan 12. CDC ZIKV olgu Amerika Birleşik Devletleri'nde son çalışmada anne ZIKV enfeksiyon sonuçlarında bir 20-fold etkilenmemiş bireyler ve enfekte ZIKV annelerin % 4'ü ABD karşılaştırıldığında microcephaly geliştirmek bir çocuk riski içinde sonuçlandı öneriyor microcephaly11çocuklu. Microcephaly ilişkili doğum kusurları ZIKV enfeksiyon Brezilya gebelikte oranı virüslü anneler, Latin Amerika'da diğer faktörler riski için katkı olabilir gösteren bebeklerde % 17'e kadar etkilediğini bildirilmiştir 13. biliyoruz ZIKV microcephaly ve Escherichia türleri içinde nöral progenitör hücre (NPC) nüfus7,8,14neden olabilir iken, gelişmekte olan ZIKV tam patogenezinde beyin zor kalır. ZIKV enfeksiyonu ile ilişkili beyin anormallikler altta yatan hastalık mekanizmaları daha ayrıntılı araştırmaya hayvan modelleri geliştirmek önemlidir.

Doğrudan ZIKV beyin gelişimi etkisini incelemek için ilk embriyonik gün 14,5 (E14.5) beyin intraserebral aşı ile ZIKV7kullanarak fare modeli geliştirdi. İlk üç aylık dönemde insan gebelik14sonu temsilcisi olarak kabul edilir gibi bu aşamada seçildi. Yavrular bu embriyonik intraserebral enjeksiyon yöntemi ile doğum sonrası gün 5 (P5) kadar yaşayabilir (~ 1.7 x 106 doku kültürü infektif doz (TCID50/mL) 1 µL). Bu doğum sonrası pups fenotipleri benzer şekilde genişlemiş ventriküller, nöronal kayıp, aksonlar rarefaction, astrogliosis ve mikroglial harekete geçirmek12,15gibi enfekte insan bebeklerde gözlenen bir dizi Sergi. Yeni doğmuş fare beyin nispeten olgunlaşmamış, benzer-e doğru orta gebelik16insan beyni gelişim aşaması ve fare beyin gelişimi ana postnatal bileşeni içerir. Daha sonra gebelik sahne enfeksiyonlar çalışmaya, postnatal enfeksiyon için bir yöntem de tanımlanır. Yenidoğan Bebeklerin ZIKV, P1 ile enfekte kadar 13 gün sonrası enjeksiyon için hayatta kalmak edebiliyoruz. Yetişkin sahne kan tarihi enfeksiyon fare içinde17 gerektiriyor ama daha önce açıklanan IRF-3, -5,-7 Çift Kişilik nakavt zorlanma interferon (IFN) düzenleyici faktörü (IRF) transkripsiyon faktörleri. Bu iletişim kuralı ZIKV intraventricularly yetişkin fare modelinde antiviral yanıt devre dışı bırakma aşmak için aşı yöntemi açıklar. Bu fare bağışıklık sistemi kaçınmanızı sağlar iken, bu rota enjeksiyon doğrudan tipik yolu enfeksiyonu taklit değil. Bu tutarsızlık adrese doğrudan, deneyci intrauterin enfeksiyon ZIKV kafa içi yol yerine gerçekleştirebilirsiniz. Önceki iş18kabul, kısaca bu embriyonik enfeksiyon Protokolü Bu teknikte anlatmıştık.

Bu teknik ile uygulanan Zika virüs suşları Meksika izole MEX1-447,19 içerir ve Afrikalı Bay-766 194720dakika içinde izole yalıtır. Zika MEX1-44 Ocak 2016 gelen virüslü bir Aedes aegypti içinde Chiapas, Meksika içinde izole sivrisinek. Biz Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi, Galveston (UTMB) aracılığıyla izni ile bu virüs elde. Buna ek olarak, dang virüs serotip 2 (DENV2) bu tekniği kullanarak bir karşılaştırma çalışmada aşı. DENV2, zorlanma S16803 (sırası GenBank GU289914), 1974 yılında Tayland hasta bir örnekten izole edildi ve C6/36 hücrelerde pasajlı. Virüs Vero hücreleri iki kez dünya referans Merkezi tarafından ortaya çıkan virüs ve Arboviruses (WRCEVA) için fare enjeksiyonları önce pasajlı. Bu bu teknik aynı şekilde çalıştığını gösterir ZIKV ve beyin gelişimi üzerinde etkisi diğer flaviviruses farklı suşları için iyi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan iletişim kuralları takip ile University of Southern California ve Georgia Üniversitesi hayvan bakımı yönergeleri kullanın. Ötanazi yöntemleri hamile barajlar ve yetişkinler için onaylanmış protokolleri göre gerçekleştirilir: karbon dioksit boğulma, ötenazi emin olmak için bir ikincil yöntem olarak servikal yerinden çıkması ve ardından. Yenidoğan pups-are euthanized tarafından işten çıkarma.

Dikkat: Aşağıdaki protokol patojenik virüs işleme içerir. Virüs taşıma sırasında gerekli tedbirleri alınmalıdır. Tüm iletişim kurallarını kullanmadan uygun kurumsal Komitesi önce tarafından onaylanması gerekir.

1. embriyonik intraserebral aşılama Zika virüs

  1. Zamanlanmış hamile çiftleşme için öğle E0.5 çiftleşme sonra günün göz önünde bulundurun. Günün sonunda farelerin çifti ve prizler çiftleşme zamanı değişkenliği azaltmak için sabahın erken saatlerinde kontrol edin.
  2. Ameliyat öncesi cam iğne hazırlayın. İğneyi çek ve 1/3'te, boy kesme, sonra gözenek 50-70 µm. onay iğne ipuçları kalite ve kırılması için bir stereoscope altında şekilde boyutlandırılır kadar micropipette kıyma makinesi su damlalıkla kullanarak 45 ° açıyla keskinleştirmek.
  3. Virüs buzda aliquot devam et. Ameliyat öncesi, ZIKV enjeksiyon karışım hazır cam enjeksiyon iğne yükleyin. Gaz geçirmez enjeksiyon şırınga (50 µL cilt), radarı-kilit ek ve boru montaj ve mineral yağ ile boru ile birleştirilmiş şırınga doyurmak. Bir kez doymuş, iğne takmak ve çizmek ~ iğne içine 6-7 µL ZIKV (~ 1 µL olduğu 1,7 × 106 TCID50/mL).
  4. (İçin kafa içi enjeksiyon) embriyonik gün E14.5 embriyo veya ketamin hidroklorür (80-100 mg/kg) ve steril serum fizyolojik çözümde seyreltilmiş xylazine (5-10 mg/kg) (intrauterin enjeksiyon için) E10.5 embriyo ile hamile C57BL/6J veya 129S1/SvImJ fareler enjekte intraperitoneally anestezi dönemde ikna etmek için. Alternatif olarak, anneler ile izlenen isoflurane isoflurane Solunduğunda, atık gaz atma ile sağlanan uygunsa anestezi. Buprenorfin-subkutan analjezi ikna etmek için SR (0.5-1.0mg/kg) enjekte.
  5. Çimdik testi anneler ayak ucu veya kuyruk anestezi ve sonra onları sırtüstü bir hayvan tarafından onaylanan Isıtma yastığını (100 x 200 2.5 mm termal pad) üzerinde yatıyordu. Ayak çimdik forseps steril değildir ve doku cerrahisinde işlemek için kullanılır. Alternatif olarak, eldivenli elleri ayak çimdik çekilme refleks test etmek için kullanılabilir.
    Not: Isıtma yöntemi tercih edilen perioperatif için kurumsal senin hayvan hastalıklarıyla ilgili personel için bakın. Bir kapak bu Isıtma yastığını ve hayvan yerleştirildi.
  6. Oftalmik merhem gözler için ekleyin.
  7. Karın yüzeyine tıraş ve iyot ve alkol ile üç kez sterilize. İyot ve alkol mendil alternatif; cerrahi sitesinden dairesel bir hareketle silin.
  8. Belgili tanımlık kesme ve aletleri kirlenmesini önlemek için steril bezler ile cerrahi site çevresindeki deri asmak.
    Not: Örtüsü açılış hazır cerrahi site daha büyük olmamalıdır; kıl örtüsü açılış görülmelidir.
  9. Annenin cilt karnının uzak Forseps ile pinch ve alt karın medial sagittal satır 1-1.5 cm satırında steril cerrahi makasla kesilmiş. Bu deri içine keser ve böylece embriyo şimdi maruz kalan karın boşluğuna daha fazla.
    Not: Cerrahi makas cilt ve Periton katman deşmek için kullanılır. Steril aletlerin ve eldiven her ameliyat için kullanılır.
  10. Bir yarık ortasında küçük bir steril gazlı bez kesme ve cerrahi açılması üzerine uygulayın. Steril serum nemlendirin. Steril gazlı bez, aynı anda bir rahim boynuz üzerinde odaklanarak daha fazla 4-5 embriyo kaldırmamanız özenle üzerinde dinlenmeye yarık aracılığıyla embriyo çek.
  11. Öncesinde ve onlar kuru değil emin olmak için aşı boyunca steril serum fizyolojik ile embriyo hidrat. Hangi embriyo enjekte edilir ve konumlarını rahim boynuz içinde takip edin. Embriyolar rahim içindegeliştirirken konumu değişmez olarak bireysel embriyo böylece ayrı deney kabul edilir. (İntrauterin enjeksiyon için 1,15 adıma devam edin).
  12. Yavaşça bir spatula embriyo başının altına koyun. Embriyo baş ve kafatası dikiş görselleştirmek için bir lamba ile de aydınlatmak.
    Not: Aseptik teknik takip steril cerrahi eldiven ve aletleri de dahil olmak üzere. Sonra steril olmayan öğeleri (lamba) manipüle, eldiven steril aletlerin ve alanları işleme önce yeni steril eldiven ile değiştirilmesi.
  13. Pozisyon kadar embriyo başkanı doğrudan rahim duvara itti ve yerde sigara dominant el ile düzenlenen lamba (görünürlük ensenizdeki) ve ücretsiz parmak ile embriyo manipüle tarafından başından.
    Not: embriyo konumlandırma önemli bir bölümüdür ve en pratik ister tekniği değil. Çok fazla parmak baskı embryonic membranlar lethality için önde gelen zarar verebilir ve yeterli basınç enjeksiyon zorlaştırabilir.
  14. Bir kılavuz olarak kafatası dikiş boyunca çalışan kan damarları kullanın. ZIKV virüs enjekte (~ 1 µL, 1,7 × 106 TCID50/mL Meksika ayrı tut MEX1-44), E14.5 embriyo beyinlerinin monte şırınga ve iğne ile lateral ventrikül içine. Denetim medya sahte enjeksiyon kullanın.
  15. Hamilelik tutma geliştirmek için viral enjeksiyon yumurtalık yanındaki iki embriyo ve üst vajina (şekil 1A) yanındaki iki embriyo kaçının. Genel olarak, 6 embriyo ameliyat süresini azaltmak ve embriyo kaybını önlemek için çöp enjekte edilir.
  16. Enjekte embriyolar tekrar hamile barajlar koyun ve karın boşluğu ile doldurun ~ 0.5 mL steril serum fizyolojik. Kapatmak için önce her iki karın Periton kas dikiş ve sonra ikinci olarak dış deri tabakası ile 4.0 steril Dikiş dikiş. Kesintiye uğramış dikiş kullanmak tercih edilir; yara yırtılması olasılığı olup olmadığını fare dikişi çiğniyor.
  17. Kısmen gerekirse ısıtmalı olmayan bir alana kaçmak fare izin vermek için bir Isıtma yastığı dinlenme bir kafes içinde fareyi getirin. (1-2 h) kurtarmak yaparken anneler anesteziden izleyin. Ameliyat için kez bireysel deneyler göre çeşitli sonra embriyo geliştirmek.
  18. İntrauterin enjeksiyon
    1. Bir rahim boynuz ve maruz embriyo ile 100 μL Zika virüs (100 μL DMEM askıya 106 TCID50 adet), enjekte için 1 mL şırınga ve 27 G iğne kullanın veya denetim orta, intrauterin uzaya veya plasental doku içine. Not hangi embriyo embriyonik evre gruptakiler için enjekte etmiş. Bkz: daha fazla bilgi18için daha önce yayımlanmış çalışma.
    2. Enjekte embriyolar tekrar hamile barajlar koyun ve karın boşluğu ile doldurun ~ 0.5 mL steril serum fizyolojik. Kapatmak için ilk karın Periton kas dikiş ve sonra ikinci olarak dış deri tabakası ile 4.0 steril Dikiş dikiş. Kesintiye uğramış dikiş kullanmak tercih edilir; yara yırtılması olasılığı olup olmadığını fare dikişi çiğniyor.
    3. Kısmen gerekirse ısıtmalı olmayan bir alana kaçmak fare izin vermek için bir Isıtma yastığı dinlenme bir kafes içinde fareyi getirin. (1-2 h) kurtarmak yaparken anneler anesteziden izleyin. Ameliyat için kez bireysel deneyler göre çeşitli sonra embriyo geliştirmek.

2. yenidoğan intraserebral aşılama Zika virüs: P0/P1

  1. Gaz geçirmez enjeksiyon şırıngaları (10 µL cilt) ve iğneler tıkalı emin olun. Temiz ve test 26'lik iğne ile üç 20 mL tek kullanımlık şırınga yükleyerek: bir serum fizyolojik ile % 70 etanol ile diğeri çözümleri temizlemek için hava ile. % 10 çamaşır suyu ile sterilize etmek için virüs enjeksiyon daha önce kullandıysanız.
  2. Virüs buz üzerinde tutun. Şırınga ölü hacim azaltmak için serum fizyolojik ile doldurarak şırınga yük ve 0,75 µL serum fizyolojik çözüm enjeksiyon malzemeden ayırmak için hava çizin.
  3. Isıtılan oksijen kurtarma odası enjekte yavrular için ayarlayın. Bir Isıtma blok kullanarak, steril bir gazlı bez ile closeable bir kap (gibi bir boş İpucu kutusunu) yerleştirin ve serum nemlendirmek. Enjeksiyonları başlatmadan önce Onceden.
  4. Pompa ve denetleyicisi ile birlikte microinjector kadar ayarla. Belirli şırınga aygıt türü kodu belirlemek (Yani, bir 10 µL şırınga, aygıt türü için bir "D"). Enjeksiyon hızı belirler.
  5. Cerrahi kurulum yanında postnatal gün 0 veya 1 pups (P0/P1) toplamak. Enjeksiyon şırınga virüs ile yükleyin. Yavru baş bağlama % 70 ile dezenfekte alkol.
  6. Belgili tanımlık pups içinde ince bir tabaka halinde gazlı bez sarın ve onları tamamen buz anestezik bir devlet elde etmek için göm. Yavrular cryoanesthetized 5 dk. belgili tanımlık pups yeterince yanıt olmadan bir kuyruk/ayak çimdik gerçekleştirerek enjeksiyon için anestezi sağlamak için vardır. Bu kabaca bir anestezik devletin 15 dk verir.
  7. Yavru fok kafa monte yerleştirin, iyot ve etanol ile baş yüzey (üç kere) sterilize ve steril mendil ile kuru silin (isopropanol veya % 70 alkol).
  8. Lambda siyah bir marker ile işaretlemek ve lambda stereotaksik enstrüman kullanarak koordinatlarda kaydedin. Göz ve lambda stereotaksik koordinatları baştan Önlem lambda mesafeden kenarına (için her iki hemisferlerin her ikisi de enjekte Eğer) göz lambda 2/5 mesafe hesaplamak.
  9. Enjeksiyon yeri için bir delik oluşturmadan önce anestezik derinlik yeniden denetleyin. Dikkatli ve yüzeysel olarak enjeksiyon iğne bir giriş oluşturmak için kafa derisi ve kafatası (kafatası içinde Yenidoğan Bebeklerin çok yumuşaktır) enjeksiyon yeri delmek için 26'lik iğne kullanın.
  10. Enjeksiyon iğne delinmiş konumda alt ve bir kez iğne sadece cilt sızmayı başardı, enjeksiyon yeri (lateral ventrikül) için bir 1 mm derinliği stereotaksik enstrüman kullanarak hesaplamak.
  11. Sonra iğneyi enjeksiyon derinlik indirilir, enjekte etmek microinjector programı: 1 µL virüs enjekte yaklaşık 1 µL 1,5 dk 10 nL/s hızında (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
  12. Enjeksiyon bitirdiğinde, bekle 30 s ve iğne geri döner vidalı (dorsally) tarafından 0,5 mm adımlarla 30 bekleyen her Artım sonra s.
    Not: Bu kaçağı enjekte virüs azaltır.
  13. Bir kez kaldırıldı, hızlı bir şekilde iğne ve şırınga ile daha fazla virüs yüklemek (farklı virüs veya sahte denetimleri var olmak yüklü ayrı şırınga/iğne) / Kaldır yavru fok baş bağlama Önceden ısıtılmış oksijen odasına. Yavru Fok Kurtarma ölçmek için birkaç dakikada izlemek. Belgili tanımlık pups onun çöp ile değiştirin.

3. yetişkin intraserebral aşılama Zika virüs

  1. Anestezi ikna etmek için steril serum fizyolojik içinde seyreltilmiş yetişkin fareler ketamin hidroklorür (80-100 mg/kg) ve xylazine (5-10 mg/kg) ile intraperitoneally enjekte. Buprenorfin-subkutan analjezi ikna etmek için SR (0.5-1.0mg/kg) enjekte. Ayak/kuyruk tutam anestezik durumuna emin olun ve daha sonra bu stereotaksik araç (ile bir Isıtma yastığı) baş ameliyat sırasında hareketsiz için bağlama için fare.
  2. Oftalmik merhem fare gözünde ameliyat sırasında kurumasını önlemek için gözler ekleyin. Kulakları başına gözler arkasında başlayan kafa derisi tıraş. Maruz kalan deri iyot ve % 70 ile sterilize alkol üç kez. İyot ve alkol mendil alternatif; cerrahi sitesinden dairesel bir hareketle silin.
  3. Cilt incising öncesinde anestezik derinlik yeniden denetleyin. Bir neşter kullanmadan, baş medial sagittal hattı boyunca 0.5 cm kesi sterilize konumda bregma açığa olun. Pamuk uçlu bir aplikatör ile çalışırken bir hareket kullanarak meninjeal dokuların kafatası yüzeyini aynı anda enjeksiyon yer uzak cilt iterek süre temizleyin.
  4. Bregma başlayarak, cerrahi matkap hizalayın ve aşağıdaki koordinatları kullanarak enjeksiyon siteleri belirlemek: AP -0,5 mm, ML: 1,5 mm kullanarak denetim ayak pedalı. +/-, ayrıntısına kadar bir delik için iğne temizlenmiş oldu, yavaş yavaş sadece kemik matkap gibi kafatası.
  5. Matkap microinjector pompa ve gaz geçirmez şırıngayı (10 µL cilt) stereotaksik değiştirin. Küçük hava kabarcığı tuzlu çözüm ve virüs arasında bırakarak, çizmek ~ 4-5 µL şunun. Aygıt türü kodu belirli şırınga birimin (yani, D 10 μL birim şırınga için) belirler. İğneyi DV için indirin:-1.5 mm beyin yüzey. 1 µL virüs enjekte 10 nL/s, yaklaşık 1 µL 1,5 dk enjekte oranında program.
  6. Enjeksiyon bitirdiğinde, bekle 30 s ve iğne 0,5 mm aralıklarla 30 bekleyen kaldırmak her dönüş sonra s. Bu geri tepme ve kaçak enjekte şunun azaltır.
  7. İnjection(s) bittiğinde, forseps cilt gevşetmek ve maruz kafatası yeniden elde etmek için kullanın. Kafa derisi birlikte 4.0 dikiş kullanarak ve fare stereotaksik araç kaldırma dikiş. Gerekirse sigara ısıtmalı bir bölgeye kaçmak ve onlar (1-2 h) kurtarmak yaparken izleyin için fareyi anesteziden izin için kısmen bir Isıtma yastığı üzerinde dinlenme bir kafes içinde fare yer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim enjeksiyon yöntemleri embriyonik beyin ZIKV aşılama için temsil edici görüntüleri intraserebral enjeksiyonları (şekil 1A) resmeden diyagramlarında gösterilen ve intrauterin ve gösteren intraplacental enjeksiyonu (şekil 1B), yol hamile Barajı ve embriyo görüntülenebilir ve ameliyat için (embriyonik aşı Protokolü) odaklı. Şekil 2A ZIKV (MEX1-44) enfeksiyon (flavivirus grup antijen, yeşil karşı antikor ile immunostained) E18.5 serebral korteks sergiler. Pax6 (kırmızı) gelişmekte olan korteks NPCs Etiketler. ZIKV E14.5 embriyonik beyin aşısını. Bizim büyüme eğrisi analizler bu ZIKV göstermektedir doku örnekleri7, TCID50 tahlil kullanarak verimli bir şekilde çoğaltmak ve gelişmekte olan beyin (şekil 2B, 2 C), yayımlanan7olarak büyür. Şekil 2B DENV2 ile başarılı enfeksiyon gelişmekte olan korteks embriyonik aşılama yöntemi kullanarak gösterir. DENV2 bir antikor flavivirus grup antijen (yeşil) karşı kullanarak algılanır. Şekil 2E ZIKV, Afrika lineage (Bay-766) farklı bir tür mantar enfeksiyonu gösterir. Şekil 2F ZIKV-Asya (MEX1-44) Alternatif-rota, intraplacental aşı E10.5 aşamada temsilcisi bir enfeksiyonu gösterir.

Şekil 3A ZIKV aşılama ve P0/1 yavrularını için lateral ventrikül içine enjeksiyon konumunu tanımlamak için kullanılan simge resmeden bir diyagramıdır. Şekil 3B ZIKV (MEX1-44) enfeksiyonun P0/1 enjeksiyon sonra P13 serebral korteks gösterir. ZIKV (MEX1-44) flavivirus grup antijen (kırmızı) karşı antikor kullanarak algılanır. Şekil 4 floresan boncuk (kırmızı), enjeksiyon yeri ve lateral ventrikül enjeksiyon başarı erişkinlerde uygulama için kullanılan gösterir.

Figure 1
Şekil 1: ZIKV embriyonik aşı. Pozlama enjeksiyon embriyo vajina için bitişik ve boynuz boyunca en yanal embriyo önlemek için bir not ile bir rahim korna temsil eden(a)diyagramı. Pozlama bir rahim korna temsil eden, intraplacental ve intrauterin enjeksiyonları konumunu gösteren (B) diyagram. Bu diyagramları kendi özgün yayın21kimden değiştirdiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: ZIKV E14.5, embriyonik aşı. ZIKV-Asya (MEX1-44) gelişmekte olan yeni korteksimiz tüm katmanları ile(a), embriyonik beyin enfekte E18.5 (ölçek çubuğu ise 200 µm). Nöral progenitör hücreler flavivirus antijen (yeşil) ile Pax6 (kırmızı) ve ZIKV ile immunolabeled vardır. (B) TCID50, E14.5 ZIKV-Asya (MEX1-44) ile aşılanmış Postnatal gün 3 (P3) beyin dokusu oluşur. Hata çubukları belirtmek s.e.m. bir sahte ve bir ZIKV bulaşmış beyin her ölçüm ile üç bağımsız ölçümlerin (***p < 0,0001, Öğrenci t-Testi)7. (C) TCID50 ZIKV viremi virüslü fetal beyin dokusu içinde tipik artan büyüme eğrisi açıklayan sonuçlanır. Hata çubukları üç bağımsız ölçümleri bir sahte ve bir ZIKV-Asya (MEX1-44) enfekte beyin her ölçüm ile s.e.m. gösterir. Geliştirme7devam ederken Varyans analizi (ANOVA) önemli bir artış içinde viral titresi algılar. (D) dang virüs (DENV2) enfekte temsilcisi Histoloji (E14.5 embriyo aşı ile ~ 1 µL 3,4 x 105 TCID50/mL, ölçek çubuğu olduğunu 200 um) ve (E) ZIKV-Afrika (MR766) enfekte temsilcisi Histoloji (ölçek 200 µm bar). (F) ZIKV-Asya (MEX1-44) enfekte intraplacental enjeksiyon strateji gelen temsilcisi Histoloji (ölçek çubuğu ise 200 µm). Tüm görüntüleri Höchst çekirdeği lekeleri. Bu rakamlar kendi özgün yayın7' den değiştirdiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: P1 aşılama, ZIKV temsilcisi Histoloji. P1 pups lateral ventrikül içine enjeksiyon konumunu belirlemek için diyagramı(a)yöntem gösteren. (B) temsilcisi koronal cryosections immunostained düşük flavivirus grup antijen için (sol tarafta, ölçek çubuğu 100 µm 's) ve yüksek (sağda, ölçek çubuğu 50 µm 's) P1 aşılama ZIKV, P15, büyütme (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Höchst çekirdeği lekeleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Yetişkin sahne İntraventriküler enjeksiyon. Yetişkin fare ile floresan boncuk enjekte kısa bir süre sonra ameliyat enjeksiyon yeri başarısını belirlemek için feda etti (ölçek çubuğu ise 200 µm). Sagittal cryosection boncuk daha fazla boyama gerekmez hemen sonra kesit görülebilir. Höchst çekirdeği lekeleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan ZIKV intraserebral aşı beyin gelişiminde ZIKV kaynaklı zararların soruşturma için embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin aşamalarında için bir yöntemdir. Basit olsa da, müfettişlerin çalışma kalitesi ve güvenliği ile ilgili bu emin olmak için gerçekleştirmeniz gereken bazı hususlar vardır.

DENV ZIKV için flavivirus cins yakından ilgilidir. DENV Pediatrik beyin bozukluğu insanlarda nedensel bağlanmamış. DENV2 başarılı bir şekilde bulaştırmak ve gelişmekte olan beyin embriyonik aşılama yöntemiyle çoğaltmak (~ 1 µL 3,4 x 105 TCID50/mL) (şekil 2B). Bu nedenle, bulaşmamış Vero hücre ortamı ek olarak (sahte), DENV enfeksiyon bir negatif kontrol gelişmekte olan beyin patogenezinde ZIKV özel eğitim için kullanılabilir. Bu da diğer embriyo istenmeyen kirlenme yol açabilir virüs sızıntısı rahim içindeönlemek önemlidir. Bu nedenle, her embriyo ardından qRT-PCR veya TCID50 tahlil beyin dokusundan izole yoluyla bulaşmış ve sigara enfekte bireylerin doğrulamak gereklidir. Bir boya görsel olarak enjeksiyon onaylamak, ama boya hasar kendisi neden olmaz emin olmak için test için viral orta eklenebilir.

Fare suşları büyüme değişkenlik gösteren ve bu nedenle P1 enjeksiyon Mekanlar her fare satırı için doğrulanması gerekir. Sahte kardiyolojik enjeksiyon enjeksiyon yeri görselleştirmek için floresan boncuk ile gerçekleştirin. Bu ön çalışmada enjeksiyon ventrikül ulaşır ya da çok derin beyin dokusuna gider bilgi verecektir. İdeal sonucu elde etmek için pups enjeksiyon ventrikül floresan boncuk konumunu belirlemek için kısa bir süre sonra kurban edilmesi. Yavru fok tüm başkanı gecede, gömülü, sabit olabilir ve hassas enjeksiyon konum gözlemlemek için cryosectioned. Enjeksiyon petrol doymuş şırınga ile deneyim gerektirir ve enjeksiyon birimin doğru olduğunu doğrulamak için parafilm üzerine boya ile sahte enjeksiyonlar kullanarak uygulama için önerilir.

Biyogüvenlik önlemleri bu çalışmalarda laboratuar personeli ile virüs çalışma yanlışlıkla enfeksiyonu önlemek için kritik öneme sahiptir. Biyogüvenlik onayları önceden tesisinde nerede çalışma tamamlandı yapılması gerekir. ZIKV bir seviye 2 (BSL2) patojen tarafından Amerika Birleşik Devletleri merkezleri hastalık kontrol ve Önleme için kabul edilir. Virüs çalışma ya da nereye belgili tanımlık virüs kontrol altında alanlarda çalışan tüm kişiler farkında ve onların kurum için Biyogüvenlik protokollerle öğür olmalıdır. Tüm araçları ve ZIKV veya DENV2 maruz yüzeylerde viral parçacıkların kullanımdan sonra kalan yok etmek için % 10 çamaşır suyu ile dezenfekte. Hamile veya gebe çalıştığınız kadınlar ZIKV veya DENV2 maruz araştırma alanları ile etkileşimli olarak tavsiye edilir. Histoloji için kullanılan tüm doku %4 oranında sabit PFA virüs analiz için devre dışı bırakabilirsiniz. Depolama ve virüs kültür Vero hücreleri BSL2 iş için belirlenmiş bir başlıklı yapılmalıdır. Hisse senedi virüs ve doku titrasyon TCID50 protokolünü kullanarak sayısal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Abdellatif Benraiss Rochester Üniversitesi rehberlik ve tartışmalar için yetişkin cerrahi ve kardiyolojik teknikleri öğrenme ile ilgili kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Dr. James Lauderdale adlı UGA onun stereotaksik ekipman ve tartışmalar kullanımı için ilgili bu tekniği için metodoloji ve ilerlemesi için araştırma üniversite bilim adamları (yay) temel için ayarlamak kabul etmek istiyorum onların ve bizim NIH desteği (R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01 NINDS verir).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor Leica 39416001
Mouse Stereotax Kopf 04557R
Micro4 Microsyringe Pump Controller WPI SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump WPI UMP3
Modulamp Schott -
Luer-lock tubing (19-gauge) Hamilton 90619
Melting Point Capillary Kimble 34500-99 Glass needle
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres Thermo Scientific R25 No dilution; Use for practice injections
10 µL, Model 1701 LT SYR Hamilton 80001 for embryonic inoculation
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 Hamilton 80030 for neonate/adult
4-0 Ethilon Nylon Sutures Ethicon -
Mineral Oil VWR -
micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Micropipette Grinder Narishige EG-44
Fastgreen FCF Dye Sigma F7252 inject with 0.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibody Millipore MAB10216 ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)
Pax6 DBHB Pax6-s ms IgG1 1:20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164, (4), 855-859 (2014).
  2. Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37, (7), 875-880 (2017).
  3. Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37, (2), 148-153 (2017).
  4. Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14, (3), 118-127 (2007).
  5. Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42, (11), 1010-1014 (2010).
  6. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (38), 16595-16600 (2010).
  7. Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143, (22), 4127-4136 (2016).
  8. Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19, (5), 672 (2016).
  9. Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
  10. Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106, (11), 972-982 (2016).
  11. Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66, (8), 219-220 (2017).
  12. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  13. Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95, (3), 191-198 (2017).
  14. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, (1), 7-17 (2001).
  15. Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374, (22), 2142-2151 (2016).
  16. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
  17. Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19, (5), 593-598 (2016).
  18. Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
  19. Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25, (22), 1-27 (2016).
  20. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  21. Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics