Zika वायरस के लिए माउस मॉडल की स्थापना-प्रेरित मस्तिष्क संबंधी विकार इंट्रा इंजेक्शन रणनीतियों का उपयोग: भ्रूण, नवजात, और वयस्क

Neuroscience

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Summary

यहां हम माउस में Zika वायरस प्रेरित microcephaly के एक मॉडल की स्थापना के लिए एक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल भ्रूण, नवजात, और Zika वायरस के वयस्क चरण इंट्रा टीका के लिए तरीके शामिल हैं ।

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Herrlinger, S. A., Shao, Q., Ma, L., Brindley, M., Chen, J. F. Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult. J. Vis. Exp. (134), e56486, doi:10.3791/56486 (2018).

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Abstract

Zika वायरस (ZIKV) एक flavivirus वर्तमान में उत्तर, मध्य, और दक्षिण अमेरिका में स्थानिकमारी वाले है । अब यह स्थापित है कि ZIKV microcephaly और अतिरिक्त मस्तिष्क विषमता पैदा कर सकता है । हालांकि, विकासशील मस्तिष्क में ZIKV के रोगजनन अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट बनी हुई है । इंट्रा सर्जिकल तरीकों अक्सर तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है दोनों सामांय और असामांय मस्तिष्क विकास और मस्तिष्क समारोह के बारे में सवालों के पते । इस प्रोटोकॉल शास्त्रीय शल्य चिकित्सा तकनीक का इस्तेमाल करता है और तरीकों का वर्णन है कि एक मॉडल ZIKV-जुड़े मानव स्नायविक रोग माउस तंत्रिका तंत्र में अनुमति देते हैं । जबकि प्रत्यक्ष मस्तिष्क टीका वायरस संचरण के सामांय मोड मॉडल नहीं है, विधि जांचकर्ताओं लक्षित सवाल विकासशील मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण के बाद परिणाम से संबंधित पूछने के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल भ्रूण, नवजात, और ZIKV के संवहन टीका के वयस्क चरणों का वर्णन है । एक बार महारत हासिल करने के बाद, इस विधि एक सीधी और reproducible तकनीक है कि केवल कुछ घंटे प्रदर्शन करने के लिए लेता है बन सकता है ।

Introduction

Microcephaly एक दोषपूर्ण मस्तिष्क के विकास से उत्पंन हालत है नवजात शिशुओं में औसत सिर आकार से छोटे द्वारा विशेषता । microcephaly के साथ बच्चे लक्षण की एक श्रृंखला है जो विकास में देरी, जब्ती, बौद्धिक विकलांगता, सुनवाई हानि, दृष्टि समस्याओं, और आंदोलन और संतुलन के साथ समस्याओं, अंय लोगों के अलावा, रोग की गंभीरता के आधार पर शामिल कर सकते है और कारण1,2,3। यह स्थिति आनुवंशिक, संक्रामक एजेंट, और पर्यावरणीय कारकों के साथ प्रकृति में multifactorial है, जिसके कारण microcephaly4,5,6,7,8, 9. २०१५-२०१६ ZIKV प्रकोप से पहले, १०,००० जंमों में से 8 बच्चों को संयुक्त राज्य अमेरिका में microcephaly के साथ सीडीसी के अनुसार का निदान किया गया10। 1 फरवरी को २०१६ केst विश्व स्वास्थ्य संगठन Zika वायरस अंतरराष्ट्रीय चिंता का एक सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकाल की घोषणा की microcephaly में खतरनाक वृद्धि के कारण माताओं में ZIKV संक्रमण के साथ जुड़े निदान11, 12. संयुक्त राज्य अमेरिका में ZIKV मामलों पर सीडीसी से हाल ही के एक अध्ययन से पता चलता है कि एक 20 में मातृ ZIKV संक्रमण परिणाम एक बच्चे के लिए बढ़ जोखिम गुना संक्रमित व्यक्तियों की तुलना में microcephaly विकसित करने के लिए, और संयुक्त राज्य अमेरिका से ZIKV संक्रमित माताओं के 4% में हुई है बच्चों के साथ microcephaly11. ब्राजील में ZIKV संक्रमण से गर्भावस्था के दौरान microcephaly-संबद्ध जंम दोष की दर संक्रमित माताओं में शिशुओं के 17% तक प्रभावित किया है सूचित किया गया है, यह दर्शाता है कि लैटिन अमेरिका में अंय कारकों को बढ़ा जोखिम में योगदान हो सकता है 13. जब हम जानते है कि ZIKV तंत्रिका जनक कोशिका (एनपीसी) में microcephaly और रोगजनन पैदा कर सकता है जनसंख्या7,8,14, रोगजनन की पूरी ZIKV विकासशील मस्तिष्क में मायावी बना रहता है । यह ZIKV संक्रमण के साथ जुड़े मस्तिष्क विषमताओं अंतर्निहित रोग तंत्र की जांच करने के लिए पशु मॉडल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

सीधे प्रभाव है कि ZIKV मस्तिष्क के विकास पर है अध्ययन करने के लिए, हम पहले एक माउस इंट्रा भ्रूण दिवस १४.५ के टीका का उपयोग कर मॉडल विकसित (ई 14.5) मस्तिष्क के साथ ZIKV7। इस चरण के रूप में यह मानव हमल में पहली तिमाही के अंत के प्रतिनिधि माना जाता है चुना गया था14. पिल्ले जन्मोत्तर दिन तक जीवित रह सकते हैं 5 (P5) इस भ्रूण इंट्रा इंजेक्शन विधि के साथ (~ 1 µ l के १.७ x 106 ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID50/एमएल)) । इन जन्मोत्तर पिल्ले phenotypes की एक श्रृंखला इसी तरह बढ़े निलय, न्यूरॉन्स हानि, axonal rarefaction, astrogliosis, और microglial सक्रियण12,15सहित संक्रमित मानव शिशुओं में मनाया । एक नवजात चूहे मस्तिष्क अपेक्षाकृत अपरिपक्व है, के मध्य में मानव मस्तिष्क के विकासात्मक चरण के समान16हमल, और माउस मस्तिष्क विकास एक प्रमुख जन्मोत्तर घटक शामिल हैं । बाद में हमल चरण संक्रमण का अध्ययन करने के लिए, जन्मोत्तर संक्रमण के लिए एक विधि भी वर्णित है । P1 पर ZIKV से संक्रमित नवजात शिशुओं 13 दिनों के बाद इंजेक्शन के लिए जीवित करने में सक्षम हैं । रक्त जनित वयस्क चरण संक्रमण पहले17 माउस में वर्णित किया गया है, लेकिन इंटरफेरॉन (IFN) विनियामक कारक (IRF) प्रतिलेखन कारकों IRF-3,-5,-7 ट्रिपल नॉकआउट तनाव के उपयोग की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल inoculating ZIKV intraventricularly की एक विधि का वर्णन करने के लिए वयस्क में murine मॉडल के एंटीवायरल प्रतिक्रिया को अक्षम दरकिनार । हालांकि इस murine प्रतिरक्षा प्रणाली को दरकिनार, इंजेक्शन के इस मार्ग को सीधे संक्रमण के ठेठ मार्ग की नकल नहीं करता है । सीधे इस विसंगति को हल करने के लिए, प्रयोगकर्ता intracranial मार्ग के बजाय ZIKV का एक अंतर्गर्भाशयी संक्रमण कर सकते हैं । पिछले काम18से अपनाया, हम संक्षेप में इस भ्रूण संक्रमण प्रोटोकॉल में इस तकनीक का वर्णन किया है ।

इस तकनीक के साथ कार्यांवित Zika वायरस उपभेदों में शामिल है मैक्सिकन अलग MEX1-447,19 और अफ्रीकी अलग श्री-७६६ १९४७20में अलग थलग । Zika MEX1-44 Chiapas, मेक्सिको में २०१६ के जनवरी में एक संक्रमित एडीज aegypti मच्छर से अलग किया गया था । हम Galveston (UTMB) में टेक्सास चिकित्सा शाखा के विश्वविद्यालय के माध्यम से अनुमति के साथ इस वायरस प्राप्त किया । इसके अलावा, डेंगू वायरस सीरोटाइप 2 (DENV2) एक तुलना अध्ययन में इस तकनीक का उपयोग inoculated था । DENV2, तनाव S16803 (अनुक्रम GenBank GU289914), १९७४ में थाईलैंड से एक मरीज के नमूने से अलग किया गया था और सी 6/36 कोशिकाओं में पारित । वायरस वीरो कोशिकाओं में दो बार उभरते वायरस और माउस इंजेक्शन से पहले Arboviruses (WRCEVA) के लिए विश्व संदर्भ केंद्र द्वारा पारित किया गया था । यह दर्शाता है कि इस तकनीक ZIKV और अंय flaviviruses है कि मस्तिष्क के विकास पर एक प्रभाव हो सकता है की विविध उपभेदों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है ।

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Protocol

सभी पशु उपयोग प्रोटोकॉल दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय और जॉर्जिया विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देश का पालन करें । गर्भवती बांधों और वयस्कों के लिए इच्छामृत्यु तरीकों को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं: कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation, एक माध्यमिक विधि के रूप में गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के बाद इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए । नवजात पिल्ले decapitation द्वारा euthanized हैं ।

चेतावनी: निंनलिखित प्रोटोकॉल एक रोगजनक वायरस हैंडलिंग शामिल है । वायरस को संभालते समय उचित एहतियात बरतनी चाहिए । सभी प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले उपयुक्त संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

1. Zika वायरस के भ्रूण इंट्रा टीका

  1. समय पर गर्भवती संभोग के लिए, ई 0.5 के रूप में संभोग के बाद दिन की दोपहर पर विचार करें । दिन के अंत में चूहों जोड़ी और संभोग समय की परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए जल्दी सुबह में प्लग की जाँच करें.
  2. सर्जरी से पहले कांच की सुई तैयार करें । सुई खींचो और 1/3 इसकी लंबाई में कटौती, तो एक ४५ डिग्री कोण पर पैनापन एक पानी ड्रिप के साथ एक micropipette चक्की का उपयोग कर जब तक ताकना ५० के लिए आकार है-७० µm. गुणवत्ता और टूटना के लिए एक stereoscope के तहत सुई सुझावों की जांच करें ।
  3. वायरस को बर्फ पर aliquot रखें । बस सर्जरी से पहले, तैयार ग्लास इंजेक्शन सुई में ZIKV इंजेक्शन मिश्रण लोड । इकट्ठा गैस तंग इंजेक्शन सिरिंज (५० µ एल मात्रा), luer-ताला लगाव, और टयूबिंग, और खनिज तेल के साथ टयूबिंग के साथ इकट्ठा सिरिंज संतृप्त । एक बार संतृप्त, सुई देते हैं, और आकर्षित ~ 6-7 µ एल ZIKV सुई में (~ 1 µ l १.७ ×10 6 TCID50/एमएल) है ।
  4. गर्भवती C57BL/6J या 129S1/SvImJ चूहों भ्रूण दिवस ई के साथ 14.5 भ्रूण (intracranial इंजेक्शन के लिए) या ई 10.5 भ्रूण (अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन के लिए) ketamine हाइडरोक्लॉराइड के साथ (80-100 मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (5-10 मिलीग्राम/) बाँझ खारा समाधान में पतला intraperitoneally मां में संज्ञाहरण पैदा करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, anesthetize माताओं की निगरानी isoflurane isoflurane द्वारा प्रदान की, अपशिष्ट गैस सफाई के साथ, यदि उपयुक्त हो । analgesia प्रेरित करने के लिए चमड़े के नीचे buprenorphine-SR (0.5-1.0 मिलीग्राम/
  5. चुटकी परीक्षण पैर की अंगुली टिप या पूंछ पर anesthetized माताओं और फिर उंहें एक जानवर को मंजूरी दी हीटिंग पैड (१०० x २०० २.५ mm के थर्मल पैड) पर लापरवाह करना । पैर की अंगुली चुटकी संदंश बाँझ नहीं हैं और सर्जरी में ऊतक को संभालने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, दस्ताने हाथ पैर की अंगुली चुटकी वापसी पलटा परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: पसंदीदा perioperative हीटिंग विधि के लिए अपने संस्थागत पशु चिकित्सा कर्मचारियों को देखें । एक कवर इस हीटिंग पैड और जानवर के बीच रखा गया था ।
  6. आंखों में नेत्र मरहम जोड़ें ।
  7. पेट की सतह दाढ़ी और आयोडीन और शराब के साथ तीन बार निष्फल । वैकल्पिक आयोडीन और अल्कोहल पोंछे; शल्य साइट से दूर एक परिपत्र गति में पोंछ ।
  8. चीरा और उपकरणों के संदूषण से बचने के लिए बाँझ कपड़े के साथ सर्जिकल साइट आसपास के त्वचा की कपड़ा ।
    नोट: कपड़े खोलने तैयार शल्य साइट से बड़ा नहीं होना चाहिए; कोई बाल कपड़ा खोलने में देखा जाना चाहिए ।
  9. मां की त्वचा संदंश के साथ उसके पेट से दूर चुटकी और बाँझ शल्य कैंची के साथ औसत दर्जे का sagittal लाइन पर एक 1-१.५ सेमी लाइन में निचले पेट में कटौती । त्वचा में यह कटौती और उदर गुहा में आगे इतना है कि भ्रूण अब उजागर कर रहे हैं ।
    नोट: सर्जिकल कैंची त्वचा और पेरिटोनियल परत incise करने के लिए उपयोग किया जाता है । बाँझ उपकरणों और दस्ताने प्रत्येक सर्जरी के लिए उपयोग किया जाता है ।
  10. एक छोटे से बाँझ धुंध के बीच में एक भट्ठा में कटौती और शल्य खोलने के शीर्ष पर लागू होते हैं । बाँझ खारा के साथ हाइड्रेट । भट्ठा के माध्यम से भ्रूण को खींच बाँझ धुंध पर आराम करने के लिए, देखभाल के साथ से अधिक 4-5 एक समय में एक गर्भाशय सींग पर ध्यान केंद्रित कर भ्रूण को दूर नहीं ।
  11. से पहले और टीका भर में बाँझ खारा के साथ भ्रूण हाइड्रेट को सुनिश्चित करने के लिए वे बाहर सूखी नहीं है । जो का ट्रैक भ्रूण इंजेक्शन और गर्भाशय सींग के भीतर अपने स्थान रखें । व्यक्तिगत भ्रूण इस प्रकार अलग प्रयोगों के रूप में इलाज कर रहे हैं, के रूप में भ्रूण की स्थिति को बदल नहीं है, जबकि utero मेंविकास । (अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन के लिए १.१५ कदम के लिए जारी) ।
  12. धीरे भ्रूण के सिर के नीचे एक रंग जगह है । सिर और खोपड़ी टांके की कल्पना करने के लिए एक दीपक के साथ अच्छी तरह से भ्रूण रोशन ।
    नोट: अपूतित तकनीक बाँझ सर्जिकल दस्ताने और उपकरणों सहित, पीछा किया है । गैर बाँझ आइटम (जैसे चिराग के रूप में) के बाद हेरफेर कर रहे हैं, दस्ताने बाँझ उपकरणों और क्षेत्रों से निपटने के लिए पहले नए बाँझ दस्ताने के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.
  13. दोनों दीपक (दृश्यता के लिए सिर के पीछे) और मुक्त उंगलियों भ्रूण के सिर तक सीधे गर्भाशय की दीवार के खिलाफ धक्का दिया और गैर-प्रमुख हाथ के साथ जगह में आयोजित किया जाता है के साथ भ्रूण जोड़ तोड़ से सिर की स्थिति ।
    नोट: स्थिति भ्रूण एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और तकनीक है कि सबसे अधिक अभ्यास लेता है । बहुत अधिक उंगली दबाव घातकता और नहीं पर्याप्त दबाव इंजेक्शन मुश्किल बना सकते हैं के लिए अग्रणी भ्रूण झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है ।
  14. रक्त वाहिकाओं एक गाइड के रूप में खोपड़ी सीवन के साथ चल रहे का प्रयोग करें । ZIKV वायरस इंजेक्षन (~ 1 µ एल, १.७ × 106 TCID50/एमएल मैक्सिकन अलग MEX1-44) के लिए इकट्ठे सिरिंज और सुई के साथ ई 14.5 भ्रूण दिमाग के पार्श्व निलय में । एक शम इंजेक्शन के रूप में नियंत्रण मीडिया का उपयोग करें ।
  15. गर्भावस्था की अवधारण में सुधार करने के लिए, अंडाशय के बगल में दो भ्रूण के वायरल इंजेक्शन से बचने और दो ऊपरी योनि के बगल में भ्रूण (चित्र 1a) । कुल मिलाकर, कोई 6 से अधिक भ्रूण सर्जरी के समय को कम करने और भ्रूण नुकसान को रोकने के लिए प्रति लिटर इंजेक्शन हैं ।
  16. इंजेक्शन भ्रूण गर्भवती बांधों में वापस प्लेस, और ~ ०.५ मिलीलीटर बाँझ खारा के साथ उदर गुहा भरें । बंद करने के लिए, पहले दोनों उदर पेरिटोनियल मांसपेशियों सीवन और फिर दूसरी टांका ४.० बाँझ टांके के साथ बाहरी त्वचा परत सीवन । यह बाधित टांके का उपयोग करने के लिए बेहतर है; वहां घाव dehiscence की संभावना है अगर माउस सीवन चबाने ।
  17. एक पिंजरे में माउस को आंशिक रूप से एक हीटिंग पैड पर आराम करने के लिए माउस एक गैर गर्म क्षेत्र में अगर जरूरत से बचने के लिए अनुमति रखें । माताओं की निगरानी करते हुए वे संज्ञाहरण से (1-2 ज) ठीक हो । व्यक्तिगत प्रयोगों के अनुसार विभिन्न समय के लिए सर्जरी के बाद भ्रूण का विकास ।
  18. अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन
    1. एक गर्भाशय सींग और भ्रूण उजागर के साथ, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और 27G सुई का उपयोग १०० μL Zika वायरस (106 TCID५० इकाइयों १०० μL DMEM में निलंबित), या मध्यम नियंत्रण, अंतर्गर्भाशयी अंतरिक्ष में या अपरा ऊतक में इंजेक्शन के लिए । भ्रूण-अवस्था के विच्छेदन के लिए कौन-सा इंजेक्शन लगाया गया है, यह ध्यान दें । अधिक विवरण के लिए पहले प्रकाशित काम देखें18.
    2. जगह भ्रूण गर्भवती बांधों में वापस इंजेक्शन, और ~ ०.५ मिलीलीटर बाँझ खारा के साथ उदर गुहा भरें । बंद करने के लिए, पहले उदर पेरिटोनियल मांसपेशियों सीवन और फिर दूसरी टांका ४.० बाँझ टांके के साथ बाहरी त्वचा परत सीवन । यह बाधित टांके का उपयोग करने के लिए बेहतर है; वहां घाव dehiscence की संभावना है अगर माउस सीवन चबाने ।
    3. एक पिंजरे में माउस को आंशिक रूप से एक हीटिंग पैड पर आराम करने के लिए माउस एक गैर गर्म क्षेत्र में अगर जरूरत से बचने के लिए अनुमति रखें । माताओं की निगरानी करते हुए वे संज्ञाहरण से (1-2 ज) ठीक हो । व्यक्तिगत प्रयोगों के अनुसार विभिन्न समय के लिए सर्जरी के बाद भ्रूण का विकास ।

2. Zika वायरस की नवजात इंट्रा टीका: P0 P1/

  1. सुनिश्चित करें कि गैस तंग इंजेक्शन सीरिंज (10 µ एल मात्रा) और सुई भरा नहीं है । स्वच्छ और 26 गेज सुई के साथ ३ २० मिलीलीटर डिस्पोजेबल सीरिंज लोड करके परीक्षण: खारा, ७०% इथेनॉल के साथ एक के साथ एक, और हवा के साथ एक समाधान स्पष्ट करने के लिए । 10% ब्लीच के साथ निष्फल अगर पहले वायरस इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया ।
  2. वायरस को बर्फ पर रखें । सिरिंज में मृत मात्रा को कम करने के लिए खारा के साथ इसे भरने से सिरिंज लोड, और इंजेक्शन सामग्री से खारा समाधान अलग करने के लिए हवा के ०.७५ µ एल ड्रा.
  3. इंजेक्शन पिल्ले के लिए एक गर्म humidified वसूली चैंबर की स्थापना की । एक हीटिंग ब्लॉक का उपयोग करना, एक बंद कंटेनर (जैसे एक खाली टिप बॉक्स के रूप में) एक बाँझ धुंध और खारा के साथ humidify के साथ जगह है । पहले से गरम करना यह इंजेक्शन शुरू करने के लिए ।
  4. पंप और नियंत्रक सहित microinjector सेट करें । विशिष्ट सिरिंज के लिए डिवाइस प्रकार कोड का निर्धारण (यानी, एक 10 µ l सिरिंज के लिए, डिवाइस प्रकार है "D"). इंजेक्शन की गति निर्धारित करें ।
  5. जन्मोत्तर दिन 0 या 1 पिल्ले (P0/P1) सर्जिकल सेटअप के पास ले लीजिए । वायरस के साथ इंजेक्शन सिरिंज लोड. ७०% ेतोः के साथ पिल्ला सिर माउंट को संक्रमित ।
  6. धुंध की एक पतली परत में पिल्ले लपेटें और उंहें पूरी तरह से बर्फ में दफन करने के लिए एक संवेदनाहारी राज्य को प्राप्त करने । पिल्ले 5 मिनट के लिए cryoanesthetized हैं कि पिल्ले प्रतिक्रिया के बिना एक पूंछ/पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करके इंजेक्शन के लिए पर्याप्त anesthetized हैं कि सुनिश्चित करें । यह मोटे तौर पर एक संवेदनाहारी राज्य के 15 मिनट पैदावार ।
  7. सिर पर पिल्ला प्लेस माउंट, आयोडीन के साथ सिर की सतह निष्फल और, इथेनॉल (तीन बार) और फिर एक बाँझ पोंछ (isopropanol या ७०% ेतोः) के साथ सूखी पोंछ ।
  8. मार्क लैंब्डा एक काले मार्कर के साथ और stereotaxic साधन का उपयोग लैंब्डा पर निर्देशांक रिकॉर्ड. लैंब्डा से आंख के किनारे तक दूरी को मापने और लैंब्डा के stereotaxic निर्देशांक से शुरुआत लैंब्डा से आँख तक 2/5 दूरी की गणना (दोनों गोलार्द्धों के लिए अगर आप दोनों इंजेक्शन हैं).
  9. इंजेक्शन साइट के लिए एक छेद बनाने से पहले संवेदनाहारी गहराई फिर से जाँच करें । इंजेक्शन सुई के लिए एक खोलने बनाने के लिए एक 26-गेज सुई को ध्यान से और सतही रूप से इंजेक्शन स्थान (खोपड़ी नवजात शिशुओं में बहुत नरम है) पर खोपड़ी और खोपड़ी को पंचर करने के लिए उपयोग करें ।
  10. पंचर स्थान में इंजेक्शन सुई कम है, और एक बार सुई सिर्फ त्वचा का उल्लंघन किया है, stereotaxic साधन का उपयोग इंजेक्शन साइट (पार्श्व निलय) के लिए एक 1 मिमी गहराई की गणना.
  11. सुई इंजेक्शन गहराई करने के लिए कम है एक बार, कार्यक्रम microinjector इंजेक्शन के लिए: वायरस के 1 µ एल, 10 nL की दर से/एस, १.५ मिनट से अधिक लगभग 1 µ एल इंजेक्शन (~ 1 μl ३.४ एक्स 105 TCID50/एमएल ZIKV).
  12. इंजेक्शन खत्म होने पर, 30 एस रुको, और पेंच (पृष्ठीय) घूर्णन द्वारा ०.५ mm वेतन वृद्धि में सुई वापस लेना, प्रत्येक वेतन वृद्धि के बाद 30 एस प्रतीक्षा ।
    नोट: यह इंजेक्शन वायरस के रिसाव को कम कर देता है ।
  13. एक बार हटा दिया, या तो जल्दी से सुई और अधिक वायरस के साथ सिरिंज लोड (अलग वायरस या नकली नियंत्रण अलग सीरिंज में लोड किया जाना चाहिए/सुई) या सिर से पिल्ला पूर्व गर्म humidified चैंबर के लिए माउंट निकालें. निगरानी पिल्ला हर कुछ मिनट वसूली गेज करने के लिए । अपने कूड़े के साथ पिल्ले की जगह ।

3. Zika वायरस के वयस्क इंट्रा टीका

  1. ketamine हाइडरोक्लॉराइड (80-100 मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (5-10 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ वयस्क चूहों intraperitoneally इंजेक्षन करने के लिए संज्ञाहरण पैदा करने बाँझ खारा में पतला । analgesia प्रेरित करने के लिए चमड़े के नीचे buprenorphine-SR (0.5-1.0 मिलीग्राम/ पैर की अंगुली/अपने संवेदनाहारी राज्य को सुनिश्चित करने के लिए माउस चुटकी, और बाद में सर्जरी के दौरान सिर स्थिर करने के लिए (एक हीटिंग पैड के साथ) stereotaxic साधन पर माउंट ।
  2. आंखों के लिए नेत्र मरहम जोड़ें सर्जरी के दौरान बाहर सुखाने से माउस की आंखों को रोकने के लिए । कान की शुरुआत करने के लिए आंखों के पीछे शुरू खोपड़ी दाढ़ी । आयोडीन और ७०% ेतोः के साथ उजागर त्वचा तीन बार निष्फल । वैकल्पिक आयोडीन और अल्कोहल पोंछे; शल्य साइट से दूर एक परिपत्र गति में पोंछ ।
  3. त्वचा को incising करने से पूर्व संवेदनाहारी गहराई की पुनः जाँच करें । एक स्केलपेल का प्रयोग, निष्फल स्थान में सिर के औसत दर्जे का sagittal लाइन के साथ एक ०.५ सेमी चीरा, bregma उजागर करते हैं । एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ एक रोलिंग गति का उपयोग करना, मस्तिष्कावरणीय ऊतकों की खोपड़ी की सतह स्पष्ट है, जबकि एक साथ त्वचा इंजेक्शन साइटों से दूर धकेल ।
  4. bregma से शुरू, सर्जिकल ड्रिल बिट संरेखित करें और इंजेक्शन साइटों का उपयोग कर की पहचान निम्नलिखित निर्देशांक: AP-०.५ मिमी, एमएल: +/-१.५ मिमी. नियंत्रण पैर पेडल का उपयोग करना, खोपड़ी में ड्रिल धीरे के रूप में केवल ड्रिल हड्डी जब तक एक छेद सुई के लिए मंजूरी दे दी गई है ।
  5. ड्रिल को microinjector पम्प और गैस-टाइट सिरिंज (10 µ l volume) के साथ stereotaxic पर बदलें । खारा समाधान और वायरस के बीच एक छोटे से हवा बुलबुला जा रहा है, आकर्षित ~ 4-5 वायरस के µ एल । विशिष्ट सिरिंज मात्रा के लिए डिवाइस प्रकार कोड का निर्धारण (यानी, 10 μL मात्रा सिरिंज के लिए डी). डीवी के लिए सुई कम:-मस्तिष्क की सतह से १.५ mm । वायरस के 1 µ एल इंजेक्षन करने के लिए, कार्यक्रम की दर 10 nL/एस, लगभग १.५ मिनट से अधिक 1 µ एल इंजेक्शन.
  6. जब इंजेक्शन खत्म, 30 एस प्रतीक्षा करें, और ०.५ mm वेतन वृद्धि में सुई हटाने के लिए, प्रत्येक बारी के बाद 30 एस प्रतीक्षा । यह इंजेक्शन वायरस के backflow और रिसाव को कम करता है ।
  7. जब इंजेक्शन समाप्त कर रहे हैं, त्वचा को ढीला और उजागर खोपड़ी ठीक करने के लिए संदंश का उपयोग करें । खोपड़ी वापस एक साथ सीवन ४.० टांके का उपयोग और stereotaxic साधन से माउस को हटा दें । एक आंशिक रूप से एक हीटिंग पैड पर आराम करने के लिए माउस एक गैर-गर्म क्षेत्र से बचने के लिए अगर जरूरत है और जब वे ठीक संज्ञाहरण से (1-2 ज) की निगरानी की अनुमति के लिए माउस प्लेस ।

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Representative Results

भ्रूण मस्तिष्क के ZIKV टीका के लिए हमारे इंजेक्शन तरीकों के प्रतिनिधि छवियों इंट्रा इंजेक्शन (चित्र 1a) और अंतर्गर्भाशयी और intraplacental इंजेक्शन (आंकड़ा 1b) चित्रण चित्र में दिखाए जाते हैं, illustrating तरह गर्भवती बांध और भ्रूण देखा जाना चाहिए और शल्य चिकित्सा (भ्रूण टीका प्रोटोकॉल) के लिए उंमुख । चित्रा 2a प्रदर्शित ZIKV (MEX1-44) संक्रमण (immunostained के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ flavivirus समूह प्रतिजन, ग्रीन) ई 18.5 सेरेब्रल प्रांतस्था में । Pax6 (red) labels NPCs in the विकासशील प्रांतस्था. ZIKV ई 14.5 भ्रूण दिमाग में inoculated था । ऊतक नमूने7से TCID50 परख का प्रयोग, हमारे विकास वक्र विश्लेषण बताते है कि ZIKV कुशलता से दोहराने और विकासशील दिमाग में विकसित कर सकते है (चित्रा बी2, 2c), के रूप में प्रकाशित7चित्रा 2d भ्रूण टीका विधि का उपयोग कर विकासशील प्रांतस्था में DENV2 के साथ सफल संक्रमण से पता चलता है । DENV2 flavivirus समूह antigen (हरा) के विरुद्ध एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया है । चित्रा 2E ZIKV के एक अलग तनाव के साथ संक्रमण दर्शाता है, अफ्रीकी वंश (एमआर-७६६) । चित्रा 2F वैकल्पिक मार्ग के लिए एक प्रतिनिधि संक्रमण दर्शाता है, ZIKV के intraplacental टीका-एशिया (MEX1-44) स्टेज ई 10.5 में ।

चित्र 3 ए P0/1 पिल्ले के ZIKV टीका के लिए पार्श्व निलय में इंजेक्शन के स्थान की पहचान करने के लिए प्रयुक्त स्थलों का चित्रण करने वाला आरेख है । चित्रा 3 बी P0/1 इंजेक्शन के बाद P13 सेरेब्रल प्रांतस्था में ZIKV (MEX1-44) संक्रमण से पता चलता है । ZIKV (MEX1-44) flavivirus समूह प्रतिजन (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया है । चित्रा 4 फ्लोरोसेंट मोतियों (लाल) है कि इंजेक्शन स्थान अभ्यास करने के लिए इस्तेमाल किया गया, और वयस्कों में पार्श्व निलय इंजेक्शन सफलता से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: ZIKV के भ्रूण टीका । () एक गर्भाशय सींग के जोखिम का प्रतिनिधित्व आरेख, योनि से सटे भ्रूण और सींग के साथ सबसे पार्श्व भ्रूण के इंजेक्शन से बचने के लिए एक नोट के साथ । (B) एक गर्भाशय हॉर्न के प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करने वाला आरेख, intraplacental और अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन के स्थान का चित्रण । ये आरेख उनके मूल प्रकाशन21से संशोधित किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ई 14.5 पर ZIKV भ्रूण टीका । () ई 18.5 पर भ्रूण मस्तिष्क ZIKV से संक्रमित है (MEX1-44) विकासशील neocortex की सभी परतों में (स्केल बार २०० µm है) । तंत्रिका जनक कोशिकाएँ Pax6 (लाल) और ZIKV के जरिए flavivirus प्रतिजन (ग्रीन) के साथ immunolabeled हैं. () जन्मोत्तर दिवस 3 (पी पी) मस्तिष्क ऊतक inoculated ई 14.5 ZIKV-एशिया (MEX1-44) के साथ में से TCID50 परिणाम । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक माप (* * *p < 0.0001, Student ' s t-test)7में एक नकली और एक ZIKV-संक्रमित ब्रेन के साथ तीन स्वतंत्र मापन के s.e.m. का संकेत देती हैं । () TCID50 संक्रमित भ्रूण मस्तिष्क ऊतक में ZIKV viremia के ठेठ वृद्धि की वक्र का वर्णन परिणाम । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक माप में एक नकली और एक ZIKV-एशिया (MEX1-44) संक्रमित मस्तिष्क के साथ तीन स्वतंत्र मापन के s.e.m. का संकेत देती हैं । प्रसरण का विश्लेषण (ANOVA) वायरल titer में विकास आय के रूप में एक उल्लेखनीय वृद्धि का पता लगाता है7। () डेंगू वायरस (DENV2) संक्रमित प्रतिनिधि प्रोटोकॉल (ई 14.5 भ्रूण inoculated के साथ ~ 1 µ l के ३.४ x 105 TCID50/स्केल बार २०० उम है) और () ZIKV-अफ्रीका (MR766) संक्रमित प्रतिनिधि प्रोटोकॉल (स्केल बार २०० µm) । () ZIKV-एशिया (MEX1-४४) संक्रमित प्रतिनिधि प्रोटोकॉल से intraplacental इंजेक्शन कार्यनीति (स्केल बार २०० µm है). सभी छवियों में, Hoechst दाग नाभिक । इन आंकड़ों को उनके मूल प्रकाशन7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: ZIKV के P1 टीका के प्रतिनिधि प्रोटोकॉल । () P1 पिल्ले के पार्श्व निलय में इंजेक्शन स्थान निर्धारित करने के लिए विधि का प्रदर्शन आरेख. () प्रतिनिधि राज्याभिषेक cryosections immunostained flavivirus समूह प्रतिजन के लिए कम के साथ (पर छोड़ दिया, स्केल पट्टी है १०० µm) और उच्च (दाईं ओर, स्केल पट्टी है ५० µm) P15 पर ZIKV के P1 टीका का इज़ाफ़ा (~ 1 μl ३.४ x 105 TCID50/एमएल ZIKV) । Hoechst दाग नाभिक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क स्टेज संवहन इंजेक्शन. वयस्क माउस फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ इंजेक्शन के बाद शीघ्र ही इंजेक्शन स्थान सफलता (स्केल बार २०० µm है) निर्धारित करने के लिए सर्जरी के बाद बलिदान दिया गया था । Sagittal cryosection के रूप में मोती आगे धुंधला की आवश्यकता नहीं है के रूप में अनुभाग के तुरंत देखा जा सकता है । Hoechst दाग नाभिक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां वर्णित भ्रूण, नवजात, और ZIKV की जांच के लिए वयस्क चरणों में ZIKV के इंट्रा टीका के लिए एक विधि-मस्तिष्क के विकास में नुकसान प्रेरित है । जबकि सीधा, वहां कुछ विचार है कि जांचकर्ताओं के अध्ययन की गुणवत्ता और शामिल लोगों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए ले जाना चाहिए रहे हैं ।

देंव बारीकी से flavivirus जीनस में ZIKV से संबंधित है । देंव मानव में बाल चिकित्सा मस्तिष्क विकारों के साथ कारण से जुड़ा नहीं किया गया है । DENV2 सफलतापूर्वक संक्रमित और भ्रूण टीका विधि का उपयोग कर विकासशील मस्तिष्क में नकल कर सकते हैं (~ 1 µ एल के ३.४ x 105 TCID50/एमएल) (चित्रा 2d) । इसलिए, संक्रमित वीरो सेल मीडिया (मॉक) के अलावा, देंव संक्रमण को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि विकासशील मस्तिष्क में ZIKV विशिष्ट रोगजनन का अध्ययन किया जा सके । यह utero मेंवायरस के रिसाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो अन्य भ्रूण के अवांछित दूषित होने में परिणाम कर सकते हैं । इसलिए, यह qRT-पीसीआर या TCID50 परख के बाद प्रत्येक भ्रूण से मस्तिष्क के ऊतकों को अलग करने के माध्यम से संक्रमित और गैर संक्रमित व्यक्तियों को सत्यापित करने के लिए आवश्यक है । एक डाई वायरल माध्यम से नेत्रहीन इंजेक्शन की पुष्टि करने के लिए जोड़ा जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि डाई नुकसान ही कारण नहीं है परीक्षण करने के लिए ।

माउस उपभेदों विकास परिवर्तनशीलता प्रदर्शन, और इसलिए P1 इंजेक्शन स्थानों प्रत्येक माउस लाइन के लिए सत्यापित करने की आवश्यकता है । इंजेक्शन साइट कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक नकली neonate इंजेक्शन प्रदर्शन । इस प्रारंभिक अध्ययन कि इंजेक्शन निलय तक पहुँचता है या मस्तिष्क के ऊतकों में भी गहरी हो जाता है कि सूचित करेंगे. आदर्श परिणामों के लिए, पिल्ले निलय में फ्लोरोसेंट मोतियों के स्थान की पहचान करने के लिए इंजेक्शन के बाद शीघ्र ही बलिदान दिया जा सकता है । पिल्ला के पूरे सिर रातोंरात तय किया जा सकता है, एम्बेडेड, और सटीक इंजेक्शन स्थान का पालन करने के लिए cryosectioned. तेल संतृप्त सिरिंज के साथ इंजेक्शन अनुभव की आवश्यकता है और यह parafilm पर डाई के साथ शम इंजेक्शन का उपयोग कर सत्यापित करें कि इंजेक्शन की मात्रा सटीक है अभ्यास करने के लिए सिफारिश की है ।

इन अध्ययनों में गंभीर वायरस के साथ काम कर रहे प्रयोगशाला कर्मियों के आकस्मिक संक्रमण से बचने के लिए सुरक्षा उपायों में महत्वपूर्ण हैं । इस सुविधा पर जहां काम पूरा किया जा रहा है पर पहले से ही सुरक्षा अनुमोदन किया जाना चाहिए । ZIKV रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका केन्द्रों द्वारा एक सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) रोगज़नक़ माना जाता है । वायरस के साथ काम कर रहे सभी व्यक्तियों या क्षेत्रों में काम कर रहे हैं, जहां वायरस को संभाला जा रहा है पता होना चाहिए और अपने संस्थान के लिए सुरक्षा प्रोटोकॉल के साथ परिचित । सभी उपकरणों और ZIKV या DENV2 करने के लिए उजागर सतहों 10% ब्लीच से संक्रमित किया जाना चाहिए उपयोग के बाद शेष वायरल कणों को नष्ट करने के लिए । जो महिलाएं गर्भवती है या गर्भ धारण करने का प्रयास कर रहे है अनुसंधान ZIKV या DENV2 के संपर्क क्षेत्रों के साथ बातचीत नहीं करने की सिफारिश की है । प्रोटोकॉल के लिए प्रयुक्त सभी ऊतक विश्लेषण के लिए वायरस को निष्क्रिय करने के लिए 4% पीएफए में तय कर रहे हैं । भंडारण और संवर्धन वायरस BSL2 काम के लिए नामित एक डाकू में वीरो कोशिकाओं में किया जाना चाहिए । स्टॉक वायरस और टिशू अनुमापन TCID50 प्रोटोकॉल का उपयोग कर quantified जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक अपनी सदस्यता और वयस्क शल्य चिकित्सा और neonate तकनीक सीखने के लिए प्रासंगिक चर्चा के लिए रोचेस्टर विश्वविद्यालय में डॉ Abdellatif Benraiss स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक भी अपने stereotaxic उपकरण और इस तकनीक के लिए पद्धति की स्थापना से संबंधित चर्चा के उपयोग के लिए UGA पर डॉ जेंस लॉडरडेल स्वीकार करना चाहते हैं, और अनुसंधान कॉलेज के वैज्ञानिकों के लिए प्रगति (आर्क्स) फाउंडेशन के लिए उनके समर्थन और हमारे NIH समर्थन (NINDS अनुदान R01NS096176-02, R01NS097231-01, और F99NS105187-01) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor Leica 39416001
Mouse Stereotax Kopf 04557R
Micro4 Microsyringe Pump Controller WPI SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump WPI UMP3
Modulamp Schott -
Luer-lock tubing (19-gauge) Hamilton 90619
Melting Point Capillary Kimble 34500-99 Glass needle
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres Thermo Scientific R25 No dilution; Use for practice injections
10 µL, Model 1701 LT SYR Hamilton 80001 for embryonic inoculation
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 Hamilton 80030 for neonate/adult
4-0 Ethilon Nylon Sutures Ethicon -
Mineral Oil VWR -
micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Micropipette Grinder Narishige EG-44
Fastgreen FCF Dye Sigma F7252 inject with 0.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibody Millipore MAB10216 ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)
Pax6 DBHB Pax6-s ms IgG1 1:20

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References

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