أساليب لتحليل آثار اليورانيوم الطبيعي في أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويعرف اليورانيوم لتؤثر على استقلاب العظام. نقدم هنا، بروتوكول يهدف إلى التحقيق أثر التعرض لليورانيوم الطبيعي على استمرارية والتفريق بين وظيفة الآكلة، الخلايا المسؤولة عن ارتشاف العظام.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

اليورانيوم قد ثبت أن تتداخل مع عظم علم وظائف الأعضاء، وكذلك ثبت أن هذا المعدن يتراكم في العظام. ومع ذلك، يعرف الكثير عن تأثير اليورانيوم الطبيعي على سلوك خلايا العظام. على وجه الخصوص، لم يتم توثيق تأثير اليورانيوم على الآكلة، الخلايا المسؤولة عن ارتشاف مصفوفة العظام،. للتحقيق في هذه القضية، وقد أنشأنا بروتوكول جديد باستخدام خلات اليورانيل كمصدر لليورانيوم الطبيعي وخط الخلية 264.7 الخام مورين كنموذج للسلائف اوستيوكلاست. هنا، نحن بالتفصيل جميع الاختبارات المطلوبة لاختبار سيتوتوكسيسيتي اليورانيوم على السلائف اوستيوكلاست وتقييم أثرها أوستيوكلاستوجينيسيس وعلى وظيفة ريسوربينج الآكلة ناضجة. الشروط التي قمنا بتطوير، ولا سيما لإعداد اليورانيل المحتوية على وسائط الإعلام الثقافة والبذر 264.7 الخام تسمح الخلايا للحصول على نتائج موثوقة وعالية الإنجابية. وعلاوة على ذلك، نحن الأمثل استخدام أدوات البرامج لتيسير تحليل معلمات مختلفة مثل حجم الآكلة أو النسبة المئوية لمصفوفة ريسوربيد.

Introduction

اليورانيوم عنصر مشعة التي تحدث بشكل طبيعي في التربة والهواء والمياه؛ على هذا النحو، تتعرض الحيوانات والبشر لليورانيوم الطبيعي في وجباتهم. بالإضافة إلى المصادر الطبيعية، ينشأ اليورانيوم من الأنشطة البشرية، مما يزيد من الوفرة في البيئة. ويشكل اليورانيوم الإخطار الكيميائية والإشعاعية. ومع ذلك، بسبب انخفاض نشاط معين (Bq.g3 25.10-1) اليورانيوم الطبيعي (وهو خليط النظائر المشعة التي تحتوي على 99.27% 238U و 0.72 في المائة 235U 2340.006% U)، آثار تغير المناخ على الصحة يعزى إلى ما سمية المواد الكيميائية.

أيا كان المسار الإدخال الخاص به (الاستنشاق أو الابتلاع أو التعرض الجلدي)، ومعظم تدخل الجسم يتم التخلص من اليورانيوم مع البراز وسوى جزء صغير يصل إلى الدوران الجهازي. حوالي 67 في المائة يورانيوم في الدم بدوره يتم تصفية بواسطة الكليتين، وتترك الجسم في البول خلال 24 ساعة1. الباقي معظمها يترسب في الكلي والعظام، والجهازين الهدف الرئيسي لليورانيوم سمية2،،من34. لأنه تم التعرف على هيكل عظمى كموقع أساسي لليورانيوم طويلة الأجل الاحتفاظ2،3،4،،من56، أجريت عدة دراسات لاستكشاف تأثير اليورانيوم على عظم علم وظائف الأعضاء7.

العظم هو نسيج التعدينية التي يتم تشكيلها بشكل مستمر طوال حياتها. إعادة عرض العظام هو عملية معقدة تعتمد على أنواع الخلايا المتخصصة، وتتألف في معظمها من مرحلتين: ارتشاف المصفوفة القديمة الموجودة مسبقاً بالأكلة يتبعها دي نوفو العظام البناء بواسطة خلايا الاوستيوبلاستس. الآكلة هي خلايا مولتينوكليار الكبيرة الناتجة عن انصهار الخلايا السليفة الأصلية المكونة للدم التي تهاجر إلى مواقع ارتشاف حيث يعلقونها على العظام8. تمسكهم يحدث في نفس الوقت إعادة تنظيم واسعة النطاق لما سيتوسكيليتون9. إعادة التنظيم هذه المطلوب لإنشاء حجرة منعزلة بين الخلية والسطح العظام التي تفرز اوستيوكلاست البروتونات، مما يؤدي إلى تفكك هيدروكسيباتيت، والبروتياز المتورطين في التدهور مصفوفة العضوية. منتجات التحلل الناتجة المبتلعة، تنقل عبر الخلية إلى منطقة الغشاء مقابل سطح العظام ويفرز، عملية تسمى ترانسسيتوسيس10،11.

تبين نتائج الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر أن اليورانيوم يحول دون تكوين العظام، ويغير العدد ونشاط خلايا الاوستيوبلاستس7،12. وفي المقابل، تم استكشاف آثار اليورانيوم على ارتشاف العظم والأكلة سيئة. وأفادت عدة في فيفو الدراسات زيادة ارتشاف العظم بعد إدارة نترات اليورانيل للفئران أو الجرذان13،14. وعلاوة على ذلك، اقترح التحريات وبائية أن الزيادة في كمية اليورانيوم عن طريق مياه الشرب تميل إلى أن تكون مرتبطة بزيادة في مستوى المصل من علامة ارتشاف العظام في الرجل15. أخذت معا، أدت هذه النتائج إلى الاستنتاج بأن اليورانيوم الذي يتراكم في العظام يمكن أن تعزز ارتشاف العظام. ومع ذلك، تظل الآليات الخلوية التي تشارك في هذا الأثر المحتمل لليورانيوم مسألة مفتوحة. لهذا السبب، قررنا أن دراسة تأثير اليورانيوم على سلوك ريسوربينج خلايا العظام.

هنا، يمكننا وصف البروتوكول قد أنشأنا لوصف وقياس آثار اليورانيوم الطبيعي على الآكلة ما قبل الجدوى والتمايز الآكلة والنشاط ريسوربتيفي. وأجريت التجارب الموضحة هنا مع خط الخلية بلعم تحول مورين 264.7 الخام، الذي يمكن أن يسهل تفرق في الآكلة عند مثقف حضور سيتوكين رانكل لمدة 4 أو 5 أيام، والذي يستخدم تقليديا للدراسة اوستيوكلاست التمايز والدالة16. الإجراءات التي وضعت موثوقة، وتعطي النتائج استنساخه بدرجة عالية، وهي تنطبق تماما على الآكلة الرئيسية. لكل هذه الأسباب، ونحن نعتقد أن هذه المنهجية مفيدة للحصول على فهم أفضل للآليات الجزيئية التي تشارك في سمية اليورانيوم في العظام. وعلاوة على ذلك، نعتقد أن هذا النهج يمكن أن تكيف كأداة فحص لتحديد جديد اليورانيوم خالب وكلاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد خلات اليورانيل

  1. إضافة إلى إعداد 2 مل خلات اليورانيل 100 مم، 85 مغ خلات اليورانيل (ثالث أكسيد اليورانيوم2(عكوش3)2, 2 ح2س؛ M = g.mol 424-1) في الحالة الصلبة لأنبوب بلاستيك 5 مل.
  2. إضافة 2 مل ماء المقطر الأنبوب من البلاستيك، وأنها تناسب مع سداده بلاستيكية.
  3. اهتز الأنبوب بقوة حتى حل إجمالي الصلبة. وضع الحل في الثلاجة ح 24.
    تنبيه: التلاعب اليورانيل [U(VI)] يعرض بعض المخاطر الكيميائية والإشعاعية. ينبغي إعداد جميع العينات وتتميز بالمعدات المخصصة في مختبرات محددة. جميع السوائل المحتوية على السادس يو ينبغي تجميعها في حاويات النفايات المعينة على وجه التحديد والتخلص منه كنفايات سامة. يمكن أن تغسل النفايات الجافة (بيبيتس، والأنابيب، إلخ) مع الحل3 N HNO 0.1، مما جعل وإزالة U(VI).
  4. التحقق من الرقم الهيدروجيني للحل باستخدام ميكروليكترودي ومقياس الأس الهيدروجيني.
    ملاحظة: ميكرويليكترودي ينبغي سابقا معايرة باستخدام حلول تجارية المخزن المؤقت (pH = 4 والرقم الهيدروجيني = 7).

2-الخام خلية 264.7 الثقافة

  1. صيانة الخلايا.
    1. زراعة الخلايا 264.7 الخام (ATCC، الطيب-71) في قوارير2 75 سم في المتوسط النمو التالية: دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (دميم) تستكمل مع 5% "مصل بقرى الجنين" والمضادات الحيوية: البنسلين 100 وحدة دولية/مل، 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. الحفاظ على الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    2. تغيير المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام. عندما تكون الخلايا روافد 85-90 ٪، ميكانيكيا إزالتها من قارورة ثقافة استخدام مكشطة خلية (كما أوصى ATCC) وتقسيمها بنسبة 1:6.
      ملاحظة: تستخدم الخلايا فقط بين مقاطع من 3 إلى 10 لتجارب التفرقة.
  2. إعداد الخلايا للتجارب
    1. إزاحة الخلايا من الركازة قارورة كما هو موضح أعلاه وتحويلها إلى أنبوب 50 مل عقيمة. مزيج من الخلايا من بيبيتينج صعودا ونزولاً تفتيت كتل. عد لهم مع هيموسيتوميتير. أتوقع 35 مليون من الخلايا الواحدة 75 سم2 قارورة.
    2. حساب حجم تعليق الخلايا اللازمة لكل تجربة على النحو التالي:
      عدد تجريبي الظروف x 3 (تريبليكاتيس) × 1 مل/بئر + 3-4 مل (خسائر بيبيتينج).
      ملاحظة: بذر الكثافة لجميع الاختبارات المبينة في هذا البروتوكول هو 5,000 خلية/سم2. ولذلك، لوحة 24-حسنا، يعني خلايا 10,000 كل بئر في 1 مل متوسطة، وكثافة تعليق الخلية وبالتالي 10,000 خلايا/مل.
    3. إعداد وحدة التخزين اللازمة من تعليق خلية خلايا/مل 10,000 والبذور الخلايا في لوحات 24-جيدا. لفحوصات سيتوتوكسيسيتي، استخدم متوسط النمو الطبيعي. للتمايز وفحوصات ارتشاف، تعديل ألفا استخدام الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (αMEM) تستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 5% FBS و 50 نانوغرام/مل من ضريبة المبيعات-رانكل17.
      ملاحظة: ضريبة المبيعات رانكل البروتين المنتجة داخليا يمكن الاستعاضة عن أي سيتوكين رانكل المتاحة تجارياً. عند العمل مع مجموعة رانكل جديدة، قد يكون من المفيد لاختبار فعاليتها في حمل أوستيوكلاستوجينيسيس عن طريق إجراء تجربة استجابة جرعة مع تركيز رانكل تتراوح من 20 إلى 150 نانوغرام/مليلتر.

3-التخفيف من خلات اليورانيل 100 ملم في المتوسط الثقافة

ملاحظة: تشكل أيونات اليورانيل [U(VI)] في مستنبت مجمعات متعددة مع المكونات الأخرى المتوسطة التي يمكن تعديلها السمية الخلوية18،19،،من2021. ولهذا السبب، ينبغي إعداد الوسائط التي تحتوي على اليورانيل اكستيمبورانيوسلي دون إهمال أو تقصير خطوات الموازنة.

  1. اختيار اليورانيل تركيزات التعرض وحساب كميات من وسائط الثقافة المطلوبة للتجربة (مع الأخذ في الاعتبار أن كل حالة تتم في ثلاث نسخ).
  2. بدءاً من الخلية العقيمة الثقافة تختبر 7.5% بيكربونات الصوديوم محلول مائي ([HCO3] = 893 ملم)، وإعداد حل 100 ملم HCO3 في الماء وتبرد على الجليد.
  3. إضافة حجم قطره قطره 1 من 100 ملم خلات اليورانيل حل الأسهم إلى 9 وحدات التخزين المثلج 100 ملم HCO3 الحل، تهتز برفق أنبوب الخلط. هذه العملية سوف يضعف خلات اليورانيل الأسهم ([ثالث أكسيد اليورانيوم22 +] = 100 مم، الرقم الهيدروجيني 4) إلى 10 ملم، وتحقيق درجة الحموضة إلى حوالي 7.
  4. إضافة إلى حجم 1 من الماء المعقم إلى وحدات تخزين 9 مم 100 المثلج HCO3 حل لتصل إلى 90 ملم HCO3 (تساوي تركيز HCO3 في اليورانيل 10 ملم)، الذي سيعمل على إعداد عنصر التحكم المتوسطة.
  5. تتيح حلول معدّة الترشح في 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) للموازنة.
  6. وفي الوقت نفسه، تعد الوسيلة الأساسية التعرض: αMEM مع 2 مم L-الجلوتامين و 5% FBS.
    ملاحظة: للتمايز وفحوصات ارتشاف، إضافة 50 نانوغرام/مل من ضريبة المبيعات-رانكل إلى متوسط التعرض الأساسية.
  7. بعد ح 3، تضعف الكميات المناسبة من 10 ملم اليورانيل قطره قطره في الأجلين المتوسط والتعرض لما يحقق اليورانيل المطلوب العمل تركيزات. إعداد في نفس الوقت وسيلة التحكم بإضافة مقدار بيكربونات المستخدمة في حالة تعامل اليورانيل الأكثر تركيزاً، إلى متوسط التعرض.
  8. السماح لوسائل الإعلام مستعدة الوقوف على ح 3 على RT للموازنة.
  9. قم بإزالة وسائط النمو من الآبار واستبداله بعنصر التحكم، ووسائل الإعلام التي تتضمن اليورانيل.

4-تحليل جدوى السلائف 264.7 الخام حضور U(VI) (MTT فحوصات السامة للخلايا)

تنبيه: كل من MTT و [دمس] يمكن أن تتسبب في الجلد وتهيّج العين. ارتداء القفازات وحماية العين عند التعامل معها. جمع النفايات في حاويات النفايات المعينة على وجه التحديد.

  1. حل قدر مناسب من مسحوق بروميد 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) في برنامج تلفزيوني للحصول على حل أسهم 10 x في 5 ملغ/مل. تعقيم أنه عن طريق الترشيح مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
  2. لوحة الخلايا على لوحات 24-جيدا (3 آبار في كل حالة تجريبية للوحة الواحدة). لا تنسى أن نحتفظ بابار فارغة 3 كل لوح للفراغات جهاز المطياف الضوئي.
  3. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 22-24 قبل التعرض لليورانيوم للسماح للخلايا إرفاق.
  4. تحضير الوسائط التي تحتوي على اليورانيل كما هو موضح في القسم 3.
  5. استبدال المتوسطة النمو في لوحات المصنف الخلية المحتوية على اليورانيل وسائط الإعلام. احتضانها ح 24.
  6. حساب حجم الضرورية لحل x MTT 1 على النحو التالي:
    (عدد من الظروف التجريبية + فارغة) x 3 (تريبليكاتيس) × 0.4 مل/بئر + 10% حجم خسائر بيبيتينج.
  7. إعداد حجم 1 x MTT الحل المطلوب بتمييع 10 × الأسهم MTT الحل في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (اللور النسر) دون الأحمر الفينول.
    ملاحظة: مقايسة اللونية ناجحة، ينبغي حماية MTT من الضوء. من المستحسن أن تضعف MTT إلى اللور بدلاً من دميم بغية الحد من الإشارات الخلفية.
  8. قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على اليورانيل من الآبار وغسلها ببرنامج تلفزيوني وإضافة 400 ميليلتر لحل MTT لكل بئر (بما في ذلك الآبار فارغة 3 الفراغات). احتضان ح 2.5 في 37 درجة مئوية في الظلام. تحقق من تحت المجهر أن بلورات formazan الأرجواني الداكن وقد شكلت داخل خلايا قابلة للحياة.
  9. تجاهل الحل MTT وإضافة 220 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) كل بئر. لف ألواح في رقائق الألومنيوم حمايتهم من الضوء وتحرض برفق لمدة 10 دقائق لإذابة بلورات formazan.
  10. استخدام قارئ مطياف ميكروسكوبية لتحديد كثافة بصرية (OD) في 570 نانومتر (formazan محددة) و 690 نانومتر (الخلفية). لكل بئر، طرح 690 nm OD من 570 نانومتر OD لضبط لتقلب قيمة OD غير محددة ممكن سبب الخدوش أو تعكر22.
  11. حساب OD تصحيح فارغة لكل بئر بطرح OD يعني فارغة من التطوير التنظيمي التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة. تحديد متوسط قيمة التطوير التنظيمي لكل حالة تجريبية.
  12. تعيين OD يعني حالة عنصر التحكم ([ثالث أكسيد اليورانيوم22 +] = 0 ملم) لبقاء 100% وحساب النسبة المئوية المقابلة لبقاء الخلية لتركيزات اليورانيل اختبار أخرى. رسم منحنى استجابة لجرعة. تقييم 50 مؤشر سيتوتوكسيسيتي (CI50)، تعرف بأنها تركيز اليورانيل مما يؤدي إلى موت الخلايا 50% بعد التعرض ح 24.

5-تحليل التمايز اوستيوكلاست حضور U(VI)

  1. التفريق بين 264.7 الخام الخلايا حضور اليورانيل وفخ (طرطرات-مقاومة حمض الفوسفاتيز) تلطيخ.
    1. لوحة خلايا 264.7 الخام على لوحة 24-حسنا، 3 آبار كل حالة تجريبية. احتضان في 37 درجة مئوية لحوالي 6 ح، الوقت الكافي للتحضير وحجته وسائط الإعلام التي تتضمن اليورانيل التعرض.
    2. تحضير الوسائط التمايز مع تركيزات اليورانيل المطلوبة كما هو موضح في القسم 3 (لا تنسى لإضافة ضريبة المبيعات-رانكل لوسائل الإعلام).
    3. استبدال الأساسية المتوسطة في الآبار بلطف مع المحتوية على اليورانيل المتوسطة. ويعتبر هذا اليوم يوم 0 التمايز أوستيوكلاستيك.
    4. تغيير المتوسطة في يوم 2 أو 3 من التمايز أوستيوكلاستيك بتكرار الخطوات من 5.1.2 و 5.1.3. يجب أن تظهر الآكلة مولتينوكليتيد بين يوم 3 و 4.
    5. أداء تلطيخ فخ مع حمض الفوسفاتيز الكريات البيض المتاحة تجارياً عدة اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: طرطرات-مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) يسمى أيضا حمض الفوسفاتيز 5، مقاومة طرطرات (ACP5) هو الغاية المعرب عنها في الآكلة ناضجة وتستخدم على نطاق واسع كعلامة لتمييز اوستيوكلاست. ولذلك، يتم تلطيخ مصيدة لتصور الآكلة. اعتماداً على الظروف التجريبية، ومعدل أوستيوكلاستوجينيسيس، يمكن القيام في اليوم 4 أو يوم 5 من عملية المفاضلة.
    6. تبقى ملطخة بفخ الآبار في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمزيد من التحليل (أنها يمكن الحفاظ في هذه الظروف ما يصل إلى 3 أو 4 أسابيع).
  2. تحليل حجم/مورفولوجيا اوستيوكلاست.
    1. الحصول على صورة من السطح كله لكل بئر. دقة الصورة ينبغي أن تكون كافية للتمييز بين نواة الخلية. النظر في فخ--إيجابية الخلايا مع نويات 3 أو أكثر، الآكلة.
    2. فتح صورة بئر واحدة في البرنامج إيماجيج: "File" ← "فتح".
    3. التحقق من وحدات القياس في الركن الأيمن العلوي من الصورة. للتحديد الكمي النسبي، يمكن استخدام أي وحدة. إذا كانت القيمة المطلقة لحجم اوستيوكلاست اللازمة، تحويل وحدات القياس إلى ميكرومتر: "صورة" ← "خصائص". التحقق من المربع "العالمية" في إطار منبثق لوحدات القياس الجديدة المطبقة على جميع الصور فتحها في وقت لاحق.
      ملاحظة: إذا تم استخدام مجهر للحصول على الصور، يرد حجم بكسل في ميكرون لكل هدف من الأهداف في برامج التصوير.
    4. تحديد معلمات القياس تحليله: "تحليل" ← "تعيين قياسات". في الإطار "تعيين قياسات"، "المجال" و "عرض التسمية" خانات الاختيار وإلغاء جميع الآخرين مربعات.
    5. فتح إدارة العائد على الاستثمار (منطقة للفائدة): "تحليل" ← "أدوات" ← "إدارة العائد على الاستثمار".
    6. في الإطار الرئيسي، اختر أداة التحديد المستطيل. استخدامه في أي مكان في الصورة إلى مخطط قطاع من حوالي 1,000 x 1,000 ميكرومتر. يحدد هذا التحديد الآن المنطقة الأولى في اوستيوكلاست التي سيتم تحليل الحجم.
    7. في إطار إدارة العائد على الاستثمار، انقر على الزر "إضافة" إضافة هذه المنطقة من اهتمام لإدارة العائد على الاستثمار، وحفظه عن طريق النقر على "مزيد" ← "حفظ". يمكن الآن حصرياً دوروا المحفوظة إلى إدارة العائد على الاستثمار في أي وقت عن طريق النقر على "مزيد" ← "فتح".
    8. كرر الخطوات 5.2.5-5.2.6 لتحديد 4 مناطق إضافية لتحليل حجم اوستيوكلاست (الشكل 2A و 2D).
      ملاحظة: سيتم استخدام مناطق محددة لتحليل أحجام اوستيوكلاست في جميع الصور.
    9. إنشاء نسخة من واحدة من المناطق الخمس يتم تحليلها: اختيار هذا العائد على الاستثمار بصورة الرئيسية إدارة العائد على الاستثمار (اختيار المقابلة سوف تظهر في الصورة الرئيسية) ← الحق فوق داخل ← الاختيار "تكرار". استخدم هذا التكرار لمزيد من التحليل.
    10. في إطار إدارة العائد على الاستثمار وخانات الاختيار "إظهار ال" l و "التسميات".
    11. في الإطار الرئيسي، اختر أداة التحديد المضلع يدوياً تحديد واحدة من الآكلة في التحديد. إضافة هذا المخطط إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق النقر على "إضافة" في إطار إدارة العائد على الاستثمار. المضي قدما وبالمثل لجميع الآكلة التي تقع تماما داخل المنطقة المحددة (الشكل 2B و 2E).
    12. في إطار إدارة العائد على الاستثمار، قم بتحديد جميع الخطوط العريضة وقياس سطحها عن طريق النقر على "قياس". تحويل القياسات التي ظهرت في نافذة جديدة (إطار النتائج و الرقم 2 و 2F) إلى جدول بيانات.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، منطقة التحليل مع جميع الخطوط العريضة الآكلة يمكن أن يتم حفظ كصورة مستقلة: ← تنسيق "ملف" "حفظ باسم" للاختيار.
    13. كرر الخطوات 5.2.8-5.2.12 للمناطق المتبقية من تحليل للصورة الحالية. ثم، كرر الإجراء بأكمله لجميع الصور الأخرى.
  3. اوستيوكلاست تحليل الأرقام مع برنامج إيماجيج.
    ملاحظة: كما توزيع اوستيوكلاست في البئر نادراً ما متجانسة، أداء العد على العموم جيدا بدلاً من بعض المناطق المحددة. نظراً لأن الآكلة غير متجانسة في الشكل والحجم، الآلي لا عد الأسلوب خلية عمليا.
    1. افتح صورة الجامعة، حسنا في برنامج إيماجيج (لهذا التحليل، واستخدام الصور من القسم الفرعي السابق).
    2. فتح نافذة العداد الخلية: "الإضافات" ← "تحليل" ← "خلية العداد". انقر على "تهيئة" وإلغاء تحديد خانة الاختيار "اكتب 1" (أو أيا كان نوع الرقم الذي تفضله). تحقق من تحديد خانة الاختيار "إظهار عدد" وخانة "حذف الوضع" غير محدد.
    3. في الصورة، انقر فوق أحد اوستيوكلاست: النقطة الملونة وعدد ستظهر عند النقر فوقه. المضي قدما وعلى نحو مماثل للأكلة كافة. حفظ العلامات بانتظام عن طريق النقر على "حفظ علامات" في إطار مكافحة الخلية
      ملاحظة: إذا كان للنقطة الأخيرة المراد إزالتها من العد، انقر على "حذف" في إطار مكافحة الخلية. إذا كان هناك أكثر من نقطة واحدة لإزالة، حدد المربع "حذف الوضع" وتشير إلى جميع النقاط غير صالح عن طريق النقر عليها. ثم قم بإلغاء تحديد مربع "وضع حذف" الاستمرار في العد.
    4. عرض نتيجة العد عن طريق النقر على النتائج في إطار مكافحة الخلية. نقل نتائج الفرز النهائي لجدول بيانات.

6-تحليل الدالة اوستيوكلاست حضور U(VI)

  1. حفرة ارتشاف المقايسة.
    1. لوحة خلايا 264.7 الخام على لوحة الإنزيم osteo 24-جيدا، مما يوفر سطح أوستيوميميتيك غير عضوية اصطناعية التي يمكن أن تكون ريسوربيد بالأكلة.
      ملاحظة: بغية السماح للخلايا نعلق على السطح المحاكاة البيولوجية، فمن الأفضل للوحة لهم اليوم قبل إضافة متوسطة التمايز غالباً.
    2. تمييز الخلايا 246.7 الخام إلى الآكلة كما هو موضح في القسم 5 (الخطوات 5.1.2-5.1.4)
    3. في يوم 5 من أوستيوكلاستوجينيسيس، إزالة الآكلة من سطح العظم mimetic بالاستعاضة عن المتوسطة المحتوية على اليورانيل مع الحل التبييض 10%. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الآبار مرتين مع المياه والسماح لهم أيردري.
    4. إضافة حل ملح صوديوم الأليزارين الأحمر S 1% إلى الآبار وصمة عار أملاح الكالسيوم في المناطق غير ريسوربيد. إزالة الحل اليزارين بعد 10-15 ثانية للحضانة وتغسل برفق الآبار 3-4 مرات بالماء. أيردري الآبار.
      ملاحظة: تم تصميمه المصبوغة الإجراء الموضح أعلاه لتعزيز التباين بين ريسوربيد وفي المناطق غير ريسوربيد لتسهيل التحليل على التوالي. ويجب أن يتم هذا الإجراء بعناية لأنه إذا لم يجف تماما قبل تلطيخ الآبار، يمكن إزالة أجزاء من سطح العظم mimetic المتبقية بطريق الخطأ. وعلاوة على ذلك، إذا ترك حل اليزارين وقتاً طويلاً في الآبار، تلطيخ غير محددة الثابتة سوف تظهر. تجدر الإشارة إلى أن الاختبار الموصوفة في هذا المقطع يتعلق بتأثير اليورانيوم على التمايز أوستيوكلاستيك والدالة. لدراسة تأثير اليورانيوم على ارتشاف مستقل عن تشكيل اوستيوكلاست، يمكن علاج خلايا 264.7 الخام مع المحتوية على اليورانيل المتوسطة لمدة 24 ساعة، إلا عندما تتشكل الآكلة ناضجة (في يوم 4 أو 5 من عملية التمايز) 23.
  2. تحليل ارتشاف الحفرة.
    1. الحصول على صورة من السطح كله لكل بئر من لوحة الإنزيم osteo.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف أساليب اقتناء الصورة لكن ينبغي أن تكون متسقة في جميع أنحاء تكرار التجارب. يمكن أن تشمل صورة مأخوذة بهدف الكلي لكاميرا ثابتة، المسح الضوئي عالية الدقة أو صورة فسيفساء المصنوع مجهر الآلي عالية إنتاجية.
    2. يبدأ التحليل بتكرار الخطوات من 5.2.2 إلى 5.2.4 من المقطع السابق.
    3. تحويل صورة RGB إلى صيغة 8 بت اللون رمادي: "صورة" ← "النوع" ← "8 بت".
    4. في الإطار الرئيسي، حدد أداة التحديد البيضاوي. استخدامه لرسم دائرة تحدد جميع سطح البئر لتحليلها لارتشاف.
    5. حفظ هذا العائد على الاستثمار الجديد كما هو الحال في الخطوة 5.2.6.
    6. لتسهيل تحديد العتبة، امسح كافة الميزات خارج دوروا محددة: "تحرير" ← "واضحة في الخارج".
      ملاحظة: عند هذه النقطة، من الأفضل كثيرا ما جعل عدد قليل من النسخ من الصورة: قم بإلغاء تحديد العائد على الاستثمار بواسطة النقر فوق خارج المنطقة المحددة ← الحق انقر على الصورة ← "تكرار". وسيساعد هذا الإجراء تفادي تكرار الصورة المعاملة المذكورة أعلاه إذا كانت عتبة اختيارها في الخطوة التالية غير مرضية.
    7. حدد "صورة" ← "ضبط" ← "العتبة". في الإطار "العتبة"، استخدم شريط التمرير لاختيار عتبة مناسبة. يجب أن تكون أدنى من العتبة (أبيض) جميع المجالات ريسوربيد وغير ريسوربيد، أعلاه (أحمر). لوضع الصيغة النهائية لاختيار العتبة، انقر فوق "تطبيق" في إطار الحد الأدنى.
    8. حفظ الصورة الثنائية النهائية: "الملف" ← "حفظ باسم" ← شكل من اختيارك.
    9. تحديد المقاييس الواجب اتخاذها في المنطقة لمصلحة: "تحليل" ← "تعيين قياسات". في الإطار "تعيين قياسات"، تحقق من "المنطقة"، "منطقة الكسر" و "الحد الأقصى لعتبة" مربعات وإلغاء جميع الآخرين.
    10. من أجل الحصول على جزء منطقة "ريسوربيد" في إطار نتائج مباشرة، عكس الصورة الثنائية ("تحرير" ← "عكس"). تأكد من تحديد العائد على الاستثمار الرئيسية في الصورة النهائية ثنائي (خلاف ذلك كسر منطقة ريسوربيد ويتم احتساب استناداً إلى سطح نافذة الصورة كاملة). قياس المنطقة ريسوربيد الكسر أما عن طريق النقر فوق "التدبير" في إطار إدارة العائد على الاستثمار أو على "تحليل" ← "قياس". حفظ النتيجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز تلطيخ استخدمت لتصور الآكلة كخلايا الأرجواني كبيرة قد نوى 3 أو أكثر. الحصول على صور الممثل للأكلة من الخلايا 264.7 الخام مثقف حضور رانكل وأيونات اليورانيل يرد في الشكل 1. التغيرات في عدد وحجم الآكلة استجابة لليورانيوم مرئية بسهولة في الصور المركبة من الآبار كلها وفي صور الموسع.

وقد تم تحليل حجم الآكلة باستخدام برنامج إيماجيج (الشكل 2). واستخدمت لهذا الغرض، صور جيدا كل من فخ الملون الآكلة ويعاملون نفس المناطق في كل بئر من كل شرط الثقافة (الشكل 2A و 2D). حددت جميع الآكلة موجودة في كل منطقة (الشكل 2B و 2E) الذي يسمح بتحديد المنطقة (المعبر عنه في ميكرومتر2) (الشكل 2 و 2F). وتوضح الأمثلة هو مبين في الشكل 2 تأثير قوي من اليورانيوم في حجم اوستيوكلاست.

للتحقيق في تأثير اليورانيوم على نشاط ارتشاف اوستيوكلاست، مطلي بالخلايا 264.7 الخام والمتباينة على لوحة سطح أوستيوميميتيك. في نهاية المقايسة، أزيلت الآكلة. ثم سطح العظم mimetic في كل كان معاملة حسنة من ملح الصوديوم الأليزارين الأحمر S لوصمة عار غير ريسوربيد المنطقة والصور لكل أسرة تم الحصول عليها (الشكل 3 ألف و 3D). تم تجهيز الصور الناتجة مع البرمجيات "ي الصورة". فتم تحويلها في الصور 8 بت اللون الرمادي (الشكل 3B و 3E)، يتعرضون لمستوى العتبة (الشكل 3 و 3F) ومنطقة ريسوربيد (المناطق البيضاء) تم حسابها تلقائياً.

Figure 1
رقم 1: التصور لتأثير U(VI) على تشكيل اوستيوكلاست- كانت متمايزة خلايا 264.7 الخام حضور تركيز اليورانيل المشار إليه. في يوم 4، أنجز تلطيخ طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP). إظهار تمثيلاً جيدا كل ميكروجرافس (لوحات العلوي) الآكلة الملطخة بفخ التي تم الحصول عليها في مثل هذه الظروف. ترد أمثلة على الآكلة مولتينوكليتيد في مناطق محاصر بتكبير أعلى (الأسهم الموجودة في أسفل اللوحات). هذه الصور توضح تأثير الجرعة تعتمد على U(VI) على تشكيل اوستيوكلاست. تشير الأسهم الرأس الأسود إلى أمثلة من نوى اوستيوكلاست. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل لتأثير U(VI) على حجم اوستيوكلاست- (ألف و دال): تظهر الصور جيدا كل من الآكلة مع محاصر المنطقة المقابلة للمناطق التي اوستيوكلاست كان تحليل حجم. الأحمر مربعات المنطقة في (A و D) تقابل تلك هو موضح في (ب) و (ه)، على التوالي. (باء و هاء): يظهر الرسم اليدوي من حواف اوستيوكلاست في ظروف الاعتقال اليورانيل اثنين باللون الأزرق. (C و F): يؤدي windows من برامج إيماجيج عرض القياسات من التحليل (ب) و (ه) على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تحليل لتأثير U(VI) على دالة اوستيوكلاست- صور لسطح أوستيوميميتيك الملون اليزارين بعد ارتشاف أوستيوكلاستيك التي جرت في الغياب (A) أو بحضور 25 ميكرومتر من اليورانيل (د). تم تحويل الصور في (أ ود) أولاً في الصور 8 بت اللون الرمادي كما هو موضح في (باء و هاء)، وفي وقت لاحق، في صور ثنائية (C و F) بتطبيق إعداد عتبة مناسبة. واستخدمت هذه الصور الثنائية لحساب النسبة المئوية لمنطقة ريسوربيد في كل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وبقدر ما نعلم، هذا هو المرة الأولى التي يرد وصف لإجراءات مفصلة تهدف إلى دراسة تأثير اليورانيوم الطبيعي على عظم ريسوربينج الخلايا. هذا النهج سوف تكون مفيدة لتحقيق فهم أفضل لتأثير اليورانيوم على عظم علم وظائف الأعضاء وقد توفر أداة جديدة مثيرة لاهتمام لفحص اليورانيوم تشيلاتورس. وعلاوة على ذلك، نعتقد أنه يمكن تطبيق البروتوكول هو موضح هنا لدراسة تأثير المعادن الثقيلة الأخرى في أوستيوكلاتوجينيسيس.

ومن المعروف أن اليورانيل الرصاصية مع المكونات العضوية وغير العضوية في ثقافة وسائل الإعلام18،19،،من2021. تؤثر هذه كومبليكساتيونس انتواع اليورانيوم، وبهذه الطريقة، سيتوتوكسيسيتي به. ولهذا السبب، هو خطوة حاسمة في البروتوكول إعداد وسائط الثقافة التي تحتوي على اليورانيوم. وقد أظهرنا سابقا23 أن وجود الجنين المصل البقري 5% في المتوسط الثقافة الخلايا 264.7 الخام ليس أثر كبير على سيتوتوكسيسيتي اليورانيل عند استخدامها بتركيزات تتراوح من 0 إلى 400 ميكرون. هذا نقطة هامة، كما مطلوب وجود المصل في الأجل المتوسط لتحليل أثر التعرض لليورانيوم خلال العملية برمتها من التمايز أوستيوكلاستيك. ومع ذلك، نود أن نشدد على أنه يجب أن يتبع الإجراء المكون من مرحلتين طويلة تحضيرا للتعرض لوسائل الإعلام (6 ساعات) ووصف بعناية. في الواقع، شكلت خطوة الحضانة لمدة 3 ساعات بعد كل تمييع أملاح اليورانيل يتيح استقرار المجمعات اليورانيل يحتمل أن تكون في الحل قبل مواصلة تخفيف أو التعرض للخلية. وهذا مطلوب على الإطلاق للحصول على نتائج موثوقة واستنساخه.

معلمة هامة أخرى لإمكانية تكرار نتائج لفحوصات التمايز وارتشاف اوستيوكلاست هو كثافة الخام 264 بذر خلايا.7. وفي الواقع، قد ثبت أن كثافة السلائف وحيدات النوى عامل حاسم لتشكيل اوستيوكلاست، على الأرجح نظراً للقرب من خلية إلى خلية التأثيرات الخلوية الانصهار أحداث24. ولذلك، يجب إيلاء اهتمام خاص خلية العد، إعداد تعليق الخلوية والتجانس للبذر في كل بئر، وبغية تجنب سوء الفهم.

أداة العتبة مفيد لأتمتة عملية التحديد الكمي لارتشاف. تجدر الإشارة إلى أن هذا التحليل يتطلب صور مضاءة بشكل صحيح. مشكلة مشتركة بغض النظر عن نوع الكاميرا والصورة أسلوب اكتساب غير الإضاءة غير متكافئ على الحواف الصورة. وفي هذه الحالة، قد يلزم أسلوب متعدد خطوة عتبة.

وباختصار، أنشأنا قوية بروتوكول يسمح لدراسة تأثير اليورانيوم على تشكيل اوستيوكلاست والجدوى ووظيفتها. هذا الإجراء قد وضعت باستخدام خط الخلية 264.7 الخام ولكن ينطبق بالكامل على السلائف اوستيوكلاست نخاع العظام الأولية كما أظهرنا23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر Cros شانتال للمساعدة التقنية مفيدة.
تم تمويل هذا البحث من المنح المقدمة من "à مفوضية الطاقة الذرية et aux بدائل الطاقات" (أورانوس-دو توكسيكولوجي دي مستعرضاً برنامج سيا وكبرر سيا-شركة أريفا)، ومن وكالة الاستخبارات الوطنية (سمية من اليورانيوم: نهج متعدد المستويات من بيومينيراليزيشن عملية في العظم، ووكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE34-0003). وأيد هذا العمل أيضا جامعة نيس صوفيا انتيبوليس، ويزأر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51, (6), 755-771 (1986).
  3. Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57, (1), 17-21 (1989).
  4. Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110, (4), 337-342 (2002).
  5. Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67, (6), 589-610 (1994).
  6. Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25, (6), 1161-1175 (2012).
  7. Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236, (2), 123-130 (2015).
  8. Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159, (1), 1-8 (2016).
  9. Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
  10. Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276, (5310), 266-269 (1997).
  11. Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276, (5310), 270-273 (1997).
  12. Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91, (4), 1903-1914 (2017).
  13. Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54, (1), 17-23 (1991).
  14. Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79, (8), 475-481 (2005).
  15. Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113, (1), 68-72 (2005).
  16. Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
  17. Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22, (7), 975-983 (2007).
  18. Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18, (3), 180-187 (1999).
  19. Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17, (3), 446-452 (2004).
  20. Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252, (1-3), 26-32 (2008).
  21. Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250, (1), 62-69 (2008).
  22. Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. Oxford University Press. Oxford. (1999).
  23. Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861, (4), 715-726 (2017).
  24. Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics