培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法

Developmental Biology

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Summary

ウランは、骨代謝に影響を与える知られています。ここでは、担当骨細胞破骨細胞の機能や分化、生存率に及ぼす天然ウランの影響の調査を目的としたプロトコルを提案する.

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Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

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Abstract

骨生理学と干渉するウランが示されているし、この金属が骨に蓄積することは周知します。しかし、少しは天然ウランの骨細胞の挙動に及ぼす影響について知られています。特に、破骨細胞、細胞の骨基質の吸収のための責任のウランの影響は記載されていません。この問題を調べるためには、破骨細胞前駆体のモデルとして天然ウランのソースとマウスの未加工 264.7 のセル行酢酸ウランを使用して新しいプロトコルを定めています。ここで、破骨細胞の前駆物質のウランの細胞毒性をテストして、破骨細胞形成と破骨細胞の吸収機能にその影響を評価するために必要なすべてのアッセイを詳しく説明します。条件を開発した、特にウラン含有培地の調製および未加工 264.7 の播種細胞を信頼性が高く、高度生殖の結果を取得する許可。さらに、破骨細胞のサイズや堤吸収症マトリックスの割合など様々 なパラメーターの解析を容易にするソフトウェア ツールの使用を最適化します。

Introduction

ウランは天然に存在する放射性元素の土壌、空気、水の存在など、動物と人間は彼らの食事療法の自然なウランに公開されます。自然な源に加えてウランは環境の豊かさを高める人為的活動から起きる。ウランは化学と放射線の危険を引き起こします。ただしの場合 (これは同位体混合物含む 99.27 238U、0.72 235U、0.006 234U) 天然ウランは低特定活動 (25.103 Bq.g-1) があるのでその健康への影響に起因して、化学的毒性。

何その侵入経路 (吸入、摂取、または皮膚暴露)、ほとんど糞便と体内に侵入が排除されウランの小さい部分だけ全身循環に達する。血液中のウランの約 67% が腎臓によってフィルター処理順番と 24 h1尿中に肉体を離れます。残りは腎臓や骨、ウランの毒性2,3,4の 2 つの主なターゲット器官ほとんど堆積されています。探索するいくつかの研究が行われているスケルトンは、ウラン長期保持2,3,4,5,6のプライマリ サイトとして識別されている、ので、骨生理学7におよぼすウラン

骨は、その生涯を通じて継続的に改造は石灰化組織です。骨を改造する専門にされた細胞のタイプに依存し、ほとんどの 2 つのフェーズで構成されています複雑なプロセスである: 骨芽細胞による de novo 骨建設続いて既存の古い行列破骨細胞と骨吸収。破骨細胞は、8を骨に接続する吸収サイトに移行する原産の造血前駆細胞の融合から生じる大きな多核細胞です。愛着は、その骨格9の広汎な再編成と同時に発生します。この再編がセルとハイドロキシアパ タイトとの分解に関与するプロテアーゼの解散につながる陽子を分泌する破骨細胞を骨表面の間の分離されたコンパートメントの確立のために必要な有機マトリックス。結果として得られる劣化製品は貪食、骨表面の反対側膜領域にセルを経由、分泌、トランスサイトーシス10,11と呼ばれるプロセス。

体内体外の調査からの結果を示すウランが骨形成を阻害して数と骨芽細胞7,12の活動を変化させます。対照的に、骨と破骨細胞に及ぼすウランは不十分な検討しています。いくつかの生体内での研究は、マウスやラット13,14硝酸ウラニル投与後骨吸収の強化を報告しています。さらに、疫学的調査は、飲料水経由でウラン摂取量の増加が男性15の骨吸収マーカーの血清レベルの増加に関連付けられている傾向があることを提案しました。一緒に取られて、これらの調査結果は、ウランは、骨に蓄積することが骨吸収を促進する結論に至った。しかし、ウランのこの潜在的な影響に関与する細胞のメカニズムは、未解決の問題を残る。このため、骨細胞を吸収に及ぼすウランの影響を調べることにしました

ここでは、設けてプロトコルについて述べるを特徴付ける、前破骨細胞の生存率と破骨細胞分化と吸収活性天然ウランの影響を定量化します。未加工 264.7 変換されたマクロファージ細胞ライン、これは容易に破 4 または 5 日間のサイトカイン RANKL の存在下で培養した場合に区別できるし、古典的な研究に用いられる実験記載が行われています。破骨細胞の分化および機能の16。開発手順は、信頼性の高い、再現性の高い結果とは完全に主要な破骨細胞を対象に与えます。これらすべての理由から、この方法論が骨におけるウランの毒性に関与する分子メカニズムのより良い理解を得ることに有用であると考えています。さらに、このアプローチは新しいウランのキレート剤を特定するためのスクリーニング ツールとして適応できると考えています。

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Protocol

1. ウラニル酢酸溶液の調製

  1. 100 mM ウラニル酢酸溶液 2 mL を準備するには、追加の酢酸ウラニル (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; 85 mgM = 424 g.mol-1) 5 mL プラスチック チューブに固体状態で。
  2. プラスチック製のチューブに 2 mL の蒸留水を追加し、プラスチック ストッパー付き合います。
  3. 固体の総解散までチューブを積極的に振る。24 時間冷蔵庫に、ソリューションを配置します。
    注意: ウラニル [気] の操作は、いくつかの化学物質と放射線の危険性を提示します。すべてのサンプルを準備し、特定の研究室でアドホック装備特徴ください。すべての液体は U VI を含む具体的割り当てられた廃棄物容器で収集する必要があり、有毒廃棄物としています。乾燥廃棄物 (pipets、管、) は、0.1 N HNO3 ・ ソリューション、可溶化し、気を削除と洗浄できます。
  4. PH 電極・ pH メーターを使用して、ソリューションを確認してください。
    注: 電極校正必要がありますが以前商業緩衝溶液を使用して (pH = 4、pH = 7)。

2. 未加工 264.7 のセルの文化

  1. 細胞のメンテナンス。
    1. 次の成長媒体で 75 cm2フラスコで未加工 264.7 のセル (ATCC、TIB 71) を養う: ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 5% ウシ胎児血清と抗生物質を添加した: 100 IU/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン。37 ° c、5% CO2インキュベーターで細胞を維持します。
    2. すべての 2 〜 3 日中を変更します。セルが 85-90% の合流と、機械的に (、ATCC が推奨) 細胞スクレーパーを使用して培養用フラスコからそれらを削除し、1:6 の比率でそれらを分割します。
      注: 分化実験用通路 10 に 3 間のセルのみ。
  2. 実験用セルの作製
    1. 前述のようにフラスコ基板からセルをずらすし、滅菌の 50 mL チューブに転送。群生を分割するため、上下ピペッティングにより細胞をミックスします。診断とのそれらを数えます。75 cm2フラスコあたり 3500 万セルを期待してください。
    2. 細胞懸濁液各実験に必要な量を次のように計算します。
      実験の数は、1 mL/井戸 + 3-4 mL (ピペッティング損失) x x 3 (トリプリケート) 条件します。
      注: 播種密度はこのプロトコルで記述されているすべてのアッセイには 5,000 のセル/cm2です。したがって、24 ウェル プレートのウェル中、1 ml あたりの 10,000 のセルを意味し、つまり、細胞懸濁液密度 10,000 細胞/mL。
    3. 10,000 mL の細胞/細胞懸濁液に必要な量を準備し、24 ウェル プレートに細胞を播きます。細胞毒性の試金、通常成長培地を使用します。差別化と吸収の試金、使用アルファ変更最小必須培地 (アルファ MEM) 2 mM 5 L グルタミンを添加した %fbs と GST RANKL1750 ng/mL。
      注: GST RANKL 社内に産生される蛋白はすべて市販の RANKL サイトカインによって置き換えることができます。新しい RANKL バッチを操作する場合は、RANKL 濃度 150 ng/mL 20 からまでの線量応答の実験を実行することにより破骨細胞形成を誘導でその有効性をテストすると便利場合があります。

3. 培地の 100 mM ウラニル酢酸溶液の希釈

注: 培養液中でウラニル イオン [気] は、その細胞毒性18,19,20,21を変更できる他の媒体のコンポーネントと複数の複合体を形成します。このため、ウランを含むメディアは、省略または平衡の手順を短縮せず即席準備されるべき。

  1. 選んだウラニル暴露濃度と培地 (各条件が 3 通で実行されることを考慮して) 実験に必要な量を計算します。
  2. 無菌培養から始まってテスト 7.5% 炭酸水素ナトリウム水溶液 ([HCO3-] = 893 mM)、100 mM HCO3-水溶液の水を準備し、氷で冷やします。
  3. 混合管を軽く振って、冷えた 100 mM HCO3-ソリューションの 9 つの容積にウラニル酢酸 100 mM ストック溶液の滴ずつ 1 ボリュームを追加します。この操作は、酢酸ウラニル原液を希釈する ([UO2+ 2] = 100 mM、pH 4) 10 mm 約 7 の pH をもたらすと。
  4. 90 mM HCO3- (10 mM ウラニル溶液中 HCO3-濃度に等しい)、コントロールを準備するなるまで冷えた 100 mM HCO3-ソリューションの 9 つの容積に滅菌水の 1 ボリュームを追加します。媒体。
  5. 平衡のため室内の温度 (RT) で 3 時間のために立つ準備ができてソリューションを許可します。
  6. 一方で、基本的な露出メディアの準備: 2 mM L グルタミンと 5% アルファ MEM FBS。
    注: 差別化と吸収の試金、基本的な露出媒体に GST RANKL の 50 ng/mL を追加します。
  7. 3 h 後 10 mM ウラニル溶液濃度の作業目的ウラニルを達成するために露光中に一滴ずつ適量を希釈します。露出中に最も濃縮されたウラン処理条件で使用される重炭酸塩の量を追加することによって制御媒体を同時に準備します。
  8. 平衡の RT で 3 h のスタンドに準備されたメディアを許可します。
  9. 井戸から成長媒体を外し、ウラニウムを含むメディア コントロールに置き換え。

4. 剤 (MTT の細胞毒性の試金) 存在下で RAW 264.7 前駆体性解析

注意: 両方 MTT と DMSO が肌を引き起こす、目の炎症。それらを処理するときは、手袋、眼の保護を着用します。具体的に割り当てられた廃棄物容器に廃棄物を収集します。

  1. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) 粉末 5 mg/mL で 10 倍原液を取得する PBS の適切な量を解散します。0.22 μ m フィルターでろ過によってそれを殺菌し、-20 ° C で因数を格納
  2. プレート 24 ウェル プレート (プレートごと実験条件あたり 3 井戸) にセルです。分光光度計のブランクのプレートごと 3 空井戸を確保することを忘れないでください。
  3. 細胞細胞を添付させるウラン露出前に 22-24 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  4. セクション 3 で説明したようにウランを含むメディアを準備します。
  5. ウラン含有細胞播種板の成長培地を交換メディア。24 時間インキュベートします。
  6. 1 x MTT ソリューションに必要な量を次のように計算します。
    (実験条件 + 空白の数) x 0.4 mL/井戸 + ピペッティング損失 10% ボリューム (トリプリケート) x 3。
  7. 希釈原液 MTT でワシの最小必須培地 (実装された EMEM) フェノールレッドなし x 10 1 x MTT ソリューションの必要量を準備します。
    注: 成功した比色定量法の MTT は、光から保護されるべきです。バック グラウンド信号を制限するために実装された EMEM よりもむしろ DMEM に MTT を希釈することをお勧めします。
  8. 井戸からウランを含むメディアを削除、PBS で洗浄し、MTT 溶液 400 μ L を各ウェル (空白の 3 空井戸を含む) に追加します。暗闇の中で 37 ° C で 2.5 時間孵化させなさい。顕微鏡下で、実行可能な細胞内暗い紫塩結晶を形成していることを確認します。
  9. MTT 液を捨て、ジメチルスルホキシド (DMSO) ウェルあたりの 220 μ L を追加します。光から身を守る、塩の結晶を溶解する 10 分間振とうしアルミ箔でプレートをラップします。
  10. マイクロ プレート分光器リーダーを使用し、570 の光学濃度 (OD) nm (特定の塩) と 690 nm (背景)。各ウェルの傷や濁り22による可能な非固有 OD 値変動を調整するための 570 nm OD から 690 nm OD を減算します。
  11. 前の手順で取得した OD から空白の平均外径を差し引くことによって各ウェルの空白修正外径を計算します。各実験条件の OD 値平均値を決定します。
  12. コントロール状態の平均外径を設定 ([UO2+ 2] = 0 mM) 100% 生存能力をテストのウラン濃度の細胞生存率の対応する割合を計算します。用量反応曲線をプロットします。細胞毒性指数 50 (CI50) 24 h 放置後 50% 細胞死につながるウラン濃度として定義を評価します。

5. 剤存在下での破骨細胞分化の解析

  1. ウラニルおよびトラップの存在下で細胞未加工 264.7 の分化 (酒石酸-抵抗力がある酸のホスファターゼ) 染色します。
    1. プレート未加工 264.7 のセル 24 ウェル プレートの 1 つの実験条件 3 の井戸。約 6 h の 37 ° C で準備し、ウラニウムを含む露出メディアを平衡時間。
    2. 必要なウラン濃度 (GST RANKL をメディアに追加することを忘れないでください) 3 で説明したように分化メディアを準備します。
    3. 優しくウラン含有井戸の基本培地を交換中。この日は、破骨細胞分化の日 0 と見なされます。
    4. 5.1.2 と 5.1.3 の手順を繰り返して、2 または 3 の破骨細胞分化の日に媒体を変更します。多核巨細胞の破骨細胞が 3、4 日間表示されます。
    5. 製造元の指示に従って市販白血球酸性ホスファターゼ キット染色トラップを実行します。
      注: 酒石酸-耐性酸フォスファターゼ (TRAP) 酸性ホスファターゼ 5、酒石酸耐性 (ACP5) とも呼ばれますは破骨細胞で高発現して、破骨細胞分化のマーカーとして広く用いられます。そのため、トラップの染色が破骨細胞を可視化する実行されます。実験条件は、破骨細胞形成の率によって 4 日または分化過程の 5 日目に出来る。
    6. (彼らは 3 または 4 週までこれらの条件で維持できる) それ以上の分析のための 4 ° C で PBS でトラップ ステンドの井戸を保ちます。
  2. 破骨細胞サイズ/形態解析。
    1. 各ウェルの表面全体のイメージを取得します。画像の解像度は、細胞核を区別するために十分なはずです。破骨細胞として 3 つ以上の核の TRAP 陽性細胞を検討してください。
    2. ImageJ のソフトウェアで 1 つの井戸の画像を開く:「ファイル」→「開く」.
    3. イメージの左上隅のスケール単位を確認します。相対的な定量化のため任意の単位を使用できます。破骨細胞サイズの絶対値が必要な場合、単位を μ m に変換:「画像」→「プロパティ」.新しいスケール単位を後で開いたすべての画像に適用するためにポップアップ ウィンドウで「グローバル」ボックスを確認します。
      注: 顕微鏡は、画像の取得に使用された、μ m のピクセル サイズがイメージング ソフトウェアの各目的のために示されます。
    4. 分析する測定パラメーターを指定:「分析する」→「設定の測定」.測定の設定」ウィンドウで「領域」と「表示ラベル」ボックスをオンして他すべてオフにボックス。
    5. 投資収益率 (興味の地域) マネージャーを開く:「分析」→「ツール」→「ROI マネージャー」。
    6. メイン ウィンドウの [長方形選択ツールを選択します。どこにでも使用画像約 1,000 x 1,000 μ m の部門の概要を説明します。今すぐこの選択は、サイズの分析する破骨細胞の最初の領域を定義します。
    7. ROI マネージャー] ウィンドウで、この関心領域を ROI マネージャーに追加し、「より」→「保存」をクリックして保存する「追加」ボタンをクリックします。保存済みの投資収益率が今再読み込みする ROI マネージャーにいつでも「詳細」→「開く」をクリックして。
    8. 手順 5.2.5 - 5.2.6 破骨細胞サイズ分析 4 追加領域を定義する (図 2 a 2 D)。
      注: 定義された領域は、すべてのイメージの破骨細胞サイズを分析する使用されます。
    9. 分析する 5 つの地域の 1 つのコピーを作成: (対応する選択項目は、メインのイメージ表示されます) ROI マネージャー メインでこの ROI を選択 → 右クリック選択 →「重複」内。詳細な分析のためこの複製を使用します。
    10. ROI マネージャー ウィンドウで、チェック ボックス"を示す Al"l「ラベル」。
    11. メイン ウィンドウで手動で選択範囲で破骨細胞の 1 つのアウトラインを作成する多角形選択ツールを選択します。ROI マネージャー] ウィンドウで「追加」をクリックして、ROI マネージャーにこのアウトラインを追加します。選択した領域内に完全にあるすべての破骨細胞の同様に進みます (図 2 b 2 e)。
    12. ROI マネージャー ウィンドウですべてのアウトラインを選択し、「測定」をクリックしてその表面を測定します。新しいウィンドウ (結果ウィンドウ、図 2および2 階) で登場している測定値をスプレッドシートに転送します。
      注: この時点で、すべての破骨細胞のアウトライン解析の領域として保存できます独立した画像:「ファイル」→「名前を付けて保存」形式選択の。
    13. 5.2.8 - 5.2.12 現在画像の解析の残りの地域のための手順を繰り返します。その後、他のすべてのイメージの全体の手順を繰り返します。
  3. ImageJ ソフトウェアと破骨細胞数の解析。
    注: 井戸における破骨細胞分布はほとんど均質なため、いくつかの選択されたゾーンではなく、全体的にカウントを実行します。破骨細胞が不均一な形やサイズ、ない自動計数セル法実用向きです。
    1. (この分析は前節からイメージを使用) ImageJ ソフトウェアで全体もイメージを開きます。
    2. 細胞カウンター ウィンドウを開きます:「プラグイン」→「分析」→「カウンター」.「初期化」と「タイプ 1」] チェック ボックスをクリックして (またはあなたが好む番号を入力)。「番号を表示」チェック ボックスをオン、「削除モード」ボックスがチェックされていないことを確認します。
    3. 1 つの破骨細胞をクリックして画像の上: 色付きの点と番号をクリックした場所が表示されます。進み、同様にすべての破骨細胞の。細胞カウンター] ウィンドウで「保存マーカー」をクリックしてしてマーカーを定期的に保存します。
      注: 最後のポイントにカウントから削除するがある場合は、セル カウンター] ウィンドウで「削除」をクリックします。削除する 1 つ以上のポイントがある場合は、「削除モード」ボックスをチェックして、それらをクリックしてしてすべての無効なポイントを示します。その後、カウントを続行する「削除モード」チェック ボックスををオフします。
    4. 結果セル カウンター] ウィンドウでをクリックしてカウントの結果を表示します。最終のカウント結果をスプレッドシートに転送します。

6. 剤存在下での破骨細胞機能の解析

  1. ピット吸収試金。
    1. 24 よく骨にプレート未加工 264.7 のセル アッセイ用プレートは、破骨細胞によって吸収されることができる合成無機 osteomimetic サーフェイスを提供します。
      注: 細胞生物模倣型面にアタッチするために、それはしばしばそれらの分化培地を追加する前に日をプレートにより良い。
    2. セクション 5 (手順 5.1.2 - 5.1.4) で説明した破骨細胞分化生 246.7 セル
    3. 破骨細胞形成の 5 日、ウラン含有培地を 10% の漂白剤のソリューションに置き換えることによって骨のバイオミメティック表面から破骨細胞を削除します。室温で 5 分間インキュベートします。脱イオン水で 2 回洗浄し、それら空気乾燥します。
    4. 非吸収エリアのカルシウム塩を染色する井戸に 1% アリザリン赤 S ナトリウム塩溶液を追加します。インキュベーションの 10-15 秒後アリザリン ソリューションを取り外し、水洗いして水に井戸を 3-4 回。井戸が空気乾燥させてください。
      注: 上記の染色手順は連続分析を容易にするため、堤吸収症と非吸収領域の間のコントラストを高めるためです。残り骨バイオミメティック表面の部分が誤って削除場合は染色前に井戸が完全に乾燥は、ので、この手順を慎重に行う必要があります。また、アリザリン ソリューションが井戸に余りに長く残っている永続的な非特異的染色は表示されます。このセクションで説明されているテストは、破骨細胞の分化と機能におよぼすウランに関連していることに注意してください。破骨細胞形成とは関係なく吸収におよぼすウランを勉強する、ウラン含有未加工 264.7 のセルを扱うことができる (日 4 または 5 分化過程の) 成熟破骨細胞が形成される 1 回だけ 24 時間中23
  2. ピット吸収分析。
    1. 骨アッセイ プレートの各ウェルの表面全体のイメージを取得します。
      注意: 画像取得方法は変わることができるが複製実験で一貫する必要があります。彼らは、固定カメラ、高解像度のスキャンまたは自動化されたハイスループット顕微鏡で作られたモザイク画像のマクロ目的で撮影した画像を含めることができます。
    2. 5.2.2 に 5.2.4 前のセクションからの手順を繰り返すことによって分析を開始します。
    3. RGB イメージをグレースケール 8 ビットの形式に変換する:「画像」→「入力」→「8 ビット」。
    4. メイン ウィンドウの [楕円形選択ツールを選択します。円の吸収を分析するためにもすべてのサーフェスのアウトラインを描画するのにには、それを使用します。
    5. 5.2.6 のステップのようにこの新しい ROI を保存します。
    6. しきい値の選択を容易にするために定義された ROI 外のすべての機能をオフに:「編集」→「外」をオフにします。
      注: この時点で、それはしばしば画像のいくつかのコピーをするが良い: ROI イメージ →「重複」に選択したゾーン → 右クリックの外をクリックしてして選択を解除します。このアクションは、次の手順で選択したしきい値が満足でない場合、上記画像処理の繰り返しを避けるために役立ちます。
    7. 「画像」→「調整」→「しきい値」を選択します。[しきい値] ウィンドウで、適切なしきい値を選択するのにスライダー バーを使用します。堤吸収症全域 (白) のしきい値を下回る必要があります (赤) 上記以外の吸収、.しきい値選択を確定するには、[しきい値] ウィンドウの「適用」をクリックします。
    8. 最終的なバイナリ イメージを保存する:「ファイル」→「名前を付けて保存」→ 形式お好みの。
    9. 関心領域の取られる測定の定義:「分析する」→「設定の測定」.設定測定ウィンドウで"Area"、「面積率」と「制限のしきい値」ボックスをチェックし、他のすべてをオフに。
    10. 結果ウィンドウで直接「堤吸収症」領域一部を取得するために (「編集」→「反転」) バイナリ イメージを反転します。主な投資収益率が最終的なバイナリ イメージに選択されていることを確認 (そうでなければ堤吸収症面積率に基づいて計算されます全体画像ウィンドウの表面に)。メジャー堤吸収症面積分率がいずれかでクリックすると「測定」ROI マネージャー] ウィンドウで、「分析」→「メジャー」。結果を保存します。

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Representative Results

酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ染色は、3 つ以上の核を持つ紫色の大型の細胞と破骨細胞を可視化する使用されました。RANKL の存在下で培養した未加工 264.7 のセルから取得した破骨細胞の代表的な画像とウラニル イオンは図 1に示します。ウランへの応答で破骨細胞の数とサイズの変更は、全体の井戸の複合画像と拡大写真で簡単に表示されます。

破骨細胞の大きさは、ImageJ ソフトウェア (図 2) を使用してによって分析されました。この目的のためトラップの破骨細胞を染色の全体も画像が使用され、各培養条件の扱われた同じ地域 (図 2 a 2 D)。輪郭を描かれた各領域内に存在すべて破骨細胞 (図 2 b 2 e) (μ m2で表される) 彼らの領域の定量を可能にした (図 2 2 階)。図 2に示す例は、破骨細胞の大きさのウランの強力な効果を示しています。

破骨吸収能のウランの影響を調べるためには、未加工 264.7 のセルはメッキされ osteomimetic 定盤に区別されます。分析の終わりに、破骨細胞が削除されました。骨擬態の表面ではなく非吸収領域を染色するためのアリザリン赤 S ナトリウム塩によって扱われたし、それぞれ全体のイメージにも買収された (図 3 a 3 D)。結果の写真は、イメージ J ソフトウェアで処理しました。これらの 8 ビットのグレースケール画像に変換された (図 3 b そして3E) しきい値をうける (図 3 3 f) と堤吸収症領域 (白い部分) が自動的に計算されます。

Figure 1
図 1: 気の破骨細胞形成に及ぼす影響の可視化します。未加工 264.7 のセルは、示されているウラン濃度の存在下で分化しました。4 日目で酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) 染色を行った。代表全体も顕微鏡 (上部パネル) は、これらの条件で得られたトラップ ステンド破骨細胞を示しています。高倍率 (最下部のパネルで矢印) でのボックス エリアに多核巨細胞の破骨細胞の例を示します。これらの写真は、破骨細胞形成の剤の用量依存的効果を示しています。頭の黒い矢印は、破骨細胞核の例を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 破骨細胞サイズ剤の効果の分析。(AD): サイズの分析する破骨細胞の領域に対応するボックス化された領域と破骨細胞の全体も画像が表示されます。赤ボックス領域 (A と D) に示したものと対応の (B) および (E)、それぞれ。(BおよびE): 2 つのウラン濃度条件で破骨細胞の端の手描きが青で表示されています。(CおよびF): (B および E) の分析からの測定値のそれぞれを示す ImageJ ソフトウェアから windows の結果します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 気が破骨細胞の機能に及ぼす影響の解析。アリザリン染色 osteomimetic 表面吸収がない場合は (A) または 25 μ M ウラニル (D) の存在下で行われた後の画像。(BおよびE) のように (AD) 写真はまず 8 ビット グレースケール画像に変換されましたし、その後、適切なしきい値を適用することによってバイナリ イメージ (CおよびF)。これらのバイナリ画像は各条件の吸収領域のパーセンテージを計算する使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

我々 の知る限り、これは天然ウランの骨細胞に及ぼす影響を研究することを目指して詳細な手順が記載されている最初の時間です。この方法は骨生理学へのウランの影響のより良い理解を達成するために役に立つでしょう、ウランのキレート剤のスクリーニングのため興味深い新しいツールを提供することがあります。さらに、ここで説明されているプロトコル可能性があります osteoclatogenesis に他の重金属の影響の研究に適用することと考えています。

そのウラニルは文化メディア18,19,20,21無機・有機成分との複合体といわれます。これらの複合体形成ウランと、このようにして、その細胞毒性の種分化に影響を与えます。このため、プロトコルの重要なステップは、ウラン含有培地の準備です。私たちは以前23ウラン濃度 0 から 400 μ M の範囲で使用する場合の細胞毒性に重大な影響を持っていた未加工 264.7 のセルの培地の 5% ウシ胎児血清の存在を示しています。これは、培地の血清の存在する破骨細胞分化のプロセス全体の中にウラン暴露の影響を分析する必要は重要なポイントです。それにもかかわらず、我々 はメディア露出 (6 時間) の準備のため長いの 2 段階の手順を慎重に従う必要を強調したいと思います。確かに、ウラニル塩の各希釈によりウラニル錯体の安定化、潜在的から 3 時間の潜伏ステップは、さらに希釈またはセルの露出前に、ソリューションに形成されました。これ絶対に信頼性が高く、再現性のある結果を得るために必要です。

破骨細胞分化と骨吸収測定法の再現性のもう一つの重要なパラメーターです RAW 264 の播種密度.7 細胞。確かに、単核球前駆体密度が破骨細胞形成のための重要な決定要因おそらく細胞に近い細胞融合イベント24に影響するのでそれが示されています。したがって、セルのカウント、細胞懸濁液調製と誤解を避けるために各ウェル内シードの均質性に特に注意をいただきます。

しきい値ツールは吸収の定量化を自動化するために役立ちます。この分析と指摘価値が正しく点灯イメージが必要です。ただし、カメラと画像集録メソッドの種類に関係なく共通の問題は、イメージのエッジに不均一な照明です。その場合は、複数のステップのしきい値選定法必要があります。

要約すると、破骨細胞形成・生存率・関数へのウランの影響の研究を許可する堅牢なプロトコルを定めています。この手順は未加工 264.7 のセルの行を使用して開発されていますが、23を示している我々 は、プライマリ骨髄破骨細胞前駆細胞に十分に対応。

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Disclosures

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Acknowledgments

著者は、役に立つのテクニカル サポートにシャンタル Cro を感謝したいです。
この研究はからの補助金によって賄われていた、「兵站 à l'Energie Atomique et aux エネルギー代替"(URANOs - プログラム トランスバーサル ・ デ ・ Toxicologie ・ デュ ・ CEA と CPRR CEA アレバ)、ANR から (ウランの毒性: バイオミネラリゼーション マルチレベルのアプローチ骨、ANR-16-CE34-0003 で処理)。この作品は、CNRS ニース ・ ソフィア ・ アンティポリ大学によっても支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

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References

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