Metoder for å analysere konsekvensene av uran på In Vitro Osteoclastogenesis

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Uran er kjent for å påvirke bein metabolisme. Her presenterer vi en protokoll å undersøke effekten av uran eksponering på levedyktigheten differensiering og funksjonen til osteoklast cellene for benresorpsjon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uran har blitt vist å påvirke bein fysiologi og det er godt etablert at dette metallet akkumuleres i bein. Men er lite kjent om effekten av uran på oppførselen til beinet cellene. Spesielt er virkningen av uran på osteoklast celler ansvarlig for benresorpsjon av bein matrix, ikke dokumentert. For å undersøke dette problemet, har vi etablert en ny protokoll med uranyl acetate som en kilde til uran og murine rå 264.7 celle linje som modell av osteoclast prekursorer. Her, detaljerte vi alle analyser nødvendig å teste uran cytotoksisitet på osteoclast prekursorer og vurdere virkningen på osteoclastogenesis og resorbing funksjonen av eldre osteoklast. Forholdene vi har utviklet, spesielt for utarbeidelsen av uranyl inneholder kultur medier og såing av rå 264.7 celler kan oppnå pålitelig og svært reproduktive resultater. Dessuten, vi har optimalisert bruk av programvareverktøy for å forenkle analysen av ulike parametere som størrelsen på osteoklast eller andelen resorbed matrise.

Introduction

Uran er et naturlig forekommende radioaktivt element finnes i jord, luft og vann. som sådan, er dyr og mennesker utsatt for uran i sine dietter. I tillegg til naturlige kilder kommer uran fra menneskelige aktiviteter, noe som øker sin overflod i miljøet. Uran utgjør både kjemiske og radiologiske farer. Men fordi uran (som er en isotopanrikning blanding med 99.27% 238U, 0.72% 235U og 0.006% 234U) har en lav bestemt aktivitet (25.103 Bq.g-1), er dens virkninger på helse knyttet til sin kjemiske giftighet.

Hva oppføring ruten (innånding, inntak eller dermal eksponering), mest uran inn i kroppen er eliminert med avføring og bare en liten del når systemisk sirkulasjon. Omtrent 67% av uran i blodet filtreres igjen av nyrene og forlater kroppen i urin innen 24 h1. Resten er stort sett satt i nyrer og bein, to hovedmål organer uran toksisitet2,3,4. Fordi skjelettet har blitt identifisert som det primære området uran langsiktig oppbevaring2,3,4,5,6, flere studier har vært gjennomført for å utforske den effekten av uran på bein fysiologi7.

Bone er en mineralholdig vev som er kontinuerlig remodeled gjennom hele levetiden. Ubalanse er en komplisert prosess som er avhengig av spesialiserte celletyper og består hovedsakelig av to faser: benresorpsjon av eksisterende gamle matrix av osteoklast etterfulgt av de novo bein konstruksjon av osteoblasts. Osteoklast er store multinuclear celler fra fusjon av precursor celler blodkreft opprinnelsesland overføre benresorpsjon områder hvor de legger til bein8. Deres vedlegg oppstår samtidig med en omfattende omorganisering av deres cytoskjelett9. Denne omorganiseringen er nødvendig for etablering av en isolert rom mellom cellen og bein overflaten som osteoclast utskiller protoner, førte til oppløsningen av hydroxyapatite og proteaser involvert i nedbrytning av det organisk matrise. De resulterende nedbrytningsprodukter er endocytosed, transporteres gjennom cellen membran området motsatt bein overflaten og utskilles, en prosess som kalles transcytosis10,11.

Resultater fra vivo og i vitro studier viser at uran hemmer bein dannelse og endrer nummeret og aktiviteten til osteoblasts7,12. Derimot har effekten av uran på benresorpsjon og osteoklast blitt dårlig utforsket. Flere i vivo studier har rapportert en forbedring av benresorpsjon etter administrasjon av uranyl nitrat mus eller rotter13,14. Videre foreslo en epidemiologiske undersøkelse at økningen i uran inntak via drikkevann tendens til å være forbundet med en økning i serum nivået av en bein benresorpsjon markør i menn15. Sammen disse funnene førte til konklusjonen at uran, som akkumuleres i bein kan fremme benresorpsjon. Imidlertid fortsatt de cellulære mekanismene involvert i potensielle effekten av uran et åpent spørsmål. Av denne grunn besluttet vi å undersøke virkningen av uran på oppførselen til resorbing beinet cellene.

Her beskriver vi protokollen har vi etablert å beskrive og kvantifisere effekten av uran på pre osteoklast levedyktighet og osteoklast differensiering og resorptive aktivitet. Eksperimentene beskrevet her har blitt gjort med rå 264.7 murint transformert macrophage cellen linje, som lett kan skille ut osteoklast når kultivert i nærvær av cytokin RANKL for 4 eller 5 dager, og som brukes til å studere klassisk osteoclast differensiering og funksjonen16. Prosedyrene utviklet er pålitelig, gir svært reproduserbar resultater og er fullt gjelder primære osteoklast. For alle disse grunner tror vi at denne metoden er nyttig for å få en bedre forståelse av molekylære mekanismer involvert i uran toksisitet i bein. Dessuten, vi tror at denne tilnærmingen kan være som en screening verktøyet for å identifisere nye uran chelaterande agenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av Uranyl Acetate løsning

  1. For å forberede 2 mL av en 100 mM uranyl acetate løsning, legger du til 85 mg uranyl acetate (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) solid tilstanden til et 5 mL plastrør.
  2. Legg 2 mL destillert vann til plast røret og passer det med en plast stopper.
  3. Rist røret kraftig til total oppløsning solid. Sette løsningen i kjøleskapet i 24 timer.
    FORSIKTIG: Manipulering av uranyl [U(VI)] presenterer noen kjemiske og radiologiske farer. Alle prøvene bør være forberedt og preget med adhoc utstyr i bestemte laboratorier. Alle U VI inneholder væske skal være samlet i spesielt tildelt avfall beholdere og avhendes som giftig avfall. Tørr avfall (Pipetter for flergangsbruk, rør, etc.) kan vaskes med 0,1 N HNO3 løsning, som vil solubilize og fjerne U(VI).
  4. Kontroller pH av løsningen med en microelectrode og en pH-meter.
    Merk: Microelectrode bør tidligere kalibreres med kommersiell buffer løsninger (pH = 4 og pH = 7).

2. rå 264.7 cellekultur

  1. Vedlikehold av cellene.
    1. Dyrke rå 264.7 celler (ATCC, TIB-71) i 75 cm2 flasker i følgende vekst medium: Dulbecco modifiserte Eagle's medium (DMEM) med 5% fosterets Bovine Serum og antibiotika: 100 IU/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin. Vedlikeholde celler i inkubator på 37 ° C, 5% CO2.
    2. Endre medium hver 2-3 dager. Når cellene er 85-90% confluent, mekanisk fjernes fra kultur kolbe bruke celle skraper (som anbefalt av ATCC) og dele dem i forholdet 1:6.
      Merk: bare celler mellom avsnitt 3 til 10 brukes for differensiering eksperimenter.
  2. Utarbeidelse av cellene for eksperimenter
    1. Fjerne celler fra kolbe underlaget som beskrevet ovenfor og overføre dem til en steril 50 mL tube. Bland celler ved pipettering opp og ned for å bryte opp klumper. Telle dem med en hemocytometer. Forvent 35-40 millioner celler per 75 cm2 kolbe.
    2. Beregn antall celler suspensjon nødvendig for hvert eksperiment som følger:
      Antall eksperimentelle forhold x 3 (triplicates) x 1 mL/vel + 3-4 mL (pipettering tap).
      Merk: Seeding tettheten for alle analyser som beskrevet i denne protokollen er 5000 cellen/cm2. Derfor for en 24-vel plate, betyr det 10.000 celler per brønn i 1 mL av medium, og cellen suspensjon tetthet er dermed 10.000 celler/mL.
    3. Forbered nødvendig mengde 10 000 celler/mL celle suspensjon og frø cellene i 24-vel platene. For cytotoksisitet analyser, bruke normal vekst medium. Differensiering og benresorpsjon analyser, bruk alpha endret Minimum viktig Medium (αMEM) med 2 mM L-glutamin, 5% FBS og 50 ng/mL GST-RANKL17.
      Merk: GST-RANKL protein som produseres internt kan erstattes av en kommersielt tilgjengelig RANKL cytokin. Når du arbeider med en ny RANKL-gruppe, kan det være nyttig å teste effektiviteten i inducing osteoclastogenesis ved å utføre en dose svar eksperiment med RANKL konsentrasjon varierer mellom 20 150 ng/mL.

3. fortynning av 100 mM Uranyl Acetate løsningen i kultur Medium

Merk: Uranyl ioner [U(VI)] i kultur medium danner flere komplekser med andre mellomstore komponenter som kunne endre sine mobilnettet toksisitet18,19,20,21. Derfor bør uranyl inneholder medier være forberedt bevisst uten å utelate eller forkorte balanse trinnene.

  1. Valgte uranyl eksponering konsentrasjoner og beregne mengder kultur medier kreves for eksperimentet (tatt i betraktning at hver tilstand er utført i tre eksemplarer).
  2. Starter fra den sterile cellekultur testet 7,5% natrium bikarbonat vandig løsning ([HCO3-] = 893 mM), forberede en 100 mM HCO3- løsning i vann og Avkjøl på is.
  3. Legge til 1 dråpe for dråpe-volum av uranyl acetate 100 mM lagerløsning 9 volumer av iskalde 100 mM HCO3- løsning, forsiktig risting blande røret. Denne operasjonen vil utvanne uranyl acetate lagerløsning ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) 10 mm og bringe pH rundt 7.
  4. Legge 1 volumet av sterilt vann til 9 mengder iskald 100 mM HCO3- -løsning å nå 90 mM HCO3- (lik HCO3- konsentrasjon i 10 mM uranyl løsningen), som vil tjene til å forberede kontrollen medium.
  5. Tillate forberedt løsninger å stå for 3t ved romtemperatur (RT) for balanse.
  6. I mellomtiden forbereder grunnleggende eksponering mediet: αMEM med 2 mM L-glutamin og 5% FBS.
    Merk: For differensiering og benresorpsjon analyser, kan du legge til 50 ng/mL av GST-RANKL til grunnleggende eksponering medium.
  7. Etter 3 h, fortynne passende mengder av 10 mM uranyl løsningen dråpe for dråpe i eksponering medium for å oppnå den ønskede uranyl arbeider konsentrasjoner. Forberede samtidig kontroll medium ved å legge mengden av bikarbonat mest konsentrerte uranyl-behandlet datatabellgruppen, til eksponering medium.
  8. Tillate forberedt media å stå for 3t på RT for balanse.
  9. Fjern vekst medier fra brønnene og erstatte den med kontroll og uranyl som inneholder mediet.

4. analyse av rå 264.7 forløpere levedyktighet i nærvær av U(VI) (MTT cytotoksiske analyser)

FORSIKTIG: Både MTT og DMSO kan føre til hud og forårsake. Bruke hansker og vernebriller ved håndtering av dem.. Samle avfallsstoffer spesielt tildelt avfall beholdere.

  1. Oppløse en passende mengde 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) pulver i PBS å få en 10 x lagerløsning på 5 mg/mL. Steriliseres ved filtrering med en 0.22 µm filter og lagre dele på 20 ° C.
  2. Plate celler på 24-vel plater (3 brønner per eksperimentelle tilstand per plate). Glem ikke å reservere 3 tom brønner per plate for spektrofotometer blanks.
  3. Inkuber cellene på 37 ° C 22-24 h før uran eksponering å la celler fest.
  4. Forberede uranyl inneholder medier som beskrevet i del 3.
  5. Erstatte vekstmediet i celle-seeded platene med uranyl inneholder medier. Inkuber 24 h.
  6. Beregn nødvendig volumet av 1 x MTT løsning som følger:
    (Antall eksperimentelle forhold + tom) x 3 (triplicates) x 0,4 mL/vel + 10% volum for pipettering tap.
  7. Forbered nødvendig volumet av 1 x MTT løsning ved å fortynne 10 x MTT lagerløsning i Eagle's Minimum viktig Medium (EMEM) uten fenol red.
    Merk: For en vellykket kolorimetrisk analysen, MTT skal beskyttes fra lys. Det anbefales å fortynne MTT til EMEM i stedet for DMEM for å begrense bakgrunn signalet.
  8. Fjern uranyl inneholder medier fra brønnene, vaske dem med PBS og legge til 400 µL av MTT løsning i hver brønn (inkludert 3 tom brønner for tomme felt). Inkuber 2,5 t på 37 ° C i mørket. Kontroller under mikroskop at mørk lilla formazan krystaller har dannet i levedyktig cellene.
  9. Forkast MTT løsningen og legge til 220 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) per brønn. Pakk plater i aluminiumsfolie beskytte dem fra lyset og forsiktig agitere for 10 min å oppløse formazan krystaller.
  10. Bruke en microplate spectrometer leser å finne ut av optisk densitet (OD) ved 570 nm (formazan spesifikke) og 690 nm (bakgrunn). For hver brønn, trekk 690 nm OD fra 570 nm OD å justere for mulige uspesifisert OD verdien svingninger på grunn av riper eller turbiditet22.
  11. Beregne tom-korrigert OD for hver brønn ved å trekke mener OD av tomt fra OD innhentet i forrige trinn. Bestemme gjennomsnittet OD verdi for hver eksperimentelle tilstand.
  12. Angi mener OD av kontroll tilstanden ([UO22 +] = 0 mM) til 100% levedyktighet og beregne den tilsvarende cellen levedyktighet for andre testet uranyl konsentrasjoner. Plotte en dose-respons kurve. Evaluere cytotoksisitet indeks 50 (CI50), definert som uranyl konsentrasjonen fører til 50% celledød etter 24 h eksponering.

5. analyse av Osteoclast differensiering i nærvær av U(VI)

  1. Differensiering av rå 264.7 celler i nærvær av uranyl og TRAP (Tartrate-resistente Acid fosfatase) flekker.
    1. Plate rå 264.7 celler i en 24-vel plate, 3 brønner per eksperimentelle tilstand. Inkuber ved 37 ° C i ca 6 h og tid til å forberede og equilibrate uranyl inneholder eksponering media.
    2. Forberede differensiering media med ønsket uranyl konsentrasjoner som beskrevet i del 3 (ikke glem å legge GST-RANKL til media).
    3. Forsiktig erstatte grunnleggende medium i brønner med uranyl som inneholder mediet. I dag regnes som 0 osteoclastic differensiering.
    4. Endre mediet dag 2 eller 3 av osteoclastic differensiering ved å gjenta trinn 5.1.2 og 5.1.3. Multinucleated osteoklast skal vises mellom dag 3 og 4.
    5. Utføre den FELLEN flekker med kommersielt tilgjengelig leukocytter sure fosfatase kit følge instruksjonene fra produsenten.
      Merk: Tartrate-resistente sure fosfatase (TRAP) også kalt sure fosfatase 5, tartrate resistente (ACP5) er svært uttrykt i eldre osteoklast og mye brukt som en markør for osteoclast differensiering. Derfor utføres FELLE flekker for å visualisere osteoklast. Avhengig av eksperimentelle forhold og frekvensen av osteoclastogenesis, kan det gjøres på 4 eller 5 dager av differensiering.
    6. Hold FELLE-farget brønner i PBS på 4 ° C for videre analyse (de kan vedlikeholdes under disse forholdene til 3 eller 4 uker).
  2. Osteoclast størrelse/morfologi analyse.
    1. Få et bilde av det hele overflaten av hver brønn. Oppløsningen til bildet bør være tilstrekkelig til å skille celle kjerner. Vurdere FELLE-positive celler med 3 eller flere kjerner, som osteoklast.
    2. Åpne et bilde av en brønn i ImageJ programvare: "Fil" → "Åpne".
    3. Kontroller skalaenhetene i øvre venstre hjørne av bildet. For den relative kvantifiseringen, kan en enhet brukes. Hvis absoluttverdien til osteoclast størrelse er nødvendig, konvertere enheter til µm: "Bilde" → "egenskaper". Merk av for "global" i popup-vinduet for å få nye enheter brukes på alle bilder åpnes senere.
      Merk: Hvis et mikroskop ble brukt for bildeopptak pikselstørrelsen i µm er angitt for hver målsetting i tenkelig programvare.
    4. Angi måling parametere som skal analyseres: "Analysere" → "sette mål". I vinduet angi målinger "Området" og "Vis etikett" avmerkingsbokser og uncheck alle andre bokser.
    5. Åpne avkastning (område av interesse) manager: "Analysere" → "verktøy" → "Avkastningen Manager".
    6. I hovedvinduet kan du velge rektangulære markeringsverktøyet. Bruk den hvor som helst i bildet for å skissere en sektor av ca 1000 x 1000 µm. Dette valget nå definerer første regionen i hvilke osteoclast størrelse vil bli analysert.
    7. I vinduet ROI Manager klikker du på "Add"-knappen for å legge til denne regionen rundt til Avkastningen manager og lagre det ved å klikke på "Mer" → "Lagre". Lagrede Avkastningen kan nå lastes til Avkastningen manager når som helst ved å klikke på "Mer" → "Åpne".
    8. Gjenta 5.2.5 - 5.2.6 å definere 4 flere områder for osteoclast størrelse analyse (figur 2A og 2D).
      Merk: De definerte regionene brukes til å analysere osteoclast størrelser i alle bildene.
    9. Opprette en kopi av en av de 5 regionene som skal analyseres: valgte denne Avkastningen i hovedsak ROI manager (tilsvarende utvalget vises på hovedbildet) → Høyreklikk inne valg → "Kopi". Bruk dette duplikatet for videre analyse.
    10. Sjekk boksene "Vis Al" l og "Merkelapper" i Avkastningen Manager-vinduet.
    11. Velg utvalg polygonverktøyet disponere en av osteoklast i valg manuelt i hovedvinduet. Legg dette omrisset til Avkastningen manager ved å klikke på "Legg til" i Avkastningen manager-vinduet. Fortsett på samme måte for alle osteoklast som ligger helt i den valgte regionen (figur 2B og 2E).
    12. I Avkastningen Manager-vinduet, Velg alle konturene og måle deres overflate ved å klikke på "Tiltak". Overføre målingene som har dukket opp i et nytt vindu (resultatene vinduet, figur 2C og 2F) til et regneark.
      Merk: På dette punktet-regionen analyse med alle osteoklast konturene, kan lagres som et uavhengig bilde: "Fil" → "Lagre som" formatet på valg.
    13. Gjenta trinn 5.2.8 - 5.2.12 for de gjenværende områdene av analyse av gjeldende bilde. Deretter gjenta hele prosedyren for alle de andre bildene.
  3. Osteoclast nummer analyse med ImageJ programvare.
    Merk: Osteoclast distribusjon i brønnen er sjelden homogen, utføre telling på hele vel stedet på noen valgte soner. At osteoklast er heterogene i form og størrelse, ikke automatiserte teller cellen metoden er praktisk mulig.
    1. Åpne en hel-og bilde i ImageJ programvaren (for denne analysen, bruk bilder fra tidligere underdelen).
    2. Åpne vinduet celle counter: "Plugins" → "analysere" → "Celle Counter". Klikk på "Starte" og "Type 1" avmerkingsboksen (eller hva skriver du inn nummeret du foretrekker). Kontroller at "Vis nummer" er merket og "Slette Mode" boksen ikke er avmerket.
    3. Bildet, klikk på en osteoclast: fargede prikken og flere vises der klikket. Fortsett på samme måte for alle osteoklast. Lagre markører regelmessig ved å klikke på "Lagre markører" i vinduet celle counter
      Merk: Hvis det siste punktet må fjernes fra teller, klikk på "Slett" i cellen counter-vinduet. Hvis det er mer enn ett poeng å fjerne, merker du av for «Slett Mode» og angi alle ugyldig poeng ved å klikke på dem. Deretter fjerner du merket for "Slett Mode" for å fortsette opptellingen.
    4. Resultatet av telle ved å klikke på resultatene i cellen counter-vinduet vises. Overføre telling sluttresultatet til et regneark.

6. analyse av Osteoclast-funksjonen i nærvær av U(VI)

  1. Grav benresorpsjon analysen.
    1. Plate rå 264.7 celler i en 24-vel osteo analysen plate, som gir en syntetisk uorganiske osteomimetic overflate som kan være resorbed av osteoklast.
      Merk: for å la celler knytte til biomimetic overflaten, er det ofte bedre til plate dem dagen før legge differensiering medium.
    2. Skille rå 246.7 celler i osteoklast som beskrevet i seksjon 5 (trinn 5.1.2 - 5.1.4)
    3. På dag 5 i osteoclastogenesis, fjerne osteoklast fra bein mimetic overflaten ved å erstatte uranyl som inneholder mediet med 10% bleike løsning. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Vask brønner to ganger med deionisert vann og la dem air-dry.
    4. Legge til en 1% Alizarin rød S natrium salt løsning i brønnene stain kalsium salter innen ikke-resorbed. Fjern Alizarin løsning etter 10-15 s med inkubering og forsiktig vaske brønnene 3 - 4 ganger med vann. La brønnene air-dry.
      Merk: Flekker prosedyren beskrevet ovenfor er utformet for å forbedre kontrasten mellom den resorbed og ikke-resorbed områdene for å lette påfølgende analyse. Denne prosedyren må gjøres nøye fordi hvis brønner ikke helt tørt før farging, deler av gjenværende bein-mimetic overflaten kan fjernes ved et uhell. Videre, hvis Alizarin løsning står lenge i brønnene, en vedvarende uspesifisert flekker vises. Det bør bemerkes at testen beskrevet i dette avsnittet gjelder effekten av uran på både osteoclastic differensiering og funksjon. For å studere effekten av uran på benresorpsjon uavhengig osteoclast formasjon, rå 264.7 celler kan behandles med uranyl inneholder middels i 24 timer, bare når eldre osteoklast er dannet (på dag 4 eller 5 av differensiering) 23.
  2. Grav benresorpsjon analyse.
    1. Få et bilde av det hele overflaten av hver brønn av osteo analysen plate.
      Merk: Image anskaffelsesmetoder kan variere, men bør være konsekvent på hele Repliker eksperimenter. De kan ta et bilde tatt med en makro objektiv av en fast kamera, en høy oppløsning skanning eller en mosaikk bildet laget med en automatisert høy gjennomstrømning mikroskop.
    2. Begynn analysen ved å gjenta trinn 5.2.2 til 5.2.4 fra den forrige delen.
    3. Konverterer et RGB-bilde til et gråskala 8-biters format: "Bilde" → "Type" → "8 bit".
    4. I hovedvinduet, Velg ellipse-verktøyet. Bruk den for å tegne en sirkel som beskriver alle overflaten av brønnen skal analyseres for benresorpsjon.
    5. Lagre denne nye avkastning som i trinn 5.2.6.
    6. For å lette terskelen utvalg, fjerner du alle funksjonene utenfor definerte Avkastningen: "Rediger" → "Fjern utenfor".
      Merk: På dette punktet, er det ofte bedre å gjøre noen kopier av bildet: Fjern Avkastningen ved å klikke utenfor valgt sone → høyre klikk på bilde → "Kopi". Denne handlingen vil bidra til å unngå en gjentakelse av bilde behandling beskrevet ovenfor hvis terskelen valgt i det neste trinnet er tilfredsstillende.
    7. Velg "Bilde" → "Juster" → "terskelen". I vinduet terskel Bruk glidebryteren for å velge en passende terskel. Alle resorbed områder bør være under terskelen (hvit) og resorbed ikke, ovenfor (rød). For å fullføre terskelen valg, klikk på "Apply" i vinduet terskel.
    8. Lagre siste binære bildet: "Fil" → "Lagre som" → formatet du ønsker.
    9. Definere mål tas i regionen rundt: "Analysere" → "sette mål". I vinduet angi målinger når "Område", "Området brøkdel" og "Limit terskelen" bokser og uncheck alle de andre.
    10. For å få brøkdel av "resorbed" området direkte i resultatvinduet, invertere det binære bildet ("Rediger" → "Inverter"). Kontroller at den største Avkastningen er valgt på det siste binære bildet (ellers resorbed området brøkdel beregnes basert på overflaten av hele bildevinduet). Måle resorbed området brøkdel ved enten å klikke på "Tiltak" i Avkastningen manager-vinduet eller på "Analysere" → "Måle". Lagre resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tartrate-resistente sure fosfatase flekker ble brukt til å visualisere osteoklast som store lilla celler har 3 eller flere kjerner. Representant bildene av osteoklast oppnådd fra rå 264.7 celler kultivert i nærvær av RANKL og uranyl ioner er vist i figur 1. Endringer i antall og størrelsen på osteoklast svar på uran er lett synlige i sammensatte bilder hele brønner og forstørret bilder.

Størrelsen på osteoklast ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare (figur 2). For dette formålet, hel-og bilder av FELLE farget osteoklast ble brukt og de samme områdene ble behandlet i hver brønn i hver kultur tilstand (figur 2A og 2D). Alle osteoklast i hver region ble skissert (figur 2B og 2E) som tillot fastsettelse av området (uttrykt i µm2) (figur 2C og 2F). Eksemplene vist i figur 2 viser den sterke effekten av uran på osteoclast størrelse.

Undersøke virkningen av uran osteoclast benresorpsjon aktivitet, var rå 264.7 celler belagt og differensiert på osteomimetic overflate plate. På slutten av analysen, ble osteoklast fjernet. Deretter bein mimetic overflaten i hver vel ble behandlet av Alizarin rød S natrium salt for å flekken ikke-resorbed området og bilder av hver hele godt anskaffet (figur 3A og 3D). Resulterende bildene ble behandlet med bilde J programvare. De ble konvertert i 8-biters gråskala bilder (figur 3B og 3E), utsettes for terskelverdi (Figur 3 c og 3F) og det resorbed området (hvit regioner) ble automatisk beregnet.

Figure 1
Figur 1: visualisering av effekten av U(VI) på osteoclast formasjon. RÅ 264.7 celler var differensiert i nærvær av den angitte konsentrasjonen av uranyl. På dag 4 ble tartrate-resistente sure fosfatase (TRAP) flekker utført. Representant hele-og micrographs (øvre panel) viser FELLE-farget osteoklast innhentet i disse betingelsene. Eksempler på multinucleated osteoklast i boksområdene vises på en høyere forstørrelse (piler i bunnen paneler). Disse bildene illustrerer doseavhengig effekten av U(VI) på osteoclast formasjon. Svart hodet piler indikerer eksempler på osteoclast kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: analyse av effekten av U(VI) på osteoclast størrelse. (A og D): hele-og bilder av osteoklast med innrammet område tilsvarer regionene i hvilke osteoclast størrelse var analysert vises. Røde bokser området i (A og D) tilsvarer de som vises i (B) og (E), henholdsvis. (B og E): manuell tegning av osteoclast kanter i de to uranyl-konsentrasjon forholdene er vist i blått. (C og F): føre windows fra ImageJ programvare viser målene fra (B og E) analyse henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: analyse av effekten av U(VI) på osteoclast funksjonen. Bilder av Alizarin farget osteomimetic overflaten etter osteoclastic benresorpsjon som fant sted i fravær (A) eller i nærvær av 25 µM av uranyl (D). Bilder i (A og D) ble først konvertert i 8-biters gråskala bilder som vist i (B og E), og deretter i binære bilder (C og F) ved å bruke en passende innstillingen. Disse binære bilder ble brukt til å beregne prosentvise området resorbed i hver betingelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Så vidt vi vet, er dette første gang at en detaljert prosedyre å studere effekten av uran på bein resorbing celler er beskrevet. Denne tilnærmingen vil være nyttig å oppnå en bedre forståelse av uran innvirkning på bein fysiologi og oppgir et interessant nytt verktøy for screening av uran chelater. Videre tror vi at protokollen beskrevet her kan brukes for å studere virkningen av andre tungmetaller på osteoclatogenesis.

Det er kjent at uranyl er kompleksbundet med uorganiske og organisk komponenter i kultur medier18,19,20,21. Disse complexations påvirke artsdannelse uran og, på denne måten sin cytotoksisitet. Derfor er et viktig skritt i protokollen utarbeidelse av uran inneholder kultur medier. Vi har tidligere vist23 som tilstedeværelse av 5% fosterets bovin serum i kultur medium celleområde rå 264.7 hadde ingen signifikant effekt på cytotoksisitet av uranyl i konsentrasjonene varierer fra 0 til 400 µM. Dette er et viktig poeng, som tilstedeværelse av serum i medium er nødvendig for å analysere effekten av uran eksponering under hele prosessen med osteoclastic differensiering. Likevel ønsker vi å understreke at lang to-trinns fremgangsmåten for utarbeidelse av eksponering media (6 timer) må følges nøye. Faktisk det inkubasjon trinnet 3 timer etter hver fortynning av uranyl salter kan stabilisering av uranyl komplekser potensielt dannet i løsningen før videre fortynning eller cellen eksponering. Dette er absolutt nødvendig å få pålitelig og reproduserbar.

En annen viktig parameter for reproduserbarhet av osteoclast differensiering og benresorpsjon analyser er seeding tettheten av RAW 264.7 celler. Faktisk har det vært vist at mononukleære forløper tetthet er en viktig determinant for osteoclast formasjon, sannsynligvis fordi celle til celle nærhet påvirker mobilnettet fusion hendelser24. Derfor må en spesiell oppmerksomhet betales til celle teller, mobilnettet suspensjon forberedelse og homogene frø i hver brønn, for å unngå feiltolkning.

Terskelverdi-verktøyet er nyttig for å automatisere kvantifisering av benresorpsjon. Det er verdt å peke på at denne analysen krever riktig opplyst bilder. Imidlertid er en vanlig problem uansett hvilken type kamera og bilde anskaffelsesmetoden ujevn belysning på kantene av bildet. I dette tilfellet kan en flertrinns terskelverdi metode være nødvendig.

I sammendraget, har vi etablert en robust protokoll slik at studiet av uran innvirkning på osteoclast formasjon, levedyktighet og funksjon. Denne fremgangsmåten er utviklet ved hjelp av rå 264.7 celle linjen men gjelder fullt primære benmarg osteoclast prekursorer som vi har vist23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Chantal Cros for nyttig teknisk assistanse.
Denne forskningen ble finansiert av tilskudd fra den "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energi alternativer" (URANOs - programmet tverrgående de Toxicologie du CEA og CPRR CEA-AREVA), og fra ANR (toksisitet av uran: multi-level tilnærming av biomineralization Behandle i bein, ANR-16-CE34-0003). Dette arbeidet ble også støttet av universitetet i fin Sophia-Antipolis og CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51, (6), 755-771 (1986).
  3. Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57, (1), 17-21 (1989).
  4. Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110, (4), 337-342 (2002).
  5. Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67, (6), 589-610 (1994).
  6. Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25, (6), 1161-1175 (2012).
  7. Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236, (2), 123-130 (2015).
  8. Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159, (1), 1-8 (2016).
  9. Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
  10. Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276, (5310), 266-269 (1997).
  11. Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276, (5310), 270-273 (1997).
  12. Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91, (4), 1903-1914 (2017).
  13. Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54, (1), 17-23 (1991).
  14. Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79, (8), 475-481 (2005).
  15. Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113, (1), 68-72 (2005).
  16. Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
  17. Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22, (7), 975-983 (2007).
  18. Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18, (3), 180-187 (1999).
  19. Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17, (3), 446-452 (2004).
  20. Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252, (1-3), 26-32 (2008).
  21. Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250, (1), 62-69 (2008).
  22. Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. Oxford University Press. Oxford. (1999).
  23. Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861, (4), 715-726 (2017).
  24. Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics