Métodos para analizar los efectos del uranio Natural en In Vitro la osteoclastogénesis

Developmental Biology

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Summary

Uranio se sabe que afectan el metabolismo óseo. Aquí, presentamos un protocolo dirigido a investigar el efecto de la exposición de uranio natural en la viabilidad, la diferenciación y la función de los osteoclastos, las células de reabsorción ósea.

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Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

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Abstract

Uranio se ha demostrado que interfieren con la fisiología del hueso y está bien establecido que este metal se acumula en el hueso. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto del uranio natural en el comportamiento de las células óseas. En particular, el impacto del uranio en los osteoclastos, las células responsables de la resorción de la matriz ósea, no está documentado. Para investigar esta cuestión, hemos establecido un nuevo protocolo con acetato de uranilo como fuente de uranio natural y la línea de celular RAW 264.7 murina como un modelo de precursores de osteoclastos. En este documento, nos detalló todos los ensayos necesarios para prueba de citotoxicidad de uranio en precursores de los osteoclastos y evaluar su impacto en la osteoclastogénesis y la función resorbing de osteoclastos maduros. Las condiciones hemos desarrollado, en particular para la preparación de medios de cultivo que contienen uranilo y para la siembra de RAW 264.7 células permiten obtener resultados confiables y altamente reproductivos. Por otra parte, hemos optimizado el uso de herramientas de software para facilitar el análisis de diversos parámetros como el tamaño de los osteoclastos o el porcentaje de la matriz correspondiente.

Introduction

El uranio es un elemento radioactivo que ocurre naturalmente en suelos, aire y agua; así, los animales y los seres humanos están expuestos a uranio natural en su dieta. Además de fuentes naturales, uranio origina de actividades antropogénicas, que aumenta su abundancia en el medio ambiente. Uranio plantea riesgos químicos y radiológicos. Sin embargo, debido a que el uranio natural (que es una mezcla de isótopos que contiene 99.27% 238U, 0.72% 235U y 0.006% 234U) tiene una baja actividad específica (25.103 Bq.g-1), su impacto en la salud se atribuye a su toxicidad química.

Sea cual sea su vía de entrada (inhalación, ingestión o exposición dérmica), la mayor parte del uranio de entrar en el cuerpo se elimina con las heces y solo una pequeña parte alcanza la circulación sistémica. Aproximadamente el 67% de uranio en la sangre a su vez es filtrado por los riñones y deja el cuerpo en la orina dentro de 24 h1. El resto se deposita sobre todo en los riñones y los huesos, los dos órganos principales de uranio toxicidad2,3,4. Porque el esqueleto se ha identificado como el sitio primario de uranio a largo plazo retención2,3,4,5,6, se han realizado varios estudios para explorar la efecto del uranio en hueso fisiología7.

El hueso es un tejido mineralizado que está remodelado continuamente durante toda su vida. Remodelamiento óseo es un proceso complejo que depende de los tipos de células especializadas y que consiste principalmente en dos fases: resorción de la matriz vieja existente por los osteoclastos seguida de construcción de hueso de novo por los osteoblastos. Los osteoclastos son células grandes, multinuclear resultante de la fusión de células precursoras de origen hematopoyético que migran a los sitios de reabsorción donde fijan al hueso8. El apego ocurre simultáneamente con una reorganización amplia de su citoesqueleto9. Esta reorganización es necesaria para el establecimiento de un compartimiento aislado entre la célula y la superficie del hueso en el cual los osteoclastos secretan protones, llevando a la disolución de hidroxiapatita y proteasas involucradas en la degradación de la matriz orgánica. Los productos resultantes de la degradación son endocytosed, transportado a través de la célula a la superficie de la membrana opuesta a la superficie del hueso y segregada, un proceso llamado transcitosis10,11.

Los resultados de estudios en vivo y en vitro indican que el uranio inhibe la formación de hueso y altera el número y la actividad de osteoblastos7,12. En contraste, los efectos del uranio sobre la resorción del hueso y osteoclastos han sido poco explorados. Varios en vivo estudios han reportado un aumento de la resorción del hueso después de la administración de nitrato de uranilo a ratones o ratas13,14. Además, una investigación epidemiológica sugiere que el aumento en la ingesta de uranio mediante agua potable tendía a asociarse con un aumento en el nivel del suero de un marcador de resorción ósea en hombres15. Tomados en conjunto, estos resultados llevaron a la conclusión de que el uranio, que se acumula en el hueso podría promover la resorción ósea. Sin embargo, los mecanismos celulares implicados en este efecto potencial de uranio siguen siendo una cuestión abierta. Por esta razón, decidimos examinar los efectos del uranio sobre el comportamiento de resorbing las células óseas.

Aquí, describimos el protocolo que hemos establecido para caracterizar y cuantificar los efectos del uranio natural sobre la viabilidad de los osteoclastos y en la diferenciación de osteoclastos y la actividad reabsorbedor. Los experimentos descritos en este documento se han realizado con la línea celular RAW 264.7 macrófago transformado murino, que pueden distinguir fácilmente en osteoclastos cuando se cultivan en presencia de la citoquina RANKL para 4 o 5 días, y que clásicamente se utiliza para estudiar diferenciación y función de los osteoclastos16. Los procedimientos desarrollados son confiables, dar resultados altamente reproducibles y son plenamente aplicable a osteoclastos primarios. Por todas estas razones, creemos que esta metodología es útil para obtener una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la toxicidad del uranio en el hueso. Además, consideramos que este enfoque puede ser adaptado como una herramienta de detección para la identificación de uranio nuevos agentes quelantes.

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Protocol

1. preparación de solución de acetato de uranilo

  1. Para preparar 2 mL de una solución de acetato de uranilo de 100 mM, añadir 85 mg de acetato de uranilo (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) en estado sólido a un tubo de plástico de 5 mL.
  2. Añadir 2 mL de agua destilada al tubo de plástico e introducirlo con un tapón de plástico.
  3. Agitar el tubo enérgicamente hasta la total disolución del sólido. Poner la solución en la nevera durante 24 h.
    PRECAUCIÓN: La manipulación de uranilo [U(VI)] presenta algunos peligros químicos y radiológicos. Todas las muestras deben ser preparadas y caracterizadas con equipos ad hoc en laboratorios específicos. Todos los líquidos que contienen U VI deben recogerse en contenedores residuos específicamente asignados y eliminados como residuos tóxicos. Residuos secos (pipetas, tubos, etc.) podrían ser lavado con 0,1 N HNO3 solución, se solubilizan y eliminar U(VI).
  4. Verificar el pH de la solución usando un microelectrodo y un medidor de pH.
    Nota: El microelectrodo debe ser previamente calibrado con soluciones tampón comercial (pH = 4 y pH = 7).

2. RAW 264.7 células cultura

  1. Mantenimiento de las células.
    1. Cultivar células RAW 264.7 (ATCC, TIB-71) en frascos de 75 cm2 en el medio de crecimiento siguiente: Dulbecco de modificado medio de águila (DMEM) suplementado con 5% de suero Fetal Bovino y antibióticos: penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100 de μg/mL. Mantener las células en incubadora a 37 ° C, 5% CO2.
    2. Cambiar el medio cada 2 a 3 días. Cuando las células son confluentes de 85-90%, mecánicamente Retire del frasco de cultivo con un raspador celular (según lo recomendado por la ATCC) y dividirlas en una proporción de 1:6.
      Nota: sólo las células entre los pasos 3 a 10 se utilizan para los experimentos de diferenciación.
  2. Preparación de las células para los experimentos
    1. Desalojar células del substrato del frasco como se describe anteriormente y transferirlos a un tubo estéril 50 mL. Mezclar las células mediante pipeteo arriba y abajo para romper grumos. Contar con un hemocitómetro. Esperan que 35 millones de células por frasco de 75 cm2 .
    2. Calcular el volumen de la suspensión de células necesario para cada experimento como sigue:
      Parte experimental las condiciones x 3 (triplicado) x 1 mL/pocillo + 3-4 mL (pipetas de pérdidas).
      Nota: Siembra de densidad para todos los ensayos descritos en el presente Protocolo es 5.000 células/cm2. Por lo tanto, para una placa de 24 pocillos, significa 10.000 células por pocillo en 1 mL de medio, y densidad de la suspensión celular es así 10.000 células/mL.
    3. Preparar el volumen necesario de suspensión de células de 10.000 células/mL y semilla de las células en placas de 24 pocillos. Para los ensayos de citotoxicidad, utilizar medio de cultivo normal. Diferenciación y pruebas resorción, uso alfa modifica mínimo esencial medio (αMEM) suplementado con 2 mM L-glutamina, 5% FBS y 50 ng/mL de GST-RANKL17.
      Nota: El GST-RANKL proteína producida en la empresa puede ser sustituida por cualquier cytokine RANKL comercialmente disponible. Cuando se trabaja con una nueva hornada RANKL, puede ser útil probar su eficacia en inducir osteoclastogénesis realizando un experimento de respuesta de dosis con concentración de RANKL que van desde 20 hasta 150 ng/mL.

3. dilución de la solución de acetato de uranilo de 100 mM en medio de cultivo

Nota: Los iones uranilo [U(VI)] en medio de cultivo forman complejos múltiples con otros componentes del medio que podrían modificar su toxicidad celular18,19,20,21. Por esta razón, uranilo que contiene los medios de comunicación deben estar preparados espontáneamente sin omitir o acortar pasos equilibrado.

  1. Eligió uranilo las concentraciones de exposición y calcular volúmenes de medios de cultivo requeridos para el experimento (teniendo en cuenta que cada Estado se realiza por triplicado).
  2. A partir de la cultura de célula estéril probada solución acuosa de bicarbonato de sodio 7.5% ([HCO3] = 893 mM), preparar una solución 100 mM HCO3 de agua y enfriar en hielo.
  3. Añadir gota a gota 1 volumen de solución stock de 100 mM de acetato de uranilo a 9 volúmenes de solución helada 100 mM HCO3 agitando suavemente el tubo de mezcla. Esta operación será diluir la solución madre de acetato de uranilo ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) hasta 10 m y llevar el pH a alrededor de 7.
  4. Agregar 1 volumen de agua estéril a 9 volúmenes de solución de3 de HCO helada 100 mM hasta 90 mM HCO3 (igual a la concentración de HCO3 en la solución de uranilo de 10 mM), que servirá para preparar el control medio.
  5. Permiten soluciones preparadas durante 3 h a temperatura ambiente (RT) para conseguir el equilibrio.
  6. Mientras tanto, prepare el soporte básico de la exposición: αMEM con 2 mM L-glutamina y 5% FBS.
    Nota: Para la diferenciación y análisis de la resorción, agregue 50 ng/mL de GST-RANKL al medio de exposición básica.
  7. Después de 3 horas, diluir cantidades apropiadas de la solución 10 mM de uranilo gota a gota en el medio de exposición para alcanzar la deseada uranilo las concentraciones de trabajo. Preparar simultáneamente el medio de control mediante la adición de la cantidad de bicarbonato que se utiliza en la condición tratada con uranilo más concentrada, al medio de exposición.
  8. Permiten medios preparados por 3 h a temperatura ambiente para conseguir el equilibrio.
  9. Retire el medio de crecimiento de los pozos y reemplazarlo con el control y los medios de comunicación que contiene el uranilo.

4. Análisis de RAW 264,7 precursores viabilidad en presencia de U(VI) (MTT ensayos citotóxicos)

PRECAUCIÓN: Tanto MTT y DMSO pueden causar piel y la irritación del ojo. Use guantes y protección ocular cuando maneje. Recoger productos de desecho en contenedores residuos específicamente asignados.

  1. Disuelva una cantidad adecuada de polvo en PBS para obtener una solución madre de 10 x 5 mg/ml de bromuro de 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT). Esterilizar por filtración con filtro 0,22 μm y almacenar en alícuotas a-20 ° C.
  2. Células de la placa en placas de 24 pocillos (3 pozos por condición experimental por placa). No te olvides de reservar 3 pozos vacíos por placa para los espacios en blanco del espectrofotómetro.
  3. Incube las células a 37 ° C durante 22-24 h antes de la exposición de uranio para dejar que las células a conectar.
  4. Preparar medios de uranilo que contienen como se describe en la sección 3.
  5. Reemplazar el medio de crecimiento en las placas sembradas de células con uranilo medios de comunicación. Incubar durante 24 h.
  6. Calcular el volumen necesario de solución de x MTT 1 como sigue:
    (Número de condiciones experimentales + en blanco) x 3 (triplicado) x 0,4 mL/pocillo + 10% volumen de pipeteo de las pérdidas.
  7. Prepare el volumen requerido de solución x MTT 1 diluyendo 10 x solución MTT del águila mínimo esencial media (EMEM) sin rojo de fenol.
    Nota: para un acertado ensayo colorimétrico, MTT debe protegerse de la luz. Se recomienda diluir MTT en EMEM en lugar de DMEM para limitar la señal de fondo.
  8. Eliminar medios de uranilo-que contienen de los pozos, lavar con PBS y añadir 400 μL de solución de MTT a cada pozo (incluyendo 3 pozos vacíos para espacios en blanco). Incubar 2,5 h a 37 ° C en la oscuridad. Verificar bajo microscopio que se han formado cristales de formazán púrpura oscuro dentro de las células viables.
  9. Deseche la solución MTT y añadir 220 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) por pozo. Envuelva las placas en papel de aluminio para proteger de la luz y agitar suavemente durante 10 minutos disolver cristales de formazán.
  10. Utilice un lector de microplacas espectrómetro para determinar la densidad óptica (OD) a 570 nm (específico de formazán) y 690 nm (fondo). Para cada bien, restar 690 nm OD de 570 nm OD para ajustar para posibles fluctuación de valor no específico OD debido a arañazos o22de la turbiedad.
  11. Calcular el OD para cada bien corregida restando OD media del espacio en blanco de la do obtenida en el paso anterior. Determinar la media valor de OD para cada condición experimental.
  12. Set media OD de la condición de control ([UO22 +] = 0 mM) a 100% de viabilidad y calcular el porcentaje correspondiente de la viabilidad celular para otras concentraciones de uranilo probado. Trazar una curva dosis-respuesta. Evaluar los 50 Índice de citotoxicidad (CI50), definida como la concentración de uranilo conduce a la muerte celular de 50% después de la exposición de 24 h.

5. Análisis de la diferenciación de osteoclastos en presencia de U(VI)

  1. Diferenciación de RAW 264.7 células en presencia de uranilo y trampa (tartrato-resistente al ácido fosfatasa) tinción.
    1. Placa RAW 264.7 las células en una placa de 24 pocillos, 3 pozos por condición experimental. Incubar a 37 ° C por aproximadamente 6 horas, el tiempo para preparar y equilibrar los medios de comunicación de la exposición que contiene uranilo.
    2. Preparar medios de diferenciación con concentraciones de uranilo deseado según se describe en la sección 3 (no olvides añadir GST-RANKL a medios de comunicación).
    3. Vuelva a colocar medio básico en pozos con uranilo medio. Este día se considera como día 0 de la diferenciación osteoclástica.
    4. Cambiar el medio día 2 o 3 de la diferenciación osteoclástica repitiendo los pasos 5.1.2 y 5.1.3. Osteoclastos multinucleated deben aparecer entre los días 3 y 4.
    5. Realizar la tinción de trampa con el kit de fosfatasa ácida leucocitaria comercialmente disponible siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: tartrato-fosfatasa ácida resistente (TRAP) también llamada fosfatasa ácida 5, tartrato-resistente (ACP5) es altamente expresada en osteoclastos maduros y ampliamente utilizada como un marcador para diferenciación de los osteoclastos. Por lo tanto, trampa de tinción se realiza para visualizar los osteoclastos. Dependiendo de las condiciones experimentales y la tasa de la osteoclastogénesis, podría hacerse en día 4 o 5 del proceso de diferenciación.
    6. Mantener pozos trampa manchada en PBS a 4 ° C para su posterior análisis (se puede mantener en estas condiciones hasta 3 o 4 semanas).
  2. Análisis de tamaño/morfología de los osteoclastos.
    1. Adquirir una imagen de toda la superficie de cada pozo. La resolución de la imagen debe ser suficiente para distinguir núcleos celulares. Considerar las células de la trampa-positive con 3 o más núcleos, como osteoclastos.
    2. Abrir una imagen de un pozo en el software ImageJ: "Archivo" → "Open".
    3. Verifique que las unidades de escala en la esquina superior izquierda de la imagen. Cualquier unidad puede utilizarse para la cuantificación relativa. Si el valor absoluto del tamaño de los osteoclastos es necesario, convertir unidades de escala μm: "La imagen" → "propiedades". Marque la casilla "global" en la ventana emergente para nuevas unidades de la escala aplicadas a todas las imágenes abiertas más tarde.
      Nota: Si el microscopio se utilizó para la adquisición de la imagen, el tamaño del pixel en μm se indica para cada objetivo en el software de imágenes.
    4. Especificar parámetros de medición a analizar: "Analizar" → "establecer medidas". En la ventana establecer mediciones, casillas "Área" y "Etiqueta de pantalla" y desactivar todas las demás cajas.
    5. Abra el administrador de ROI (región de interés): "Analizar" → "herramientas" → "ROI Manager".
    6. En la ventana principal, selecciona la herramienta de selección rectangular. Se usa en cualquier lugar en la imagen para describir un sector de aproximadamente 1.000 x 1.000 μm. Esta selección ahora define la primera región en la que los osteoclastos se analizará tamaño.
    7. En la ventana ROI Manager, haga clic en el botón "Añadir" para añadir esta región de interés para el gestor del retorno de la inversión y guardar haciendo clic en "Más" → "Guardar". El ROI guardado ahora se puede recargar al responsable del retorno de la inversión en cualquier momento haciendo clic en "Más" → "Open".
    8. Repita los pasos 5.2.5 - 5.2.6 definir 4 regiones adicionales para el análisis de tamaño de los osteoclastos (figura 2A y 2D).
      Nota: Las regiones definidas se utilizará para analizar los tamaños de los osteoclastos en todas las imágenes.
    9. Crear una copia de una de las 5 regiones a ser analizadas: eligió este retorno de la inversión en el principal cargo de ROI (la selección correspondiente aparecerá en la imagen principal) → click derecho dentro de la selección → "Duplicado". Utilizar esta copia para su posterior análisis.
    10. En la ventana de administrador de ROI, casillas de verificación "Mostrar Al" l y "Etiquetas".
    11. En la ventana principal, elija la herramienta de selección de polígono a uno de los osteoclastos en la selección del esquema manualmente. Añadir este esquema al Gerente de ROI haciendo clic en "Agregar" en la ventana de administrador de ROI. Proceder del mismo modo para todos los osteoclastos que se encuentran totalmente dentro de la región seleccionada (figura 2B y 2E).
    12. En la ventana ROI Manager, seleccione todos los contornos y medir su superficie haciendo clic en "Medida". Transferencia de las medidas que han aparecido en una nueva ventana (ventana de resultados, figura 2 y 2F) a una hoja de cálculo.
      Nota: En este punto, la región de análisis con todos los contornos de osteoclastos podría guardar como una imagen independiente: "Archivo" → "Guardar como" formato de elección.
    13. Repita los pasos 5.2.8 - 5.2.12 para las restantes regiones de análisis de la imagen actual. Repita todo el procedimiento para todas las imágenes.
  3. Análisis número de osteoclastos con el software ImageJ.
    Nota: Como distribución de osteoclastos en el pozo es raramente homogénea, llevar a cabo el recuento en todo el bien en lugar de en algunas zonas seleccionadas. Dado que los osteoclastos son heterogéneos en forma y tamaño, no automatizado método de celda de conteo es posible.
    1. Abrir una imagen de todo bien en el software ImageJ (para este análisis, imágenes de uso del apartado anterior).
    2. Abrir la ventana del contador de célula: "Plugins" → "analizar" → "Contador de células". Haga clic en "Iniciar" y la casilla de verificación "Tipo 1" (o lo que sea tipo número prefiere). Verifique que esté marcada la casilla "Mostrar número" y la casilla de "Modo de eliminar" esté desactivada.
    3. En la imagen, haga clic en uno de los osteoclastos: punto de color y un número aparecerá cuando haga clic en. Continuar del mismo modo por los osteoclastos. Guardar los marcadores regularmente haciendo clic en "Guardar los marcadores" en la ventana del contador de célula
      Nota: Si el último punto tiene que ser quitado de la cuenta, haga clic en "Eliminar" en la ventana del contador de célula. Si hay más de un punto a eliminar, marque la casilla de "Modo de eliminar" e indicar todos los puntos no válidos haciendo clic en ellos. Luego desmarque la casilla de "Modo de borrar" para continuar la cuenta.
    4. Mostrar el resultado de la cuenta haciendo clic en resultados en la ventana del contador de célula. Transferencia de los resultados finales del escrutinio a una hoja de cálculo.

6. Análisis de la función de osteoclastos en presencia de U(VI)

  1. Ensayo de la resorción del hoyo.
    1. Células RAW 264.7 de la placa en una placa de 24 pocillos osteo ensayo, que proporciona una superficie de osteomimetic inorgánico sintético que puede ser reabsorbida por osteoclastos.
      Nota: para dejar que las células se fije a la superficie biomimética, a menudo es mejor que los de la placa el día antes de añadir el medio de diferenciación.
    2. 246.7 crudo las células se diferencian en osteoclastos como se describe en la sección 5 (pasos 5.1.2 - 5.1.4)
    3. El día 5 de la osteoclastogénesis, retire osteoclastos la superficie mimética del hueso mediante la sustitución de uranilo que contiene medio con solución de lejía del 10%. Incubar por 5 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos dos veces con agua desionizada y dejarlos secar al aire.
    4. Añadir una solución de sal de sodio de rojo de alizarina S de 1% a los pozos de sales de calcio en las áreas no reabsorbido de la mancha. Eliminar la solución de alizarina después de 10-15 s de incubación y lave suavemente los pocillos 3 - 4 veces con agua. Dejar que secar los pocillos.
      Nota: El procedimiento de tinción descrito está diseñado para realzar el contraste entre la reabsorción y las áreas no reabsorbido para facilitar análisis consecutivos. Este procedimiento debe hacerse con cuidado porque si los pozos no estén completamente secos antes de la tinción, partes de la superficie ósea mimética restante podrían ser quitadas accidentalmente. Por otra parte, si solución de alizarina se deja demasiado tiempo en los pozos, una persistente coloración inespecífica aparecerá. Cabe señalar que la prueba que se describe en esta sección se refiere al efecto del uranio sobre la función y diferenciación osteoclástica. Para estudiar el efecto del uranio en resorción independientemente de la formación de los osteoclastos, las células RAW 264.7 pueden tratarse con uranilo media durante 24 horas, una vez que los osteoclastos maduros se forman (en el día 4 o 5 del proceso de diferenciación) 23.
  2. Análisis de la reabsorción del hoyo.
    1. Adquirir una imagen de toda la superficie de cada pocillo de la placa de ensayo de osteo.
      Nota: Métodos de adquisición de imagen pueden variar pero deben ser consistentes a través de experimentos repetidos. Pueden incluir una fotografía tomada con un objetivo macro de una cámara fija, una exploración de alta resolución o una imagen de mosaico hecho con un microscopio automatizado de alto rendimiento.
    2. Iniciar análisis repitiendo los pasos 5.2.2 a 5.2.4 de la sección anterior.
    3. Convertir una imagen RGB en un formato de 8 bits en escala de grises: "La imagen" → "Tipo" → "8 bits".
    4. En la ventana principal, seleccione la herramienta Selección oval. Se usa para dibujar un círculo sobre toda la superficie del pozo a analizar para la reabsorción.
    5. Guardar este nuevo retorno de la inversión como en el paso 5.2.6.
    6. Para facilitar la selección de umbral, claro todas las funciones fuera de la ROI definido: "Editar" → "Claro fuera".
      Nota: En este punto, a menudo es mejor hacer unos pocos ejemplares de la imagen: anule la selección de ROI haciendo clic fuera de la zona seleccionada → botón derecho del ratón sobre la imagen → "Duplicado". Esta acción ayudará a evitar una repetición del tratamiento de imagen descrito anteriormente si el umbral elegido en el paso siguiente es insatisfactoria.
    7. Seleccione "Imagen" → "Ajustar" → "umbral". En la ventana de umbral, utilice la barra deslizante para seleccionar un umbral adecuado. Todas las áreas de reabsorción deben estar por debajo del umbral (blanco) y no reabsorben, por encima de (rojo). Para finalizar la selección de umbral, haga clic en "Aplicar" en la ventana de umbral.
    8. Guardar la imagen binaria final: "Archivo" → "Guardar como" → formato de su elección.
    9. Definir las medidas que se adopten en la región de interés: "Analizar" → "establecer medidas". En la ventana establecer mediciones, compruebe "Área", "Fracción de área" y "Límite umbral" cajas y desactive todos los demás.
    10. Para obtener la fracción de área "reabsorción" directamente en la ventana resultados, invertir la imagen binaria ("Editar" → "Invertir"). Asegúrese de que el retorno de la inversión principal es seleccionado en la imagen binaria final (lo contrario fracción de zona correspondiente se calculará partiendo de la superficie de la ventana de la imagen entera). Fracción de área correspondiente de medida ya sea haciendo clic en "Medida" en la ventana de administrador de ROI o en "Analizar" → "Medir". Guarde el resultado.

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Representative Results

Tinción de fosfatasa ácida tartrato-resistente fue utilizado para visualizar los osteoclastos como grandes células púrpura que tienen 3 o más núcleos. Imágenes representativas de los osteoclastos de RAW 264.7 células cultivadas en presencia de RANKL e iones de uranilo se muestran en la figura 1. Cambios en número y tamaño de los osteoclastos en respuesta a uranio son fácilmente visibles en imágenes compuestas de los pozos todas y en imágenes ampliadas.

Tamaño de los osteoclastos se analizó usando el software ImageJ (figura 2). Para ello, se utilizaron imágenes todo-bien de trampa manchada osteoclastos y las mismas regiones fueron tratadas en cada pocillo de cada condición de cultivo (figura 2A y 2D). Se esbozaron los osteoclastos presentes en cada región (figura 2B y 2E) que permitió la determinación de su área (expresada en μm2) (figura 2 y 2F). Ejemplos que se muestran en la figura 2 ilustran el efecto fuerte de uranio en el tamaño de los osteoclastos.

Para investigar los efectos del uranio sobre la actividad de reabsorción los osteoclastos, las células RAW 264.7 plateadas y diferenciadas en la placa de superficie osteomimetic. Al final del ensayo, se eliminaron los osteoclastos. Entonces, superficie mimética del hueso en cada bien fue tratada por sal sódica de rojo de alizarina S para mancha área no reabsorbido e imágenes de cada conjunto bien fueron adquiridos (Figura 3A y 3D). Las imágenes resultantes fueron procesadas con el software Image J. Fueron convertidos en imágenes en escala de grises de 8 bits (figura 3B y 3E), sometidas a umbral (figura 3 y 3F) y automáticamente se calculó el área correspondiente (regiones blanco).

Figure 1
Figura 1: visualización del efecto de U(VI) en la formación de osteoclastos. RAW 264,7 células se diferenciaron en la presencia de la concentración indicada de uranilo. En el día 4, se efectuó tinción de fosfatasa ácida tartrato-resistente (TRAP). Representante todo bien las fotografías (paneles superiores) muestran teñidos de trampa osteoclastos obtenidos en estas condiciones. Se muestran ejemplos de multinucleated osteoclastos en zonas en caja en un aumento mayor (flechas en los paneles inferiores). Estas fotos ilustran el efecto dependiente de la dosis de U(VI) en la formación de osteoclastos. Flechas negras cabeza indican ejemplos de núcleos de los osteoclastos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: análisis del efecto de U(VI) en el tamaño de los osteoclastos de. (A y D): se muestran imágenes de conjunto bien de osteoclastos con área en caja correspondiente a las regiones en que los osteoclastos se analizó el tamaño. El rojo cajas de zona en (A y D) corresponden a las indicadas en (B) y (E), respectivamente. (B y E): el dibujo manual de bordes de osteoclastos en las dos condiciones de uranilo-concentración se muestra en azul. (C y F): resultado windows de software ImageJ que muestra las mediciones de análisis (B y E) respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: análisis del efecto de U(VI) en función de los osteoclastos de. Imágenes de alizarina osteomimetic manchada superficie después de la reabsorción osteoclástica que tuvo lugar en la ausencia (A) o en presencia de 25 μm de uranilo (D). Fotos en (A y D) primero fueron convertidos en imágenes en escala de grises de 8 bits como se muestra en (B y E) y, posteriormente, en imágenes binarias (C y F) mediante la aplicación de un ajuste adecuado. Estas imágenes binarias se utilizaron para calcular el porcentaje de área que se resorbe en cada condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Lo que sabemos, esta es la primera vez que se describe un procedimiento detallado con el objetivo de estudiar el efecto del uranio natural en resorbing células del hueso. Este enfoque será útil para lograr una mejor comprensión del impacto de uranio en la fisiología del hueso y puede proporcionar una nueva herramienta para la proyección de quelantes del uranio. Además, creemos que el protocolo descrito aquí podría aplicarse para estudiar el impacto de metales pesados en osteoclatogenesis.

Se sabe que uranilo es complexed con componentes orgánicos e inorgánicos en el medio de cultivo18,19,20,21. Estos complexations influencian de la especiación del uranio y, de esta manera, su citotoxicidad. Por esta razón, un paso crítico en el protocolo es la preparación de medios de cultivo que contiene uranio. Previamente hemos demostrado23 que la presencia de 5% de suero bovino fetal en el medio de cultivo de células RAW 264.7 no tuvo efectos significativos sobre la citotoxicidad de uranilo cuando se utiliza en concentraciones que van desde 0 hasta 400 μm. Esto es un punto importante, como la presencia de suero en el medio es necesaria para analizar el efecto de la exposición de uranio durante todo el proceso de la diferenciación osteoclástica. Sin embargo, queremos subrayar que el procedimiento de dos pasos largos descrito para la preparación de medios de exposición (6 horas) debe ser seguido cuidadosamente. De hecho, el paso de incubación de 3 horas después de cada dilución de sales de uranilo permite la estabilización de los complejos de uranilo potencialmente formado en solución antes de mayor dilución o exposición de la célula. Esto es absolutamente necesario para obtener resultados confiables y reproducibles.

Otro parámetro importante para la reproducibilidad de los ensayos de diferenciación y de la resorción osteoclasta es la densidad de siembra de la RAW 264.7 las células. De hecho, se ha demostrado que densidad de precursores mononucleares es un determinante crítico para la formación de osteoclastos, probablemente debido a proximidad de célula a célula influye en la fusión celular eventos24. Por lo tanto, una atención particular debe prestarse a la célula contando, preparación de la suspensión celular y homogeneidad de la siembra en cada pozo, para evitar interpretaciones erróneas.

La herramienta umbral es útil para la automatización de la cuantificación de la resorción. Vale la pena señalar que este análisis requiere imágenes correctamente iluminadas. Sin embargo, un problema común independientemente del tipo de método de adquisición de imagen y cámara es iluminación desigual en los bordes de la imagen. En ese caso, un método de umbralización de multi-step puede ser necesario.

En Resumen, hemos establecido un protocolo robusto que permite el estudio de impacto de uranio en la formación de osteoclastos, la viabilidad y función. Este procedimiento ha sido desarrollado utilizando la línea de células RAW 264.7 pero es plenamente aplicable a los precursores de osteoclasto primario médula mostramos23.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Chantal Cros por asistencia técnica útil.
Esta investigación fue financiada por donaciones de la "Commissariat à l ' Energie Atomique et aux energías alternativas" (URANOs - programa Transversal de Toxicologie du CEA y CEA CPRR-AREVA) y de la ANR (toxicidad de uranio: enfoque multinivel de biomineralización proceso en el hueso, ANR-16-CE34-0003). Este trabajo fue apoyado también por la Universidad de Niza Sophia-Antipolis y el CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

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References

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